專(zhuān)利名稱(chēng)：2-芳基吡唑并[1,5-α]嘧啶-3-基乙酰胺衍生物作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(18kDa)配體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使對(duì)象體內(nèi)表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(18 kDa)(TSPO)成像的化合物和方 法。本發(fā)明還涉及用于治療對(duì)象的神經(jīng)變性疾病、炎癥或焦慮癥的化合物和方 法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(18kDa)(TSPO)，以前稱(chēng)為外周苯二氮卓受體(PBR)，可與腺嘌呤 核苷酸載體(ANC) (30 kDa)以及電壓依賴(lài)性陰離子通道(VDAC) (32 kDa)形成 三聚復(fù)合物從而構(gòu)成線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)變孔(MPTP)。 TSPO與中央苯二氮卓受體 (CBR)的區(qū)別在于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、生理功能以及在線(xiàn)粒體外膜上的亞細(xì)胞定位。 盡管已知TSPO參與許多生物過(guò)程，但其生理作用的若干方面仍舊不清楚。研 究暗示了TSPO在類(lèi)固醇生物合成限速步驟、免疫調(diào)節(jié)、卟啉轉(zhuǎn)運(yùn)、鈣體內(nèi)平 衡和程序性細(xì)胞死亡中的重要性。
TSPO密集分布在大多數(shù)外周器官內(nèi)，其中包括肺、心臟和腎臟，但它在 正常腦實(shí)質(zhì)中僅少量表達(dá)。在神經(jīng)損傷或感染之后，腦實(shí)質(zhì)中的TSPO表達(dá)顯 著提高。體外放射自顯影和免疫組織化學(xué)已顯示，該區(qū)域內(nèi)TSPO結(jié)合升高與 存在激活的小膠質(zhì)細(xì)胞直接相關(guān)。最近，在阿爾茨海默病(AD)和多發(fā)性硬化 (MS)患者體內(nèi)正電子發(fā)射體層攝影(PET)成像證實(shí)腦實(shí)質(zhì)中的TSPO結(jié)合僅限 于活化的小膠質(zhì)細(xì)胞。
小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的主要免疫效應(yīng)細(xì)胞。這些巨噬細(xì)胞樣 的免疫細(xì)胞被假設(shè)源自單核細(xì)胞系，它們的主要作用取決于宿主防御和免疫監(jiān) 視。它們對(duì)于它們微環(huán)境的改變高度敏感，并在病理事件響應(yīng)中迅速激活。出 于這些原因，TSPO被認(rèn)為與某些神經(jīng)變性疾病早期節(jié)段的最初炎性過(guò)程密切 相關(guān)。
在過(guò)去幾十年中已經(jīng)報(bào)道了許多種類(lèi)的TSPO配體，其中包括苯二氮卓類(lèi)
5(苯甲二氮卓和Ro 5-4864)、異喹啉氨甲酰類(lèi)(PK 11195)、吲哚乙酰胺類(lèi) (FGIN-l-27)、苯氧基苯基-乙酰胺類(lèi)(DAA1106)、吡唑并嘧啶類(lèi) (pyrazolopyrimides)(DPA-713)、苯并噻氮卓類(lèi)(benzothiazepine)和咪唑并吡啶類(lèi)。
一些其他種類(lèi)也已經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái)，然而，需要更多具有不同結(jié)合特性和生物活性 的配體以更好地表征TSPO的生理和治療作用、其準(zhǔn)確定位以及TSPO亞類(lèi)的 預(yù)期存在。
異喹啉氨甲酰["C](/ )-PK 11195已被用作藥物探針用來(lái)研究TSPO的功能 和表達(dá)。在AD、 MS和多系統(tǒng)萎縮癥(MSA)患者內(nèi)進(jìn)行的許多PET研究已經(jīng) 顯示，在體內(nèi)用["C](i )-PK 11195測(cè)量TSPO在活體腦內(nèi)是可行的。盡管 ["C](i )-PK 11195被認(rèn)為是最廣泛應(yīng)用的PET TSPO配體，但它具有較差信噪 比并顯示出較低腦透過(guò)性，這最終會(huì)降低其作為小膠質(zhì)細(xì)胞激活標(biāo)記物的靈敏 度。
1998年曾報(bào)道苯氧基苯基-乙酰胺衍生物DAA1106是TSPO的高選擇性的 且有效的配體(Chaki， S.; Funakoshi， T.; Yoshikawa， R.; Okuyama， S.; Okubo， T.; Nakazato ， A.; Nagamine ， M.; Tomisawa ， K. European Journal of Pharmacology ， 1999， 371， 197-204)。最近，DAA1106被碳-11 ("C)標(biāo)記并用于PET研究以 評(píng)價(jià)其在鼠類(lèi)和靈長(zhǎng)類(lèi)大腦中的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)(ZhangMR， KidaT， Noguchi J等， [UC]DAA1106: radiosynthesis and in vivo binding to peripheral benzodiazepine receptors in mouse brain(小鼠大腦內(nèi)外周苯二氮卓受體的放射性合成和體內(nèi)結(jié) 合).Wmc/Med說(shuō)W2003; 30:513-519. Maeda J， SuharaT, ZhangMR等，Novel peripheral benzodiazepine receptor ligand [UC]DAA1106 for PET: An imaging tool for glial cells in the brain(用于PET的新型外周苯二氮卓受體配體 [UC]DAA1106:腦內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的成像工具).S少"fl;we. 2004; 52:283-291)。 在猴枕葉皮質(zhì)中，["C]DAA1106的結(jié)合顯示比[UC](i )-PK 11195高四倍，說(shuō)明 它有優(yōu)良的腦透過(guò)性。該化合物的氟-18 ("F)類(lèi)似物也已經(jīng)被合成，名為 [18F]FEDAA1106，該類(lèi)似物也顯示出與["C]DAA1106類(lèi)似的體內(nèi)結(jié)合特性 (Zhang MR， Maeda J， Ogawa M等，Development of a new radioligand,
1 ft
N-(5-fluoro-2-phenoxyphenyl)-N-(2-[ F]fluoroethyl-5-methoxybenzyl)acetamide， for pet imaging of peripheral benzodiazepine receptor in primate brain訴于靈長(zhǎng)類(lèi)腦內(nèi)外周苯二氮卓受體的pet成像的新型放射性配體N-(5-氟-2-苯氧基苯 基)-N-(2-["F]氟乙基-5-甲氧基芐基)乙酰胺的開(kāi)發(fā)).Ozem. 2004; 47:2228-2235)。然而，["C]DAA1106和["F]FEDAA1106的結(jié)合似乎是不可逆 的，且實(shí)際上，它們從腦中緩慢清除，表明它們沒(méi)有合適的定量分析動(dòng)力學(xué)。 Ryu JK等，A^wra6/o/og7 o/D&^we， 20 (2005) 550-561報(bào)道稱(chēng)，TSPO配 體PK11195能減少注射了喹啉酸的大鼠皮層中的小膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)元死 亡。該篇論文中報(bào)道的結(jié)果說(shuō)明，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞造成的炎性反應(yīng)會(huì)損傷紋 狀體神經(jīng)元，因此藥理學(xué)尋靶小膠質(zhì)細(xì)胞中的TSPO有可能保護(hù)神經(jīng)疾病中的 神經(jīng)元。
鑒定可用于體內(nèi)TSPO表達(dá)成像的具有改進(jìn)的腦動(dòng)力學(xué)的TSPO配體是有 益的，因?yàn)檫@樣的配體可用于進(jìn)一步研究涉及某些神經(jīng)變性疾病早期階段的生 化事件的級(jí)聯(lián)。同樣有利的是鑒定具有改進(jìn)的腦動(dòng)力學(xué)的TSPO配體，因?yàn)檫@ 樣的配體具有作為神經(jīng)變性疾病診斷和治療工具的潛能。
在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用選自18F、 123I、 76Br、 1241或75Br的放射性 同位素放射性標(biāo)記的式(I)的化合物，或其鹽
式中
R是H、鹵素、任選被鹵素取代的烷基、或任選被鹵素取代的垸氧基；
R,、 R2和R3各自獨(dú)立為H或疏水性基團(tuán)；和
R4和R5各自獨(dú)立為任選被鹵素取代的垸基、或任選被鹵素取代的烷氧基。
文中，式(I)的化合物用18F、 123I、 76Br、 1241或7581""放射性標(biāo)記"是指，

發(fā)明內(nèi)容
7式(I)中的R,、 R2、 R3、 R4或R5中的至少一個(gè)被"F、 123I、 76Br、 ^I或"Br取 代。通常是R、 R。 R2或R3中的一個(gè)被"F、 123I、 76Br、 1241或758[取代。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其中包含用選自18F、 123I、 76Br、 124I或75Br的放射性同位素放射性標(biāo)記的式(I)的化合物，或其藥學(xué)上可 接受的鹽，以及藥學(xué)上可接受的載體。
在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種使對(duì)象體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(18kDa)(TSPO) 成像的方法，所述方法包括給予該對(duì)象用選自18F、 123I、 76Br、 ^I或"Br的放 射性同位素放射性標(biāo)記的式(I)的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽，并獲得放射 性同位素在對(duì)象體內(nèi)的定位圖。
通常，當(dāng)式(I)的化合物用18F、 76Br、 ^I或"Br放射性標(biāo)記時(shí)，所述圖像 通過(guò)正電子發(fā)射體層攝影(PET)成像而獲得。通常，當(dāng)式(I)的化合物用1231放射 性標(biāo)記時(shí)，所述圖像是通過(guò)單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)體層攝影(SPECT)成像獲得的。
在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種診斷對(duì)象的神經(jīng)變性疾病的方法，包括 給予該對(duì)象用選自18F、 123I、 76Br、 ^I或"Br的放射性同位素放射性標(biāo)記的式 (I)的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽，并獲得放射性同位素在對(duì)象體內(nèi)的定位 圖以評(píng)價(jià)對(duì)象腦實(shí)質(zhì)中該化合物或其鹽的TSPO結(jié)合程度。
在第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了用選自18F、 123I、 76Br、 124I或75Br的放射性 同位素放射性標(biāo)記的式(I)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于對(duì)象體 內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(18kDa)成像的藥物中的應(yīng)用。
在第六個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種式(II)的化合物，或其鹽<formula>formula see original document page 8</formula>式中:R是任選被^素取代的垸基，或任選被鹵素取代的垸氧基； R" R2和R3各自獨(dú)立為H或疏水性基團(tuán)；和
R4和R5各自獨(dú)立為任選被鹵素取代的垸基、或任選被鹵素取代的垸氧基，
和
其中，R、 R卜R2、 R3、 R4或Rs中的至少一個(gè)被F取代。 在第七個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含式(II)的化合物或
其藥學(xué)上可接受的鹽以及藥學(xué)上可接受的載體。
在第八個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種治療對(duì)象的神經(jīng)變性疾病、炎癥或焦慮
癥的方法，所述方法包括給予該對(duì)象治療有效量的式(II)的化合物或其藥學(xué)上
可接受的鹽。
在第九個(gè)方面，本發(fā)明提供了式(n)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制
備用于治療神經(jīng)變性疾病、炎癥或焦慮癥的藥物中的應(yīng)用。 附圖簡(jiǎn)述


圖1是TSPO配體PK11195、 Ro5-4864、 DPA-713和DPA-714對(duì)C6膠質(zhì)
瘤大鼠細(xì)胞中孕烯醇酮積聚的作用的圖示。所有化合物以相同濃度(40 一)使 用；培育期(2h)結(jié)束時(shí)，通過(guò)放射免疫測(cè)定(RIA)測(cè)定孕烯醇酮的量。所示值為 至少三次測(cè)定的平均值。
圖2是實(shí)施例4中所述四組QA損傷大鼠中每一組的["F]DPA-714的外周 分布的圖示；所述四組為對(duì)照組(僅注射放射性配體)和三個(gè)預(yù)處理組(PK 11195、 DPA-713和DPA-714)。
圖3是實(shí)施例4中所述四組QA損傷大鼠中每一組的右紋狀體(右Stri)、左 紋狀體(左Stri)、右額皮質(zhì)(右Cx)、左額皮質(zhì)(左Cx)、右海馬(右Hippoc)和左 海馬(左Hippoc)中["F]DPA-714的大腦分布的圖示；所述四組為對(duì)照組(僅注射 放射性配體)和三個(gè)預(yù)處理組(PK 11195、 DPA-713和DPA-714)。
圖4顯示了描繪實(shí)施例5所述三個(gè)研究中60分鐘PET掃描時(shí)間期間狒狒 全腦中["F]DPA-714的攝取的時(shí)間活性曲線(xiàn)(TAC)(基線(xiàn)["F]DPA-714，阻斷 [18F]DPA-714 + PK 11195 (1.5 mg/kg)，替代["F]DPA-714 + DPA-714 (1 mg/kg) 研究)。發(fā)明詳述
文中，術(shù)語(yǔ)"垸基"指直鏈、支鏈或者單環(huán)或多環(huán)烷基。典型地，所述烷基 是C,-C3o烷基，例如，CrC6垸基。直鏈和支鏈垸基的例子包括甲基、乙基、 丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、仲戊基、1，2-二甲基丙基、U-二甲基丙基、己基、4-甲基戊基、l-甲基戊基、2-甲基戊基、 3-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1,2-二甲基丁 基、1，3-二甲基丁基、1,2，2-三甲基丙基和1，1,2-三甲基丙基。 環(huán)垸基的例子包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基。 文中，術(shù)語(yǔ)"烷氧基"指化學(xué)式為0垸基的基團(tuán)。垸氧基的例子包括甲氧基、 乙氧基、丙氧基和丁氧基。
文中，術(shù)語(yǔ)"烯基"指直鏈、支鏈或環(huán)狀烯基。典型地，所述烯基是CVC30 烯基，例如CVCV烯基。烯基的例子包括乙烯基，烯丙基，1-甲基乙烯基， 丁烯基，異丁烯基，3-甲基-2-丁烯基，l-戊烯基，環(huán)戊烯基，1-甲基環(huán)戊烯基， l-己烯基，3-己烯基，環(huán)己烯基，l-庚烯基，3-庚烯基，l-辛烯基，環(huán)辛烯基， l-壬烯基，2-壬烯基，3-壬烯基，l-癸烯基，3-癸烯基，1，3-丁二烯基，1,4-戊 二烯基，1，3-環(huán)戊二烯基，1,3-己二烯基，1，4-己二烯基，1,3-環(huán)己二烯基，1,4-環(huán)己二烯基，1,3-環(huán)庚二烯基，1,3,5-環(huán)庚三烯基和1,3,5,7-環(huán)辛四烯基。
文中，術(shù)語(yǔ)"炔基"指直鏈、支鏈或環(huán)狀炔基。典型地，所述炔基是C2-C30
炔基，例如，CVCV炔基。
文中，術(shù)語(yǔ)"芳基"指單核、多核、共軛或稠合的芳烴或芳香雜環(huán)系統(tǒng)的殘 基。芳基的例子包括苯基、萘基和呋喃基。當(dāng)芳基包含雜環(huán)芳環(huán)系統(tǒng)時(shí)，該 雜環(huán)芳環(huán)系統(tǒng)可含有1-4個(gè)獨(dú)立選自N、 O或S的雜原子。
文中，術(shù)語(yǔ)"齒素"指鹵素殘基，例如氟、氯、溴或碘。文中，提及"任選 被鹵素取代的"基團(tuán)時(shí)是指該基團(tuán)可被一個(gè)或多個(gè)鹵素取代基取代。
本發(fā)明人吃驚地發(fā)現(xiàn)，用選自18F、 123I、 76Br、 ^I或"Br的放射性同位素 放射性標(biāo)記的式(I)的化合物是選擇性TSPO配體，并可被用作TSPO的精確體 內(nèi)標(biāo)記物，因此可作為小膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)記物。這些放射性標(biāo)記的化合物因 此可用于研究許多神經(jīng)變性疾病中的神經(jīng)病理學(xué)事件，并可用作診斷這種疾病以及監(jiān)測(cè)這種疾病進(jìn)展的工具。
文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了許多類(lèi)型的TSPO配體。作為治療藥物有效的化合物不 必是可被放射性標(biāo)記的并用于成像的化合物。實(shí)際上，許多在治療上使用的藥 物對(duì)于特定靶點(diǎn)沒(méi)有選擇性并且可與許多靶點(diǎn)相互作用而產(chǎn)生治療效果。此
外，許多治療藥不具有成像所需的通常為nM級(jí)的親和力，其親和力為^M級(jí)。 此外，治療藥的代謝和親油性，尤其當(dāng)成像時(shí)以示蹤劑水平給予時(shí)，可使得該 藥不適合用于成像。
本發(fā)明人吃驚地發(fā)現(xiàn)，用選自18F、 123I、 76Br、 "I或"Br的放射性同位素 放射性標(biāo)記的式(I)的化合物可用于使TSPO成像，因此可使對(duì)象體內(nèi)小膠質(zhì)細(xì) 胞的活化情況成像。用"F、 123I、 76Br、 ^I或"Br放射性標(biāo)記的式(I)的化合物 是TSPO的選擇性配體并對(duì)TSPO具有高親和力。
用選自"F、 123I、 76Br、 ^I或"Br的放射性同位素放射性標(biāo)記的式(I)的化 合物形成鹽，且這種化合物的鹽也包括在本發(fā)明之內(nèi)。所述鹽優(yōu)選是藥學(xué)上可 接受的，但非藥學(xué)上可接受的鹽也落入本發(fā)明范圍內(nèi)。藥學(xué)上可接受的鹽的例 子包括包括藥學(xué)上可接受的陽(yáng)離子的鹽，所述陽(yáng)離子如鈉、鉀、鋰、轉(zhuǎn)、鎂、 銨和烷基銨；藥學(xué)上可接受的無(wú)機(jī)酸的酸加成鹽，所述無(wú)機(jī)酸如鹽酸、正磷酸、 硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸和氫溴酸；或者藥學(xué)上可接受的有 機(jī)酸的鹽，所述有機(jī)酸如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、馬來(lái)酸、羥基馬來(lái)酸、 延胡索酸、檸檬酸、乳酸、粘酸、葡糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、 甲磺酸、三鹵甲烷磺酸、甲苯磺酸、、苯磺酸、水楊酸、對(duì)氨基苯磺酸、天冬 氨酸、谷氨酸、依地酸、硬脂酸、棕櫚酸、油酸、月桂酸、泛酸、單寧酸、抗 壞血酸和纈草酸。
在式(I)中，R通常是CL6垸基或CL6烷氧基，其中CL6垸基或CV烷氧基
可任選被鹵素取代。
典型地，！^和R3各自是除H之外的基團(tuán)。當(dāng)R。 112或113是疏水性基團(tuán)，
該疏水性基團(tuán)例如可以是任選被鹵素取代的CL6垸基，任選被鹵素取代的芳 基，任選被鹵素取代的NHCV6烷基，任選被鹵素取代的OCL6垸基，任選被鹵 素取代的SCl6綜基，COOR6其中R6是任選被鹵素取代的Cl6院基，(CH2)nOR^
其中R6是任選被鹵素取代的CL6垸基且n是整數(shù)(如1、 2、 3、 4、 5或6)，或
11任選被鹵素取代的聚醚。當(dāng)R。 R2或R3是任選被鹵素取代的聚醚時(shí)，所述聚
醚例如可以是任選被鹵素取代的式-(0(CH2U(CH2)cCH3所示基團(tuán)，其中a是1、 2或3， b是2、 3、 4或5，而c是0、 1、 2、 3、 4或5。
各種式(I)的化合物描述于Selleri等，"(2-Arylpyrazolo[l，5-a]pyrimidin-3-yl Acetamides. New Potent and Selective Peripheral Benzodiazepine Receptor Ligands (2-芳基吡唑射l,5-a]嘧啶-3-基乙酰胺—新的有效的選擇性外周苯二氮 卓受體配體)"，說(shuō)'oorg朋/c cfe Me&c/"a/ C/ em&fr7 9 (2001) 2661-2671 ("Selleri 等(2001)")，將其納入本文作為參考。該文獻(xiàn)描述了某些具體的式(I)的化合物(該 文獻(xiàn)所述化合物3f-3y)的制備，并披露那些化合物對(duì)TSPO有親和力和選擇性 (該文獻(xiàn)中稱(chēng)為PBR)。盡管該文獻(xiàn)描述的具體化合物中的一些對(duì)CBR有一定 親和力，但該文獻(xiàn)所述化合物3f-3y中的每一種對(duì)TSPO的選擇性高于CBR。
如Sdleri等(2001)所述，該文獻(xiàn)提及的式(I)的化合物可從合適的芳?；?腈開(kāi)始采用三步驟方法制備。在所述方法中，芳?；译嬖趬A性介質(zhì)中與AUV-二乙基氯乙酰胺反應(yīng)，所得焦油通過(guò)柱層析純化以分離AUV-二乙基丁酰胺。將 AUV-二乙基丁酰胺在存在乙酸時(shí)與水合肼在乙醇中回流反應(yīng)，以得到相應(yīng)的 A^V-二乙基-(3-氨基-5-芳基吡唑-4-基)乙酰胺。A^V-二乙基-(3-氨基-5-芳基吡唑 -4-基)乙酰胺然后與合適的親電試劑(4，4-二甲氧基-2-丁酮，1,1,3,3-四乙氧基丙 垸，2，4-戊二酮，l-三氟甲基-2,4-戊二酮，1，5-三氟甲基-2，4-戊二酮，1-苯基-1,3-丁二酮，3-甲基-2,4-戊二酮，2-乙酰-3-氧代丁酸乙酯，2-乙酰-3-乙氧基丙烯酸 乙酯，苯基丙醛或l-苯基-3-二甲基氨基-2-丙-l-酮)縮合以封閉嘧啶環(huán)，從而形 成相應(yīng)的式(I)的化合物。
另一種制備各種式(I)的化合物的方法描述于Selleri， S.; Grafted, P.; Costagli， C; Bonaccini， C; Costanzo， A.; Melani， F.; Guerrini， G.; Ciciani， G.; Costa， B.; Spinetti， F.; Martini, C; Bruni， F.說(shuō)'oorgam'c朋d Mec/Z"'"fl/ C/zem/Wo;， 2005， 13， 4821-4834 ("Selleri等(2005)")，納入本文作為參考。在 該文獻(xiàn)所述方法中，使苯甲酰乙腈在堿性介質(zhì)(LiOH-H20)中與碘乙酸或碘乙酸 乙酯反應(yīng)以分別得到相應(yīng)的酸或酯(Ia和Ib)。中間體Ia和Ib在在存在乙酸時(shí) 與水合肼在乙醇中回流反應(yīng)，以得到相應(yīng)的3-氨基吡唑(2a和2b)。化合物2a 饑餓2b與2,4-戊二酮縮合以封閉嘧啶環(huán)，得到酸3a和酯3b。將酸3a轉(zhuǎn)化成該中間體與酰胺反應(yīng)以得到相應(yīng)的式(I)的化合 物。
Selleri等(2001)和Selleri等(2005)中描述的式(I)的化合物可通過(guò)那些文獻(xiàn) 中描述的方法或通過(guò)有機(jī)化學(xué)合成領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法制備。本領(lǐng)域 技術(shù)人員將了解，其他式(I)的化合物可通過(guò)與Selleri等(2001)和Selleri等(2005) 所述方法類(lèi)似的方法制備。
式(I)的化合物可通過(guò)有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域已知的修飾有機(jī)化合物的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用 18F、 123I、 76Br、 Wl或"Br放射性標(biāo)記，從而用18F、 123I、 76Br、 124I或75Br代 替化合物中的鹵素或鹵素基團(tuán)。
或者，用選自！8F、 ！23I、 76Br、 ^I或"Br的放射性同位素放射性標(biāo)記的式 (I)的化合物可通過(guò)在用于合成式(I)的化合物的開(kāi)始原料之一或中間體中摻入 18F、 123I、 76Br、 "4l或75Br作為取代基來(lái)制備。
例如，用"F、 123I、 76Br、 ^I或"Br放射性標(biāo)記的式(I)的化合物可以通過(guò) 制備具有上文定義的式(I)的化合物來(lái)制備，但其中，R2、 R3、 R4或Rs中 的一個(gè)被其上能發(fā)生無(wú)環(huán)親核取代反應(yīng)的離去基團(tuán)如甲苯磺酸根、甲磺酸根、
Br或I取代，然后將化合物置于能發(fā)生無(wú)環(huán)親核取代反應(yīng)的環(huán)境下以使18F、 123I、 76Br、 ^I或"Br取代該離去基團(tuán)。例如，當(dāng)離去基團(tuán)是Br或甲苯磺酸根 時(shí)，可使化合物在乙腈(acetonitrite)中與["F]-kryptofix-K222復(fù)合物在約8(TC反 應(yīng)10分鐘以形成用"F放射性標(biāo)記的式(I)的化合物。用1231、 76Br、 ^I或"Br 放射性標(biāo)記的式(I)的化合物也可通過(guò)形成上文定義的式(I)的化合物來(lái)形成，但 其中，R、 R,、 R2、 R3、 R4或Rs中的一個(gè)被甲錫烷基、甲硅垸基或鹵素(該鹵 素取代基通常不同于放射性同位素)取代，并在酸性介質(zhì)中用氧化劑如氯胺-T 對(duì)化合物進(jìn)行親電取代反應(yīng)以形成用123I、 76Br、 ^I或"Br放射性標(biāo)記的式(1) 的化合物。在一些實(shí)施方式中，該反應(yīng)可在室溫進(jìn)行，而在其他實(shí)施方式中， 反應(yīng)混合物被加熱至約80'C至10(rC。如上文所定義的但R、 R!、 R2、 R3、 R4 或R5中的一個(gè)被離去基團(tuán)取代的式(I)的化合物可通過(guò)與Selleri等(2001)或 Selleri等(2005)描述的制備式(I)的化合物的方法類(lèi)似的方法來(lái)制備，但合適的 反應(yīng)物被離去基團(tuán)取代?；蛘?，式(I)的化合物可通過(guò)有機(jī)化學(xué)中己知的反應(yīng)來(lái) 修飾以引入離去基團(tuán)作為R、 R4、 R2、 R3、 R4或R5中一個(gè)上的取代基。
13式(I)的化合物可用18F (半衰期110分鐘)、1231 (半衰期13.2小時(shí))、76Br (半 衰期16.2小時(shí))、124I (半衰期4.2天)或75Br (半衰期1.6小時(shí))放射性標(biāo)記。典型 地，式(I)的化合物用"F放射性標(biāo)記的。相比用具有明顯較短半衰期的放射性 同位素放射性標(biāo)記的化合物，臨床成像時(shí)更經(jīng)常使用18F、 123I、 76Br、 124I或75Br 放射性標(biāo)記的式(I)的化合物，從而可在一天內(nèi)進(jìn)行多次掃描。此外，現(xiàn)場(chǎng)沒(méi)有 回旋加速器的醫(yī)院/機(jī)構(gòu)可使用這種放射性配體，因?yàn)檫@種放射性配體可在上述 地點(diǎn)外制備并運(yùn)送到醫(yī)院/機(jī)構(gòu)，在運(yùn)輸過(guò)程中沒(méi)有明顯的活性損失。此外，對(duì) 用18F、 123I、 76Br、 ^I或"Br標(biāo)記的化合物可進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間掃描(如180分鐘)，
這使得它們更適用于大多數(shù)生物過(guò)程的研究。
用"F、 123I、 76Br、 ^或"Br放射性標(biāo)記的式(I)的化合物對(duì)TSPO有高親 和力和選擇性，并可用于對(duì)象體內(nèi)的TSPO成像。因此，用18F、 123I、 76Br、 124I 或"Br放射性標(biāo)記的式(I)的化合物可用于研究對(duì)象體內(nèi)的TSPO。
在患有神經(jīng)變性疾病的對(duì)象中，腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的TSPO表達(dá)較之未患神經(jīng)變性 疾病的對(duì)象明顯升高。因此，用"F、 123I、 76Br、 ^I或"Br放射性標(biāo)記的式(1) 的化合物可用于研究神經(jīng)變性疾病并可用來(lái)診斷和監(jiān)測(cè)神經(jīng)變性疾病的進(jìn)展。 可利用這些化合物研究、診斷或監(jiān)測(cè)的神經(jīng)變性疾病包括阿爾茨海默病、多發(fā) 性硬化、帕金森病、亨廷頓病、多系統(tǒng)萎縮癥、癲癇、腦病、中風(fēng)和腦瘤。這 些疾病中的每一種都與神經(jīng)損傷或感染有關(guān)。
根據(jù)本發(fā)明第三或第四方面的方法，用選自18F、 123I、 76Br、 124I或75Br 的放射性同位素放射性標(biāo)記的式(I)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽被給予對(duì) 象。當(dāng)式(I)的化合物用18F、 76Br、 Wl或"Br放射性標(biāo)記時(shí)，可采用本領(lǐng)域已 知的常規(guī)技術(shù)通過(guò)正電子發(fā)射體層攝影(PET)成像獲得該放射性同位素在對(duì)象 體內(nèi)的定位影像，以及對(duì)象體內(nèi)TSPO的定位。當(dāng)化合物用1231放射性標(biāo)記時(shí)， 可采用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)通過(guò)SPECT成像獲得該放射性同位素在對(duì)象體 內(nèi)的定位影像。通常，對(duì)于PET和SPECT成像，數(shù)據(jù)都是利用常規(guī)的動(dòng)態(tài)或 序列模式采集技術(shù)獲得的，在給予用"F、 123I、 76Br、 ^I或"Br放射性標(biāo)記的 式(I)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽之后立即開(kāi)始，并持續(xù)約40分鐘或更長(zhǎng) 時(shí)間。在完成數(shù)據(jù)釆集時(shí)，通常對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理以提供各自描繪了特定時(shí)間點(diǎn) 上放射性同位素在體內(nèi)的分布的三維重建的時(shí)間序列。典型地，用"F、 123I、 76Br、 1241或7&放射性標(biāo)記的式(1)的化合物或其藥 學(xué)上可接受的鹽是腸胃外給予的。典型地，用"F、 123I、 76Br、 ^I或"Br放射 性標(biāo)記的式(I)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽是通過(guò)靜脈注射或灌注腸胃外 給予的。典型地，用"F、 76Br、 ^I或"Br放射性標(biāo)記的式(I)的化合物或其藥 學(xué)上可接受的鹽是以約5-20 mCi (185-740 MBq)的劑量范圍給藥。
典型±也，用"F、 123I、 76Br、 "I或"Br放射性標(biāo)記的式(I)的化合物或其藥 學(xué)上可接受的鹽通過(guò)給予一種藥物組合物來(lái)施用，該藥物組合物包含用18F、 123I、 76Br、 ^I或"Br放射性標(biāo)記的式(I)的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽， 以及藥學(xué)上可接受的載體。
供腸胃外給予的制品的形式通常是無(wú)菌的水性或非水性溶液、懸浮液或乳 液。合適的非水性溶劑的例子包括丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄欖油，以 及可注射的有機(jī)酯類(lèi)如油酸乙酯。合適的水性載體包括水和醇性/水性溶液、 乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。合適的腸胃外載體包括氯化鈉溶液。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，其中的R是任選被鹵素取代的垸基或任選被鹵素取代的 烷氧基并含有至少一個(gè)氟基的式(I)的化合物對(duì)TSPO的活性明顯高于不含氟基 的類(lèi)似化合物。
因此，本發(fā)明還提供了式(II)的化合物，或其鹽 <formula>formula see original document page 15</formula>
式中
R是任選被鹵素取代的垸基，或任選被鹵素取代的垸氧基； R,、 R2和R3各自獨(dú)立為H或疏水性基團(tuán)；和
R4和115各自獨(dú)立為任選被鹵素取代的烷基、或任選被鹵素取代的烷氧基，和
其中，R、 R。 R2、 R3、 R4或R5中的至少一個(gè)被F取代。 式(II)的化合物的鹽優(yōu)選是藥學(xué)上可接受的，但非藥學(xué)上可接受的鹽也落 入本發(fā)明范圍內(nèi)。式(II)的化合物的非藥學(xué)上可接受的鹽可用作制備式(II)的化 合物的藥學(xué)上可接受的鹽的中間體。藥學(xué)上可接受的鹽的例子包括包括藥學(xué) 上可接受的陽(yáng)離子的鹽，所述陽(yáng)離子如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、銨和垸基銨；藥 學(xué)上可接受的無(wú)機(jī)酸的酸加成鹽，所述無(wú)機(jī)酸如鹽酸、正磷酸、硫酸、磷酸、 硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸和氫溴酸；或者藥學(xué)上可接受的有機(jī)酸的鹽，所 述有機(jī)酸如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、馬來(lái)酸、羥基馬來(lái)酸、延胡索酸、檸 檬酸、乳酸、粘酸、葡糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲磺酸、三鹵 甲垸磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、水楊酸、對(duì)氨基苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸、 依地酸、硬脂酸、棕櫚酸、油酸、月桂酸、泛酸、單寧酸、抗壞血酸和纈草酸。 典型地，在式(II)中，A和R3各自是除H之外的基團(tuán)。
典型地，R是任選被鹵素取代的CL6烷基、或任選被鹵素取代的CL6烷氧
基。在一些實(shí)施方式中，R是被F取代的CV6垸氧基，如OCH2CH2F。
典型地，R!、 R2和R3各自獨(dú)立選自H， Cl6院基，芳基，NHCw烷基，
OCL6烷基，Sd-6垸基，COOR6其中R6是d-6烷基(如甲基、乙基或丙基)，
(CH2)。OR6其中R6是CL6烷基且n是整數(shù)(如1、 2、 3、 4、 5或6)，以及聚醚， 其中，這些基團(tuán)中的任何一個(gè)(H除外)可任選被鹵素取代。當(dāng)R。 R2或R3是 任選被鹵素取代的聚醚時(shí)，所述聚醚例如可以是任選被鹵素取代的式 -(0(CH2)a)b(CH2)eCH3所示基團(tuán)，其中a是l、 2或3， b是2、 3、 4或5，而c 是0、 1、 2、 3、 4或5。
在一些實(shí)施方式中，R4和R5各自獨(dú)立選自CL6烷基或Q.6烷氧基，其中， cl6烷基或cl6垸氧基可任選被鹵素取代。
在一些實(shí)施方式中，R是被F取代的cl6垸氧基，R。 R2和R3各自獨(dú)立
選自H， Cl6院基，芳基，NHCl6院基，OdV烷基，SCL6烷基，COOR6其 中R6是Cw垸基，(CH2)nOR6其中R6是CL6烷基且n是整數(shù)，和聚醚，且R4 和R5各自獨(dú)立選自CL6烷基或CL6垸氧基。
式(II)的化合物對(duì)TSPO有選擇性并激活TSPO。 TSPO的活化與神經(jīng)類(lèi)固醇合成增加有關(guān)。因此TSPO的活化可提高腦內(nèi)神經(jīng)類(lèi)固醇的濃度。這些神經(jīng) 類(lèi)固醇，包括孕酮和脫氫表雄酮以及它們的代謝物，正性調(diào)節(jié)，氨基丁酸
(GABA)神經(jīng)遞質(zhì)從而導(dǎo)致非鎮(zhèn)靜的抗焦慮效應(yīng)，這種效應(yīng)對(duì)于記憶和應(yīng)激相 關(guān)疾病有治療益處。式(II)的化合物也可用作治療神經(jīng)變性疾病的神經(jīng)保護(hù)劑、 作為抗炎藥、以及作為抗焦慮藥。
因此，在另一方面，本發(fā)明提供了一種治療對(duì)象的神經(jīng)變性疾病、炎癥或
焦慮癥的方法，該方法包括給予該對(duì)象治療有效量的式(n)的化合物或其藥學(xué)
上可接受的鹽?？捎迷摲椒ㄖ委煹纳窠?jīng)變性疾病包括阿爾茨海默病，多發(fā)性硬
化，帕金森病，亨廷頓病，多系統(tǒng)萎縮癥，癲癇，腦病，中風(fēng)和腦瘤。式(n) 的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽通常是通過(guò)給予包含式(n)的化合物或其藥學(xué) 上可接受的鹽的藥物組合物而施用的。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含式(n)的化合物或其 藥學(xué)上可接受的鹽以及藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明第七個(gè)方面所述的組合物包含至少一種式(n)的化合物或其藥學(xué)上 可接受的鹽以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體，并任選包含其他治療劑。合 適的組合物包含那些適合口服、直腸、鼻、局部(包括含服和舌下)、陰道或腸 胃外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和真皮內(nèi))給藥的物質(zhì)。該組合物可方便地以單 位劑型存在，并可通過(guò)藥物領(lǐng)域熟知的方法制備。這種方法包括使活性成分與 構(gòu)成一種或多種輔助成分的載體相結(jié)合的步驟。通常，該組合物是通過(guò)使式(n) 的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽與液態(tài)載體、稀釋劑、佐劑和/或賦形劑或者細(xì) 致分散的固態(tài)載體，或者這兩者，均勻而密切地結(jié)合而制備的，如果需要的話(huà) 然后可使產(chǎn)物成形。
術(shù)語(yǔ)"對(duì)象"在文中指任何動(dòng)物。所述對(duì)象可以是哺乳動(dòng)物，如人。在一些 實(shí)施方式中，所述對(duì)象是伙伴動(dòng)物如狗或貓、馴養(yǎng)動(dòng)物如馬、小型馬、驢、騾、 駱駝、羊駝、豬、奶牛或綿羊，或動(dòng)物園動(dòng)物如靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、貓科動(dòng)物、犬科 動(dòng)物、?？苿?dòng)物或有蹄類(lèi)動(dòng)物。
文中，術(shù)語(yǔ)"治療有效量"指有效產(chǎn)生所需治療反應(yīng)的化合物的量。具體的 "治療有效量"將隨要治療的具體癥狀、對(duì)象的身體狀況、要治療對(duì)象的類(lèi)型、 治療持續(xù)時(shí)間、并行治療(如果有的話(huà))的特性、以及采用的具體制劑等因素變
17化，且主治醫(yī)師將能夠決定合適的治療有效量。例如，主治醫(yī)師可根據(jù)其他神
經(jīng)活性化合物或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)決定式(n)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽
的合適的治療有效量。在一些實(shí)施方式中，式(II)的化合物或其藥學(xué)上可接受
的鹽的給藥劑量可以約為l-20mg/kg體重/天。
文中，"藥學(xué)上可接受的載體"是用來(lái)將化合物遞送給對(duì)象的藥學(xué)上可接受 的溶劑、懸浮劑或載體。所述載體可以是液態(tài)或固態(tài)，并可根據(jù)計(jì)劃的給藥方 式選擇。載體是"藥學(xué)上可接受的"是指不是生物學(xué)上或其他方面不需要的，即 該載體可與活性成分一起給予對(duì)象而不會(huì)造成任何或?qū)嵸|(zhì)性不良反應(yīng)。
式(II)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽可采取含有常規(guī)的藥學(xué)上可接受的 無(wú)毒載體的劑量單位形式通過(guò)口服、局部或腸胃外(如通過(guò)皮下注射，通過(guò)氣 溶膠給予肺部或鼻腔，或通過(guò)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鞘內(nèi)或顱內(nèi)注射或灌注技術(shù))給 予。式(II)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽可作為片劑、水性或油性懸浮液、 錠劑、含片、粉末劑、顆粒劑、乳液、膠囊、糖漿劑或酏劑口服給予。供口服 的組合物可包含一種或多種選自下組的試劑以得到美觀且可口的藥物制品甜
味劑、調(diào)味劑、著色劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、延時(shí)劑和防腐劑。合適的甜味劑包 括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴特或糖精。合適的崩解劑包括玉米淀粉、甲基 纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、黃原膠、膨潤(rùn)土、藻酸或瓊脂。合適的調(diào)味劑包括 薄荷油、冬青油、櫻桃、橙子或覆盆子香精。合適的防腐劑包括苯甲酸鈉、維
生素E、 ct生育酚、抗壞血酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯或亞硫
酸氫鈉。合適的潤(rùn)滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂酸、油酸鈉、氯化鈉或滑石。合適 的延時(shí)劑包括甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。
供腸胃外給藥的制品的形式通常是無(wú)菌的水性或非水性溶液、懸浮液或乳
液。合適的非水性溶劑的例子包括丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄欖油，以 及可注射的有機(jī)酯類(lèi)如油酸乙酯。合適的水性載體包括水和醇性/水性溶液、 乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。合適的腸胃外載體包括氯化鈉溶液。也 可存在防腐劑和其他添加劑，如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、生長(zhǎng)因子、 惰性氣體，等等。
通常，術(shù)語(yǔ)"治療"等在文中用來(lái)表示使對(duì)象獲得所需藥理學(xué)和/或生理效 應(yīng)。所述效應(yīng)可以是預(yù)防性的，即完全或部分防止疾病或病癥或其征兆或癥狀，
18和/或可以是治療性的，即部分或完全治愈疾病或病癥。"治療"在文中涵蓋對(duì)脊 椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物，尤其是人類(lèi)的疾病或病癥的任何處理，并包括(a)防止 疾病或病癥在可能對(duì)于這種疾病或病癥易感但還未被診斷為患有該疾病或病 癥的對(duì)象中發(fā)生；(b)抑制疾病或病癥，即延遲疾病或病癥的發(fā)展；或(C)緩解 或改善疾病或病癥的影響，即使疾病或病癥的影響減退。
實(shí)施例
下面參考以下非限制性實(shí)施例描述了本發(fā)明的實(shí)施方式。 實(shí)施例1合成DPA-714和["F]DPA-714 1.合成DPA-714
方案1.合成PBR配體DPA-714及其甲苯磺酰基前體8; (i)乙腈，甲醇 鈉；(ii)A/^-二乙基氯-乙酰胺，碘化鈉，NaOH/80%EtOH; (iii)水合肼，EtOH， 乙酸；(iv)2,4-戊二酮，EtOH. (Selleri等，2001); (v) 48% HBr/PTC; (vi)7，三 苯基膦，DIAD; (vii)三苯基膦，2-氟乙醇，DMF， DIAD。
3-(4-甲氧基-苯萄-3-氧代-丙腈(2)
將4-甲氧基苯甲酸甲酯(30 g， 181 mmol)和甲醇鈉(9.75 g， 181 mmol)的 混合物在氬氣下8(TC加熱，并連續(xù)攪拌直至均勻。在混合物中逐滴加入乙腈 (16.5 ml， 313 mmol)和氯苯(19 ml)。反應(yīng)物在90-100。C加熱24小時(shí)并連續(xù)攪
19拌。將混合物冷卻至約0。C并用冰水(約50ml)和二乙醚(約200 ml)處理，振蕩 直至固體物質(zhì)溶解。將水層與有機(jī)層分離并用稀硫酸酸化至pH2。加入二乙醚 之后萃取有機(jī)層，用無(wú)水Na2S04干燥并蒸發(fā)至干。將所得黃色固體溶于CHC13 并用飽和NaHC03水溶液洗滌(5x 100 ml)以除去苯甲酸。有機(jī)層用無(wú)水NaS04 干燥并蒸發(fā)至干。固體用石油醚洗滌純化，得到精細(xì)的淡黃色晶體狀的2(2.91 g， 9%); mp: 132-137。C; ^n.m.r.(CDCl3， 300 MHz) S 3.89 (s， 3H， OCH3)， 4.03 (s， 2H， CH2)， 6.97 (d， J=9.0， 2H， Ph)， 7.90 (d， J = 9.0， 2H， Ph)。 3-氰基-N,N-二乙基-4-(4-甲氧基-苯基)-4-氧代-丁酰胺(3) 將2 (2.0 g， 11.4 mmol)、N,N-二乙基氯乙酰胺(1.7 g， 11.4 mmol)和Nal (5.1 g， 34 mmol)的混合物加入用80% EtOH (80 ml)配制的NaOH (0.5 g， 12.5 mmol) 溶液，同時(shí)連續(xù)攪拌。混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)并通過(guò)TLC監(jiān)測(cè)。 一旦反應(yīng) 完成便將其冷卻并過(guò)濾以除去無(wú)機(jī)物質(zhì)。將濾液濃縮，殘余物通過(guò)柱層析 (CH2Cl2作為洗脫液)純化以得到暗黃色油狀的3 (2.1 g,64 %); n.m.r. (CDC13， 300 MHz) 5 1.06-1.30 (m， 6H， N(CH2CH3)2)， 2.85 (dd， J=4.5， 16.2 Hz， 1H， CH2)， 3.21-3.43 (m， 5H: 4H， N(CH2CH3)2: 1H， CH2)， 3.卯(s， 3H， OCH3)， 4.89-5.02 (m， 1H， CH)， 6.98 (d， J=8.7， 2H， Ph)， 8.05 (d， J=9.0， 2H， Ph)。 質(zhì)譜CI， m/z289 (M+ 1)。
2-[3-氨基-5-(4-甲氧基-苯基)-lH-吡唑-4-基]-N,N-二乙基乙酰胺(4) 在EtOH(37 ml)配制的3 (2.1 g， 7.3 mmol)的溶液中加入水合肼(0.73 g， 14.6 mmol)和乙酸(0.73 ml)。將混合物加熱回流4小時(shí)并通過(guò)TLC監(jiān)測(cè)。 一旦反應(yīng) 完成便使其冷卻至室溫。將溶液蒸發(fā)至干，殘余物通過(guò)硅膠柱層析 (CH2Cl2/MeOH， 10:1 v/v，作為洗脫液)純化。將純化產(chǎn)物重溶于CH2C12并用 飽和NaHC03水溶液洗滌(4x20 ml)以除去乙酸。這樣得到黃色晶體狀的4 (1.52 g， 68%); mp: 154.5-157.5°C; ^ n.m.r. (CDC13， 300 MHz) 5 0.90-1.10 (m， 6H， N(CH2CH3)2)， 3.04-3.33 (m， 4H， N(CH2CH3)2)， 3.50 (s， 2H， CH2)， 3.85 (s， 3H， OCH3)， 6.98 (d， J=8.7， 2H， Ph)， 7.32 (d， J=9.0, 2H， Ph)。
將^>^-二乙基-2-[2-(4-甲氧基-苯基)-5,7-二甲基吡唑并[1,5-01]嘧啶-3-基]-乙酰胺(5) 2,4-戊二酮(0.4 g，4 mmol)加入EtOH (20 ml)配制的4 (1.2 g，4 mmol) 的溶液。將混合物加熱回流12小時(shí)。使反應(yīng)混合物冷卻并將溶劑蒸發(fā)至干。殘余物通過(guò)硅膠柱層析(CHCVMeOH， 40:1 v/v作為洗脫液)純化，得到淡黃色 晶體狀的5(1.37g， 93%); mp: 120.5-123.5。C;H n.m.r. (CDC13， 300 MHz) S 1.09-1.22 (m， 6H， N(CH2CH3)2)， 2.54 (s， 3H， 5-CH3)， 2.74 (s， 3H， 7-CH3)， 3.39-3.51 (m， 4H， N(CH2CH3)2)， 3.85 (s， 3H， OCH3)， 3.91 (s, 2H， CH2), 6.51 (s， 1H， H-6)， 6.98 (d， J=9.0， 2H， Ph)， 7.76 (d， J=9.0， 2H， Ph)。
N,N-二乙基-2-[2-(4-羥基-苯基)-5,7-二甲基-卩比唑并[l,5-a]嘧啶-3-基]-乙酰 胺(6)
將5(0.43g， 1.16mmo1)，溴化十六烷基三丁基l粦(0.06 g， 0.116 mmol)和 45% HBr (6 ml)的溶液在IO(TC邊攪拌邊加熱7小時(shí)。反應(yīng)混合物用NaHC03 堿化至pH 8-9并用CH2Cb萃取。收集有機(jī)層并用無(wú)水NaS04干燥。真空除去 溶劑，殘余物通過(guò)柱層析(CHCl3/MeOH， 40:1 v/v作為洗脫液)純化，得到象牙 色晶體6 (220 mg， 54%); mp: 242.5陽(yáng)247。C; 'H n.m.r. (CDC13， 300 MHz) S 1.06-1.18 (m， 6H, N(CH2CH3)2)， 2.54 (s， 3H， 5-CH3)， 2.73 (s， 3H， 7-CH3)， 3.34-3.51 (m， 4H， N(CH2CH3)2)， 3.96 (s， 2H， CH2)， 6.49 (s， 1H， H-6)， 6.79-6.82 (d， J=8.7， 2H, Ph)， 7.61-7.64 (d， J=8.4， 2H， Ph);(實(shí)測(cè)值，C， 66.35; H， 6.71; N， 15.38。 C20H24N4O2.l/2H2O理論值C， 68.16; H， 6.86; N， 15.90%)。 質(zhì)譜CI， m/z353 (M+l)。
甲苯-4-磺酸2-羥基-乙酯(7)
在二氯甲垸(10ml)中的1，2-乙二醇(62mg， 1 mmol)溶液中邊攪拌邊加入新 鮮氧化銀(350 mg， 1.5mmo1)、對(duì)甲苯磺酰氯(210 mg， 1.1 mmol)和碘化鉀(33 mg， 0.2 mmol)。將反應(yīng)混合物室溫?cái)嚢?小時(shí)，通過(guò)小硅藻土墊過(guò)濾并用油 酸乙酯洗漆。除去溶劑，粗產(chǎn)物通過(guò)柱層析(CH2Cl2MeOH， 40:lv/v作為洗脫 液)純化，得到透明油狀的單甲苯磺酸酯產(chǎn)物7，產(chǎn)率為46%。 iHiLmx^DC^, 300 MHz) S: 7.81 (d， 2H， J = 8.1)， 7.36 (d， 2H， J=8.1)， 4.15(d， 2H， J=9.0)， 3.82 (d， 2H， J=9.0)， 2.46 (s， 3H)。
甲苯-4-磺酸2-[4-(3-二乙基氨甲?；谆?5,7-二甲基-吡唑并-[l，5-a]嘧啶 -2_基)-苯氧基]-乙酯(S)
二異丙基偶氮二羧酸酯(DIAD， 0.48 ml， 2.4 mmol)加入6 (400 mg， 1.1 mmol)三苯基膦(637 mg, 2.4 mmol)和2-羥基乙基甲苯磺酸根(525 mg， 2.4mmol)的溶液在干燥THF(10ml).反應(yīng)混合物室溫?cái)嚢?0小時(shí)并蒸發(fā)至干應(yīng) 余物通過(guò)硅膠柱層析(CHQ3/MeOH， 80:1 v/v作為洗脫液)產(chǎn)生淡黃色晶體8， 產(chǎn)率85。/。？Hn.m.r.(CDCl3， 300應(yīng)z)8: 7.83 (d， 2H， J=8.1)， 7.74 (d， 2H， J=9.0)， 7.35 (d， 2H， J= 8.1)， 6.86 (d， 2H， J= 9.0)， 6.52 (s， 1H)， 4.37 (d， 2H， J=4.8)， 4.19 (d， 2H， J=4.8)， 3.92 (s， 2H)， 3.39-3.52 (m， 4H)， 2.74 (s， 3H)， 2.56 (s， 3H)， 2.45 (s， 3H)， 1.08-1.23 (m， 6H);(實(shí)測(cè)值，C， 63.37; H， 5.96; N， 9.89。質(zhì)譜CI， m/z 551 (M + 1)。
^^二乙基-2-{2-[4-(2-氟-乙氧基)-苯基]-5，7-二甲基-吡唑并[1,5-01]嘧啶-3-基}-乙酰胺(DPA-714)
在無(wú)水DMF(6ml)中的6(150mg， 0.43 mmol)、三苯基膦(274 mg， 0.94 mmol)和2-氟乙醇(60 mg， 0.94 mmol)的溶液中加入二異丙基偶氮二羧酸酯 (DIAD， 190 mg， 0.94 mmol)。將反應(yīng)混合物室溫?cái)嚢?8小時(shí)然后蒸發(fā)48小 時(shí)再然后蒸發(fā)至干。殘余物通過(guò)硅膠柱層析(CHCyMeOH， 80:lv/v作為洗脫 液)純化，得到淡黃色晶體狀的DPA-714，產(chǎn)率為47%。 1Hn.m.r.(CDCl3， 300 MHz)S: 7.78 (d， 2H， J=9.0Hz)， 6.52 (s, 1H)， 7.01 (d， 2H， J=9.0Hz)， 4.78 (dt， 2H， J=4， 47Hz)， 4.26 (dt， 2H， J=4， 28Hz)， 3.93 (s， 2H)， 3.39-3.51 (m， 4H)， 2.75 (s， 3H)， 2.56 (s， 3H)， 1.09-1.27 (m， 6H);(實(shí)測(cè)值，C， 66.70; H， 6.60; N， 13.14。質(zhì)譜CI， m/z399 (M+l)。
2.放射性合成["F]DPA-714
K[18F〗FK222
CH3CN， 85°C， 5分鐘 USaLyDPA-714
放射性同位素制備。在PETtrace回旋加速器(瑞典GE醫(yī)療公司(GE Healthcare, Sweden))上制造未加入載體的水性["F]氟化物離子，方法是應(yīng)用 16.5 MeV質(zhì)子束在95。/。富集的卩S0]-H20上通過(guò)卩S0(p,nysF]核反應(yīng)激發(fā)0.8 mL水靶。制備["F]-kryptofix-K222。將[180]富集的H20中的["F]氟化物轉(zhuǎn)移至GE TRACERlab MXFDG合成儀并使其在真空下通過(guò)陰離子交換樹(shù)脂(Sep-Pak Waters Accell Light QMA柱，碳酸酯形式，制備時(shí)用10 mL 0.5 M K2C03洗 滌然后用10mL水沖洗)。捕獲的["F]氟化物離子然后用含有K2C03(7mg溶于 300 ^tL純水)、300 乙腈和22 mg Kryptofix 222 (K222: 4，7,13,16,21,24-六氧 雜-l，10-二氮雜二環(huán)[8.8.8]二十六烷)的洗脫液從Sep-Pak柱上洗脫下來(lái)并轉(zhuǎn)移至 反應(yīng)容器。加入等份乙腈并在每次加入后將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干(3次每次 80pL)。蒸發(fā)在氮?dú)饬骱驼婵障掠?5。C進(jìn)行。
制備并配制["F]DPA-714。將甲苯磺酸酯前體(7)溶于3 mL乙腈并加入無(wú) 水["F]-kryptofix-K222配合物。使混合物在85'C反應(yīng)5分鐘。反應(yīng)完成后用注 射水Waters for Injections BP (WFI BP)稀釋反應(yīng)混合物并通過(guò)tC-18 Sep-Pak柱。 反應(yīng)容器用WFI沖洗后再次通過(guò)tC18 Sep-Pak柱。tC18捕獲的放射性標(biāo)記的 產(chǎn)物再用WFI(總共40mL)沖洗三次。然后用EtOH (2mL)和WFI (3mL)將產(chǎn)物 從tC18 Sep-Pak柱上洗脫下來(lái)。使所得溶液通過(guò)0.22 Millipore CATHIVEX 無(wú)熱原無(wú)菌濾膜以除去顆粒物質(zhì)，然后進(jìn)行HPLC純化。將粗制混合物注射到 HPLC Waters XTerra RP C-18 10pm (7.8 x 300 mm)半制備型反相柱上。采用的 流動(dòng)相為0.1 MNH4Ac: CH3CN(pH=10): (60/40， v:v)，流速為4.0毫升/分鐘， [18F]DPA-714的保留時(shí)間(tR)為12.42分鐘。收集對(duì)應(yīng)于["F]DPA-714的放射性 組分并真空蒸發(fā)。殘余物在WFI BP (4 mL)中重建并通過(guò)無(wú)菌13 mm Millipore GV0.22pm濾膜過(guò)濾入無(wú)菌無(wú)熱原的真空瓶?jī)?nèi)。如此得到["F]DPA-714，產(chǎn)率 為10%(n=6)無(wú)衰變校正放射性化學(xué)物質(zhì)。DPA-714的質(zhì)控。為測(cè)定比放射活性和放射化學(xué)純度，將已知體積和 放射活性的等份最終溶液注射到分析型反相HPLC柱(Waters XTerra C18 5pm (4.6 x 150 mm)。洗脫用的流動(dòng)相為0.1 MNH4Ac: CH3CN (pH,: (50:50; v:v)，流速為2.0毫升/分鐘，[18"0 八-714的保留時(shí)間(110為2.23分鐘。在對(duì)應(yīng) 于載體產(chǎn)物的254 nm下測(cè)量(積分)HPLC色譜圖上UV吸收峰的面積，并與將 質(zhì)量與UV吸收進(jìn)行關(guān)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行比較。放射化學(xué)和化學(xué)純度大于98W， 比活為1680GBq/pmo1。實(shí)施例2 DPA-714的體外結(jié)合親和力
為進(jìn)行結(jié)合研究，線(xiàn)粒體按之前的描述(TrapaniG， FrancoM， RicciardiL 等，Synthesis and binding affinity of 2-phenylimidazo[l,2-alpha]pyrimidin derivatives for both central and peripheral benzodiazepine receptor. A new series of high-affinity and selective ligands for the peripheral type(新系歹U的夕卜周類(lèi)型的高 親和力和選擇性配體一中央和外周苯二氮卓受體的2-苯基咪唑并[l，2-a]嘧啶衍 生物的合成和結(jié)合親和力)./owma/ C/zem^fry. 1997; 40:3109-3118
以及CampianiG， NacciV， Fiorinil等，Synthesis, Biological Activity, and SAR of Pyrrolo benzoxazepine Derivatives ， a New Class of Specific "Peripheral-Type" Benzodiazepine Receptor Ligands (新的一類(lèi)特異性"外周型"苯二氮卓受體配體 一吡唑并苯并噁氮卓衍生物的合成、生物活性和SAR). Jow加/ 0 em/^y. 1996; 39:3435-3450)經(jīng)細(xì)微改進(jìn)從經(jīng)頸脫臼處死的雄性Wistar大鼠 的腎臟制備。在玻璃勻漿器內(nèi)用特氟隆研體將腎臟勻漿在含有蛋白酶抑制劑 (160嗎/mL節(jié)脒，200(xg/mL桿菌肽(bacitracine)和20 (xg/mL大豆胰蛋白酶 抑制劑)的20倍體積的冰冷的50 mM Tris/HCl， pH 7.4， 0.32 M蔗糖和1 mM EDTA(緩沖液A)中，并在4t:下600g離心10分鐘。所得懸浮液在4t:下10,000g 離心10分鐘。然后將沉淀重懸于20倍體積冰冷的緩沖液A中，并在4t;下 10,000g離心10分鐘。粗制的線(xiàn)粒體沉淀在-20。C冷凍直至測(cè)定或與0.6 nM 卩H]PK11195—起在50mMTris/HCl， pH 7.4 (緩沖液B)中培育，待測(cè)化合物的 濃度范圍為0.1nM-10pM，總體積為0.5mL，在4'C下培育90分鐘。用冰冷 的緩沖液B稀釋至5 mL以終止培育，然后立即通過(guò)玻璃纖維Whatman GF/C 濾器快速過(guò)濾。濾器然后用緩沖液B洗滌(2 5mL)，并通過(guò)功效設(shè)定為66%的 Packard 1600 TR液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定濾器上保留的放射活性的量。在存在未標(biāo) 記的1 pMPK 11195時(shí)分別評(píng)估各種情況下的非特異性結(jié)合。測(cè)定ICso值并根 據(jù)Cheng和Prusoff的方程(Cheng Y-C， Prusoff WH. Relationship between the inhibition constant (KI) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (150) of an enzymatic reaction(抑制常數(shù)(KI)和能夠抑制50%酶反應(yīng)的 抑制劑濃度(I50)之間的關(guān)系).5/oc/ eAm'cfl/P/zamzflco/ogy. 1973; 22:3099-3108) 推測(cè)得到Ki值。通過(guò)Lowry等(LcwxyOH， RosebroughNJ, FairAL， Randall
24RJ. Protein measurement with the folin phenol reagent(用福林酚試齊U領(lǐng)!j量蛋白質(zhì)) /owm"/o/5/o/og/ca/C/^m/W7. 1951; 193:265-275)的方法估算蛋白質(zhì)濃度，以 牛血清作為標(biāo)準(zhǔn)品。
采用[SH]PK11195作為放射性配體并以大鼠腎柱子作為受體來(lái)源通過(guò)膜結(jié) 合實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)DPA-714對(duì)TSPO的親和力。為確保DPA-714的選擇性，用^H]Ro 15-1788和大鼠腦組織來(lái)評(píng)價(jià)其與CBR的結(jié)合。結(jié)果示于表1。如表1所示， 在相同試驗(yàn)中，DPA-714的親和力(Ki = 7.0 nM)不如DPA-713的(Ki = 4.7 nM) 高，但高于PK 11195的(IQ = 9.3 nM)。所有三種TSPO配體，DPA-714、 DPA-713 和PK 11195對(duì)CBR的親和力可忽略。
表1.配體對(duì)TSPO和CBR的親和力，采用[3H]PK 11195和卩H]Ro 15-1788 作為放射性配體，并分別以大鼠腎包膜和大鼠腦組織作為受體來(lái)源。各配體的 LogD值通過(guò)HPLC測(cè)定c
配體A (nM) TSPO(nM) CBRLogD
DPA-7147.0> 10,0002.44
DPA-7134.7〉10,0002.44
PK 111959.3> 10,0003.35
實(shí)施例3刺激神經(jīng)類(lèi)固醇產(chǎn)生
在該實(shí)施例中，采用充分開(kāi)發(fā)的類(lèi)固醇生成試驗(yàn)(Selleri S， Bruni F， Costagli C等，"2-芳基吡唑射l,5-a]嘧啶-3-基乙酰胺—新的有效的選擇性外周苯二氮卓 受體配體".MeWc/"fl/ Ozem/Wo;. 2001; 9:2661-2671)評(píng)價(jià)了 DPA-714提高孕烯醇酮合成的能力。
孕烯醇酮試驗(yàn)的結(jié)果(示于圖l)證實(shí)，DPA-714刺激類(lèi)固醇產(chǎn)生的功效顯 著高于DPA-713和廣泛使用的PBR配體PK11195和Ro5-4864。
細(xì)胞培養(yǎng)
大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞在添加有10%FBS, 2mML-谷氨酰胺，100單位/mL 青霉素和100 pg/mL鏈霉素的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)在 37°C、 5%(:02/95%空氣的潮濕氣氛下進(jìn)行。
類(lèi)固醇生物合成試驗(yàn)
25將C6細(xì)胞以約1 x 106細(xì)胞/孔的密度接種于24孔板，終體積為1 ml。測(cè) 量孕烯醇酮產(chǎn)量之前細(xì)胞用由140mMNaCl、 5mMKCl、 1.8mMCaCl2、 1 mM MgS04、 10mM葡萄糖、10 mM HEPES/NaOH， pH7.4，加0,P/。BSA構(gòu)成的
單鹽培養(yǎng)基洗滌三次。試驗(yàn)期間，將細(xì)胞與該單鹽培養(yǎng)基一起在37t;空氣培養(yǎng)
箱中孵育。為測(cè)量分泌到培養(yǎng)基中的孕烯醇酮，在單鹽培養(yǎng)基中加入曲洛司坦
(25 pM)和SU 10603 (10 ^M)(分別為3|3-羥基類(lèi)固醇脫氫酶和17a-羥化酶的抑 制劑)以阻斷其進(jìn)一步代謝，如之前所述(Campiani B， Nacci V， Fiorinil等， 新的一類(lèi)特異性"外周型"苯二氮卓受體配體一吡唑并苯并噁氮卓衍生物的合 成、生物活性和SAR， ^wma/o/Mecfc/wa/C/^w/Wo/ 1996; 39:3435-3450)。在 C6細(xì)胞中加入新化合物以及加入PK 11195、 Ro 5-4864或氯硝西泮能將單鹽培 養(yǎng)基徹底改變成含有適當(dāng)濃度(40 ^M)化合物的培養(yǎng)基。每次實(shí)驗(yàn)期間所有孔 的乙醇終濃度是恒定的且不超過(guò)0.5% (v/v)，濃度本身對(duì)于類(lèi)固醇產(chǎn)生沒(méi)有影 響。在培育期(2h)結(jié)束時(shí)，保留細(xì)胞培養(yǎng)基并1500g離心10分鐘。分泌到培養(yǎng) 基中的孕烯醇酮的量通過(guò)放射免疫測(cè)定(RIA)定量測(cè)定，測(cè)定采用獲自美國(guó)加 州ICN生物化學(xué)公司(ICN Biochemical Inc.， CA， USA)的抗體在供應(yīng)商推薦的 條件下進(jìn)行。按照之前描述的方法(Lowry OH, Rosenbrough NJ， Farr AL， Randall RJ.用福林酚試劑測(cè)量蛋白質(zhì).J5fo/CAem. 1951; 193; 265-275)測(cè)定細(xì)胞蛋白 質(zhì)濃度。
結(jié)果示于圖1。如圖1所示，DPA-714刺激孕烯醇酮合成水平高出基線(xiàn)80^， 明顯比PK 11195和Ro 5-4864有效。在相同試驗(yàn)中，DPA-713顯示對(duì)于類(lèi)固醇 產(chǎn)生沒(méi)有影響。
實(shí)施例4離體["F]DPA-714的嚙齒動(dòng)物研究
離體實(shí)驗(yàn)采用重300-320g的成年雄性Wistar大鼠(Janvier ， Le Genest-St-Isle，法國(guó))。所有過(guò)程按照關(guān)于實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理的歐洲社團(tuán)委員會(huì)指 令86/609/EEC(European Community Council Directive 86/609/EEC)進(jìn)行。動(dòng)物 在12小時(shí)晝/夜循環(huán)條件下養(yǎng)殖(溫度22.4 ± 0.5°C;濕度40.3 ± 7.2%)并可隨意
獲得水和食物。
喹諾酮酸(QA， Quinolonicacid)損傷大鼠用異氟烷(4%， 500 mL/分鐘)局
26部麻醉，置于立體定位裝置(Stoelting， Phymep，巴黎，法國(guó))上并在手術(shù)期間
維持2。/。異氟烷注射(500 mL/分鐘)。暴露頭骨并用牙鉆鉆出小孔。按以下坐標(biāo)
在動(dòng)物右側(cè)紋狀體單側(cè)注射離開(kāi)前囟A， 0.7; L， -3; P， -5.5 mm(Paxinos
和Watson， 1986)。插入套管(25號(hào)，Hamilton, Massy，法國(guó))并以0.5 ^L/分鐘
的流速輸注QA溶液(300 nmol，用2pL磷酸鹽緩沖液，pH 7.4配制)。將注射
器保留在位4分鐘，然后抽出以免QA倒流。在頭骨中填入蠟，然后縫合頭皮。 生物分布研究用QA損傷一側(cè)紋狀體6天后用["F]DPA-714進(jìn)行離體生
物分布研究。通過(guò)陰莖靜脈給大鼠注射含20-37MBq [18F]DPA-714的水和EtOH
的混合物(85/15)，或者預(yù)注射PK 11195 (n = 5， 5mg/kg)、DPA-714 (n = 2， 1 mg/kg)
或DPA-713(n-2; 1 mg/kg)， 15分鐘后再注射放射性配體。僅注射放射性配
體(['SF]DPA-714)而未預(yù)注射的大鼠作為對(duì)照組(n = 6)。注射["F]DPA-714后
60分鐘處死動(dòng)物。將外周組織樣品，即血液、肌肉、骨骼、肝臟、心臟、腎上
腺和一些腦部區(qū)域(小腦，右和左紋狀體，右和左額皮質(zhì)，右和左海馬)除去，
稱(chēng)重并用(acompleterDenis)測(cè)量它們的放射活性。對(duì)于外周組織，結(jié)果表示為
(%ID/g組織)/(Q/oID/g血液)之比± SEM。對(duì)于腦，結(jié)果表示為(。/。ID/g大腦區(qū)
域)/(o/。ID/g小腦)之比士SEM。當(dāng)數(shù)據(jù)數(shù)》5時(shí)進(jìn)行斯氏t檢測(cè)。當(dāng)pO.05時(shí)
被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
結(jié)果
外周生物分布圖2顯示了["F]DPA-714分別在四個(gè)QA損傷大鼠組；對(duì) 照組(僅注射放射性配體)和三個(gè)預(yù)處理組(PK 11195、DPA-713和DPA-714)中的 外周分布。對(duì)照組的結(jié)果顯示，["F]DPA-714最多積聚在腎上腺(71.62土 35.06) 和心臟(59.26 ± 29.06)，而在骨骼(6.30 ± 0.97)、肝臟(3.36 ± 0.16)和肌肉(2.11 ± 1.13)中的積聚最少。用PK 11195 (5 mg/kg)預(yù)處理的大鼠顯著抑制心臟、骨骼 和肝臟攝取放射性配體，但不抑制腎上腺和肌肉攝取。相反，用DPA-714 (1 mg/kg)或DPA-713 (1 mg/kg)預(yù)處理能阻斷["F]DPA-714在所有外周組織內(nèi)積 聚。
大腦生物分布圖3顯示了四個(gè)QA損傷大鼠組中每一組的["F]DPA-714 的大腦分布。對(duì)照組的結(jié)果證實(shí)，與它們對(duì)應(yīng)的未損傷側(cè)相比，右(損傷)側(cè)紋狀體(4.81 ± 0.47對(duì)比0.61 ± 0.14;pO.05)和額皮質(zhì)(1.92 ± 0.86對(duì)比0.68 ±0.13， pO.05)攝入的["F]DPA-714在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著升高。而在海馬中未觀察到這一現(xiàn) 象(0.74 ± 0.13對(duì)比0.77 ±0.29)。在右紋狀體和額皮質(zhì)中，預(yù)注射PK 11195能 顯著降低["F]DPA-714的積聚(分別為1.90 ± 0.59和1.18 ±0.16， p<0.05)。預(yù)注 射DPA-714 (分別為2.00 ± 0.23和1,28 ± 0.17)或DPA-713 (分別為1.08 ± 0.08 和1.06±0.05)之后在這些相同區(qū)域同樣看到了可見(jiàn)的降低。有趣的是，與對(duì)照 相比，在PK 11195預(yù)處理組中，在左紋狀體(1.25 ± 0.48)、左額皮質(zhì)(0.99 ± 0.04)、 右海馬(1.19 ± 0.14)和左海馬(1.09 ± 0.10)內(nèi)積聚的["F]DPA-714增加。預(yù)注射 DPA-714和DPA-713之后也觀察到類(lèi)似趨勢(shì)。
實(shí)施例5體內(nèi)["F]DPA-714狒狒PET研究
選擇13歲、23.1 kg的正常雄性toma*_yay狒狒進(jìn)行PET掃描。按 照全國(guó)衛(wèi)生與醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)(NHMRC)有關(guān)供科學(xué)研究使用的非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng) 物的護(hù)理和使用實(shí)踐規(guī)范撫養(yǎng)和處理狒狒。項(xiàng)目申請(qǐng)獲得悉尼西南部健康服務(wù) (SSWAHS)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。注射的放射性配體的劑量為100 MBq [18F]DPA-714。
在澳大利亞皇家阿爾佛雷德王子醫(yī)院(Royal Prince Alfred Hospital)的PET 和核醫(yī)學(xué)科利用西門(mén)子Biograph LSO PET-CT掃描儀獲得所有PET數(shù)據(jù)。該雙 模態(tài)裝置在同一掃描架內(nèi)裝備了具有24個(gè)晶體環(huán)(crystal ring)的全-3D PET掃 描儀和雙層CT掃描儀。它在視野中央產(chǎn)生6.3 mm半高寬(FWHM)的重建PET 空間分辨率。先用氯胺酮(8mg/kg， /m)麻醉狒狒。以0，2mg氯胺酮/kg/分的劑 量速率靜脈內(nèi)(AO輸注含氯胺酮(帕內(nèi)爾實(shí)驗(yàn)室(ParnellLaboratory),澳大利亞) 鹽水以維持麻醉。半小時(shí)后狒狒還接受了 MgS04 (2 mL /v) +阿托品(l mg /m) + maxalon(5mg/m)。用塑料帶將狒狒的頭固定以使運(yùn)動(dòng)偽影最小。先進(jìn)行頭部 的CT掃描，完成后再注射放射性配體。以列表模式(list mode)采集PET數(shù) 據(jù)，之后立即注射放射性配體并持續(xù)60分鐘。阻斷研究包括在注射放射性配 體5分鐘前用PK 11195 (1.5 mg/kg)進(jìn)行預(yù)處理，而替代研究包括在注射 [18F]DPA-714后20分鐘給予冷的DPA-714 (1 mg/kg)。在總結(jié)各研究時(shí)，將列 表模式(listmode)數(shù)據(jù)按動(dòng)態(tài)掃描分類(lèi)，包括54層面(20x30s， 30x60s禾口4 x 300 s)。動(dòng)態(tài)3-D PET正弦圖用Fourier Rebinning (FORE)重新劃分(rebinned) 并重建，重建采用過(guò)濾的反投影和基于CT數(shù)據(jù)的光子衰減校正，并分散到47 個(gè)軸向?qū)又校鲗影?28 x 128體素。重建體素的尺寸為0.206 x 0.206 x 0.337 cm。以注射劑量百分?jǐn)?shù)/腦組織體積(M劑量/mL)作為單位將放射性配體攝取進(jìn) 行轉(zhuǎn)換并對(duì)時(shí)間作圖。用自動(dòng)3D配準(zhǔn)算法配準(zhǔn)兩種重建的掃描，然后定義 ROI(Eberl S， Ka皿o I， Fulton RR， Ryan A， Hutton BF， Fulham MJ. 1996. Automated interstudy image registration technique for SPECT and PET(SPECT禾口 PET的自動(dòng)交互研究圖像配準(zhǔn)技術(shù)).JA^c/Med37(1): 137-145)。
從選出的丘腦、小腦、紋狀體、皮層、顱骨和全腦的興趣區(qū)層面構(gòu)建代表 配體濃度改變與時(shí)間關(guān)系的延遲校正時(shí)間活性曲線(xiàn)。列表模式(list mode)采 集之后進(jìn)行全身PET-CT掃描，在六個(gè)床位中的每一個(gè)上進(jìn)行2分鐘，以測(cè)定 攝取放射性配體的其他部位。
結(jié)果
進(jìn)行基線(xiàn)研究，其中動(dòng)態(tài)PET腦成像開(kāi)始于i.v.給予["F]DPA-714 (100 MBq，用2ml鹽水配制，比活性為270 GBq4imol)之前數(shù)分鐘時(shí)并結(jié)束于注射 后60分鐘時(shí)。然后進(jìn)行全身采集，在六個(gè)床位中的每一個(gè)上采集2分鐘。在 基線(xiàn)研究中獲得的這種軸向腦切片PET全圖證實(shí)，[18F]DPA-714能夠透過(guò)血腦 屏障并在腦中可觀地積聚。未觀察到狒狒顱骨內(nèi)有積聚。
為測(cè)定["F]DPA-714結(jié)合的特異性進(jìn)行了阻斷研究，其中包括用TSPO配 體PK11195 (1.5 mg/kg)進(jìn)行預(yù)處理。該研究中獲得的軸向腦層面的PET全圖證 實(shí)，PK11195能有效阻斷腦攝取["F]DPA-714。最后進(jìn)行替代研究以評(píng)價(jià)放射 性配體結(jié)合的可逆性，該研究在注射["F]DPA-714后20分鐘給予冷的DPA-714 (1 mg/kg)。
圖4顯示了描繪三種PET研究(基線(xiàn)研究、阻斷研究和替代研究)中狒狒全 腦中["F]DPA-714的攝取的時(shí)間活性曲線(xiàn)(TAC)。在基線(xiàn)研究中，[18F]DPA-714 在10分鐘內(nèi)達(dá)到最大攝取并在隨后的50分鐘內(nèi)維持大致相同的攝取水平。替 代研究在最初的20分鐘內(nèi)似乎類(lèi)似于基線(xiàn)研究，然后，在注射冷的DPA-714 之后，曲線(xiàn)升高形成尖峰，然后放射性配體被完全清除。相反，用TSPO特異 性配體PK 11195預(yù)處理導(dǎo)致["F]DPA-714攝取先升高，然后迅速降至清除水平，與替代研究結(jié)果相同。
腦成像后還立即獲得了全身圖像，以研究攝取放射性配體的其他部位。這
些圖像證實(shí)在心臟、腎上腺和唾液腺中["F]DPA-714高攝取。給予放射性配體 20分鐘后注射冷的DPA-714導(dǎo)致這些外周區(qū)域內(nèi)的["F]DPA-714結(jié)合被完全 替代(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例6 ["F]DPA-714作為T(mén)SPO的PET示蹤劑在HSV腦炎大鼠模型 中與[HC]PK11195的比較
包括帕金森病和單純性皰疹性腦炎(HSE)在內(nèi)的許多神經(jīng)疾病與神經(jīng)炎癥 有關(guān)。外周苯二氮卓受體(PBR)的表達(dá)在神經(jīng)炎癥期間升高并可用[UC]PK11195 通過(guò)正電子發(fā)射體層攝影(PET)觀測(cè)。然而，[UC]PK11195顯示出低腦攝取和 高非特異性結(jié)合，并可能對(duì)顯示輕微炎癥不夠靈敏。在該研究中，在HSE大 鼠模型中評(píng)價(jià)了["F]DPA-714，并在相同模型中與[UC]PK11195進(jìn)行比較。
實(shí)驗(yàn):使相應(yīng)的甲苯磺酸酯前體與K"F/kryptofix反應(yīng)以制備["F]DPA-714。 通過(guò)TLC檢測(cè)["F]DPA-714的穩(wěn)定性。給雄性Wistar大鼠鼻內(nèi)接種1型單純 皰疹病毒(107 PFU，用1001PBS配制)或PBS(對(duì)照)。接種后一周內(nèi)，復(fù)制中 的病毒遷移到腦中并導(dǎo)致神經(jīng)炎癥。接種后第6或7天時(shí)給大鼠/.v.注射 [18F]DPA-714 (559 MBq)或[H(:]PK11195 (7822 MBq)，并分別進(jìn)行2小時(shí)和1 小時(shí)動(dòng)態(tài)PET掃描(MicroPET Focus 220)，然后進(jìn)行離體生物分布研究。
結(jié)果和討論[18F]DPA-714的放射化學(xué)產(chǎn)率為20 ± 5%，比活為10428 MBq/nmo1，放射化學(xué)純度>99%。在體內(nèi)，[18F]DPA-714緩慢轉(zhuǎn)化成極性更大 的代謝物，注射示蹤劑211時(shí)含有母體化合物的大鼠血漿的放射活性為78±1%。 [18F] DPA-714的PET圖像顯示在對(duì)照大鼠(11=3)中有低示蹤劑攝取，該值明顯 低于lh時(shí)的[UC]PK11195攝取(11=5)( =0.01)，且示蹤劑從腦中緩慢廓清 (T1/2>100分鐘)。HSE大鼠中積聚HSV-1的嗅區(qū)和的逆行腦區(qū)域的["F]DPA-714 攝取升高(90-150%)。在這些區(qū)域當(dāng)中，[UC]PK11195攝取未顯著升高。
結(jié)論這些結(jié)果證實(shí)，["F]DPA-714是一種有效的顯示神經(jīng)炎癥的示蹤劑， 并且由于炎癥和非炎癥區(qū)域更好的反差，它比[HC]PK11195更加靈敏。實(shí)施例7 DPA-714的毒性研究
在該研究中，通過(guò)靜脈途徑給大鼠施用一次DPA-714之后評(píng)價(jià)了它的潛在 毒性。
該研究包括2組共20只SPF Sprague-Dawley大鼠(每組5只雄性和5只雌 性大鼠)，7周齡，隨機(jī)分組當(dāng)天雄性大鼠重量在193.1 g和215 g之間，雌性 大鼠重量在160.6 g和180.1 g之間。動(dòng)物購(gòu)自法國(guó)查爾斯河實(shí)驗(yàn)室(Charles River Laboratories France)(Domaine des Oncins - 69592 L'Arbresle Cedex，法國(guó))。
各組如下
組l:給予載體(即0.9。/。NaCl/乙醇(9/1， (v/v))。
組2:給予5 mL/kg DPA-714
將1/10稀釋于載體(即0.9。/。NaCl/乙醇9/1， (v/v))的待測(cè)DPA-714或者載 體用0.2 pm濾膜過(guò)濾，然后通過(guò)靜脈內(nèi)途徑在約30秒內(nèi)以團(tuán)注形式給予動(dòng)物， 給藥體積為5 mL/kg。
在隨機(jī)分組當(dāng)天、D7、 D14和D15(尸檢當(dāng)天)對(duì)動(dòng)物稱(chēng)重。
在D1進(jìn)行常規(guī)觀測(cè)，給藥后60分鐘± 30分鐘進(jìn)行，再在給藥后3-4小 時(shí)觀測(cè)一次，然后每天一次持續(xù)14天。還在D1評(píng)價(jià)功能和神經(jīng)行為，給藥后 60分鐘±30分鐘進(jìn)行，然后在D7和D14進(jìn)行。每天記錄兩次死亡率，持續(xù) 14天。對(duì)14天后存活的所有動(dòng)物通過(guò)肉眼進(jìn)行尸檢。
在采取的實(shí)驗(yàn)條件下，給予載體(即0.9。/。NaCl/乙醇9/1， v/v))的動(dòng)物未顯 示任何明顯征兆且體重增加正常。尸檢時(shí)未檢測(cè)到載體對(duì)器官造成任何異常影 響。
1/10稀釋于載體(即終濃度為0.05 mg/mL)并以5 mL/kg通過(guò)靜脈內(nèi)途徑施 用的DPA-714未導(dǎo)致死亡。觀察到與對(duì)照組相比，對(duì)于雄性和雌性大鼠的體重 增加沒(méi)有影響。在以5 mL/kg通過(guò)靜脈內(nèi)給予1/10稀釋于載體DPA-714的動(dòng) 物中未觀察到有關(guān)臨床征兆。尸檢時(shí)未觀察到肉眼損傷。
在采取的實(shí)驗(yàn)條件下，以5 mL/kg給Sprague-Dawley大鼠靜脈注射一次的 DPA-714 (批號(hào)140306)未導(dǎo)致任何中毒跡象。
因此，DPA-714(批號(hào)140306)當(dāng)通過(guò)靜脈內(nèi)途徑給予時(shí)，其在雄性和雌性 Sprague-Dawley大鼠中的LD5o高于5 mL/kg。解釋
采用大鼠腎膜和卩H]PK 11195進(jìn)行的體外結(jié)合研究(實(shí)施例2)證實(shí)，
DPA-714以高親和力特異性結(jié)合TSPO。在正常和損傷大鼠內(nèi)采用microPET 進(jìn)行的生物分布研究(實(shí)施例4)顯示，[18F]DPA-714在檢測(cè)TSPO表達(dá)改變區(qū)域 時(shí)是一種高度靈敏且精確的放射性配體。這些大鼠研究還證實(shí)，[18F]DPA-714 在體內(nèi)具有良好的動(dòng)力學(xué)和穩(wěn)定性。
正常狒狒腦的PET成像(實(shí)施例5)再次證實(shí)了在大鼠研究中觀察到的結(jié) 果。實(shí)施例5的結(jié)果顯示，["F]DPA-714特異性并選擇性結(jié)合TSPO，且在TSPO 結(jié)合時(shí)未顯示物種依賴(lài)性。
DPA-714的一個(gè)新特征是其在孕烯醇酮類(lèi)固醇生成試驗(yàn)中顯著的功能活 性(實(shí)施例3)。實(shí)際上，DPA-714在刺激神經(jīng)類(lèi)固醇合成時(shí)的活性是最廣泛使 用的TSPO配體PK 11195在相同實(shí)驗(yàn)中的兩倍。
此外，與PK 11195(K,-9.3nM)相比，DPA-714具有較高的結(jié)合親和力(K, =7.0 nM)(實(shí)施例2)。 DPA-714的這種較高的結(jié)合親和力以及良好的體內(nèi)動(dòng)力 學(xué)和較低親油性意味著["F]DPA-714能夠更好地標(biāo)記TSPO。
因此，["F]DPA-714能夠被用作小膠質(zhì)細(xì)胞活化的精確體內(nèi)標(biāo)記物。更具 體地說(shuō)，[18F]DPA-714可與PET —起使用以檢測(cè)許多神經(jīng)變性疾病的最初神經(jīng) 病理學(xué)事件。這種放射性配體也可被用作研究疾病進(jìn)展和治療功效的工具?？?將["F]DPA-714用作研究疾病進(jìn)展和治療功效的工具的疾病種類(lèi)包括阿爾茨 海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷頓病、多發(fā)性硬化(MS)、多系統(tǒng)萎縮癥(MSA)、 癲癇、腦病、中風(fēng)和腦瘤。["F]DPA-714的高特異性結(jié)合和高選擇性以及其良 好的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)使其適合這種應(yīng)用。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，除了那些具體描述之外，易對(duì)這里描述的發(fā)明進(jìn) 行變化和修改。所有這種變化和修改都被認(rèn)為包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)，其特征 可從上面的描述中得出。
在隨后的權(quán)利要求書(shū)和之前的發(fā)明描述中，除非由于表達(dá)方式或必要暗示 的原因在文中另有說(shuō)明，詞語(yǔ)"包含"或其變化形式如"包括"或"含有"以 開(kāi)放式含義使用，即表示存在所列舉的特征但不排除存在或加入本發(fā)明各種實(shí) 施方式中的其他特征。
3權(quán)利要求
1. 一種用選自18F、123I、76Br、124I或75Br的放射性同位素放射性標(biāo)記的式(I)的化合物，或其鹽式中R是H、鹵素、任選被鹵素取代的烷基、或任選被鹵素取代的烷氧基；R1、R2和R3各自獨(dú)立為H或疏水性基團(tuán)；和R4和R5各自獨(dú)立為任選被鹵素取代的烷基、或任選被鹵素取代的烷氧基。
2. 如權(quán)利要求1所述的放射性標(biāo)記的化合物或其鹽，其特征在于，在式(I)中，R是任選被鹵素取代的CL6垸基或任選被鹵素取代的CL6垸氧基。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的放射性標(biāo)記的化合物或其鹽，其特征在于，在式(I)中，R。 R2和R3各自獨(dú)立選自氫；任選被鹵素取代的Cw烷基；任 選被鹵素取代的芳基;任選被鹵素取代的NHCL6垸基;任選被鹵素取代的Od.6 烷基；任選被鹵素取代的SQv烷基；COOR6，其中&是任選被鹵素取代的 Cw烷基；(CH2)nOR6，其中R6是任選被鹵素取代的CL6烷基，n是整數(shù)；以及任選被鹵素取代的聚醚。
4. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的放射性標(biāo)記的化合物或其鹽，其特征在于，在式(I)中，R4和R5各自獨(dú)立選自任選被鹵素取代的Cu6垸基或任選被鹵素取代的Cw烷氧基。
5. —種藥物組合物，其包含如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的放射性標(biāo)記的 化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽以及藥學(xué)上可接受的載體。
6. —種使對(duì)象體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(18 kDa) (TSPO)成像的方法，所述方法包括 給予該對(duì)象如權(quán)利要求l所定義的用選自18F、 123I、 76Br、 124I或75Br的放射性 同位素放射性標(biāo)記的式(I)的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽，并獲得放射性同 位素在對(duì)象體內(nèi)的定位圖。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述式(I)的化合物用18F、 76Br、 "I或"Br放射性標(biāo)記，且所述圖像通過(guò)正電子發(fā)射體層攝影(PET)成像而獲得。
8. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述式(I)的化合物用1231放射 性標(biāo)記，且所述圖像是通過(guò)SPECT成像獲得的。
9. 一種診斷對(duì)象的神經(jīng)變性疾病的方法，該方法包括給予該對(duì)象如權(quán)利要 求l所定義的用選自18F、 123I、 76Br、 ^I或"Br的放射性同位素放射性標(biāo)記的 式(I)的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽，并獲得放射性同位素在對(duì)象體內(nèi)的定 位圖以評(píng)價(jià)對(duì)象腦實(shí)質(zhì)中該化合物或其鹽的TSPO結(jié)合程度。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述神經(jīng)變性疾病是阿爾茨 海默病、帕金森病、亨廷頓病、多發(fā)性硬化、多系統(tǒng)萎縮癥、癲癇、腦病、中 風(fēng)或腦瘤。
11. 如權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述對(duì)象是人。
12. 如權(quán)利要求l所定義的用選自18F、 123I、 76Br、 ^I或"Br的放射性同 位素放射性標(biāo)記的式(I)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于對(duì)象體內(nèi) 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(18kDa)成像的藥物中的應(yīng)用。
13. —種式(II)的化合物，或其鹽<formula>formula see original document page 3</formula>式中:R是任選被鹵素取代的垸基，或任選被鹵素取代的垸氧基； R。 R2和R3各自獨(dú)立為H或疏水性基團(tuán)；和R4和R5各自獨(dú)立為任選被鹵素取代的垸基、或任選被鹵素取代的垸氧基，和其中，R、 R,、 R2、 R3、 R4或R5中的至少一個(gè)被F取代。
14. 如權(quán)利要求13所述的化合物，或其鹽，其中，R是OCH2CH2F。
15. —種藥物組合物，其包含權(quán)利要求13或14所述的化合物或其藥學(xué)上 可接受的鹽以及藥學(xué)上可接受的載體。
16. —種治療對(duì)象的神經(jīng)變性疾病、炎癥或焦慮癥的方法，所述方法包括 給予該對(duì)象治療有效量的如權(quán)利要求13或14所述的化合物或其藥學(xué)上可接受 的鹽。
17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述對(duì)象是人。
18. 如權(quán)利要求13所定義的式(II)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備 用于治療神經(jīng)變性疾病、炎癥或焦慮癥的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了用¹⁸F、¹²³I、⁷⁶Br、¹²⁴I或⁷⁵Br放射性標(biāo)記的式(I)的化合物及其鹽，以及使對(duì)象體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(18kDa)(TSPO)成像的方法，該方法包括給予用¹⁸F、¹²³I、⁷⁶Br、¹²⁴I或⁷⁵Br放射性標(biāo)記的式(I)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明還提供了氟-取代的式(II)的化合物及其鹽，以及治療對(duì)象的神經(jīng)變性疾病、炎癥或焦慮癥的方法，該方法包括給予式(II)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。
文檔編號(hào)C07D487/04GK101448834SQ200780018195
公開(kāi)日2009年6月3日 申請(qǐng)日期2007年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月19日
發(fā)明者M·L·詹姆斯, M·卡西奧 申請(qǐng)人:悉尼大學(xué)