專利名稱：：針對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ受體的抗體及其應(yīng)用的制作方法針對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子I受體的抗體及其應(yīng)用本發(fā)明涉及針對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子I受體(IGF-IR)的抗體，制備它們的方法，包含所述抗體的藥物組合物及其應(yīng)用。胰島素樣生長(zhǎng)因子I受體(IGF-IR,EC2.7.112，CD221抗原)屬于跨膜蛋白酪氨酸激酶的家族(LeRoith，D.，等，Endocrin.Rev(內(nèi)分泌綜述).16(1995)143-163;和Adams，T.E.，等，Cell.Mol.LifeSci(細(xì)胞分子生命科學(xué)).57(2000)1050-1093)。IGF-IR高親和力地結(jié)合IGF-I并且在體內(nèi)激發(fā)對(duì)這種配體的生理響應(yīng)。IGF-IR還結(jié)合IGF-II,但親和性稍低。IGF-IR的過(guò)量表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞的致瘤性轉(zhuǎn)化并且存在IGF-IR涉及細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化的證據(jù)，因此其是一個(gè)開(kāi)發(fā)治療癌癥的治療劑的有用靶標(biāo)(Adams，T.E.,等，Cell.Mol丄ifeSci(細(xì)胞分子生命科學(xué)).57(2000)1050-1093)。針對(duì)IGF-IR的抗體在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的，并且在體外和體內(nèi)對(duì)它們的抗腫瘤效果進(jìn)行了研究(Benini,S.，等，Clin.CancerRes(臨床癌癥研究).7(2001)1790-1797;Scotlandi,K.,等，CancerGeneTher(癌癥基因治療),9(2002)296-307;Scotlandi,K.，等，Int.J.Cancer(國(guó)際癌癥雜志)101(2002)11-16;Brimetti,A.,等，Biochem.Biophys.Res.Commun(生物化學(xué)生物物理研究通訊).165(1989)212-218;Prigent,S.A.,等，J.Biol.Chem(生物化學(xué)雜志).265(1990)9970-9977;Li,S丄.，等，CancerImmunol.Immunother.49(2000)243-252;Pessino，A.,等，Biochem.Biophys.Res.Commun(生物化學(xué)生物物理研究通訊).162(1989)1236-1243;Surinya,K.H.,等，J.Biol.Chem(生物化學(xué)雜志).277(2002)16718-16725;Soos，M.A.,等，J,Biol.Chem(生物化學(xué)雜志).，267(1992)12955-12963;Soos,M.A.,等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào))86(1989)5217-5221;O'Brien,R.M.,等，EMBOJ.6(1987)4003-4010;Taylor,R.，等，Biochem.丄242(1987)123-129;Soos，M.A"等，Biochem.J.235(1986)199-208;Li，S丄.，等，Biochem.Biophys.Res.Commun(生物化學(xué)生物物理研究通訊).196(1993)92-98;Ddafontaine，P.,等，J.Mol.Cell.Cardiol.26(1994)1659-1673;Kull,F.C.Jr.,等J.Biol.Chem(生物化學(xué)雜志).258(1983)6561-6566;Morgan,D.O.，和Roth,R.A.，Biochemistry(生物化學(xué))25(1986)1364-1371;Forsayeth,J.R.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào))84(1987)3448-3451;Schaefer,E.M.,等，J.Biol.Chem(生物化學(xué)雜志).265(1990)13248-13253;Gustafson,T.A.，和Rutter，W丄，J.Biol.Chem(生物化學(xué)雜志).265(1990)18663-18667;Hoyne，RA.,等，F(xiàn)EBSLett.469(2000)57-60;Tulloch，P.A.，等，J.Struct.Biol(結(jié)構(gòu)生物學(xué)雜志).125(1999)11-18;Rohlik，Q.T.,等，Biochem.Biophys.Res.Comm(生物化學(xué)生物物理研究通訊).l49(1987)276-281;禾BKalebic，T.，等，CancerRes(癌癥研究).54(1994)5531-5534;Adams,T.E.，等，Cell.Mol.LifeSci(細(xì)胞分子生命科學(xué)).57(2000)1050-1093;Dricu，A.,等，Glycobiology(糖生物學(xué))9(1999)571-579;Kanter-Lewensohn,L.，等，MelanomaRes(黑素瘤研究).8(1998)389-397;Li,S丄.，等，CancerImmunol.Immunother,49(2000)243-252)。針對(duì)IGF-IR的抗體還描述于許多其它出版物中，例如Arteaga，C丄.，等，BreastCancerRes(乳腺癌研究).Treatment(治療)22(1992)101-106;和Hailey,J.，等，Mol.CancerTher(分子癌癥治療).1(2002)1349-1353。具體地，將針對(duì)IGF-IR的稱為aIR3的單克隆抗體廣泛應(yīng)用于研究IGF-IR介導(dǎo)的過(guò)程禾MGF-I介導(dǎo)的疾病諸如癌癥的研究中。a-111-3在1<:1111，F(xiàn).C.,J.Biol.Chem(生物化學(xué)雜志).258(1983)6561-6566中有所描述。同時(shí)，已經(jīng)公開(kāi)了約百篇涉及alR3的研究及其治療應(yīng)用的出版物，涉及alR3單獨(dú)和與細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑諸如多柔比星和長(zhǎng)春新堿一起的抗腫瘤效果。aIR3是一種鼠單克隆抗體，已知其抑制IGF-I與IGF受體的結(jié)合但是不抑制IGF-II與IGF-IR的結(jié)合。高濃度的aIR3刺激腫瘤細(xì)胞增殖和IGF-IR的磷酸化(Bergmann，U.，等，CancerRes(癌癥研究).55(1995)2007-2011;Kato，H.，等，J.Biol.Chem(生物化學(xué)雜志).268(1993)2655-2661)。存在其它抗體(例如，1H7，Li,S丄.，等，CancerImmunol.Immunother.49(2000)243-252)，與抑制IGF-I的結(jié)合比較，其更有效抑制IGF-II與IGF-IR的結(jié)合。抗體以及它們的特性和性狀的現(xiàn)有技術(shù)的概要在Adams,T.E.,等.，Cell.Mol丄ifeSci(細(xì)胞分子生命科學(xué)).57(2000)1050-1093中有所描述。描述在現(xiàn)有技術(shù)中的大多數(shù)抗體起源自小鼠。如在現(xiàn)有技術(shù)中眾所周知的，在沒(méi)有經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的改變諸如嵌合化或人源化的情況下，這些抗體對(duì)于治療人患者是沒(méi)有作用的?；谶@些缺陷，在治療人患者中，明顯優(yōu)選將人抗體作為治療人患者的治療劑。在現(xiàn)有技術(shù)中，人抗體是眾所周知的(vanDijk,M.A"和vandeWinkel,J.G,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)?；谶@項(xiàng)技術(shù)，可以制備針對(duì)許多種類靶目標(biāo)的人抗體。針對(duì)IGF-IR的人抗體的實(shí)例在WO02/053596,WO2004071529,WO2005016967WO2006008639,US20050249730,US20050084906,WO2005058967,WO2006013472,US20030165502,WO2005082415,WO2005016970,WO03106621,WO04083248,WO2003100008,WO2004087756,WO2005005635和WO2005094376中有所描述。但是，對(duì)于需要抗腫瘤治療的患者而言，仍然需要具有令人信服的益處的針對(duì)IGF-IR的抗體。簡(jiǎn)而言之，與患者有關(guān)的益處是通過(guò)用抗腫瘤發(fā)生藥治療使腫瘤生長(zhǎng)減少，并使其進(jìn)展時(shí)間明顯延長(zhǎng)。Routier,F.H.等，GlycoconjugateJ(糖綴合物雜志).14(1997)201-207報(bào)道在CHO-DUKX細(xì)胞中表達(dá)的人源化IgGl抗體的糖基化作用模式。這種抗體顯示0.8:3.0的Fuc:Man的摩爾比，它表示80%的巖藻糖基化比例。Niwa,R.等，J.Immunol.Methods(免疫方法雜志)306(2005)151-160報(bào)道在CHODG44中重組生產(chǎn)的抗CD20IgGl和lgG3抗體巖藻糖基化分別為卯％和91%。Mimura,Y.等，J.Immunol.Methods(免疫方法雜志)247(2001)205-216報(bào)道丁酸鹽提高CHO-Kl細(xì)胞中的人嵌合IgG的生產(chǎn)，同時(shí)保持功能和糖形模式。寡糖模式顯示相當(dāng)含量的非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)。Raju,T.S.,BioProcessInternational1(2003)44-53報(bào)道了表達(dá)系統(tǒng)糖基化作用變化對(duì)于治療性免疫球蛋白生物學(xué)活性的影響和命名法。Ma,S.等，Anal.Chem.71(1999)5185-5192報(bào)道了利妥昔單抗的糖類分析。利妥昔單抗顯示9-10%的巖藻糖基化(Niwa，R.等，J.Immunol.Methods(免疫方法雜志)306(2005)151-160)。Fujii,S.,J.Biol.Chem(生物化學(xué)雜志)265(1990)6009-6018報(bào)道牛IgG包括大約11%的非巖藻糖基化IgG。Mizuochi,T.,J.Immunol(免疫學(xué)雜志).129(1982)2016-2020報(bào)道人IgG為大約14。/。非巖藻糖基化。Bergwerff，A.A.，GlycoconjugateJ(糖綴合物雜志).12(1995)318-330報(bào)道在小鼠SP2/0中生產(chǎn)的抗體包含大量的N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NGNA傳糖。Nahrgang,S.等，在AnimalCellTechnology:ProductsfromCells，CellsasProducts(動(dòng)物細(xì)胞技術(shù):來(lái)自細(xì)胞的產(chǎn)物，細(xì)胞作為產(chǎn)物)中，Bernard,A.等(eds.),KluwerAcademicPublishers,Dordrecht,NL，(1999)第259-261頁(yè)，報(bào)道了IgGl的CHO表達(dá)，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)少量的全部(overall)糖基化作用。Lund,J.等，Mol,Immunol.(分子免疫學(xué))30(1993)741-748報(bào)道了在小鼠轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞中重組生產(chǎn)小鼠-人嵌合抗體。IgGl抗體非巖藻糖基化的量為13%。Patd,T.P.，等，Biochem.J.(生物化學(xué)雜志)285(1992)839-845報(bào)道了來(lái)自雜交瘤細(xì)胞和小鼠腹水的抗體的糖基化作用。NiwaR.等，J.Immunol.Methods(免疫學(xué)方法雜志)306(2005)151-160,報(bào)道在CHODG44中的重組生產(chǎn)之后CD20IgGl抗體的巖藻糖基化為91%，而Mori，K.等，Biotech.Bioeng(生物技術(shù)生物工程).88(2004)卯1-908報(bào)道巖藻糖基化為94%。Davies，J.，等，Biotechnol.Bioeng(生物技術(shù)生物工程).74(2001)288-294報(bào)道糖形改變的抗體的表達(dá)導(dǎo)致ADCC的提高。Shedey，D.M.,等，Anal.Biochem.247(1997)102-110比較了不同表達(dá)系統(tǒng)中的抗體糖基化作用。Shields,R丄.，等,J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)277(2002)26733-26740報(bào)道人IgGlFc上巖藻糖的缺失提高了FqRin結(jié)合和ADCC。約90。/。巖藻糖基化的抗Her2抗體也顯示相當(dāng)大量的ADCC。Zhu，L.,等，NatureBiotechnol(自然生物技術(shù)).23(2005)1159-1169報(bào)道了在雞蛋中生產(chǎn)人抗體。發(fā)明概述本發(fā)明包括一種抗體，其結(jié)合IGF-IR,是人IgGl或IgG3型并且在Asn297上被糖鏈所糖基化，所述抗體特征在于所述糖鏈內(nèi)巖藻糖的量為至少98%("完全巖藻糖基化"，優(yōu)選形式見(jiàn)下面)，此外NGNA的量為1%或更少和/或N末端a-l,3-半乳糖的量為1%或更少。按照本發(fā)明"量"意指糖鏈內(nèi)Asn297上所述糖的量，涉及G0，Gl，G2(無(wú)甘露糖(4和5))之和為100%并且如實(shí)施例3中所計(jì)算的那樣。按照本發(fā)明可提供結(jié)合IGF-IR的抗體，其甚至具有99.4%或更多，99.5%或更多或99.9%或更多的巖藻糖基化。優(yōu)選地NGNA的量為0.5%或更少，更加優(yōu)選0.1%或更少，甚至不可被LCMS(液相色譜/質(zhì)譜)檢測(cè)到。優(yōu)選地N末端a-l，3-半乳糖的量為0.5%或更少，更加優(yōu)選0.1%或更少，甚至不可被LCMS檢測(cè)到。優(yōu)選地糖鏈顯示如下特征N-連接的聚糖附于抗體的Asn297上，所述抗體結(jié)合重組表達(dá)在CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞中的IGF-IR。優(yōu)選地所述CHO細(xì)胞是這樣的CHO細(xì)胞，其包含刪除(例如DG44)或兩種DHFR等位基因的功能性失活或一種DHFR等位基因的刪除以及第二種DHFR等位基因的功能性失活(例如DXBll)。優(yōu)選地所述抗體是單克隆抗體。優(yōu)選地所述抗體是嵌合的，人源化的或人抗體。優(yōu)選地本發(fā)明包括完全巖藻糖基化抗體，其結(jié)合IGF-IR并抑制IGF-1和IGF-II與IGF-IR的結(jié)合，特征是所述抗體顯示一種或多種選自由下列組成的組的特征a)顯示其對(duì)IGF-I與IGF-IR結(jié)合的抑制的105。值與其對(duì)IGF-II與IGF-IR結(jié)合的抑制的K^值的比率為1:3-3:1，b)當(dāng)與沒(méi)有所述抗體的這種測(cè)定比較時(shí)，其在5nM的濃度上，在使用HT29細(xì)胞的細(xì)胞磷酸化測(cè)定中，抑制至少80%，優(yōu)選地至少90%的IGF-IR磷酸化，所述HT29細(xì)胞在包含0.5%的熱滅活胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基中，c)當(dāng)與沒(méi)有所述抗體的這種測(cè)定比較時(shí)，在使用3T3細(xì)胞的細(xì)胞磷酸化測(cè)定中，其在10PM的濃度上沒(méi)有顯示如PKB磷酸化所測(cè)量的IGF-IR的刺激活性(無(wú)信號(hào)傳導(dǎo)，無(wú)IGF-1模擬活性)，所述3T3細(xì)胞在包含0.5。/。的熱滅活胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基中提供400,000-600，000分子IGF-IR/細(xì)胞，d)在向細(xì)胞中加入抗體后24小時(shí)在腫瘤細(xì)胞(例如HT29)上表達(dá)的IGF-1R下調(diào)50%或更多。按照本發(fā)明的抗體顯示了對(duì)于需要抗腫瘤治療的患者的益處并且使腫瘤生長(zhǎng)減少以及明顯延長(zhǎng)進(jìn)展時(shí)間。按照本發(fā)明的抗體具有新穎性和創(chuàng)造性的特性，其給患有與IGF失調(diào)有關(guān)的疾病，特別是腫瘤疾病的患者帶來(lái)了益處。按照本發(fā)明的抗體，其特征在于上述特性。令人驚奇地，按照本發(fā)明的抗體("完全巖藻糖基化抗體")，并不導(dǎo)致ADCC(抗體依賴型細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)(在來(lái)自參照標(biāo)準(zhǔn)抗體(針對(duì)匙孔血藍(lán)蛋白的抗體，KLH抗體)的3xSD(標(biāo)準(zhǔn)偏差)內(nèi)，如實(shí)施例中所描述的ADCC測(cè)定中所示)。優(yōu)選地所述抗體特異性結(jié)合IGF-IR,以上述比率抑制IGF-I和IGF-II與IGF-IR的結(jié)合，是IgGl同種型，以及甚至在其ICs。值的200倍濃度上在IGF-IR過(guò)量表達(dá)細(xì)胞中沒(méi)有激活I(lǐng)GF-IR信號(hào)傳導(dǎo)。當(dāng)被用作治療劑時(shí)，結(jié)合IGF-1R，不具有"IGF-I模擬活性"的組合以"完全巖藻糖基化"的抗體提供強(qiáng)大的益處。優(yōu)選地，在5nM的濃度上，按照本發(fā)明的抗體完全抑制腫瘤細(xì)胞中由IGF-I介導(dǎo)的IGF-IR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。下面定義多肽的優(yōu)選核酸，所述多肽能夠與各個(gè)其它的抗體鏈一起組配成按照本發(fā)明的抗體a)包括作為CDRs的SEQIDNO:1或3的CDR1(氨基酸31-35),CDR2(氨基酸50-66)和CDR3(氨基酸99-107)的抗體重鏈；b)包括作為CDRs的SEQIDNO:2或4的CDR1(氨基酸24-34),CDR2(氨基酸50-56)和CDR3(氨基酸89-98)的抗體輕鏈。優(yōu)選地所述抗體是單克隆抗體，并且除此之外，是嵌合抗體(人的恒定鏈)，人源化的抗體并且特別優(yōu)選地是人抗體。優(yōu)選地所述抗體與抗體18競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人IGF-IR(EC2.7丄112，SwissProtP08069)。優(yōu)選地所述抗體的特征還在于親和性是10—Sm(Kd)或更少，優(yōu)選地是約ict9-io"3m。優(yōu)選地所述抗體不顯示可檢測(cè)到的濃度依賴性的對(duì)胰島素與胰島素受體結(jié)合的抑制。優(yōu)選地所述抗體是IgGl型。和載體處理的動(dòng)物比較，在相關(guān)異種移植腫瘤模型中，按照本發(fā)明的抗體相當(dāng)長(zhǎng)地延長(zhǎng)了進(jìn)展時(shí)間并且減少了腫瘤的生長(zhǎng)。所述抗體優(yōu)選地以對(duì)IGF-I和IGF-II大約等同的方式，在體外和體內(nèi)抑制了IGF-I和IGF-II與IGF-IR的結(jié)合。優(yōu)選地，按照本發(fā)明的抗體包括下列序列作為互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs):a)包括作為CDRs的SEQIDNO:1或3的CDR1(氨基酸31-35)，CDR2(氨基酸50-66)和CDR3(氨基酸99-107)的抗體重鏈；b)包括作為CDRs的SEQIDNO:2或4的CDRl(氨基酸24-34)，CDR2(氨基酸50-56)和CDR3(氨基酸89-98)的抗體輕鏈。按照本發(fā)明的抗體的重鏈的優(yōu)選可變區(qū)和CDRs，特別是CDR3由<IGF-1R〉HUMAB克隆18(抗體18)和<IGF-1R〉HUMAB克隆22(抗體22)提供，保藏在德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSMZ))，德國(guó)。細(xì)胞系保藏號(hào)保藏曰期<IGF-1R>HUMAB克隆18DSMACC258710.04.2003<IGF-1R>HUMAB克隆22DSMACC259409.05.2003這些抗體在WO2005/005635中詳細(xì)描述。按照本發(fā)明的抗體的重鏈的其它優(yōu)選可變區(qū)和CDRs，特別是CDR3由〈IGF-1R〉HuMab克隆la(抗體1A,Ab1A或Ak1A)，<IGF-1R>HuMab克隆23(抗體23),和<IGF-1R>HuMab-克隆8(抗體8)提供，保藏在德意志微生物中心(DeutscheSammlungvonMikrorganismenundZellkulturenGmbH(DSMZ))，Germany:_<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>這些抗體在WO2004/087756中詳細(xì)描述。本發(fā)明還提供重組生產(chǎn)這些抗體的方法。本發(fā)明還提供治療癌癥的方法，其包括向被診斷患有癌癥(因此需要抗腫瘤治療)的患者施用有效量的按照本發(fā)明的針對(duì)IGF-IR的拮抗抗體。所述抗體可以以藥物組合物的形式單獨(dú)施用，或備選地與細(xì)胞毒性的治療諸如放射療法或細(xì)胞毒性試劑或其前藥結(jié)合進(jìn)行施用。本發(fā)明還包括按照本發(fā)明的抗體用于癌癥治療以及制備按照本發(fā)明的藥物組合物的用途。此外，本發(fā)明包括制備按照本發(fā)明的藥物組合物的方法。本發(fā)明還包括一種藥物組合物，其包含藥物有效量的按照本發(fā)明的抗體，以及任選地，對(duì)于藥用的抗體的制劑是有用的緩沖劑和/或佐劑。本發(fā)明還提供藥物組合物，其在藥用載體中包含這種抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將藥物組合物包含在制品的物品中或試劑盒中。本發(fā)明還包括制備按照本發(fā)明的重組人抗體的方法，其特征在于在CHO宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼結(jié)合IGF-1R的抗體的核酸，以及從所述細(xì)胞中回收所述抗體，所述宿主細(xì)胞將所述抗體完全巖藻糖基化。本發(fā)明還包括可通過(guò)這種重組方法獲得的抗體附圖簡(jiǎn)述圖1是顯示在本發(fā)明的抗體和在對(duì)照抗體和對(duì)比抗體中的ADCC活性或其缺乏。發(fā)明詳述術(shù)語(yǔ)"抗體"涵蓋各種形式的抗體，其包括但不限于只要保留了按照本發(fā)明的性狀特性的整個(gè)抗體、抗體片段、人抗體、人源化抗體以及遺傳工程化的抗體。"抗體片段"包括全長(zhǎng)抗體的部分，通常至少是抗原結(jié)合部分或其可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括雙抗體、單鏈抗體分子、免疫毒素和由抗體片段形成的多特異性抗體。用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"指專一氨基酸組成(singleaminoacidcomposition)的抗體分子的制劑。因此，術(shù)語(yǔ)"人單克隆抗體"指顯示單一結(jié)合特異性的抗體，其具有衍生自人胚系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)域。術(shù)語(yǔ)"嵌合抗體"指一種單克隆抗體，其包括來(lái)自一種來(lái)源或物種的可變區(qū)域，即結(jié)合區(qū)域以及來(lái)源自不同來(lái)源或物種的恒定區(qū)域的至少一部分，通常通過(guò)重組DNA技術(shù)進(jìn)行制備。特別優(yōu)選包括鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體。這種鼠/人嵌合抗體是表達(dá)免疫球蛋白基因的產(chǎn)物，所述免疫球蛋白基因包括編碼鼠免疫球蛋白可變區(qū)的DNA區(qū)段和編碼人免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA區(qū)段。本發(fā)明涵蓋的"嵌合抗體"的其它形式是其中類或亞類己經(jīng)經(jīng)過(guò)從初級(jí)抗體的修飾或改變的那些。也將這種"嵌合"抗體稱作"類別轉(zhuǎn)換抗體"。制備嵌合抗體的方法包括目前在本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)重組DNA和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。見(jiàn),例如，Morrison,S.L.,等,Proc.Natl.AcadSci.USA81(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào))(1984)6851-6855;美國(guó)專利號(hào)5,202,238和5,204,244。術(shù)語(yǔ)"人源化抗體"指其中的框架或"互補(bǔ)決定區(qū)"(CDR)已經(jīng)被修飾從而包括與親本免疫球蛋白的特異性不同的免疫球蛋白的CDR的抗體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將鼠CDR移植到人抗體的框架區(qū)域以制備所述"人源化抗體"。見(jiàn)，例如，Riechmann，L.，等，Nature(自然)332(1988)323-327;禾HNeuberger，M.S.，等，Nature314(1985)268-270。特別優(yōu)選的CDRs對(duì)應(yīng)于識(shí)別上述特別指出的嵌合和雙功能抗體的抗原的那些代表性序列。用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"人抗體"意欲包括具有來(lái)自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。可變的重鏈優(yōu)選地來(lái)自種系序列DP-50(GenBankL06618)并且可變輕鏈優(yōu)選地來(lái)自種系序列L6(GenBankX01688)或可變重鏈優(yōu)選地衍生自DP61(GenBankM99682)，并且可變輕鏈來(lái)自種系序列L15(GenBankK01323)。抗體的恒定區(qū)是人IgGl型的恒定區(qū)。這些區(qū)域可以是異型的并且在例如Johnson,G.，禾QWu,T.T.,NucleicAcidsRes(核酸研究).28(2000)214-218以及其參考的數(shù)據(jù)庫(kù)中有所描述。術(shù)語(yǔ)"重組人抗體"指以重排方式具有來(lái)自人胚系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。按照本發(fā)明的重組人抗體已經(jīng)經(jīng)過(guò)體內(nèi)體細(xì)胞高變。因此，重組抗體的VH和VL區(qū)域的氨基酸序列是盡管來(lái)自和涉及人胚系VH和VL序列，但可能在體內(nèi)非天然存在于人抗體胚系所有組成成分中的序列。用于本文時(shí)，"結(jié)合"指抗體以約1(T"-1(TSM(KD)，優(yōu)選地約10—13-10—9M的親和性結(jié)合于IGF-IR。用于本文時(shí)"核酸分子"意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但是優(yōu)選地是雙鏈DNA。IgGl或lgG3型的人恒定結(jié)構(gòu)域詳細(xì)描述于KabatE.A.等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫目的蛋白質(zhì)序列)，第5版.PublicHealthService(公眾健康服務(wù))，NationalInstitutesofHealth(國(guó)立健康研究所)，Bethesda,MD.(1991)和Brliggemann,M.,等，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361;Love,T.W.,等,MethodsEnzymol(酶學(xué)方法).178(1989)515-527。實(shí)例顯示于SEQIDNOS:5—8。其它有用且優(yōu)選的恒定結(jié)構(gòu)域是可以從用于本發(fā)明以DSMZ保藏的雜交瘤細(xì)胞系中獲得的抗體的恒定結(jié)構(gòu)域。IgGl或IgG3型的恒定結(jié)構(gòu)域在Asn297上被糖基化。按照本發(fā)明的"Asn297"意指位于Fc區(qū)中大約位置297上的氨基酸天冬酰胺；基于抗體的較小序列變化，Asn297還可以位于上游或下游一些氨基酸上(通常不超過(guò)±3個(gè)氨基酸)。例如，在一種按照本發(fā)明的抗體中，"Asn297"位于氨基酸位置298上。人IgGl或IgG3的糖基化作用發(fā)生在Asn297上，因?yàn)楹诵膸r藻糖基化雙觸角復(fù)合物寡糖糖基化作用以多達(dá)2個(gè)Gal(半乳糖)殘基終止。根據(jù)末端Gal殘基的量，這些結(jié)構(gòu)被命名為GO,Gl(al,6或al,3)或G2聚糖殘基(Raju，T.S.,BioProcessInt1(2003)44-53)?？贵wFc部分的CHO型糖基化作用被例如Routier,RH.,GlycoconjugateJ.(糖綴合物雜志)14(1997)201-207所描述。用于本文時(shí)，"可變區(qū)"(輕鏈的可變區(qū)(VL)，重鏈的可變區(qū)(VH))表示直接涉及抗體與抗原結(jié)合的每個(gè)輕鏈和重鏈對(duì)?？勺?nèi)溯p鏈和重鏈的結(jié)構(gòu)域具有相同的一般結(jié)構(gòu)并且每個(gè)結(jié)構(gòu)域包括4個(gè)框架區(qū)域(FR)，其序列是廣泛保守的，并通過(guò)三個(gè)"高變區(qū)"(或互補(bǔ)決定區(qū)，CDRs)連接。所述框架區(qū)域采取P折疊構(gòu)象并且所述CDRs可以形成連接P折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。通過(guò)框架區(qū)域，每條鏈的CDRs保持在它們的三維結(jié)構(gòu)中并且與來(lái)自其它鏈的CDRs—起形成抗原結(jié)合部位?？贵w的重鏈和輕鏈CDR3區(qū)域在按照本發(fā)明的抗體的結(jié)合特異性/親和性中具有特別重要的作用，并且因此提供本發(fā)明的另外的目的。用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"高變區(qū)"或"抗體的抗原結(jié)合部分"指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。高變區(qū)包括來(lái)自"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基。"框架"或"FR"區(qū)域是除本文詳細(xì)說(shuō)明的高變區(qū)殘基之外的那些可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域。因此，抗體的輕鏈和重鏈包括從N端到C端的結(jié)構(gòu)域FR1,CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特別地，重鏈的CDR3是最有助于抗原結(jié)合的區(qū)域。按照KabatE.A.等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫目的蛋白質(zhì)序列)，第5版，PublicHealthService(公眾健康服務(wù))，NationalInstitutesofHealth(國(guó)立健康研究所)，Bethesda，MD.(1991))的標(biāo)準(zhǔn)定義禾卩/或來(lái)自"高變環(huán)"的那些殘基來(lái)確定CDR和FR區(qū)域。用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"與IGF-IR結(jié)合"意味著在體外試驗(yàn)中，優(yōu)選地在結(jié)合試驗(yàn)中進(jìn)行抗體與IGF-IR的結(jié)合，在所述試驗(yàn)中，所述抗體與表面結(jié)合并且通過(guò)表面等離子共振(SurfacePlasmonResonance)(SPR)來(lái)測(cè)量與IGF-IR的結(jié)合。結(jié)合意味著1(T8M或更少，優(yōu)選地10—13-1(T9M的結(jié)合親和性(Ko)。通過(guò)BIAcore分析(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala,Sweden)可以石開(kāi)究與IGF-IR的結(jié)合。通過(guò)術(shù)語(yǔ)ka(來(lái)自抗體/抗原復(fù)合物的抗體的關(guān)聯(lián)的速率常數(shù))、kd(解離常數(shù))以及KD(kd/ka)來(lái)定義結(jié)合的親和性。按照本發(fā)明的抗體顯示10^M或更少的KD。IGF-I和IGF-II與IGF-IR的結(jié)合還受到按照本發(fā)明的抗體的抑制。在進(jìn)行腫瘤細(xì)胞上IGF-I/IGF-II與IGF-IR的結(jié)合的試驗(yàn)中，測(cè)量抑制，表示為IC,在實(shí)施例7中描述了這種試驗(yàn)。在這種試驗(yàn)中，在不增加和增加抗體的濃度情況下，測(cè)量與所述腫瘤細(xì)胞(例如HT29)表面提供的IGF-IR結(jié)合的放射性標(biāo)記的IGF-I或IGF-II或IGF-IR結(jié)合片段的量。對(duì)于IGF-I和IGF-II與IGF-IR的結(jié)合而言，按照本發(fā)明的抗體的IC5。值不超過(guò)2nM并且IGF-I/IGF-II與IGF-IR的結(jié)合的1<:5()值的比率是約1:3-3:1。測(cè)量的IC5o值是至少三次獨(dú)立測(cè)量的平均值或中位值。單個(gè)ICso可不在這個(gè)范圍內(nèi)。用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"抑制IGF-I和IGF-II與IGF-IR的結(jié)合"指在體外試驗(yàn)中，抑制I125標(biāo)記的IGF-I或IGF-II與存在于HT29(ATCCHTB-38)腫瘤細(xì)胞表面的IGF-IR的結(jié)合。抑制意味著ICs。值為2nM或更低。術(shù)語(yǔ)"IGF-IR表達(dá)細(xì)胞"指過(guò)量表達(dá)IGF-I受體到約至少20,000受體/細(xì)胞的這種細(xì)胞。這些細(xì)胞是，例如，腫瘤細(xì)胞系諸如NCIH322M或HT29，或在用IGF-IR的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后，過(guò)量表達(dá)IGF-IR的細(xì)胞系(例如3T3ATCCCRL1658)。按照Lammers，R.,等EMBOJ.8(1989)1369-1375來(lái)測(cè)量每個(gè)細(xì)胞的受體的量。術(shù)語(yǔ)"抑制IGF-IR磷酸化"指一種細(xì)胞磷酸化測(cè)定，其在包含0.5%熱滅活胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基中使用提供400,000-600,000分子IGF-IR/細(xì)胞的3T3細(xì)胞，屆時(shí)與沒(méi)有所述抗體的這種測(cè)定比較。使用特異于酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)的抗體通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法來(lái)檢測(cè)磷酸化。這種測(cè)定在實(shí)施例11中有所描述。通過(guò)短期加熱到56t:進(jìn)行FCS的熱滅活從而鈍化補(bǔ)體系統(tǒng)。術(shù)語(yǔ)"抑制PKB磷酸化"指一種細(xì)胞磷酸化測(cè)定，其在包含0.5%熱滅活胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基中使用提供400,000-600,000分子IGF-IR/細(xì)胞的3T3細(xì)胞，屆時(shí)與沒(méi)有所述抗體的這種測(cè)定比較。使用特異于在PKB的絲氨酸473被磷酸化的PKB的抗體(Akt1,SwissProtAcc.No.P31749)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法來(lái)檢測(cè)磷酸化。這種測(cè)定在實(shí)施例11中有所描述。術(shù)語(yǔ)"抗體-依賴型細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)"指在存在效應(yīng)細(xì)胞的情況下，通過(guò)按照本發(fā)明的抗體裂解人腫瘤靶細(xì)胞。在存在效應(yīng)細(xì)胞諸如新鮮分離的PBMC(外周血單核細(xì)胞)或來(lái)自暗黃覆蓋層(buffycoats)的純化效應(yīng)細(xì)胞，象單核細(xì)胞或NK細(xì)胞(天然殺傷細(xì)胞)的情況下，優(yōu)選地通過(guò)用按照本發(fā)明的抗體處理表達(dá)IGF-IR的細(xì)胞制劑進(jìn)行ADCC的測(cè)術(shù)語(yǔ)"IGF-I介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的完全抑制"指IGF-I介導(dǎo)的對(duì)IGF-IR的磷酸化的抑制。對(duì)于這種分析，用IGF-I對(duì)IGF-IR表達(dá)細(xì)胞，優(yōu)選地H322M細(xì)胞進(jìn)行刺激，并用按照本發(fā)明的抗體進(jìn)行處理(5nM的抗體濃度或更高是有效的)。隨后，進(jìn)行SDSPAGE，并且通過(guò)以特異于磷酸化的酪氨酸的抗體進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡法分析來(lái)測(cè)量IGF-IR磷酸化。如果在蛋白質(zhì)印跡中，明顯不能觀察到指示磷酸化的IGF-IR的條帶，則發(fā)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的完全抑制。優(yōu)選地按照本發(fā)明的抗體顯示結(jié)合于與抗體18相同的IGF-IR的表位，或者由于抗體18的結(jié)合的空間位阻，在與IGF-IR結(jié)合中被抑制。使用20-50nM濃度的固定化的抗體18和IGF-IR以及在100nM濃度上待檢測(cè)的抗體通過(guò)SPR分析可以檢測(cè)結(jié)合抑制。50%或更多的信號(hào)減少顯示所述抗體與抗體18競(jìng)爭(zhēng)。通過(guò)將抗體22用作固定化抗體，以相同的方式可以進(jìn)行這種分析。術(shù)語(yǔ)"表位"表示能夠特異性地與抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)決定簇。表位通常由分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)諸如氨基酸或糖側(cè)鏈組成，并且通常具有特異性三維結(jié)構(gòu)特性，以及特異性電荷特性。構(gòu)象和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于在變性溶劑存在下，對(duì)前者的結(jié)合而不是后者的結(jié)合丟失。按照本發(fā)明的抗體抑制IGF-IR酪氨酸磷酸化并優(yōu)選地也抑制PKB酪氨酸磷酸化到相似的程度。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地在腫瘤細(xì)胞，和腫瘤例如異種移植的腫瘤中下調(diào)IGF-IR蛋白質(zhì)水平。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地在集落形成試驗(yàn)中抑制腫瘤細(xì)胞的三維生長(zhǎng)以及抑制IGF-IR表達(dá)細(xì)胞(例如NIH3T3細(xì)胞)的增殖。使用200nmo1/1濃度的所述抗體，在胰島素受體過(guò)量表達(dá)的3T3細(xì)胞的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)分析中，優(yōu)選地按照本發(fā)明的抗體不抑制胰島素與胰島素受體的結(jié)合。通過(guò)重組方法在完全將抗體巖藻糖基化的CHO細(xì)胞中生產(chǎn)按照本發(fā)明的抗體。對(duì)于蛋白質(zhì)表達(dá)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法將編碼輕和重鏈的核酸或其片段插入表達(dá)載體中。在這些CHO細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，并從細(xì)胞中(上清液或裂解后的細(xì)胞)回收抗體?？梢酝ㄟ^(guò)這樣的方法來(lái)生產(chǎn)有用的CHO宿主細(xì)胞，其包括培養(yǎng)CHO細(xì)胞，用編碼按照本發(fā)明的抗體的核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在DHFR選擇壓力下，挑取擴(kuò)增克隆的單個(gè)克隆并選擇產(chǎn)生具有按照本發(fā)明的糖基化作用模式的抗體的克隆。優(yōu)選地至少進(jìn)行兩周，優(yōu)選地至少三周培養(yǎng)。優(yōu)選地所述CHO細(xì)胞為DG44細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"CHO細(xì)胞"包括各種形式的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，其基于兩種功能性失活的，優(yōu)選刪除的dhfr等位基因(二氫葉酸還原酶缺陷(dhfr—))。這些dhfr—細(xì)胞及其生成方法在例如Urlaub,G.等，Cell(細(xì)胞)33(1983)405-412;Chasin,L.等，Som.CellMolec.Genet.12(1986)555-556;Kolkekar,A.S.等，Biochemistry(生物化學(xué))36(1997)10901-10909中進(jìn)行描述。優(yōu)選地所述細(xì)胞是DG44細(xì)胞系。利用y射線來(lái)消除完整dhfr基因座可以產(chǎn)生這種CHOdhfr—細(xì)胞。在未突變的野生型細(xì)胞中，dhfr對(duì)于甘氨酸、嘌呤和胸苷酸的從新合成是必需的酶。這就允許在質(zhì)粒上編碼的dhfr基因被用作顯性可選擇的標(biāo)記以及基因擴(kuò)增劑來(lái)在dhfr—缺陷細(xì)胞系中表達(dá)蛋白質(zhì)。DG44細(xì)胞中的dhfr—突變是穩(wěn)定的并且是不可逆轉(zhuǎn)的。成功共轉(zhuǎn)染人IgGl或IgG3型抗體的表達(dá)載體和DHFR基因的CHO細(xì)胞將具有dhfr+表型并且能夠通過(guò)在培養(yǎng)基上培養(yǎng)克隆輕易地進(jìn)行選擇用于擴(kuò)增，所述培養(yǎng)基缺乏胸腺嘧啶脫氧核苷和次黃嘌呤并且任選地包含甲氨蝶呤(MTX)。DG44細(xì)胞是現(xiàn)有技術(shù)中眾所周知的，并且例如作為細(xì)胞系是可商購(gòu)的，例如由InvitrogenCorp.(USA)商購(gòu)。DG44細(xì)胞可以在混懸液禾口/或在無(wú)血清的培養(yǎng)基中貼附生長(zhǎng)。用于本文時(shí)，表述"細(xì)胞,""細(xì)胞系,"和"細(xì)胞培養(yǎng)物"可以交換使用并且CHOdhfr—細(xì)胞系(兩種刪除的dhfr等位基因)的所有這些命名都包括后代。因而，單詞"轉(zhuǎn)化子"和"經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞"包括原代主題細(xì)胞及源于它的培養(yǎng)物，不考慮轉(zhuǎn)移的數(shù)量。還理解由于有意或無(wú)意的突變，所有后代可能在DNA內(nèi)容上并不精確相同。包括在最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選的具有按照本發(fā)明的糖基化作用特性的不同后代。優(yōu)選地所述CHOdhfr—細(xì)胞系至少與作為一個(gè)可選擇標(biāo)記基因的DHFR—起共擴(kuò)增。例如將包含所述可選擇標(biāo)記的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體和抗體基因共轉(zhuǎn)染入受體CHO細(xì)胞中?？梢赃x擇得到的克隆并且顯示預(yù)期表型的克隆能夠表達(dá)所述抗體。其它可選擇的標(biāo)記是或可以不是顯性的。用于共轉(zhuǎn)染的其它可選擇標(biāo)記的實(shí)例包括腺苷脫氨酶(Kaufman,R丄，等，Pro"Natl.Acad.Sci.USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào))83(1986)3136-3140)，天冬酰胺合成酶(Cartier，M.,等，Mol.CellBiol.(分子細(xì)胞生物學(xué))7(1987)1623-1628)，大腸桿菌(￡.co")trpB基因和沙門氏菌屬(Sa/mo"e〃a)hisD基因(Hartman，S.C.，禾qMulligan,R.C.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào))85(1988)8047-8051),M2小鼠核糖核苷酸還原酶(Thelander，M.，禾nThelander，L.,EMBOJ.8(1989)2475-2479),人多種藥物抗性基因(Kane,S.E.,等，Gene(基因)84(1989)439-446),谷氨酰胺合成酶(Bebbington,C.R.等，DNACloning(DNA克隆)，Vol.Ill,D.M.Glover(ed.),IRLPress,pp.163-188，1987)，黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(gpt)(Mulligan，R.C"和Berg,P,,Science(科學(xué))209(1980)1422-1427)，潮霉素B(Santerre,R.R,等，Gene(基因)30(1984)147-156),新霉素基因(Southern,P.J"和Berg,P.,J.Mol.Appl.Genet.(分子應(yīng)用遺傳學(xué)雜志)1(1982)327-341)。可選擇的標(biāo)記還可以提供編碼抗體的基因可以擴(kuò)增的基礎(chǔ)。在CHO細(xì)胞系的共轉(zhuǎn)染中，載體DNAs經(jīng)常在相同位點(diǎn)整合到細(xì)胞的染色體中。因而，只使用一種可選擇標(biāo)記作為擴(kuò)增基礎(chǔ)一般情況下導(dǎo)致兩種基因拷貝數(shù)的同時(shí)增長(zhǎng)。以此方式使用的一種特定可選擇標(biāo)記是dhfr，其能夠通過(guò)使用濃度提高的MTX(甲氨蝶呤)來(lái)獲得所需擴(kuò)增。第二種優(yōu)選的可選擇標(biāo)記是GS，其允許通過(guò)加入methioninesulphoximine(MSX)進(jìn)行擴(kuò)增?？蛇x擇標(biāo)記當(dāng)然是在DNA調(diào)控元件的控制下，以便提供它們的表達(dá)。在使用dhfr作為可選擇標(biāo)記的情況下，所述調(diào)控元件優(yōu)選地是病毒來(lái)源的，諸如來(lái)自DNA腫瘤病毒。特別優(yōu)選使用SV40或腺病毒主要晚期啟動(dòng)子。在此方面特別有益的是從啟動(dòng)子上除去增強(qiáng)子元件，由此有效地"凸出(crippling)"它。這種修飾允許在甲氨蝶呤選擇的每種濃度上，與如果使用強(qiáng)啟動(dòng)子相比，提高基因擴(kuò)增水平。在使用新霉素作為可選擇標(biāo)記的情況下，合適啟動(dòng)子的實(shí)例為小鼠金屬硫蛋白啟動(dòng)子。重組制備抗體的一般方法在現(xiàn)有技術(shù)中眾所周知，并且，描述于例如，Makrides，S.C.，ProteinExpr.Purif.17(1999)183-202;Geisse，S.，等，ProteinExpr.Purif.8(1996)271-282;Kaufman,R丄，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161;Werner,R.G.，DrugRes.48(1998)870-880的綜述文獻(xiàn)中。所述抗體可以存在于整個(gè)細(xì)胞中，在上清液中，在細(xì)胞溶解產(chǎn)物中，或以部分純化或基本純化形式存在。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括堿/SDS處理、CsCl顯帶法、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳，以及其它本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)來(lái)進(jìn)行純化以去除其它細(xì)胞成分或其它污染物，例如其它細(xì)胞的核酸或蛋白質(zhì)。見(jiàn)，Ausubel,F.，等，編輯CurrentProtocolsinMolecularBiology(，現(xiàn)代分子生物學(xué)操作方法)，GreenePublishingandWileyInterscience，紐約(1987)。例如，適合于原核生物的調(diào)控序列，包括啟動(dòng)子、任選地操縱序列，和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和多腺苷酸化信號(hào)。當(dāng)核酸被置于與另外的核酸序列的功能性關(guān)聯(lián)中時(shí)，核酸被"可操作地連接"。例如，如果前序列或分泌前導(dǎo)區(qū)的DNA被表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白，所述DNA可操作地與多肽的DNA連接；如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄，其可操作地與編碼序列連接；或如果將核糖體結(jié)合部位定位以促進(jìn)翻譯，其可操作地與編碼序列連接。通常，"可操作地連接"意味著被連接的DNA序列是連續(xù)的，并且在分泌前導(dǎo)區(qū)的情況中，是連續(xù)的，并且在閱讀框中。但是，增強(qiáng)子不一定是連續(xù)的。通過(guò)在適宜限制性位點(diǎn)的連接反應(yīng)來(lái)完成連接。如果這些位點(diǎn)不存在，依照常規(guī)慣例，使用合成的寡核苷酸連接物或接頭。通過(guò)常規(guī)免疫球蛋白純化方法諸如，例如蛋白質(zhì)A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析，或親和層析來(lái)適當(dāng)?shù)貜碾s交瘤培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)胤蛛x單克隆抗體。使用常規(guī)方法，容易將編碼所述單克隆抗體的DNA和RNA從雜交瘤中分離并進(jìn)行測(cè)序。雜交瘤細(xì)胞可以作為這種DNA和RNA的來(lái)源。一旦鑒定和分離，可以將DNA插入表達(dá)載體中，然后將其轉(zhuǎn)染到不另外產(chǎn)生免疫球蛋白蛋白質(zhì)的CHO細(xì)胞中，以便在宿主細(xì)胞中獲得重組單克隆抗體的合成。本發(fā)明還涉及免疫綴合物，其包括與細(xì)胞毒性試劑諸如化療劑、毒素(例如，細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的酶促活性毒素，或其片段)、放射性活性同位素(即放射性綴合物)或細(xì)胞毒性試劑的前體藥物連接的按照本發(fā)明的抗體。上面已描述了有效用在產(chǎn)生這些免疫綴合物中的試劑?？梢允褂玫拿复倩钚远舅丶捌淦伟ò缀鞟鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來(lái)自尸sewcfomw7cwaeragz'"(wa)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、塑蓮根毒蛋白IIA鏈、a-帚曲霉素、Aleuritesfordii蛋白質(zhì)、香石竹毒蛋白質(zhì)、Phytolacaamericana蛋白質(zhì)(PAPI，PAPII,和PAP-S)、momordicacharantia抑制齊U、麻風(fēng)樹(shù)毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonariaofficinalis抑制劑、多花白樹(shù)毒蛋白、mitogdlin、局限曲菌素、酚霉素、伊諾霉素禾口tricothecenes。使用許多雙官能的蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑諸如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫酚)丙酸酯(SRDP)、iminothiolane(IT)、亞氨酸酯的雙官能衍生物；(諸如二甲基adipimidateHCL)、活性酯(諸如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)、醛(諸如戊二醛)、二-疊氮基化合物(諸如二(對(duì)-疊氮基苯甲?；?已二胺)、二-重氮化衍生物(諸如二-(對(duì)-二重氮化苯甲酰基)-ethylenediatnine)、二異氰酸酯(諸如tolyene2,6-二異氰酸酯)和雙活性的氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)制備抗體和細(xì)胞毒性試劑的綴合物。例如，可以如在Vitetta，E.S.，等，Science(科學(xué))238(1987)1098-1104)中所描述的制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳14標(biāo)記的l-異硫氰酸芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是放射性核苷酸與抗體結(jié)合的示范性螯合劑。見(jiàn)WO94/11026。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種組合物，例如，藥物組合物，其包含與藥用載體一起配制的本發(fā)明的抗體。還可以在組合療法中，即與其它試劑組合來(lái)施用本發(fā)明藥物組合物。例如，組合療法可以包括本發(fā)明的組合物與至少一種抗腫瘤試劑，像化療劑，細(xì)胞毒性劑或前體藥物或其它常規(guī)療法組合。"化療劑"是在癌癥治療中有用的化合物?；焺┑膶?shí)例包括阿霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷("Ara-C")、環(huán)磷酰胺、塞替派、泰索帝(多西他賽)、白消胺、吉西他濱、Cytoxin、泰素、甲氨蝶呤，順鉑、美法侖、長(zhǎng)春堿，博來(lái)霉素、依托泊苷、異環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C、米托蒽醌、Vincrdstine、長(zhǎng)春瑞濱、卡鉑、替尼泊苷、道諾紅霉素、洋紅霉素、氨蝶呤、放線菌素D、絲裂霉素(Mitomycins)、Esperamicins(見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4，675,187)、美法侖和其它相關(guān)的氮芥。用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞毒性試劑"指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或?qū)е录?xì)胞損傷的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)意欲包括放射性同位素、化療劑和毒素諸如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶促活性毒素或其片段。用于本申請(qǐng)時(shí)，術(shù)語(yǔ)"前體藥物"指與親本藥物相比對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較少細(xì)胞毒性的藥用活性物質(zhì)的前體或衍生物形式，并且其能夠被酶促地活化或轉(zhuǎn)化為更有活性的親本形式。見(jiàn)，例如，Wilman，DE，BiochemicalSocietyTransaction(生物化學(xué)社會(huì)學(xué)報(bào))14(1986)，375-382，和StellaVJ.等,"Prodrugs:AChemicalApproachtoTargetedDrugDelivery(前藥革巴向藥物遞送的化學(xué)方法)，"在DirectedDrugDelivery(定向藥物遞送)，BorchardtR.T.等,(編輯)，247-267頁(yè)，HumanaPress,Clifton,新澤西(1985)中。本發(fā)明的前體藥物包括，但不限于含磷酸鹽(酯)的前體藥物、含硫代磷酸鹽(酯)的前體藥物、含硫酸鹽(酯)的前體藥物、含肽的前體藥物、D-氨基酸修飾的前體藥物、糖基化的前體藥物、P-內(nèi)酰胺環(huán)前體藥物，包含任何取代的苯氧基乙酰胺的前體藥物或含任選取代的苯乙酰胺的前體藥物，可以被轉(zhuǎn)化為更具活性的無(wú)細(xì)胞毒性的藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前體藥物?？梢员谎苌鸀橛迷诒景l(fā)明中的前體藥物形式的細(xì)胞毒性藥物的實(shí)例包括但不限于上述的那些化療劑。用于本文時(shí)，"藥用載體"包括生理相容的任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延緩試劑等。優(yōu)選地，所述載體適合于靜脈內(nèi)的、肌內(nèi)的、皮下的、腸胃外的、脊柱的或表皮的施用(例如，通過(guò)注射或灌輸)。"藥用鹽"指保留抗體的所需的生物學(xué)活性并不帶來(lái)任何不需要的毒理作用的鹽(見(jiàn)例如，Berge,S.M.,等，J.Pharm.Sci(藥物科學(xué)雜志).66(1977)1-19)。將這些鹽包括在本發(fā)明中。這些鹽的實(shí)例包括酸式加成鹽和堿式加成鹽。酸式加成鹽包括從非毒性無(wú)機(jī)酸衍生的那些，諸如鹽酸鹽。通過(guò)許多本領(lǐng)域己知的各種方法可以施用本發(fā)明的組合物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，施用路徑和/或模式將取決于所需結(jié)果而變化。為了通過(guò)某些施用路徑來(lái)施用本發(fā)明化合物，用一種材料來(lái)包被化合物，或與一種材料共同施用化合物以預(yù)防其失活可能是必需的。例如，可以以適當(dāng)載體，例如脂質(zhì)體或稀釋劑來(lái)給受試者施用所述化合物。藥用稀釋劑包括鹽水和水性緩沖溶液。藥用載體包括用于即時(shí)制備滅菌的可注射溶液或分散體的滅菌水溶液或分散體和滅菌粉末。將這些介質(zhì)和試劑用于藥用活性物質(zhì)的應(yīng)用為本領(lǐng)域所知。在用于本文時(shí)，短語(yǔ)"腸胃外的施用"和"經(jīng)腸胃外施用"表示除腸內(nèi)的和局部施用以外的通常通過(guò)注射的施用模式，包括但不局限于，靜脈內(nèi)的、肌內(nèi)的、動(dòng)脈內(nèi)的、鞘內(nèi)的、囊內(nèi)的、眶內(nèi)的、心內(nèi)的、皮內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、經(jīng)氣管的、皮下的、表皮下的、關(guān)節(jié)內(nèi)的、囊下的、蛛網(wǎng)膜下的、脊柱內(nèi)的、硬膜外的、胸骨內(nèi)的注射和灌輸。這些組合物還可以包含佐劑諸如防腐劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^(guò)上述的滅菌方法以及加入各種抗細(xì)菌和抗真菌試劑，例如，對(duì)羥基苯甲酸酯類、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等都可以確保預(yù)防微生物的存在。將等滲試劑，諸如糖、氯化鈉等包括在組合物中也可能是理想的。此外，通過(guò)將延緩吸收的試劑諸如單硬脂酸鋁和明膠加入可導(dǎo)致可注射的藥用形式的延長(zhǎng)吸收。無(wú)論選擇何種施用路徑，通過(guò)為本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的常規(guī)方法，將可以以適合的水合形式和/或本發(fā)明的藥物組合物形式使用的本發(fā)明的化合物配制成可藥用劑型。對(duì)于特定患者、組合物和施用方式，本發(fā)明藥物組合物的活性成分的實(shí)際劑量水平可以變化以獲得有效實(shí)現(xiàn)理想的治療反應(yīng)而不會(huì)對(duì)患者具有毒性的活性成分的量。選定的劑量水平將取決于許多藥物動(dòng)力學(xué)因素，其包括所用的本發(fā)明特定組合物的活性，施用的路徑，施用的時(shí)間，所用的特定化合物的排泄率，治療的持續(xù)時(shí)間，與所用的特定化合物組合使用的其它藥物、化合物和/或物質(zhì)，待治療的患者的年齡、性別、體重、疾病狀況、一般健康和以前的疾病史等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾所周知的類似因素。所述組合物必須滅菌并且形成流體到組合物可以通過(guò)注射器進(jìn)行傳遞的程度。除了水之外，載體優(yōu)選是等滲緩沖鹽溶液。例如，通過(guò)應(yīng)用包衣諸如磷脂酰膽堿，通過(guò)在分散狀況下維持所需的顆粒大小，以及通過(guò)表面活性劑的使用可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在許多情況中，將等滲試劑，例如，糖，多元醇諸如甘露糖醇或山梨糖醇和氯化鈉包括在組合物中是優(yōu)選的。優(yōu)選地按照本發(fā)明的完全巖藻糖基化抗體可用于優(yōu)選地組合Erlotinib(Tarceva⑧)治療NSCLC(非小細(xì)胞肺癌)，用于優(yōu)選地組合Herceptin(曲妥單抗)治療乳腺癌，和優(yōu)選地組合吉西他濱(Gemzar⑧)治療胰腺腫瘤。提供下列實(shí)施例、附圖和序列表以協(xié)助理解本發(fā)明，在后附的權(quán)利要求中要求其實(shí)際范圍。要理解的是可以在不背離本發(fā)明精神的情況下在提出的方法中進(jìn)行修改。實(shí)施例細(xì)胞系用于生成重組IgG表達(dá)的細(xì)胞系的親本細(xì)胞系是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系，CHO-DG44(Flintoff,W.R等，SomatCelLGenet.2(1976)245-261;Flintoff等，Mol.Cell.Biol(分子細(xì)胞生物學(xué)).2(1982)275-285;Urlaub,G.等，Cell(細(xì)胞)33(1983)405-412;Urlaub,G等，Somat.CellMol.Genet.12(1986)555-566)。CHO-DG44細(xì)胞已經(jīng)丟失了二氫葉酸還原酶(DHFR)的兩個(gè)內(nèi)源性位點(diǎn)。將CHO-DG44細(xì)胞培養(yǎng)在MEMa負(fù)型培養(yǎng)基中(GibcoNo.22561),10%透析的FCS(GibcoNo.26400-044)和2mmol/LL-谷氨酰胺，IOOjliM次黃嘌呤，16pM胸苷(HT添加物)。質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)包含CMV啟動(dòng)子并且描述于表1中。作為抗體使用針對(duì)IGF-IR的抗體(WO2005005635;AK18或AK22)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>實(shí)施例1轉(zhuǎn)染和選擇用Fugene(RocheDiagnostics(羅氏診斷)GmbH)進(jìn)行表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后1天，將DG44細(xì)胞置于由MEMa負(fù)型培養(yǎng)基，10%透析的FCS和2mmol/LL-谷氨酰胺和20nM甲氨蝶呤(MTX)組成的選擇壓力下。在選擇壓力下3周后，從板上挑取單一克隆并進(jìn)行擴(kuò)增。收集上清液并用人IgG-特異性的ELISA來(lái)分析抗體的存在。進(jìn)一步擴(kuò)增亞克隆并分析特異性抗體的產(chǎn)生。將克隆在混懸培養(yǎng)物和無(wú)血清培養(yǎng)基，包含20nMMTX的HyQSFM4CHO-Utility(HyClond/SH30516)中培養(yǎng)。同時(shí)，測(cè)定糖模(glycopattern)模式。選擇提供2.0%或更低去巖藻糖基化的亞克隆(相對(duì)于總的摩爾寡糖實(shí)施例2培養(yǎng)和純化將3X105細(xì)胞于37°C,5%C02,100rpm下培養(yǎng)在加載了30ml培養(yǎng)基的125ml搖瓶(Coming)中10天。通過(guò)CASY計(jì)數(shù)器測(cè)量細(xì)胞密度并取上清液通過(guò)蛋白A親和層析來(lái)測(cè)定抗體濃度。對(duì)于每種上清液純化大約20ml用于通過(guò)蛋白A親和層析作進(jìn)一步生化表征(用PBS平衡,用25mM檸檬酸鈉緩沖液pH5.2洗滌，用lOOmM檸檬酸鈉緩沖液pH2.8洗脫，用10mMNaOHCIP)?？贵w的糖結(jié)構(gòu)分析通過(guò)液相色譜/質(zhì)譜(LCMS)肽圖譜分析來(lái)分析純化的抗體物質(zhì)。將樣品還原(0.4MTRIS/HC1,8M胍/HC1，pH8.5,DTT(3mg/ml)，羧甲基化(碘乙酸)并用胰蛋白酶剪切。用RP-HPLC分離肽-糖肽混合物并用電霧化質(zhì)譜進(jìn)行在線分析。整合包含糖結(jié)構(gòu)的肽的m/z譜，結(jié)果在表2中給出。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>Man:分別具有四和五個(gè)甘露糖殘基的高甘露糖結(jié)構(gòu)。G0，G1，G2:具有巖藻糖基化雙觸角復(fù)合型糖的還原的重鏈，所述糖具有1，2或3個(gè)末端半乳糖殘基。NonFuc:具有雙觸角復(fù)合型糖的還原的重鏈，所述糖無(wú)巖藻糖。在國(guó)際公認(rèn)的用于專利程序目的的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約下，將CHO細(xì)胞系克隆5(huMAb<IGF-lR>Bl-4E10—9-16)于2006年6月21日保藏于德意志微生物中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSMZ)),德國(guó)，保藏號(hào)為DSMACC2795。用來(lái)培養(yǎng)不同克隆的培養(yǎng)基獲自Hyclone(HyQSFM4CHO-Utility，用于克隆4-6)或西格瑪(Sigma)(C-8862用于克隆1-3禾卩7)。對(duì)于所有糖肽通過(guò)整合全部電荷狀態(tài)的特異性離子色譜來(lái)進(jìn)行LCMS肽圖譜分析。以相同的方式測(cè)定等分GlcNac,NGNA和高甘露糖。等分GlcNac和NGNA是不可檢測(cè)的。因而NGNA的量是0.5%或更低，此外是0.1%或更低。另外等分GlcNac的量是0.5%或更低，和0.1%或更低。糖基化作用的示范性計(jì)算顯示于表3中(表3a:克隆3，表3b:克隆5;包含asn298的肽，名為H27)。表33<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>H27—GO-H27一G4:具有巖藻糖基化雙觸角復(fù)合型糖的糖肽H27(包含Asn298)，所述糖具有x-末端半乳糖(例如具有4個(gè)半乳糖單位的G4)無(wú)Fuc的相對(duì)量涉及無(wú)甘露糖(4和5)糖結(jié)構(gòu)(高甘露糖)的所有GO,Gl,G2的Fuc的百分比。H27—Gl—1NGNA-H27—G3一2NGNA:具有巖藻糖基化雙觸角復(fù)合型糖的糖肽H27(包含Asn298)，所述糖具有x-末端半乳糖單位(例如具有2個(gè)單位的G2)，所述半乳糖單位具有l(wèi)-2個(gè)N-羥乙酰-神經(jīng)氨酸。無(wú)Fuc的相對(duì)量涉及無(wú)甘露糖(4和5)糖結(jié)構(gòu)(高甘露糖)的所有G0,Gl,G2的Fuc的百分比。表3b糖基化作用的示范性計(jì)算(克隆5)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>')具有x-末端半乳糖(分別為0，1，2，3禾n4個(gè))的巖藻糖基化雙觸角復(fù)合型糖結(jié)構(gòu)"具有x-末端半乳糖(分別為0，1，2，3和4個(gè))的巖藻糖基化雙觸角復(fù)合型糖結(jié)構(gòu)，具有另外的n-羥乙酰神經(jīng)氨酸殘基3)巖藻糖基化雙觸角復(fù)合型糖結(jié)構(gòu)(該方法的主要人工制品)4)分別具有四或五個(gè)甘露糖殘基的高甘露糖結(jié)構(gòu)5)非巖藻糖基化的糖結(jié)構(gòu)實(shí)施例4通過(guò)抗IGF-IRHuMAbs測(cè)定抗體介導(dǎo)的效應(yīng)子功能為了測(cè)定產(chǎn)生的HuMAb抗體激發(fā)免疫效應(yīng)器機(jī)制的能力，進(jìn)行抗體依賴的細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)研究。為了研究抗體在ADCC中的效果，用1二(乙酰氧基甲基)2,2，:6，，2"-三聯(lián)吡啶-6,6，，-二羧酸酯(BATDA)溶液于37。C在細(xì)胞培養(yǎng)箱中將表達(dá)IGF-IR的DU145前列腺癌細(xì)胞(HTB-81ATCC;1x106于2-4mlRPMI-FM中)標(biāo)記25分鐘。用10mlRPMI-FM將細(xì)胞洗滌四次并于200xg制動(dòng)離心IO分鐘。此后，將細(xì)胞調(diào)整到1x1()S細(xì)胞/ml的濃度。以5000細(xì)胞/孔將細(xì)胞在50pl的體積中接種于圓底平板的每個(gè)孔中。在50^1細(xì)胞培養(yǎng)基的體積中以25-0.1ng/ml的終濃度加入HuMAb抗體。隨后，以25:1的E:T比例加入50^1的效應(yīng)細(xì)胞、剛從全血中分離的PBMC或來(lái)自暗黃覆蓋層的純化的效應(yīng)細(xì)胞。立即將板于200xg制動(dòng)離心1分鐘，并于37"C溫育2小時(shí)。溫育后于200xg將細(xì)胞離心10分鐘并將20^上清液轉(zhuǎn)移至Optiplate96-F微量培養(yǎng)板中。加入200pl銪溶液(于室纟顯)并將混合物在振蕩器上溫育15分鐘。利用來(lái)自PerkinElmer(鉑爾金愛(ài)爾默)的EU-TDA方案在時(shí)間分辨熒光計(jì)中測(cè)量得到的熒光。將通過(guò)ADCC細(xì)胞裂解的量表示為來(lái)自去污劑裂解的靶細(xì)胞的TDA的最大釋放的％，并作來(lái)自各靶細(xì)胞的2,2，:6，,2"-三聯(lián)吡啶-6,6"-二羧酸酯(TDA)自發(fā)釋放的校正。作為不顯示"ADCC"的抗體參照標(biāo)準(zhǔn)，使用分離自大約35.000供體("Redimune")的相同IgG類型或IgG混合物的針對(duì)KLH(匙孔血藍(lán)蛋白)的(單克隆)抗體。使用針對(duì)IGF-IR的不含75%巖藻糖(75%fucosefree)的抗體作為陽(yáng)性對(duì)照。按照本發(fā)明的抗體顯示TDA釋放，其在標(biāo)準(zhǔn)抗體的TDA釋放的3xSD內(nèi)(圖l)。測(cè)定抗-IGF-IR抗體與IGF-IR的親和性儀器BIACORE3000芯片:CM5偶聯(lián)胺偶聯(lián)緩沖液HBS(HEPES，NaCl)，pH7.4，25。C對(duì)于親和性測(cè)試，已經(jīng)將抗人Fey抗體(來(lái)自兔)與存在針對(duì)IGF-IR的抗體的芯片表面偶聯(lián)。以各種濃度將IGF-IR胞外結(jié)構(gòu)域添加到溶液中。通過(guò)IGF-IR注射3分鐘來(lái)測(cè)量關(guān)聯(lián)性；通過(guò)用緩沖液洗滌芯片表面5分鐘來(lái)測(cè)量解離。將抗體18和22的親和性數(shù)據(jù)顯示于表4中。表4:通過(guò)811081八(:011￡@3000:)測(cè)量的親和性數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>實(shí)施例6對(duì)IGF-I禾BIGF-II結(jié)合表達(dá)IGF-IR的腫瘤細(xì)胞的抑制為了測(cè)定本發(fā)明抗體阻遏配體IGF-I和IGF-II結(jié)合IGF-I受體(IGF-IR)的能力，用放射性標(biāo)記的配體肽進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。將人腫瘤細(xì)胞(HT29，NCIH322M，0.5-1X1()5/ml)接種于RPMI1640培養(yǎng)基中(PAA，Cat.No.E15-(B9)，所述培養(yǎng)基中添加了2mML-谷氨酰胺，1X非必需氨基酸(Gibco，CatNo.11140-035)，1mM丙酮酸鈉(Gibco，Cat.No.11360-039)和10%熱滅活的FCS(PAA，Cat.No.A15-771)。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，在各自培養(yǎng)基中，將20ml細(xì)胞接種于六個(gè)T175形式的瓶并于37"和5y。C02下培養(yǎng)兩天以獲得匯合的單細(xì)胞層。為了收集個(gè)體細(xì)胞，加入2ml的lX胰蛋白酶/EDTA(Gibco，Cat.No.25300-054)/T175燒瓶并用ZeissAxiovert25顯微鏡監(jiān)測(cè)細(xì)胞的脫附。收集細(xì)胞并如前所述將具有10%FCS的培養(yǎng)基加至總體積50ml。通過(guò)于1000rpm離心10分鐘(Heraeussepatech，Omnifuge2.0RS)重新分離細(xì)胞并重懸于50ml的結(jié)合緩沖液中(120mMNaCl，5mMKCl，1.2mMMgS04，1mMEDTA，10mMD(+)葡萄糖，15mMNaAc，100mMHepespH7.6，1%BSA)。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過(guò)離心重新分離并用結(jié)合緩沖液調(diào)整到1X106細(xì)胞/ml。將溶于0.1%CH3COOH的I125標(biāo)記的IGF-I禾QIGF-II肽(阿莫仙(Amersham),2000Ci/mmol,Cat.No.IM172和IM238)在結(jié)合緩沖液中稀釋到最終活性4X105計(jì)數(shù)/(分鐘Xml)。將75pl特定濃度的抗體與25^1預(yù)稀釋的1125標(biāo)記的IGF-I或IGF-II肽一起加入到200^1的細(xì)胞混懸液中并于4。C溫育3,5小時(shí)。通過(guò)于2000rpm(Eppendorf，5415C)離心5分鐘重新分離細(xì)胞并去除上清液。在lml結(jié)合緩沖液中洗滌兩次后，將細(xì)胞重懸于lml結(jié)合緩沖液中并轉(zhuǎn)移到閃爍管中。在閃爍計(jì)數(shù)器上測(cè)量結(jié)合到細(xì)胞表面受體上的放射性肽的量?？贵w18的IC5。的平均值是0.3nM。沒(méi)有觀察到對(duì)于IGF-II結(jié)合的可檢測(cè)的抑制。實(shí)施例7IGF-IR結(jié)合的抗體競(jìng)爭(zhēng)分析對(duì)于抗IGF-IR單克隆抗體的表位圖譜，選擇與親和性測(cè)量(實(shí)施例5)相似的格式，但是以在溶液中的抗體于室溫將IGF-IR預(yù)培養(yǎng)至少0.5小時(shí)。注射該混合物并檢測(cè)IGF-IR的結(jié)合(或抑制)。這種測(cè)定容許測(cè)量IGF-IR結(jié)合的單克隆抗體的相應(yīng)(reciprocal)抑制活性。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的抗體與aIR3競(jìng)爭(zhēng)和IGF-IR的結(jié)合，已知所述aIR3是一種與217-274氨基酸結(jié)合的抗體(Gustafson，T.A.，和Rutter，W丄，J.Biol.Chem(生物化學(xué)雜志).265(1990)18663-18667)。實(shí)施例8IGF-I介導(dǎo)的IGF-IR和Akt/PKB的磷酸化的抑制為了測(cè)定本發(fā)明抗體抑制IGF-I受體(IGF-IR)的活化和磷酸化的能力，以IGF-I肽進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)和隨后用特異于磷酸化酪氨酸的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。將人腫瘤細(xì)胞(HT29,NCIH322M,5X1()4/ml)接種于RPMI1640培養(yǎng)基中(PAA,Cat.No.E15-039),所述培養(yǎng)基中添加了2mML-谷氨酰胺，IX非必需氨基酸(Gibc—o,Cat.No.11140-035),1mM丙酮酸鈉(Gibco,Cat.No.11360-039)和0.5。/。熱滅活的FCS(PAA,Cat.No.A15-771)。為了測(cè)定ICso值，對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，在各自的培養(yǎng)基中，將lml細(xì)胞接種12孔板并于37°C和5%(^02下培養(yǎng)2天。用低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)之后，小心去除培養(yǎng)基并替代以不同濃度的稀釋于各自培養(yǎng)基中的抗體。于37'C和57。C02中溫育5分鐘后，以2nM的終濃度加入IGF-I肽并在上面所述的條件下將細(xì)胞再次溫育10分鐘。通過(guò)抽吸小心去除培養(yǎng)基并加入100pl/孔的冷裂解緩沖液(50mMHepespH7.2,150mMNaCl,lmMEGTA，10%甘油，l%Triton-X100,100mMNaF,10mMNa4P207,Complete蛋白酶抑制劑)。用細(xì)胞刮器(Coming,Cat.No.3010)使細(xì)胞脫附并將孔內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到Eppendorf反應(yīng)管中。通過(guò)于13000rpm和4。C離心10分鐘去除細(xì)胞片段并以1:1(v/v)的比例將一半的上清液加到2XLaemmli樣品緩沖液中。對(duì)于IGF-IR的免疫沉淀，將細(xì)胞裂解物的剩余上清液進(jìn)行清除性離心(于13000rpm和4°C10分鐘)，隨即(rightbefore)加入lpl的針對(duì)IGF-IRP的多克隆抗體(C-20,SantaCruz生物技術(shù))，或鼠單克隆抗體(IgGl)，所述單克隆抗體識(shí)別在人IGF類型1受體中的胞外結(jié)構(gòu)域O鏈)的氨基酸440-586中的表位(mAb，24-55，GroPep)。在轉(zhuǎn)動(dòng)的Eppendorf反應(yīng)管中于4"C溫育2小時(shí)后，加入25^1ProteinGSepharosee珠(阿莫仙生物科學(xué)(AmershamBiosciences),Cat.No.17-0618-01)，隨后于4。C進(jìn)行另一次1小時(shí)的溫育步驟。通過(guò)離心(于2000rpm和4°C1分鐘)分離具有結(jié)合抗體-蛋白質(zhì)-復(fù)合物的珠并用洗滌緩沖液(只具有0.1%Triton-X100的裂解緩沖液)洗滌三次。在將珠于Laemmli樣品緩沖液中煮沸后，通過(guò)SDS-PAGE分離細(xì)胞蛋白質(zhì)并通過(guò)半干蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上(PROTRANBA85,Schleicher&Schuell)。利用一種磷酸酪氨酸特異性抗體(Upstate，clone4G10，Cat.No.05-321)測(cè)定免疫純化的IGF-IR的磷酸化狀態(tài)。為了檢測(cè)磷酸化的Akt/PKB，應(yīng)用一種具有對(duì)于磷酸化的Ser473的特異性的抗體(細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，Cat.No.9271)。發(fā)現(xiàn)抗體18能夠以0.6nM的ICso抑制IGF-1介導(dǎo)的IGF-1R和PKB的磷酸化作用。實(shí)施例9體外誘導(dǎo)抗體介導(dǎo)的IGF-IR的下調(diào)為了檢測(cè)本發(fā)明抗體對(duì)于腫瘤細(xì)胞中IGF-I受體(IGF-IR)量的影響，進(jìn)行時(shí)程實(shí)驗(yàn)和隨后使用IGF-IR特異性抗體的蛋白質(zhì)印跡分析。將人腫瘤細(xì)胞(HT29，5X10"ml)接種于RPMI1640培養(yǎng)基中(PAA，Cat.No.E15-039)，所述培養(yǎng)基中添加了2mML-谷氨酰胺，IX非必需氨基酸(Gibco,Cat.No.11140-035),1mM丙酮酸鈉(Gibco,Cat.No.ll360-039)禾口10%熱滅活的FCS(PAA,Cat.No.A15-771)。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)的每個(gè)溫育時(shí)期，在各自的培養(yǎng)基中，將lml細(xì)胞接種一個(gè)12孔板并于37E和5c/。C02中培養(yǎng)24小時(shí)。小心去除培養(yǎng)基并替代以不同濃度的稀釋于各自培養(yǎng)基中的抗體。在兩個(gè)對(duì)照孔中，將培養(yǎng)基替代以沒(méi)有抗體的培養(yǎng)基或具有對(duì)照抗體(AB-1，Oncogene,Cat.No.GRll)的培養(yǎng)基。將細(xì)胞于37。C和5%C02中培養(yǎng)并在15分鐘、24小時(shí)和48小時(shí)后將單個(gè)板取出進(jìn)行進(jìn)一步處理。通過(guò)抽吸小心去除培養(yǎng)基并且每孔加入的冷裂解緩沖液(50mMH印espH7.2，150mMNaCl，lmMEGTA,10%甘油，l%Triton-X100,lOOmMNaF，10mMNa4P207,Complete蛋白酶抑制劑)。使用細(xì)胞刮器(Coming,Cat.No.3010)使細(xì)胞脫附并將孔內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到Eppendorf反應(yīng)管中。通過(guò)于13000rpm和4"C離心10分鐘去除細(xì)胞片段并以1:1(v/v)的比例將上清液加到2XLaemmli樣品緩沖液中。通過(guò)SDS-PAGE分離細(xì)胞蛋白質(zhì)并通過(guò)半干蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上(PROTRANBA85，Schleicher&Schuell，CatNo.10401196)。利用特異于IGF-IR的抗體(C-20,SantaCruz生物技術(shù)，Cat.No.sc-713)測(cè)定IGF-IR的蛋白質(zhì)水平。在加入抗體之后不到24小時(shí)觀察到由本發(fā)明抗體誘導(dǎo)的IGF-IR的下調(diào)。實(shí)施例10抑制胰島素結(jié)合表達(dá)人胰島素受體的3T3細(xì)胞為了測(cè)定本發(fā)明的抗體是否也阻遏胰島素結(jié)合胰島素受體(IR),用放射性標(biāo)記的配體肽進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。將表達(dá)重組高數(shù)目(>1()S)的人IR的3T3細(xì)胞(lX105/ml)接種于具有高葡萄糖的MEMDulbecco培養(yǎng)基(DMEM)(PAA,Cat.No.E15-009)中，所述培養(yǎng)基添加了2mML-谷氨酰胺(Gibco,Cat.No.25030-024)和10%熱滅活的FCS(PAA,Cat.No.A15-771)。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，在各自的培養(yǎng)基中，將20ml細(xì)胞接種于六個(gè)T175形式的瓶中，并于37匸和5%C02中培養(yǎng)兩天以獲得匯合的單細(xì)胞層。為了收集個(gè)體細(xì)胞，加入2ml的lX胰蛋白酶/EDTA(Gibco，Cat.No.25300-054)/T175燒瓶并用顯微鏡監(jiān)測(cè)細(xì)胞的脫附。收集細(xì)胞并如前所述將具有10%FCS的培養(yǎng)基加至總體積50ml。通過(guò)于1000rpm離心10分鐘重新分離細(xì)胞并重懸于50ml的結(jié)合緩沖液中(120mMNaCl，5mMKCl，1.2mMMgS04，lmMEDTA，10mMD(+)葡萄糖，15mMNaAc，100mMHepespH7.6，1%BSA)。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過(guò)離心重新分離并用結(jié)合緩沖液調(diào)整到1X106細(xì)胞/ml。將溶于0.1%CH3COOH的I"5標(biāo)記的胰島素肽(Amersham(阿莫仙)，Car.No.IM1662000Ci/mmol)在結(jié)合緩沖液中稀釋到最終活性4*105計(jì)數(shù)/(分鐘^ml)。將75)Lil抗體與25^1預(yù)稀釋的1125標(biāo)記的胰島素肽一起加入到200^1的細(xì)胞混懸液中(最終抗體濃度200nM)并于4'C溫育3,5小時(shí)。通過(guò)于2000rpm離心5分鐘重新分離細(xì)胞并去除上清液。在lml結(jié)合緩沖液中洗滌兩次后，將細(xì)胞重懸于lml結(jié)合緩沖液中并轉(zhuǎn)移到閃爍管中。在閃爍計(jì)數(shù)器上測(cè)量結(jié)合到細(xì)胞表面受體上的放射性肽的量。結(jié)果表明本發(fā)明的抗體并不干擾胰島素配體結(jié)合胰島素受體。實(shí)施例11對(duì)IGF-IR和Akt/PKB磷酸化沒(méi)有刺激為了排除本發(fā)明抗體的IGF-IR刺激活性，在缺乏IGF-I配體而存在本發(fā)明抗體和參比抗體(alR3，Oncogene,德國(guó))時(shí)，確定IGF-IR的磷酸化。用磷酸化狀態(tài)的特異性抗體對(duì)此進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。將用IGF-IR轉(zhuǎn)染的3T3細(xì)胞(ATCCCRL1658)(5氣()4細(xì)胞/ml，Pietrzkowski，Z.，等，CellGrowthDiffer(細(xì)胞生長(zhǎng)分化).4(1992)199-205)接種在具有高葡萄糖的MEMDulbecco培養(yǎng)基(DMEM)(PAA,CatNo.E15-009)中，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充以2mML-谷氨酰胺(Gibco,CatNo.25030-024)和0.5%熱滅活的FCS(PAA，CatNo.A15-771)或?qū)⑷四[瘤細(xì)胞(HT29，NCIh322M5X104/ml)接種于RPMI1640培養(yǎng)基中(PAA,Cat.No.El5-039)，所述RPMI1640培養(yǎng)基中添加了2mML-谷氨酰胺，lX非必需氨基酸(Gibco,CatNo.11140-035),1mM丙酮酸鈉(Gibco,Cat.No.11360-039)和0.5%熱滅活的FCS(PAA,Cat.No.A15-771)。為了測(cè)定105()值，對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，在各自的培養(yǎng)基中，將1ml細(xì)胞接種12孔板并于37'C和5%C02下培養(yǎng)2天。用低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)之后，小心去除培養(yǎng)基并替代以不同濃度的稀釋于各自培養(yǎng)基中的抗體。在上述條件下，將細(xì)胞溫育15分鐘。通過(guò)抽吸小心去除培養(yǎng)基并加入100pl/孔的冷裂解緩沖液(50mMHepespH7.2，150mMNaCl，lmMEGTA，10%甘油，1。/。Triton-XIOO，100mMNaF，10mMNa4P2O7，Complete蛋白酶抑制劑)。用細(xì)胞刮器(Corning，Cat.No.3010)使細(xì)胞脫附并將孔內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到Eppendorf反應(yīng)管中。通過(guò)于13000rpm和4。C離心10分鐘(Eppendorf離心機(jī)5415R)去除細(xì)胞片段并以1:1(v/v)的比例將一半的上清液加到2XLaemmli樣品緩沖液中。對(duì)于IGF-IR的免疫沉淀，將細(xì)胞裂解物的剩余上清液進(jìn)行清除性離心(于13000rpm和4。C10分鐘)，隨即(rightbefore)加入lpl的針對(duì)IGF-IR的抗體(C-20，SantaCruz生物技術(shù)，CatNo.sc-713或mAb24-55，GroPep，CatNo.MAD1)。在轉(zhuǎn)動(dòng)的Eppendorf反應(yīng)管中于4"C溫育2小時(shí)后，加入25^1ProteinGSqAarosee珠(AmershamBiosciences(阿莫仙生物科學(xué))，Cat.No.l7-0618-01)，隨后于4匸進(jìn)行另一次1小時(shí)的溫育步驟。通過(guò)離心(于2000rpm和4°C1分鐘)分離具有結(jié)合抗體-蛋白質(zhì)-復(fù)合物的珠并用洗滌緩沖液(只具有0.1Q/。Triton-X100的裂解緩沖液)洗漆三次。在將珠于Laemmli樣品緩沖液中煮沸后，通過(guò)SDS-PAGE分離細(xì)胞蛋白質(zhì)并通過(guò)半干蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上(PROTRANBA85，Schleicher&Schuell，CatNo.10401196)。將磷酸酪氨酸特異性抗體(Upstate，克隆4G10，CatNo.05-321，識(shí)別酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì))用于測(cè)定免疫純化的IGF-IR的磷酸化狀態(tài)。為了檢測(cè)磷酸化的Akt/pkB，應(yīng)用一種針對(duì)Aktl特異于磷酸化的絲氨酸473(細(xì)胞信傳導(dǎo)，CatNo.9271)的抗體。觀察到在IGF-IR信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的Akt/pkB激酶下調(diào)明顯地被以高于5nM濃度的參比抗體激活，但是沒(méi)有被在多至10.000nM濃度上的本發(fā)明抗體激活。實(shí)施例12在H322M異種移植模型中誘導(dǎo)受體下調(diào)在裸鼠中誘導(dǎo)腫瘤并以不同濃度的本發(fā)明抗體處理1次。在處理后24小時(shí)，在液氮下提取腫瘤并進(jìn)行勻漿。以3:1的緩沖液體積對(duì)腫瘤重量比加入冷裂解緩沖液(50mMH印espH7.2，150mMNaCl，lmMEGTA，10%甘油，1%Triton-XI00，lOOmMNaF，lmMNa3V04，10mMNa4P2O7，Complete蛋白酶抑制劑，ImMPMSF)并與融解的腫瘤勻漿物一起充分混合。在冰上溶解組織15分鐘后，通過(guò)于13000rpm和4"C離心(Eppendorf離心機(jī)5415R)10分鐘去除不可溶的片段。用MicroBCAReagents(Pierce)測(cè)定樣品的蛋白質(zhì)濃度并加入裂解緩沖液以調(diào)節(jié)相等的濃度。將部分上清液以1:Kv/v)的比例加入到2XLaemmli樣品緩沖液中。通過(guò)SDS-PAGE分離細(xì)胞蛋白質(zhì)并通過(guò)半干蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上(PROTRANBA85，Schleicher&Schuell，Cat.No.10401196)。利用IGF-IR特異性抗體(C-20，SantaCruz生物技術(shù)，Cat.No.sc-713)檢測(cè)IGF-IR。用本發(fā)明的抗體處理后，觀察到濃度依賴型的IGF-IR水平的減少，估計(jì)的EC50為0.6mg/kg。實(shí)施例13H322M腫瘤的生長(zhǎng)抑制通過(guò)按照已確定的方法在無(wú)胸腺裸鼠中誘導(dǎo)腫瘤來(lái)研究抗體18在體內(nèi)的效應(yīng)。將人H322MNSCLC細(xì)胞與基質(zhì)膠(Matrigel)—起皮下共注射到6-7周齡的無(wú)胸腺nu小鼠(nu/nu)中。為此目的，將5x106H322M細(xì)胞濃縮在100|il培養(yǎng)基中并混和以100^基質(zhì)膠。將200pi的該混和物注射到小鼠的右脅。按照由Geran等首先公開(kāi)的公式("Protocolsforscreeningchemicalagentsandnaturalproductsagainstanimaltumorsandotherbiologicalsystems(針對(duì)動(dòng)物腫瘤和其它生物系統(tǒng)篩選化學(xué)劑和天然產(chǎn)物的方法)"，CancerChemother.Rep.11.301，1972)，其中腫瘤體積[mgh(長(zhǎng)度x(寬度)2)通過(guò)每周兩次用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤直徑來(lái)計(jì)算腫瘤的體積。以10ml/kg腹膜內(nèi)地(i.p.)施用抗體。處理開(kāi)始以雙倍體積的雙倍劑量抗體施用。如上所述在裸鼠中誘導(dǎo)腫瘤。在腫瘤生長(zhǎng)到160mg的平均體積后，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)處理6次，所述處理在處理的第一天以12，1.2和0.12mg/kg作為負(fù)荷劑量給藥1次，以6、0.6和0.06mg/kg的抗體作為連續(xù)劑量，每周一次。該實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)以6和0.6mg/kg的單個(gè)試劑施用時(shí)，由rhu抗-IGF-IRmAblS對(duì)IGF-IR軸(axis)的阻斷導(dǎo)致抗腫瘤效率。與此相對(duì)，0.06mg/kg對(duì)腫瘤生長(zhǎng)沒(méi)有影響。此外，在相同的模型中結(jié)合吉西他濱檢驗(yàn)了抗體18。如上所述誘導(dǎo)腫瘤并且當(dāng)腫瘤已經(jīng)在所有的組中形成并長(zhǎng)到170mm3的平均大小時(shí)開(kāi)始治療。以6禾P0.6mg/kg并以0.6mg結(jié)合62mg/kg的吉西他濱i.p.施用抗體每周1次。施用吉西他濱一個(gè)周期，即每隔三天，總共4次。通過(guò)施用雙倍劑量的抗體再次開(kāi)始治療。實(shí)驗(yàn)證明了以每7日施用1次用抗體18進(jìn)行的治療本身抑制腫瘤生長(zhǎng)并增加了吉西他濱的有效性，己知所述吉西他濱是一種抗代謝化合物。實(shí)施例14對(duì)3T3腫瘤的生長(zhǎng)抑制基本如實(shí)施例15中所述在裸鼠中誘導(dǎo)腫瘤，除了應(yīng)用過(guò)度表達(dá)人IGF-IR的鼠3T3成纖維細(xì)胞之外。以18，6或0.6mg/kg的抗體18對(duì)具有約180mg的形成的腫瘤的小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)處理，每周1次，共7次。將雙倍劑量的抗體給藥作負(fù)荷劑量(36，12和1.2mg/kg)來(lái)開(kāi)始治療。所述實(shí)驗(yàn)證實(shí)了通過(guò)用抗體治療，當(dāng)被以18和6mg/kg，每周l次給藥時(shí)，腫瘤的生長(zhǎng)可被延緩。實(shí)施例15體外誘導(dǎo)抗體介導(dǎo)的IGF-1R的下調(diào)為了檢測(cè)本發(fā)明抗體對(duì)于腫瘤細(xì)胞中IGF-I受體(IGF-IR)量的影響，進(jìn)行時(shí)程實(shí)驗(yàn)和隨后使用IGF-IR特異性抗體的蛋白質(zhì)印跡分析。將人腫瘤細(xì)胞(HT29，5X10Vml)接種于RPMI1640培養(yǎng)基中(PAA,Cat.No.E15-039)，所述培養(yǎng)基中添加了2mML-谷氨酰胺，IX非必需氨基酸(Gibco，Cat.No.11140-035)，1mM丙酮酸鈉(Gibco,Cat.No.11360-039)禾口10%熱滅活的FCS(PAA,Cat.No.A15-771)。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)的每個(gè)反應(yīng)時(shí)期，在各自的培養(yǎng)基中，將lml細(xì)胞接種12孔板并于37X:和5%C02中培養(yǎng)24小時(shí)。小心去除培養(yǎng)基并替代以不同濃度的稀釋于各自培養(yǎng)基中的抗體。在兩個(gè)對(duì)照孔中，將培養(yǎng)基替代以沒(méi)有抗體的培養(yǎng)基或具有對(duì)照抗體(AB-1，Oncogene,Cat.No.GRll)的培養(yǎng)基。將細(xì)胞于37。C和5%C02中培養(yǎng)并在15分鐘、24小時(shí)和48小時(shí)后將單個(gè)板取出進(jìn)行進(jìn)一步處理。通過(guò)抽吸小心去除培養(yǎng)基并且每孔加入lOOpl的冷裂解緩沖液(50mMHepespH7.2,150mMNaCl，lmMEGTA,10%甘油，l%Triton-X100，lOOmMNaF,10mMNa4P207，Complete蛋白酶抑制劑)。使用細(xì)胞刮器(Coming,Cat.No.3010)使細(xì)胞脫附并將孔內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到Eppendorf反應(yīng)管中。通過(guò)于13000rpm和4。C離心IO分鐘去除細(xì)胞片段并以1:1(v/v)的比例將上清液加到2XLaemmli樣品緩沖液中。通過(guò)SDS-PAGE分離細(xì)胞蛋白質(zhì)并通過(guò)半干蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上(PROTRAN⑧BA85，Schleicher&Schuell，Cat.No,10401196)。利用特異于IGF-IR的抗體(C-20,SantaCmz生物技術(shù)，Cat.No.sc-713)測(cè)定IGF-IR的蛋白質(zhì)水平。在加入抗體之后24小時(shí)后觀察到由本發(fā)明抗體誘導(dǎo)的50%或更多IGF-IR的下調(diào)。權(quán)利要求1.結(jié)合IGF-IR的抗體，其是人IgG1或IgG3型并且在Asn297上被糖鏈所糖基化，所述抗體特征在于所述糖鏈內(nèi)巖藻糖的量為至少99％(“完全巖藻糖基化”)，此外NGNA的量為1％或更少和/或N末端α-1，3-半乳糖的量為1％或更少。2.按照權(quán)利要求l的抗體，其特征在于NGNA的量為0.5%或更少。3.按照權(quán)利要求1或2的抗體，其特征在于N末端a-l，3-半乳糖的量為0.5%或更少。4.按照權(quán)利要求1-3的抗體，其特征在于所述抗體是嵌合的，人源化的或人抗體。5.按照權(quán)利要求1-4的抗體，其特征在于所述抗體顯示一種或多種選自由下列組成的組的特性a)顯示其對(duì)IGF-1與IGF-IR結(jié)合的抑制的IQ()值與其對(duì)IGF-II與IGF-IR結(jié)合的抑制的ICso值的比率為1:3-3:1,b)當(dāng)與沒(méi)有所述抗體的這種測(cè)定比較時(shí)，其在5nM的濃度上，在使用HT29細(xì)胞的細(xì)胞磷酸化測(cè)定中，抑制至少80%，優(yōu)選地至少90%的IGF-IR磷酸化，所述HT29細(xì)胞在包含0.5%的熱滅活胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基中，c)當(dāng)與沒(méi)有所述抗體的這種測(cè)定比較時(shí)，在使用3T3細(xì)胞的細(xì)胞磷酸化測(cè)定中，其在10pM的濃度上沒(méi)有顯示如PKB磷酸化所測(cè)量的IGF-IR的刺激活性(無(wú)信號(hào)傳導(dǎo)，無(wú)IGF-1模擬活性)，所述3T3細(xì)胞在包含0.5。/。的熱滅活胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基中提供400,000-600,000分子IGF-IR/細(xì)胞。6.按照權(quán)利要求l-5的抗體，其特征在于親和性為約10—13到10—9M(KD)。7.按照權(quán)利要求l-5的抗體，其特征在于包含作為互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，具有下列序列a)包括作為CDRs的SEQIDNO:1或3的CDR1(氨基酸31-35),CDR2(氨基酸50-66)和CDR3(氨基酸99-107)的抗體重鏈；b)包括作為CDRs的SEQIDNO:2或4的CDR1(氨基酸24-34)，CDR2(氨基酸50-56)和CDR3(氨基酸89-98)的抗體輕鏈。8.按照權(quán)利要求1-7的抗體用于制備藥物組合物的應(yīng)用。9.藥物組合物，其包含藥物有效量的按照權(quán)利要求1-7的抗體。10.制備藥物組合物的方法，所述藥物組合物包括藥物有效量的按照權(quán)利要求1-7的抗體。11.治療需要抗腫瘤治療的患者的方法，其特征是向該患者施用藥物有效量的按照權(quán)利要求1-7的抗體。12.按照權(quán)利要求15的方法，其特征在于組合細(xì)胞毒性劑、其前體藥物或細(xì)胞毒性放療施用所述抗體。13.能夠重組表達(dá)按照權(quán)利要求1-7的抗體的CHO細(xì)胞。全文摘要一種結(jié)合IGF-IR的抗體在抗腫瘤治療中具有提高的特性，所述抗體是人IgG1或IgG3型并且在Asn297上被糖鏈所糖基化，所述抗體特征在于所述糖鏈內(nèi)巖藻糖的量為至少99％，此外NGNA的量為1％或更少和/或N末端α-1，3-半乳糖的量為1％或更少。文檔編號(hào)C07K16/28GK101421305SQ200780012828公開(kāi)日2009年4月29日申請(qǐng)日期2007年4月10日優(yōu)先權(quán)日2006年4月11日發(fā)明者克勞斯-彼得·金克勒,拉爾夫·舒馬克,西爾克·漢森,迪特馬爾·羅伊施申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司