專利名稱：：糖基化抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及其Fc區(qū)得以表達且被糖基化的重組抗體，由此與抗體Fc區(qū)相連的主要核心糖結(jié)構(gòu)被充分巖藻糖基化(fucosylated)。本發(fā)明還涉及CHO(中國倉鼠卵巢)宿主細胞，選擇此類CHO宿主細胞的方法，以及此類重組抗體的用途。
背景技術(shù)：
：天然形式的免疫球蛋白或抗體通常是由兩條輕鏈和兩條重鏈組成的四聚體糖蛋白?？贵w含有恒定結(jié)構(gòu)域，據(jù)此將抗體歸屬為不同的類，如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，以及若干亞類，如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。IgGl和IgG3類的人抗體通常介導ADCC(抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用)。也存在已知的其他抗體樣分子，含有例如異源蛋白質(zhì)如受體、配體或酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和抗體的Fc區(qū)。例如，這樣的Fc融合蛋白由Stabila，P.等，NatureBiotech16(1998)1357-1360和US5，610，297描述。單克隆抗體引發(fā)四種效應功能ADCC，吞噬作用，補體依賴性細胞毒作用(CDC)，影響半衰期/清除率。ADCC和吞噬作用通過細胞結(jié)合的抗體與FqR(Fcy受體)之間的相互作用介導；CDC則通過細胞結(jié)合的抗體與構(gòu)成補體系統(tǒng)的系列蛋白之間的相互作用。CDC與Clq結(jié)合C3激活和/或Fc受體與Fc部分的結(jié)合相關(guān)。如果需要降低Clq結(jié)合C3激活和/或Fc受體與抗體恒定部分的結(jié)合，通常使用IgG4抗體，它不激活補體系統(tǒng)，不結(jié)合Clq，不激活C3?？蛇x地，使用含有-重鏈恒定區(qū)的Fc部分，其中所述恒定區(qū)具有某些突變，如L234A和L235A或D265A和N297A4(WO99/51642)。本領(lǐng)域眾所周知如何修飾抗體的恒定結(jié)構(gòu)域以改善效應功能。例如，這樣的方法描述在WO99/54342中。Routier，F(xiàn).H.等，GlycoconjugateJ.14(1997)201-207報道了在CHO-DUKX細胞中表達的人源化IgGl抗體的糖基化模式。此抗體顯示出Fuc:Man為0.8:3.0的摩爾比，述及80。/。的巖藻糖基化比率。Niwa，R.等，J.Immunol.Methods306(2005)151-160報道了在CHODG44中重組生產(chǎn)的巖藻糖基化約為90%的抗CD20IgGl和IgG3抗體。Mimura,Y等，J.Immunol.Methods247(2001)205-216報道了丁酸鹽增加CHO-K1細胞中人嵌合IgG的產(chǎn)量，同時維持其功能和糖型分布。寡糖分布顯示相當可觀量的無巖藻糖基化的(afucosylated)聚糖結(jié)構(gòu)。Raju，T.S.，BioProcessInternational1(2003)44-53報道了表達系統(tǒng)糖基化差異對治療性免疫球蛋白生物活性的影響以及命名法。Ma，S"AnaLChem.71(1999)5185-5192報道了利妥昔單抗(rituximab)的糖分析。利妥昔單抗顯示出9-10%的巖藻糖基化(Niwa，R.等，J.Immunol.Methods306(2005)151-160)。Fujii，S.，J.Biol.Chem.265(1990)6009-6018報道牛IgG包括大約11%無巖藻糖基化的IgG。Mizouchi，T.，J.Immunol.129(1982)2016-2020報道人IgG大約14%是無巖藻糖基化的。Bergwerff，A.A.，GlycoconjugateJ.12(1995)318-330報道了在小鼠SP2/0中生產(chǎn)的抗體含有大量N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(N-glycolylneuraminicacid,NGNA)寡糖。Nahrgang，S.等在AnimalCellTechnology:ProductsfromCells,CellsasProducts,Bernard,A.等(編輯)，KluwerAcademicPublishers,Dordrecht,NL，1999，第259-261頁中報道了IgGl的CHO表達，在瞬時轉(zhuǎn)染之后發(fā)現(xiàn)總體糖基化弱。Lund，J.等，Mol.Immunol.30(1993)741-748報道了在小鼠轉(zhuǎn)染瘤細胞中重組生產(chǎn)小鼠-人嵌合抗體。13%量的IgGl抗體是無巖藻糖基化的。Patel，T.P.等，Biochem.J.285(1992)839-845報道了來自雜交瘤細胞和小鼠腹水的抗體的糖基化。Niwa，R.等，J.Immunol.Methods306(2005)151-160報道了在CHODG44中重組生產(chǎn)CD20IgGl抗體之后91%的巖藻糖基化，而Mori,K.等，Biotech.Bioeng.88(2004)卯l-908報道了94%的巖藻糖基化。Davies，J.等，Biotechnol.Bioeng.74(2001)288-294報道表達具有改變的糖型的抗體導致ADCC增加。Sheeley，D.M.等，Anal.Biochem.247(1997)102-110比較了不同表達系統(tǒng)中的抗體糖基化。Shields,R丄.等，J.Biol.Chem.277(2002)26733-26740報道人IgGlFc上缺乏巖藻糖提高FcyRIII結(jié)合和ADCC。Zhu，L.等，NatureBiotechnol.23(2005)1159-1169報道了在雞蛋中生產(chǎn)人抗體。WO2004/087756和WO2005/005635^>開了抗IGF-1R的改良的抗體。發(fā)明概述本發(fā)明包括人IgGl或IgG3型抗體，所述抗體在Asn297處被糖鏈糖基化，其特征在于在所述糖鏈內(nèi)巖藻糖的量至少為99%,此外，NGNA的量為1%或以下，和/或N-末端a-l，3-半乳糖的量為1%或以下。根據(jù)本發(fā)明，"量"是指在Asn297處糖鏈內(nèi)所述糖的量，以G0、Gl、G2(不含甘露糖(4和5))之和作為100%,如實施例3所述進行計算。根據(jù)本發(fā)明，有可能提供巖藻糖基化甚至為99.4%或以上、".5%或以上、或99.9。/o或以上的抗體和/或CHO宿主細^i。優(yōu)選NGNA的量為0.5%或以下，更優(yōu)選0.1%或以下，甚至LCMS(液相色鐠/質(zhì)鐠)不可檢測。優(yōu)選N-末端a-l，3-半乳糖的量為0.5%或以下，更優(yōu)選0.1%或以下，甚至LCMS不可檢測。糖鏈優(yōu)選表現(xiàn)出與CHO細胞中重組表達抗體的Asn297處相連的N-連接聚糖的特征。優(yōu)選抗體是單克隆抗體。優(yōu)選抗體是嵌合、人源化或人抗體。本發(fā)明還包括能夠重組表達人IgGl或IgG3型抗體的CHO細胞，所述抗體在Asn297處被糖鏈糖基化，其特征在于在所述糖鏈內(nèi)巖藻糖的量至少為99%,此外，NGNA的量為1%或以下，和/或N-末端a-l，l半乳糖的量為1%或以下。這沖羊的細胞系為細胞系huMAb<IGF-lR>Bl-4E10—9-16)，根據(jù)國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約，于2006年6月21日保藏在德國的德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,DSMZ),保藏號DSMACC2795。優(yōu)選的糖的量如上文所述。優(yōu)選CHO細胞是這樣的CHO細胞包括兩個DHFR等位基因缺失(如DG44)或功能性失活，或者一個DHFR等位基因缺失，笫二個DHFR等位基因功能性失活(如DXBll)。本發(fā)明還包括根據(jù)本發(fā)明用于人類醫(yī)療的組合物。根據(jù)本發(fā)明組合物的抗體優(yōu)選是嵌合抗體、人抗體、人源化抗體、非人抗體、包含IgGl或IgG3重鏈恒定部分的單鏈抗體、或者IgGl或IgG3重鏈恒定部分。本發(fā)明還包括根據(jù)本發(fā)明的抗體用于制備藥物的用途。優(yōu)選藥物用于免疫抑制、用以治療T細胞介導的紊亂、自身免疫紊亂、傳染病、癌病。本發(fā)明還包括藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的另一目的是選擇用于重組生產(chǎn)人IgGl或IgG3型單克隆抗體的CHO細胞的方法，所述抗體在Asn297處被糖鏈糖基化，其特征在于在所述糖鏈內(nèi)巖藻糖的量至少為99%,此外，NGNA的量為1%或以下，和/或N-末端a-l，3-半乳糖的量為1%或以下，所述方法包括在DHFR和MTX選擇壓力下培養(yǎng)用IgGl或IgG3抗體和DHFR基因轉(zhuǎn)染的CHO細胞，挑取單個的克隆，擴增所述克隆，選擇產(chǎn)生本發(fā)明糖基化模式抗體的克隆。優(yōu)選培養(yǎng)進行至少兩周、優(yōu)選至少三周。本發(fā)明的另一目的是根據(jù)本發(fā)明的CHO細胞用于重組生產(chǎn)單克隆抗體的用途。本發(fā)明的另一目的是在根據(jù)本發(fā)明的CHO細胞中重組生產(chǎn)單克隆抗體的方法。CHO細胞是用于重組表達異源多肽的宿主細胞。附圖的簡短說明圖1的柱形圖顯示了本發(fā)明抗體以及對照和參比抗體的ADCC活性或該活性的不足。發(fā)明詳述抗體在重鏈恒定區(qū)的保守位置上含有糖結(jié)構(gòu)，其中每個同種型擁有獨特排列的N-連接糖結(jié)構(gòu)，它們可變地影響著蛋白質(zhì)的裝配、分泌或功能活性(Wright，A.和Morrison,S丄.，TrendsBiotechnol.15(1997)26-32)。視加工程度不同，所連的N-連接糖的結(jié)構(gòu)相當?shù)刈兓鄻?，可以包括高甘露糖、多分支以及二天線復雜型寡糖(Wright，A.和Morrison,S.L.，TrendsBiotechnol.15(1997)26-32)。IgGl和IgG3型抗體是在各CH2結(jié)構(gòu)域的Asn297處具有保守N-連接糖基化位點的糖蛋白。與Asn297相連的兩個復雜型二天線寡糖被遮蔽在CH2結(jié)構(gòu)域之間，與多肽主鏈形成廣泛接觸，且其存在對于抗體介導效應功能如抗體依賴性細胞細胞毒作用(ADCC)是必不可少的(Lifely，M.R.等.Glycobiology5(1995)813-822;Jefferis，R.等，ImmunolRev.163(1998)59-76;Wright,A.和Morrison,S丄.，TrendsBiotechnol.15(1997)26-32)。如本文所用，術(shù)語"人IgG型Fc區(qū)"優(yōu)選還包括天然存在的免疫球蛋白(抗體)Fc區(qū)的等位基因變體，以及具有取代、添加或缺失改變但不影響Ans297糖基化作用的變體。例如，免疫球蛋白Fc區(qū)的N-末端或C-末端可以缺失一個或多個氨基酸，而不會導致生物功能的實質(zhì)損失。這樣的變體可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的一般規(guī)則進行選擇，從而對活性具有最小的影響(參見例如Bowie，J.U.等，Science247(1990)1306-1310)。術(shù)語"抗體"涵蓋多種形式的抗體，包括但不限于全抗體、抗體片段、人抗體、人源化抗體和遺傳改造的抗體，只要保留根據(jù)本發(fā)明的特征性特性即可。因此，才艮據(jù)本發(fā)明的抗體至少含有IgGl或IgG3型功能活性(結(jié)合FcR的)Fc部分，包含糖基化的Asn297。如本文所用的術(shù)語"單克隆抗體，，或"單克隆抗體組合物，，是指具有完全相同氨基酸組成的抗體分子制品。相應地，術(shù)語"人單克隆抗體，，是指具有來源于人生殖系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)、呈現(xiàn)出單一結(jié)合特異性的抗體。術(shù)語"嵌合抗體"是指包含來自一種來源或物種的可變區(qū)即結(jié)合區(qū)，以及至少一部分來源于不同來源或物種的恒定區(qū)的單克隆抗體，通常通過重組DNA技術(shù)制備。特別優(yōu)選包含鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體。此類鼠/人嵌合抗體為免疫球蛋白基因的表達產(chǎn)物，所述免疫球蛋白基因包含編碼鼠免疫球蛋白可變區(qū)的DNA區(qū)段以及編碼人免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA區(qū)段。生產(chǎn)嵌合抗體的方法包括目前本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)(參見例如Morrison,S.L.等，Proc.Natl.AcadSci.USA81(1984)6851-6855;美國專利No.5,202,238和5，204，244)。術(shù)語"人源化抗體"是指這樣的抗體，其中框架或"互補決定區(qū)，，(CDR)已經(jīng)凈皮^修飾，以包含與親本免疫球蛋白相比具有不同特異性的免疫球蛋白CDR。在優(yōu)選的實施方案中，將鼠CDR移植至人抗體的框架區(qū)，以制備"人源化抗體，，(參見例如Riechmann，L.等，Nature332(1988)323-327;以及Neuberger，M.S.等，Nature314(1985)268-270)。特別優(yōu)選的CDR對應于提供這樣序列的CDR，所述序列識別上迷嵌合及雙功能抗體的抗原。如本文所用，術(shù)語"人抗體，，旨在包括具有來源于人生殖系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)的抗體。這樣的區(qū)域由例如Johnson,G.和Wu，T.T.，NucleicAcidsRes.28(2000)214-218和文中引迷的數(shù)據(jù)庫描述，只要保留根據(jù)本發(fā)明的特性就是可用的。人抗體在本領(lǐng)域是眾所周知的(vanDijk，M.A.和vandeWinkel，J.G"Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。人抗體也可以在轉(zhuǎn)基因動物(如小鼠)中生產(chǎn)，所述轉(zhuǎn)基因動物經(jīng)免疫后能夠生產(chǎn)全部或選擇的人抗體，而無內(nèi)源免疫球蛋白生產(chǎn)。將人生殖系免疫球蛋白基因排列轉(zhuǎn)移到這樣的生殖系突變小鼠中導致在抗原刺激時生產(chǎn)人抗體(參見例如Jakobovits，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)2551-2555;Jakobovits,A.等，Nature362(1993)255-258;Bruggemann，M.9等，YearImmunol.7(l993)3340)。人抗體也可以在噬菌體展示文庫中生產(chǎn)(Hoogenboom，H.R.和Winter,G"J.Mol.Biol.227(1992)381-388;Marks,J.D.等，J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。還可以利用Cole等及Boerner等的技術(shù)制備人單克隆抗體(Cole等，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss，第77頁(1985);和Boerner,P.等，J.Immunol.147(1991)86-95)。人抗體涵蓋多種形式的抗體結(jié)構(gòu)，優(yōu)選單克隆抗體，包括但不限于全抗體、抗體片段和遺傳改造的抗體(變體或突變抗體)，只要保留根據(jù)本發(fā)明的特征性特性即可。尤其優(yōu)選重組人抗體。如本文所用，術(shù)語"重組人抗體"旨在包括通過重組手段生產(chǎn)制備、表達、創(chuàng)建或分離的所有人抗體，例如，利用轉(zhuǎn)染到根據(jù)本發(fā)明的宿主細胞中的重組表達栽體，從這樣的宿主細胞中分離的抗體。"恒定結(jié)構(gòu)域，，不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但表現(xiàn)出其他功能如效應功能。對應于IgGl的重鏈恒定區(qū)稱為鏈。對應于IgG3的重鏈恒定區(qū)稱為y3鏈。人恒定y重鏈由Kabat，E.A.等，S叫uencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD.(1991)以及Bmeggemann，M.等，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361;Love，T.W.等，MethodsEnzymol.178(1989)515-527詳細描述。IgGl或IgG3型的恒定結(jié)構(gòu)域在Asn297處糖基化。根據(jù)本發(fā)明的"Asn297"表示大致位于Fc區(qū)第297位上的氨基酸天冬酰胺；根據(jù)抗體微小的序列變異，Asn297也可以位于上游或下游的某些氨基酸位置上(通常不超過土3個氨基酸)。例如，在根據(jù)本發(fā)明的一個抗體中，"Asn297"位于氨基酸位置298處。人IgGl或IgG3的糖基化發(fā)生在Asn297處，為核心巖藻糖基化的二天線復雜型寡糖糖基化，由至多2個Gal殘基封端。根椐末端Gal殘基量的不同，這些結(jié)構(gòu)命名為G0、Gl(al，6或al，3)或G2聚糖殘基(Raju，T.S.，BioProcessInternational1(2003)44-53)?？贵wFc部分的CHO型糖基化由例如Routier,F.H,GlycoconjugateJ.14(1997)201-207描述。如本文所用的"可變區(qū)"(輕鏈可變區(qū)(VL)、重鏈可變區(qū)(VH))表示直10接參與抗體與抗原結(jié)合的每一對輕鏈和重鏈。根據(jù)本發(fā)明，可以選擇生產(chǎn)抗體的CHO宿主細胞，其能夠經(jīng)由重組表達提供表現(xiàn)出根據(jù)本發(fā)明糖基化模式的單克隆抗體的組合物。這樣的CHO宿主細胞含有用于重組表達這類抗體的一個或多個表達載體。優(yōu)選宿主細胞用所述載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，抗體編碼核酸穩(wěn)定整合到CHO宿主細胞基因組中。術(shù)語"CHO細胞"涵蓋以兩個缺失的dhfr等位基因(二氫葉酸還原酶缺陷型(dhfr-))為h出的多種形式的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。這樣的dhfr-細胞及其產(chǎn)生方法描述在例如Urlaub，G..等，Cell33(1983)405-412;Urlaub，G.等，Som.CellMolec.Genet.12(1986)555-566;Kolkekar等,Biochemistry36(1997)10901-10909中。優(yōu)選細胞是DG44細胞系?？梢岳脃射線消除整個的dhfr基因座生產(chǎn)這樣的CHOdhfr-細胞。在非突變的野生型細胞中，dhfr是從甘氨酸、嘌呤和胸苷酸從頭合成必不可少的酶。這使得質(zhì)粒上編碼的dhfr基因能夠在dhfr-缺陷型細胞系中用作蛋白質(zhì)表達的顯性選擇標記和基因放大器(amplifier)。細胞中的dhfr-突變穩(wěn)定且不可逆轉(zhuǎn)。成功地共轉(zhuǎn)染了人IgGl或IgG3型抗體和DHFR基因的表達栽體的CHO細胞將擁有dhfr+表型，并且通過在缺乏胸苷和次黃嘌呤、任選含有擴增用甲氨蝶呤(MTX)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞集落能容易地進行選擇。DG44細胞在本領(lǐng)域眾所周知，例如，可以作為細胞系從例如美國英駿公司(InvitrogenCorp.，USA)商購獲得。DG44細胞可以貼壁、在懸液中和/或在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。如本文所用，表述"細胞"、"細胞系"和"細胞培養(yǎng)物"互換使用，且所有這樣命名的CHOdhfr-細胞系(兩個缺失的dhfr等位基因)包括子代。從而，措辭"轉(zhuǎn)化林"和"轉(zhuǎn)化細胞"包括最早的受試細胞和由之獲得的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移次數(shù)。也應當理解，由于故意或無意的突變，所有的子代在DNA內(nèi)容方面可能并不精確相同。具括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。優(yōu)選CHOdhfr-細胞系至少與DHFR—起進行共擴增，后者作為一種選擇標記基因。例如，將含有選擇標記的哺乳動物表達載體和抗體基因共轉(zhuǎn)染到受體CHO細胞中。可以對產(chǎn)生的集落進行選擇，呈現(xiàn)出預期表型的集落能夠表達抗體。額外的選擇標記是或者可能不是顯性的。用于共轉(zhuǎn)染的額外選擇標記的實例包括腺苷脫氨酶(Kaufman，R.J.等，Proc.Natl.Acad,Sci.USA83(1986)3136-3140)、天冬酰胺合成酶(Cartier，M.等，Mol.CellBiol.7(1987)1623-1628)、大腸桿菌(E.o//)trpB基因和沙門氏菌屬(S"/加owe〃")hisD基因(Hartman，S.C.和Mulligan,R.C.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(1988)8047-8051)、M2小鼠核糖核苷酸還原酶(Thelander，M.和Thelander，L.，EMBOJ.8(1989)2475-2479)、人多藥耐藥基因(Kane，S.E.等，Gene84(1989)439-446)、谷氨酰胺合成酶(Bebbington,C.R.等，DNACloning,Vol.III，D.M.Glover(編輯)，IRLPress,第163-188頁，1987)、黃噤呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(gpt)(Mulligan,R.C.和Berg，P"Science209(1980)1422-1427)、潮霉素B(Santerre，R.F.等，Gene30(1984)147-156)、新霉素基因(Southern,P.J.和Berg，P.，J.Mol.Appl,Genet.1(1982)327-341)。選擇標記還可以提供抗體編碼基因得以擴增的基礎(chǔ)。在CHO細胞系的共轉(zhuǎn)染過程中，各栽體DNA通常整合到細胞染色體相同的基因座上。從而，一般僅僅使用一種選擇標記作為擴增基礎(chǔ)就引起兩種基因拷貝數(shù)的平行增加。以這種方式使用的一種特別的選擇標記是dhfr，通過使用濃度漸增的MTX，能夠獲得期望的擴增。又一優(yōu)選的選擇標記是GS，通過添加甲硫氨酸亞砜胺(methioninesulphoxhnine，MSX)能夠進行擴增。選擇標記當然要處于DNA調(diào)控元件的控制之下以確保其表達。在使用dhfr作為選擇標記的情況下，調(diào)控元件優(yōu)選為病毒來源的，例如來自DNA腫瘤病毒。特別優(yōu)選使用SV40或腺病毒主要晚期啟動子。就此而言，從所述啟動子中除去增強子元件從而有效使之"削弱"尤為有利。與否則如果使用強啟動子會發(fā)生的情況相比，這種修飾能夠在各種濃度的甲氨蝶呤選擇下增加基因擴增水平。在使用新霉素作為選擇標記的情況下，適宜啟動子的實例為小鼠金屬硫蛋白啟動子。如本文所用，術(shù)語"核酸，，或"核酸分子，，旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選為雙鏈DNA。當核酸與另一核酸序列處于功能關(guān)聯(lián)狀態(tài)時，其"有效連接"。例如，如果前序列或分泌前導序列的DNA與多肽的DNA的連接表達為參與所述多肽分泌的前蛋白，則他們有效連接；如果啟動子或增強子的連接影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則他們有效連接；或者如果核糖體結(jié)合位點與編碼序列的排置有利于翻譯，則他們有效連接。通常，"有效連接，，表示連接的DNA序列是順式的，而且在分泌前導序列的情況下是相鄰且同讀框連接的。不過，增強子不必相鄰。連接通過便利的限制性位點處的連接實現(xiàn)。如果不存在這樣的位點，則按照常規(guī)操作使用合成的寡核苷酸接納體(adaptor)或接頭。根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選通過重組手段生產(chǎn)。此類方法在本領(lǐng)域廣為人知，并且包括在原核和真核細胞中表達蛋白質(zhì)，隨后分離抗體多肽，并通常純化至可藥用的純度。為進行蛋白質(zhì)表達，通過標準方法將編碼輕鏈和重鏈或其片段的核酸插入表達載體中。在CHO宿主細胞中進行表達，并從細胞或上清液(優(yōu)選在裂解后)中回收抗體?？贵w的重組生產(chǎn)在本領(lǐng)域眾所周知，并描述在例如Makrides，S.C.，ProteinExpr.Purif.17(1999)183-202;Geisse，S.等，ProteinExpr.Purif.8(1996)271-282;Kaufman,R.J.，Mol.Biotechnol,16(2000)151-161;Werner,R.G.，DrugRes.48(1998)870-880的綜述文章中?？贵w可以存在于完整細胞、上清液、細胞裂解物中，或為部分純化或基本上純的形式。通過標準技術(shù)，包括本領(lǐng)域眾所周知的堿/SDS處理、氯化銫分帶(CsCIbanding)、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳等等進行純化，以除去其他細胞組分或其他雜質(zhì)，如其他細胞核酸或蛋白質(zhì)(參見Ausubel，F(xiàn).等編輯CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience，NewYork(1987))。例如，適用于原核生物的控制序列包括啟動子，任選的操縱子序列，和核糖體結(jié)合位點。真核細胞已知利用啟動子、增強子和多聚腺苷酸化信號?？梢酝ㄟ^常規(guī)的免疫球蛋白純化方法如蛋白質(zhì)A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析從雜交瘤培養(yǎng)基中適當?shù)胤蛛x單克隆抗體。編碼單克隆抗體的DNA和RNA很容易從雜交瘤中分離，并利用常規(guī)方法進行測序。雜交瘤細胞可用作為此類DNA和RNA的來源。DNA—經(jīng)鑒定和分離，即可插入到表達載體中，隨之轉(zhuǎn)染到否則將不生產(chǎn)免疫球蛋白的CHO細胞中，以實現(xiàn)宿主細胞中重組單克隆抗體的合成。本發(fā)明在另一方面提供了藥物組合物，包括與可藥用載體配制在一起的本發(fā)明組合物。優(yōu)選4吏用才艮據(jù)WO98/22136的藥物組合物。例如，1ml這樣的組合物含有2.0mg抗體，15mM磷酸緩沖液pH6.5，30mM氯化鈉，25mg甘露醇(mannite)，10mg精氨酸，0.1mgTween20。如本文所用，"可藥用載體，，包括生理上相容的任何及所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。優(yōu)選栽體適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊髓(spinal)或表皮給藥(例如通過注射或輸注)。"可藥用鹽"是指保留抗體期望的生物活性而不帶來任何不期望的毒物學效應的鹽(參見例如Berge，S.M.等，J.Pharm.Sci.66(1977)1-19)。這樣的鹽包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。這樣的鹽的實例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括從無毒的無機酸衍生的鹽，如鹽酸鹽。本發(fā)明的組合物可通過本領(lǐng)域^^知的多種方法給藥。正如技術(shù)人員將會理解的那樣，給藥路徑和/或方式將隨期望的結(jié)果而變動。為通過某些給藥路徑給藥本發(fā)明的化合物，可能需要用防止化合物失活的材料對其進行包衣，或化合物與之共給藥。例如，可以向受試者給藥處于適宜載體例如脂質(zhì)體或稀釋劑中的化合物?？伤幱孟♂寗┌}溶液和水性緩沖溶液?？伤幱幂d體包括無菌水性溶液或^t液，以及用于臨時制備無菌注射液或*液的無菌粉劑。此類介質(zhì)和藥劑用于藥物活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域公知的。14如本文所用的短語"腸胃外給藥"和"經(jīng)腸胃外給藥"，表示不同于腸和局部給藥的給藥方式，通常是通過注射，包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、嚢內(nèi)、眶內(nèi)、心臟內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、嚢下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。這些組合物還可以含有佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。通過前述滅菌操作，以及通過納入多種抗細菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，均可以確保防止微生物的存在。還可能期望在組合物中納入等滲劑，如糖、氯化鈉等。另外，可注射藥物形式的延遲吸收可以通過納入延遲吸收的藥劑如單硬脂酸鋁和明膠來實現(xiàn)。無論所選的施用路徑如何，可以以適宜水合物形式使用的本發(fā)明的化合物和/或本發(fā)明的藥物組合物通過本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法配制為可藥用劑型。根據(jù)本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可有變動，以獲得有效量的活性成分，從而對于特定的患者、組合物和給藥方式實現(xiàn)期望的治療反應，而對患者沒有毒性。所選的劑量水平將取決于多種藥代動力學因素，包括所采用的本發(fā)明特定組合物或其酯、鹽或氨基化合物(amide)的活性、給藥路徑、給藥時間、所采用特定化合物的排泄速率、與所采用特定組合物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料、所治療患者的年齡、性別、體重、病情、總體健康和既往病史、以及醫(yī)學領(lǐng)域眾所周知的類似因素。組合物必需是無菌和流動的，從而組合物可以通過注射器遞送。除了水之外，栽體還可以是等滲緩沖鹽溶液，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇，液體聚乙二醇，等等)，以及它們適宜的混合物。例如，可以通過使用包衣如卵磷脂，分散劑的情況下通過維持所需的顆粒大小，通過使用表面活性劑，來維持適當?shù)牧鲃有浴Ｔ谠S多情況下，優(yōu)選在組合物中納入等滲劑，例如糖，多元醇如甘露醇或山梨糖醇，和氯化鈉?？勺⑸浣M合物的長期吸收可以通過在組合物中納入延遲吸收的藥劑如單硬脂酸鋁或明膠來實現(xiàn)。提供如下實施例和附圖以幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真正范圍闡釋在所附權(quán)利要求書中。應當理解，可以對所示的操作進行改動而不會偏離本發(fā)明的精神。實施例細胞系用來產(chǎn)生重組表達IgG的細胞系的親本細胞系是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系CHO-DG44(Flintoff，W.F.等，Somat.CellGenet.2(1976)245-261;Flintoff，W.F.等,Mol.Cell.Biol.2(1982)275-285;Urlaub,G.等，Cell33(1983)405-412;IMaub.G.等，Somat.CeHMol.Genet.12(1986)555-566)。CHO-DG44細胞的兩個內(nèi)源二氫葉酸還原酶(DHFR)基因座均已喪失。CHO-DG44細胞培養(yǎng)在MEMalphaMinus培養(yǎng)基(GibcoNo.22561)，10%透析的胎牛血清FCS(GibcoNo.26400-044)和2mmol/LL-谷氨酸，100次黃噤呤，16jliM胸苷(HT增補物)中。質(zhì)粒表達系統(tǒng)包括CMV啟動子，并在表l中描述。至于抗體，使用了抗IGF-1R抗體(WO2005005635;AK18或AK22)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>Bp栽體元件/DNAsegment7182-7792復制起點("pUC起點")7793-7939接頭7940-8847(3-內(nèi)酰胺酶基因(Ap(r))8848-8941接頭8942-9529人巨細胞病毒(HCMV)啟動子(CMV-Prom)包括人CMVIE啟動子包括合成的5'-UTR9530-9556接頭9557-9696鼠Ig重鏈前導序列(Ll,信號序列內(nèi)含子，L2)9557-9602U9603-9685信號序列內(nèi)含子(ss內(nèi)含子)9686-96969697-10051IGF-1R抗體(AK18)的可變IgGl重鏈結(jié)構(gòu)域10052-10085接頭10086-11682人/小鼠重鏈雜合體內(nèi)含子2包括小鼠Ig重鏈J-連接區(qū)部分包括Ig重鏈增強子元件(部分JH3，JH4)小鼠Ig重鏈增強子元件11683-11909接頭11910-13504人IgGl重鏈恒定區(qū)(CKh-鉸鏈-CHrCH3)11910-12203CH112594-12638鉸鏈12757-13086CH213184-13504CH3(可變剪接位點缺失)13505-13967人IgGl重鏈多聚腺苷酸化序列(IgGlpA)13968-13970SgrAI-接頭實施例1轉(zhuǎn)染和選擇表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染利用Fugene(羅氏診斷有限公司，RocheDiagnosticsGmbH)進行。在轉(zhuǎn)染1天后，將DG44細胞置于選擇壓力下包括MEMalphaMinus培養(yǎng)基、10%透析的胎牛血清FCS、2mmol/LL-谷氨酸和20nM曱氨蝶呤(MTX)。置于選擇壓力下培養(yǎng)3周后，從板中挑取單個的克隆，并進行擴增。收集上清液，利用人IgG特異性ELISA分析抗體的存在。亞克隆進一步擴增，并分析特異性抗體的產(chǎn)量。使克隆適應生長于懸浮培養(yǎng)物和無血清培養(yǎng)基中，即含20nMMTX的HyQSFM4CHO-Utility(?？寺」?，HyClone#SH30516)。平行測定糖模式分布(glycopatternprofile)。選擇脫巖藻糖基化(defucosylation)為2.0%或更低(指寡糖總摩爾量)的亞克隆。實施例2培養(yǎng)和純化細胞在裝有30ml培養(yǎng)基的125ml搖瓶(康寧公司，Corning)中于37°C,5%C02，100rpm條件下培養(yǎng)。通過CASY計數(shù)器測量細胞密度，采樣上清液，通過蛋白質(zhì)A親合層析測定抗體濃度。對大約20ml的各上清液進行純化，通過蛋白質(zhì)A親合層析(用PBS平衡，用25mM檸檬酸鈉緩沖液pH5.2洗滌，用洗脫100mM檸檬酸鈉緩沖液pH2.8，用10mMNaOH進行CIP原位清潔)進一步進行生化表征。實施例3抗體糖結(jié)構(gòu)的分析通過液相色傳/質(zhì)傳(LCMS)肽圖譜分析對純化的抗體材料進行分析。對樣品進行還原(0.4MTRIS/HC1，8M胍/HCl，pH8.5，DTT(3mg/ml)，羧甲基化的(碟乙酸))并用胰蛋白酶切割。肽-糖肽混合物利用RP-HPLC分離，并利用電噴霧質(zhì)譜進行在線分析。整合了含糖結(jié)構(gòu)的肽的m/z鐠，結(jié)構(gòu)示于表2。表2糖基化變體的相對量<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>Man:高甘露糖結(jié)構(gòu)，分別攜帶4個和5個甘露糖殘基G0、Gl、G2:巖藻糖基化二天線復雜型糖還原重鏈，具有1、2或3個末端半乳糖殘基nonFuc:二天線復雜型糖還原重鏈，不含巖藻糖CHO細胞系克隆5(huMAb<IGF-lR>Bl-4E10—9-16)根據(jù)國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約，于2006年6月21日保藏在德國的德意志微生物保藏中心，保藏號DSMACC2795。所用的培養(yǎng)基獲自?？寺」?Hyclone)(HyQSFM4CHO-Utility，用于克隆4-6)或希格瑪公司(Sigma)(C-8862,用于克隆1-3和7)。通過整合所有糖肽所有電荷狀態(tài)下的特異性離子色譜，進行LCMS肽圖譜分析。以相同的方式測定了平分型GlcNac、NGNA和高甘露糖。平分型GlcNac和NGNA不可檢測，因此NGNA的量為0.5%或更低，優(yōu)選0.1%或更低。平分型GlcNac的量也為0.5%或更低，優(yōu)選0.1%或更低。例示性的糖基化計算(克隆3)示于表3(表3a:克隆3;表3b:克隆5;肽包含asn298，稱為H27)。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>具有NGNA的糖結(jié)構(gòu)的相對量0,0具有半乳糖的糖結(jié)構(gòu)的相對量(G3和G4)o，o高甘露糖的相對量0，8G0-Fuc和Gl-Fuc的相對量0,2力口和G042,4力口和Gl48，2力口和G28,4總和99,0相對于100%的G0-l-2GO42,8Gl48,7G28,5力口和不含Man99，2力口和G0/1-Fuc0,2不含F(xiàn)uc的相對量0,2面積峰面積H27—GO至H27—G4:巖藻糖基化二天線復雜型糖糖肽H27(含有Asn298),具有x個末端半乳糖(例如，G4具有4個半乳糖單位)不含F(xiàn)uc的相對量Fuc相對于不含甘露糖(4和5個)糖結(jié)構(gòu)(高甘露糖)的所有G0、Gl、G2的百分比H27—G1—1NGNA至H27—G3—2NGNA:巖藻糖基化二天線復雜型糖糖肽H27(含有Asn298),具有x個末端半乳糖單位(例如，G2具有2個半乳糖單位)，攜帶1-2個N-羥乙酰神經(jīng)氨酸。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>攜帶額外己糖的糖結(jié)構(gòu)(63+G4)O，O高甘露糖糖結(jié)構(gòu)l，O"巖藻糖基化二天線復雜型糖結(jié)構(gòu)，具有x個末端半乳糖(分別為0、1、2、3和4個)2)巖藻糖基化二天線復雜型糖結(jié)構(gòu)，具有x個末端半乳糖(分別為0、1、2、3和4個)，具有額外的N-羥乙酰神經(jīng)氨酸殘基"巖藻糖基化二天線復雜型糖結(jié)構(gòu)(主要是本發(fā)明方法的人工制品)4)高甘露糖結(jié)構(gòu)，分別攜帶4或5個甘露糖殘基5)非巖藻糖基化的糖結(jié)構(gòu)實施例4測定抗IGF-IRHuMAb抗體介導的效應功能為了測定所產(chǎn)生的HuMAb抗體引發(fā)免疫效應機制的能力，進行了抗體依賴性細胞細胞毒作用(ADCC)的研究。為了研究各抗體在ADCC中的效應，表達IGF-IR的DU145前列腺癌細胞(HTB-81;1x106，處于2-4mlRPMI-FM中)在細胞培養(yǎng)箱中用1jil雙(乙酰氧基甲基)2，2':6，，2，，-三聯(lián)吡，定-6，6，，-二羧酸(bis(acetoxymethyl)2，2，:6，，2，，-terpyridine-6，6，，-dicarboxylate，BATDA)溶液于37。C標記25分鐘。細胞用10mlRPMI-FM洗滌4次，以200xg制動旋轉(zhuǎn)10分鐘。之后，將細胞調(diào)整至lxl()5個細胞/ml的濃度。在圓底板的每個孔中涂布相當于50pl體積的5,000個細胞。添加處于50pl細胞培養(yǎng)基中的HuMAb抗體，終濃度范圍為25-0.1ng/ml。隨后，以25:1范圍的E:T比添加50pl效應細胞，即從全血中新鮮分離的PBMC或從白細胞層純化的效應細胞。板立即以200xg制動離心1分鐘，于37。C孵育2小時。孵育后，細胞以200xg10分鐘旋沉，將20pl上清液轉(zhuǎn)移到Optiplate96-F微量滴定板中。添加200jil銪溶液(室溫)，混合物在搖床上孵育15分鐘。利用來自珀金埃爾默公司(PerkinElmer)的EU-TDA方案在時間分辨熒光計中測量所產(chǎn)生的熒光。ADCC的細胞裂解幅度表達為占去污劑裂解靶細胞中TDA最大釋放量[已針對相應靶細胞中的TDA自發(fā)釋放進行了校準的百分比。作為顯示"無ADCC，，抗體參比標準使用的是抗KLH(鑰孔戚血藍蛋白)(單克隆)抗體或從大約35.000個供體分離的IgG混合物("Redimune")。利用75%無巖藻糖的抗IGF-IR抗體作為陽性對照。根據(jù)本發(fā)明的抗體表現(xiàn)出的TDA釋放處于標準抗體TDA釋放3xSD的范圍內(nèi)(圖1)。權(quán)利要求1.人IgG1或IgG3型抗體，所述抗體在Asn297處被糖鏈糖基化，其特征在于在所述糖鏈內(nèi)巖藻糖的量至少為99％，此外，NGNA的量為1％或以下，和/或N-末端α-1，3-半乳糖的量為1％或以下。2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其特征在于NGNA的量為0.5%或以下。3，根據(jù)權(quán)利要求1或2的抗體，其特征在于N-末端a-l,3-半乳糖的量3根據(jù)權(quán)利要求1或2的抗體，其特征在于N-末端a-1，3-半乳糖的量為0.5%或以下。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的抗體，其特征在于所述抗體是嵌合、人源化或人抗體。5.能夠重組表達人IgGl或IgG3型抗體的CHO細胞，所述抗體在Asn297處被糖鏈糖基化，其特征在于在所述糖鏈內(nèi)巖藻糖的量至少為99%,此外，NGNA的量為1%或以下，和/或N-末端a-l，3-半乳糖的量為1%或以下。6.根據(jù)權(quán)利要求5的CHO細胞，其特征在于所述細胞包括兩個DHFR等位基因缺失。7.CHO細胞系DSMACC2795。8.根據(jù)權(quán)利要求1至5的抗體用于人類醫(yī)療的用途。9.根據(jù)權(quán)利要求1至5的抗體用于制備藥物的用途。10.根據(jù)權(quán)利要求1至5的抗體在制備用于免疫抑制、用以治療T細胞介導的紊亂、自身免疫紊亂、傳染病、癌病的藥物中的用途。11.藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1至5的抗體。12.選擇用于重組生產(chǎn)人IgGl或IgG3型單克隆抗體的CHO細胞的方法，所述抗體在Asn297處被糖鏈糖基化，其特征在于在所述糖鏈內(nèi)巖藻糖的量至少為99。/c)，此夕卜，NGNA的量為1%或以下，和/或N-末端a-l，3-半乳糖的量為1。/?；蛞韵?，所述方法包括在DHFR選擇壓力下培養(yǎng)用IgGl或lgG3抗體轉(zhuǎn)染的CHO細胞，挑取單個的克隆，擴增所述克隆，選擇產(chǎn)生本發(fā)明糖基化模式抗體的克隆。13.根據(jù)權(quán)利要求5至7的CHO細胞用于重組生產(chǎn)單克隆抗體的用途。14.在根據(jù)權(quán)利要求5至7的CHO細胞中重組生產(chǎn)單克隆抗體的方法o全文摘要本發(fā)明提供了人IgG1或IgG3型抗體及其用途，所述抗體在Asn297處被糖鏈糖基化，其特征在于所述糖鏈內(nèi)巖藻糖的量至少為99％，此外，NGNA的量為1％或以下，和/或N-末端α-1，3-半乳糖的量為1％或以下。文檔編號C07K16/28GK101460522SQ200780012678公開日2009年6月17日申請日期2007年4月10日優(yōu)先權(quán)日2006年4月11日發(fā)明者D·羅伊施,K-P·金克勒,R·舒馬赫,S·漢森申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司