專(zhuān)利名稱(chēng)：靶向組織蛋白酶s的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及治療腫瘤性疾病的方法以及用于這種治療的組合物。具體而言，其涉及用于治療癌癥的基于抗體的治療，以及用于抵抗腫瘤細(xì)胞對(duì)于化療的防御機(jī)制的聯(lián)合治療。
背景技術(shù)：
蛋白酶是一大組蛋白質(zhì)，其占所有基因產(chǎn)物的大約2% (RawlingsandBarrett, 1999 )。蛋白酶催化狀鍵水解而因此對(duì)于所有細(xì)胞和生物體的正常功能是重要的。蛋白水解加工事件(event)在廣泛的細(xì)胞進(jìn)程、包括骨形成、創(chuàng)傷愈合、血管生成和細(xì)胞凋亡中具有重要性。
最初認(rèn)為溶酶體半胱氨酸蛋白酶是在溶酶體中負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)非選擇性降解的酶?，F(xiàn)在已知它們負(fù)責(zé)許多重要的細(xì)胞進(jìn)程，在細(xì)胞凋亡、抗原遞呈、血凝固、消化、激素原加工和細(xì)胞外基質(zhì)重建中發(fā)揮作用(Chapman等，1997 )。
組織蛋白酶S (Cat S)是溶酶體半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶超家族的成員。截至目前，已鑒定了 ll種人組織蛋白酶，然而仍需測(cè)定每一種的具體體內(nèi)作用(Katunuma等，2003 )。組織蛋白酶B、 L、 H、 F、 0、 X和C在大多數(shù)細(xì)胞中表達(dá)，提示在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換中可能發(fā)揮作用，而組織蛋白酶S、 K、 W和V局限于特定的細(xì)胞和組織，指示其可能具有更特殊的作用(Kos等，2001; Berdowska, 2004, C7/"/ca C7 >mca勿a. 2004; 342:41-69)。
Cat S最初從牛淋巴結(jié)和脾以及從人巨噬細(xì)胞cDNA文庫(kù)克隆的人類(lèi)形式中鑒定(Shi等，頂o/ C/2亂1992; 267: 7258-7262 )。編碼Cat S的基因位于人染色體lq21上。由CatS基因編碼的996石tt對(duì)轉(zhuǎn)錄物最初翻譯成具有37.5kDa分子量的未加工前體蛋白。所述未加工蛋白主要由331個(gè)氨基酸組成15個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、99個(gè)氨基酸的前肽序列和217個(gè)氨基酸的肽。CatS最初與信號(hào)肽一起表達(dá)，進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔后所述信號(hào)狀被除去。前肽序列結(jié)合到蛋白酶活性位點(diǎn)，使其失活直到它被運(yùn)輸?shù)剿嵝詢(xún)?nèi)涵體間隔，之后除去前肽序列，并且激活蛋白酶(Baker等，2003 ProteinExprPurif .28, 93-101 )。
通過(guò)負(fù)載抗原前切割恒定鏈，Cat S被鑒定為在主要組織相容性復(fù)合物II類(lèi)(MHC-n)中介導(dǎo)抗原遞呈的關(guān)鍵酶。研究顯示CatS缺陷型小鼠通過(guò)APC遞呈外源蛋白的能力受損(Nakagawa等，/m附M",(y. 1999; 10:207-217 )。 Cat S在加工恒定鏈Ii中的特異性，允許Cat S在治療例如哮喘和自身免疫性疾病等病癥中，作為特異性的治療靶點(diǎn)(Chapman等，1997 )。
CatS的病理關(guān)聯(lián)性
蛋白酶控制的改變經(jīng)常成為許多人類(lèi)病理過(guò)程的基礎(chǔ)。溶酶體半胱氨酸蛋白酶組織蛋白酶S失控的表達(dá)(deregulated expression )和活性，與一系列病癥相關(guān)聯(lián)，所述病癥包括神經(jīng)退化疾病、自身免疫性疾病和某些惡性腫瘤。
Cat S上調(diào)與幾種神經(jīng)退化疾病相關(guān)聯(lián)。它纟皮i人為在淀粉樣前體蛋白(APP)里產(chǎn)生(3肽(AP)中發(fā)揮作用(Munger等，說(shuō)oc/^附./. 1995; 311:299-305 )并且顯示它的表達(dá)在阿爾茨海默氏病和唐氏綜合征中上調(diào)(Lemere等，1995 )。通過(guò)Cat S降解髓磷脂堿蛋白( 一種潛在自身抗原，牽涉于MS發(fā)病機(jī)理中(Beck等，2001, E r.丄J柳附"朋/. 2001; 31:3726-3736 ))的能力，Cat S在多發(fā)性硬化癥中也可發(fā)揮作用，在Creutzfeldt-Jakob病(CJD )患者中已顯示Cat S表達(dá)增加超過(guò)4倍(Baker等，2002 )。
據(jù)報(bào)道血管成形術(shù)后組織蛋白酶S在動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄中過(guò)度表達(dá)(Cheng等，Am J Pathology, 2006, 168:685-694 )。在這些病癥中，據(jù)報(bào)道CatS與整聯(lián)蛋白av(33 —起集中作為血管平滑肌細(xì)胞表面的受體。
血管生成、微血管系統(tǒng)的發(fā)展是許多正常生理過(guò)程，例如正常發(fā)育和
8創(chuàng)傷愈合內(nèi)的必需的過(guò)程。血管生成的特征在于促進(jìn)上皮細(xì)胞形成原始血管，其中一種不明確的復(fù)合相互作用存在于內(nèi)皮細(xì)胞、周?chē)奈h(huán)境和一系列促-和抗-血管生成因子之間。然而，不受控或不當(dāng)?shù)难苌杀徽J(rèn)為是一 系列廣泛疾病、包括腫瘤發(fā)展和眼部疾病的病理學(xué)的根本因素。
Cat S與血管生成的3[關(guān)系最初顯示在體外使用的Cat S缺陷型內(nèi)皮細(xì)胞中(Shi等，2003 )。已顯示微血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)分泌蛋白酶，并且允許其穿透血管基底膜以及間隙的細(xì)胞外基質(zhì)。用炎性細(xì)胞因子或血管生成因子處理培養(yǎng)的EC,刺激了CatS的表達(dá)，并且它的抑制減少了微管形成。與野生型對(duì)照相比，Cat S -/-小鼠在創(chuàng)傷修復(fù)期顯示缺陷的微血管發(fā)育(Shi等，2003 )。
Cat S在血管生成和肺瘤發(fā)展中的作用的進(jìn)一步檢驗(yàn)，在用于胰島細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中證明。已發(fā)現(xiàn)0315-/-小鼠與CatS+y+對(duì)照小鼠相比形成明顯較小的腫瘤和較少的血管生成胰島(Gocheva等，2006)。洞察支撐這種表型的分子機(jī)制，其隨后由下迷證據(jù)提供CatS能切割和失活抗-血管生成肽并且促進(jìn)有活性的前-血管生成片段(pro-angiogemc fragment)的產(chǎn)生(Wang等，2006 )。
在特殊的惡性腫瘤中也研究了 Cat S的作用。與正常組織相比，在肺部腫瘤和前列腺癌切片中顯示了 Cat S的表達(dá)明顯較高(Kos等，200,Fernandez等，2001 )，這因而提示Cat S可能在腫瘤侵襲和疾病發(fā)展中發(fā)揮作用。
最近在Cat S方面的研究證明了它在人類(lèi)星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)的重要性(Flannery等，2003 )。免疫組織化學(xué)分析顯示了來(lái)源于WHO I到IV級(jí)的一組星形細(xì)胞瘤活檢樣品中Cat S的表達(dá)，但是在正常的星形細(xì)胞、神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中無(wú)表達(dá)。在IV級(jí)腫瘤中Cat S表達(dá)出現(xiàn)最大值，并且在由IV級(jí)腫瘤衍生的培養(yǎng)物中胞外活性水平最高。
已顯示Cat S在降解例如層粘連蛋白、膠原、彈力蛋白和硫酸軟骨素蛋白聚糖等ECM大分子中具有活性(Liuzzo等，1999 )。使用U251MG IV級(jí)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的侵襲測(cè)定，在Cat S抑制劑LHVS29存在時(shí)顯示侵襲下降61 % (Flannery等，2003)。特異性靶向Cat S的抑制劑的產(chǎn)生有作為治療劑的潛力，用于緩解與 這種蛋白酶活性有關(guān)的癥狀。
在腫瘤發(fā)展中異常的細(xì)胞外半胱氨酸組織蛋白酶活性的牽涉，尤其成 為研究者的焦點(diǎn)。這些溶酶體酶中的每一種都牽涉于各種腫瘤的發(fā)展中， 認(rèn)為在肺瘤細(xì)胞中它們的異常高分泌導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解。這 種ECM組分(例如彈力蛋白和膠原)的異常破壞加速了這些異常細(xì)胞對(duì) 周?chē)＝M織的滲透和侵入。此外，在血管生成和其他分子加工過(guò)程中的 作用也歸因于不當(dāng)?shù)慕M織蛋白酶的活性(Lah和Kos, 1998 Biol Chem.. 379, 125-30; Folkman和Ingber, 1992; Fernandez等，2001 )。
大量研究集中在產(chǎn)生這種細(xì)胞外蛋白水解活性破壞性增加的根本機(jī) 制上。組織蛋白酶一皮認(rèn)為包括在ECM的降解過(guò)程中，直接通過(guò)它們的能 力降解ECM組分例如層粘連蛋白、纖連蛋白和膠原，或者間接通過(guò)激活 蛋白水解級(jí)聯(lián)中其他的蛋白酶進(jìn)行(Koblinski等，2000; Rao等，2003 )。
CatS的抑制
當(dāng)?shù)鞍酌高^(guò)度表達(dá)時(shí)，治療策略就集中在開(kāi)發(fā)用于阻斷這些酶活性的 抑制劑。針對(duì)組織蛋白酶的特異性小分子抑制劑，由于選擇性和特異性問(wèn) 題其產(chǎn)生在過(guò)去證明是困難的。二肽a -酮-P _醛作為針對(duì)Cat S的有效 可逆抑制劑由Walker等開(kāi)發(fā)，具有抑制Cat B和L的能力，雖然以較低效 力(Walker等，說(shuō)0c/2e附.說(shuō)0p/2" . Comm. 2000; 75: 401-405 )，并且Cat S抑制劑4 -嗎啉尿素-亮氨酸-高苯丙氨酸-乙烯砜 (4隱Morpholineurea-Leu-HomoPhe-vinylsulphone ) (LHVS)當(dāng)以4交高濃度寸吏 用時(shí)也顯示能抑制其他的組織蛋白酶(Palmer等，J. Med CZ em. 1995; 38: 3193-3196)。
已開(kāi)發(fā)了廣泛的抗腫瘤劑用于治療癌癥。雖然這些化合物中有許多已 成功用于治療策略，然而在許多情況下特定的治療方案不會(huì)產(chǎn)生腫瘤的完 全清除，或者僅是暫時(shí)地清除。因此這就非常需要開(kāi)發(fā)新的癌癥療法和治 療方案。發(fā)明概述
如本文所描述，本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶S (CatS)能在腫瘤 細(xì)胞系的細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)。當(dāng)采用Cat S單克隆抗體作為同種型對(duì)照時(shí)，在 不相關(guān)的腫瘤治療研究中本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞以抗體陽(yáng)性染色。
本發(fā)明的發(fā)明人這個(gè)驚奇的發(fā)現(xiàn)，與本領(lǐng)域通常所執(zhí)的觀念相反這 種分子局限于腫瘤細(xì)胞的溶酶體的內(nèi)部或者乂人這種細(xì)胞分泌；位于腫瘤細(xì) 胞的細(xì)胞表面的組織蛋白酶s，提供了一種在細(xì)胞群體中鑒定腫瘤細(xì)胞的 方法。
相應(yīng)地，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種在細(xì)胞群體中鑒定肺瘤細(xì) 胞的方法，所述方法包括使對(duì)于組織蛋白酶s具有結(jié)合特異性的配體與所 述細(xì)胞群體接觸并且確定配體與所述群體中細(xì)胞的結(jié)合存在與否，其中結(jié) 合指示所述細(xì)胞群體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的存在。
本發(fā)明第一方面的方法可以在體外執(zhí)行。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述 方法在體內(nèi)執(zhí)行。
本發(fā)明也能采用細(xì)胞表面的Cat S作為生物標(biāo)記，用于抗體遞送的藥 物結(jié)合物。通過(guò)遞送前體藥物到細(xì)胞中能進(jìn)一步地采用這種策略，所述前 體藥物被Cat S的酶活性特異性活化。
在本發(fā)明的第二方面，提供了組織蛋白酶S作為用于腫瘤細(xì)胞的生物 標(biāo)記的用途。
而且，本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用化療劑治療腫瘤衍生的細(xì)胞系，導(dǎo)致位于 細(xì)胞表面的組織蛋白酶S增加。這暗示了化療能因此結(jié)果相反地促進(jìn)了 ECM的降解，增加了異常細(xì)胞的侵襲性質(zhì)。對(duì)于用此類(lèi)化療來(lái)治療患者預(yù) 期的結(jié)果，這種作用會(huì)有嚴(yán)重影響。
然而，現(xiàn)有化療劑的效力能通過(guò)靶向這種細(xì)胞表面的Cat S而改善。 CatS的抑制劑，例如小分子、肽/蛋白質(zhì)或抗體，能與化療劑聯(lián)合^^用以 確?；煵粚?dǎo)致高侵襲性細(xì)胞亞群的產(chǎn)生。
因此，在本發(fā)明的第三方面，提供了一種抑制化療誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞表 面組織蛋白酶S上調(diào)的方法，所述方法包括施用組織蛋白酶S抑制劑到所述細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面提供了一種治療腫瘤性疾病的方法，其包括同 時(shí)、連續(xù)或單獨(dú)施用組織蛋白酶S抑制劑和化療劑。
在本發(fā)明的第五方面提供了組織蛋白酶S抑制劑和化療劑在制備通過(guò) 同時(shí)、連續(xù)或單獨(dú)施用組織蛋白酶S抑制劑和化療劑而用于治療腫瘤性疾 病的聯(lián)合治療的藥物中的用途。
在本發(fā)明的第六方面提供了 一種藥物組合物，其包括組織蛋白酶S抑 制劑和化療劑。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，組織蛋白酶s抑制劑和化療劑以其產(chǎn)生
協(xié)同效應(yīng)的濃度提供。
如實(shí)施例中所描述，引起組織蛋白酶s上調(diào)的化療劑不僅局限于一類(lèi) 抗腫瘤劑，而且存在于通常的許多或所有種類(lèi)中。因此本發(fā)明的方法可用 于涉及任何種類(lèi)化療劑的治療方案。例如，可以用于本發(fā)明的化療劑包括 基于鉑的抗肺瘤劑、抗代謝藥、核苷類(lèi)似物、胸苷酸合成酶抑制劑或拓樸 異構(gòu)酶抑制劑。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述化療劑是基于鉑的抗腫瘤劑，例如順鉑或奧 沙利鉑。
在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，所述化療劑是胸苷酸合成酶抑制劑，例
如5-FU。
在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，所述化療劑是拓樸異構(gòu)酶抑制劑，例如 CPT陽(yáng)ll。
本發(fā)明可以使用任何適合的組織蛋白酶S抑制劑。這種抑制劑例如可 以是小分子抑制劑、肽或抗體、或者編碼所述肽或抗體的核酸分子。在一 個(gè)實(shí)施方式中，所述組織蛋白酶S抑制劑是小分子抑制劑，例如二肽a-酉同-P -醛或者4 -嗎啉尿素-亮氨酸-高苯丙氨酸-乙烯砜(LHVS)。在 另一個(gè)實(shí)施方式中，所述組織蛋白酶S抑制劑是抗體分子，例如抗體或抗 體片段。如本申請(qǐng)人的共同待決的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)(WO2006/109045,其要求 GB0507219.4和GB0507272.3的優(yōu)先權(quán))所詳述，本發(fā)明人鑒定了新種類(lèi) 的組織蛋白酶S抗體，所述抗體具有有效的抗蛋白水解活性。而且，已顯 示所述抗體對(duì)于腫瘤侵襲和血管生成具有明顯的抑制作用。所述種類(lèi)由單 克隆抗體1E11舉例說(shuō)明，并且本發(fā)明人已鑒定了所述抗體的VH和VL區(qū) 以及CDR。這是第一次證明組織蛋白酶S特異性抗體直接抑制組織蛋白酶 S的蛋白酶活性，而且獨(dú)特地能使這種抗體用作有活性的治療劑，廣泛地 應(yīng)用于從癌癥治療到抗炎劑的應(yīng)用，具有高的特異性和低的毒性。
相應(yīng)地，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，組織蛋白酶S抑制劑是抗體分 子，其結(jié)合組織蛋白酶S并且抑制其蛋白水解活性。任何能夠抑制組織蛋 白酶S的蛋白水解效應(yīng)的抗體分子，均可以用于本發(fā)明的這個(gè)方面。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，抗體分子包括抗原結(jié)合區(qū)域，其包括至 少一種具有選自由Seq ID No: 1 、 Seq ID No : 2和Seq ID No : 3組成的組的 氨基酸序列的CDR，和/或至少一種具有由Seq ID No: 4、 Seq ID No : 5和 Seq ID No : 6組成的氨基酸序列的CDR。
相應(yīng)于SEQ ID NO: 1-6的氨基酸序列如下
Seq ID No : 1:
SYDMS
Seq ID No: 2:
YITTGGVNTYYPDTVKG Seq ID No : 3 HSYFDY Seq ID No: 4: RSSQSLVHSNGNTYLH Sea ID No: 5: KVSNRFS Sea ID No: 6:
13SQTTHVPPT
在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體分子包括抗原結(jié)合區(qū)域，其包括至少一種、 例如至少2種或全部3種具有選自由Seq ID No: 1 、 Seq ID No : 2和Seq ID No : 3或其變體組成的組的氛基酸序列的CDR,以及包括至少一種、例如 至少2種、例如全部3種具有選自由Seq ID No: 4、 Seq ID No : 5和Seq ID No : 6或其變體組成的組的氨基酸序列的CDR。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗體分子包括抗原結(jié)合區(qū)域，其包括至少一種 具有選自由Seq ID No: 1 、 Seq ID No : 2和Seq ID No : 3組成的組的氨基酸 序列的CDR，和/或至少一種具有選自由Seq ID No: 4、 Seq ID No : 5和Seq ID No : 6組成的組的氨基酸序列的CDR。
在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，抗體分子包括CDR,所迷CDR具有SEQ ID No : 5或其變體的氨基酸序列，和/或所述CDR具有SEQ ID No : 6或其 變體的氨基酸序列。
在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體分子包括抗體Vh區(qū)或抗體Vl區(qū)，或其兩者。
在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體分子含有抗體Vh區(qū)，其包括至少一種、例 如2種或3種具有選自由Seq ID No: 1 、 Seq ID No : 2和Seq ID No : 3組成 的組的氨基酸序列的CDR,和/或含有抗體V^區(qū)，其包括至少一種、例如 2種或3種具有由Seq LD No: 4、 Seq ID No : 5和Seq ID No : 6組成的氨基 酸序列的CDR。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗體VL區(qū)包括Seq ID No :8的氨基酸序列， 和/或抗體VH區(qū)包括Seq ID No :7的氨基酸序列。
Seq ID No :7:
VQLQESGGVLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLE WVAYITTGGVNTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMY YCARHSYFDYWGQGTTVTVSS
Seq ID No : 8 :
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPTTHVPPTFGSGTKLEIKR
抗體分子可以是抗體，例如完整抗體。
在一個(gè)替代的實(shí)施方式中，抗體分子可以是抗體片段例如scFv。
本發(fā)明可以使用的進(jìn)一步的抗體分子包括，含有至少一種例如1種、 2種或3種CDR的抗體分子，所述CDR具有選自由Seq ID No: 1 、 Seq ID No : 2和Seq ID No : 3組成的組的氨基酸序列，和/或含有至少一種例如1 種、2種或3種CDR的抗體分子，所述CDR具有由SeqlDNo:4、 SeqID No : 5和Seq ID No : 6組成的氨基酸序列，其中在至少一種CDR中進(jìn)行5 或更少，例如4、 3、 2或1個(gè)氨基酸置換，而且其中所述抗體分子保持抑 制組織蛋白酶S的蛋白水解活性的能力。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，用于本發(fā)明的抗體分子具有抑制腫瘤細(xì) 胞侵襲的能力。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，用于本發(fā)明的抗體分子具有抑制血管生成的能力。
如上文描述，本發(fā)明人令人驚奇地顯示，在腫瘤細(xì)胞中組織蛋白酶S 位于所述細(xì)胞表面，而且在經(jīng)受化療劑的肺瘤細(xì)胞中，所述肺瘤細(xì)胞表面
組織蛋白酶s的表達(dá)上調(diào)。這證明，以及能使用抗組織蛋白酶s的抗體來(lái) 鑒定腫瘤細(xì)胞，并且能使用組織蛋白酶s抑制劑和化療劑的聯(lián)合治療，也
提示了抗組織蛋白酶s的抗體可以在缺乏化療劑的情況下使用，以在腫瘤 細(xì)胞中誘導(dǎo)ADCC。
相應(yīng)地，在本發(fā)明的第七方面，提供了一種誘導(dǎo)抗肺瘤細(xì)胞的、抗體 依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)的方法，所述方法包括施用結(jié)合 組織蛋白酶S的、抗組織蛋白酶S的抗體分子到所述細(xì)胞。
通過(guò)誘導(dǎo)ADCC可以殺死肺瘤細(xì)胞。因此在本發(fā)明的第八方面，提供 一種殺死腫瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括施用結(jié)合組織蛋白酶S的、抗組 織蛋白酶S的抗體分子到所述細(xì)胞。
如果需要，本發(fā)明的第七和第八方面的方法可以在體外、體內(nèi)或間接相應(yīng)地，在本發(fā)明的第九方面，提供了一種在受治療者中治療腫瘤性 疾病的方法，所述方法包括施用結(jié)合組織蛋白酶S的、抗組織蛋白酶S的 抗體分子到所述受治療者。
在本發(fā)明的第十方面，提供了結(jié)合組織蛋白酶s的、抗組織蛋白酶s 的抗體分子在制備用于治療腫瘤性疾病的藥物中的用途。
而且，組織蛋白酶s位于腫瘤細(xì)胞表面的證明提示了，為誘導(dǎo)抗腫瘤
細(xì)胞的效應(yīng)，結(jié)合組織蛋白酶S的抗體無(wú)需具有任何抗蛋白水解的活性。
因此，在本發(fā)明的第七至第十方面任一方面的一個(gè)實(shí)施方式中，其抗 體分子不抑制組織蛋白酶S的蛋白水解活性。
在本發(fā)明的第七至第十方面任一方面的一個(gè)實(shí)施方式中，在缺乏另一 種化療劑的情況下施用抗組織蛋白酶S的抗體分子，即與在本發(fā)明的第一 至第六方面任一方面的方法相反。
如上文描述，在本發(fā)明的方法中可以使用不抑制組織蛋白酶S蛋白水 解活性的、抗組織蛋白酶s的抗體分子。如在實(shí)施例中描述的，本發(fā)明人 所證明的這種抗組織蛋白酶s的抗體分子的抗血管生成效應(yīng)，進(jìn)一步支持
了這種抗體分子的治療用途。
具體地，本發(fā)明人首次顯示了對(duì)于組織蛋白酶s具有特異性、但不抑
制組織蛋白酶s的蛋白水解活性的抗體，然而其充當(dāng)血管生成的有效抑制 劑。這尤其令本發(fā)明人感到驚奇，因?yàn)槿鏟CT/GB2006/001314中描述，據(jù)
信對(duì)于其抵抗組織蛋白酶s活性失調(diào)的病理效應(yīng)，抑制組織蛋白酶s蛋白
水解效應(yīng)是所需的策略。此外，雖然使用抗體來(lái)隔離(sequester)蛋白質(zhì) 被建議為對(duì)于一些蛋白質(zhì)的治療策略，例如VEGF，然而這種策略至今為 止對(duì)于在治療與組織蛋白酶S活性有關(guān)的疾病中^皮認(rèn)為是不可行的。
相應(yīng)地，在本發(fā)明的第十一方面，提供了一種在有相應(yīng)治療需要的患 者中治療與血管生成相關(guān)的病癥的方法，所述方法包括施用抗體分子或編 碼所述抗體分子的核酸到所述患者，其中所述抗體分子特異性結(jié)合組織蛋 白酶S但不抑制組織蛋白酶S的蛋白水解活性。
16依照本發(fā)明的第十二方面，提供了抗體分子或編碼所述抗體分子的核 酸在制備用于治療與血管生成有關(guān)的病癥的藥物中的用途，其中所述抗體 分子特異性結(jié)合組織蛋白酶S但不抑制組織蛋白酶S的蛋白水解活性。
本發(fā)明的這些方面可以用于治療其中血管生成對(duì)病理有影響的任何 疾病或病癥。所述病癥和疾病包括〗旦不限于癌癥、炎性病癥例如多發(fā)性肌
炎(inflammatory muscle disease )、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和哮喘、眼部疾病以及 動(dòng)脈粥樣硬化。
然而，特異性地結(jié)合組織蛋白酶S但不抑制組織蛋白酶S的蛋白水解 活性、然而卻抑制血管生成的抗體分子的證明，使得這種抗體分子能用于 治療與組織蛋白酶S有關(guān)的其他病癥。
在第十三方面，提供了一種在有相應(yīng)治療需要的患者中，治療與活性 例如組織蛋白酶s異常活性有關(guān)的病癥的方法，所述方法包括施用抗體分
子或編碼所述抗體分子的核酸，其中所述抗體分子特異性結(jié)合組織蛋白酶 s但不抑制組織蛋白酶s的蛋白水解活性。
用于治療與組織蛋白酶s異常活性有關(guān)的病癥的藥物中的用途，其中所述 抗體分子特異性結(jié)合組織蛋白酶s但不抑制組織蛋白酶s的蛋白水解活性。
除了治療腫瘤之外，本發(fā)明可以用于治療與組織蛋白酶s異?；钚杂?關(guān)的任何病癥，具體而言是與組織蛋白酶s異常表達(dá)有關(guān)的病癥。在一個(gè) 實(shí)施方式中，如果組織蛋白酶s的蛋白水解活性高于一種病癥不存在時(shí)的
活性，例如與所述病癥不存在時(shí)的活性相比，其中的蛋白水解活性至少高
20 % ，例如至少高50 % ,例如至少高100 % ，至少高200 %或至少高500 %,那么這種病癥就被認(rèn)為與組織蛋白酶S異?；钚杂嘘P(guān)。在一個(gè)實(shí)施方 式中，如果組織蛋白酶S的表達(dá)高于一種病癥不存在時(shí)的表達(dá)，例如與所 述病癥不存在時(shí)的表達(dá)相比，其中的表達(dá)是至少高20%,例如至少高50 % ，例如至少高100 % ，至少高200 %或至少高500 % ，那么這種病癥就被 認(rèn)為與組織蛋白酶S的異常表達(dá)有關(guān)。例如，可使用本發(fā)明的病癥包括但不限于，神經(jīng)退化疾病例如阿爾茨 海默氏病和多發(fā)性硬化癥，自身免疫性疾病，和與過(guò)量、失控或不當(dāng)?shù)难?管生成有關(guān)的其他疾病。
在本發(fā)明第十一至第十四方面的任一方面中，可以使用任何適合的抗
組織蛋白酶s的抗體分子，其不抑制組織蛋白酶s的蛋白水解活性但其抑
制血管生成。
這種抗體分子和編碼這種抗體分子的核酸，構(gòu)成獨(dú)立的本發(fā)明的第十
五方面。
在本發(fā)明第十五方面的一個(gè)實(shí)施方式中，抗體分子是1E4抗體或其片 段或變體。這種片段和變體優(yōu)選地保持抑制血管生成的能力而不具有抑制 組織蛋白酶S的蛋白水解活性的能力。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體分子和用于本發(fā)明的抗體 分子具有抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的能力。
依照本發(fā)明的第十六方面，提供了用于藥物的抗體分子或編碼所述抗 體分子的核酸，其中所述抗體分子特異性結(jié)合組織蛋白酶S但不抑制組織 蛋白酶s的蛋白水解活性。
在制備用于治療與組織蛋白酶s活性有關(guān)的病癥的藥物中的用途，其中在
制備用于治療與組織蛋白酶s活性有關(guān)的病癥的藥物中，所述抗體分子特 異性結(jié)合組織蛋白酶s但不抑制組織蛋白酶s的蛋白水解活性。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種藥物組合物，其包括抗體分子或編碼所述 抗體分子的核酸，其中所述抗體分子特異性結(jié)合組織蛋白酶s但不抑制組 織蛋白酶s的蛋白水解活性。
除非上下文另有說(shuō)明，本發(fā)明每個(gè)方面優(yōu)選的特征，可以視作是根據(jù) 情況對(duì)其他每個(gè)方面作適當(dāng)變動(dòng)的特征。
詳述組織蛋白酶s抑制劑
如上文描述，本發(fā)明可以使用任何適合的組織蛋白酶s抑制劑。這種
抑制劑例如可以是小分子藥物，例如二肽a -酮-卩-醛。所迷二肽a -酮 -p -搭作為針對(duì)Cat S的有效可逆抑制劑由Walker等開(kāi)發(fā)，并且顯示抑 制CatB和L，雖然以較低效力(Walker等，2000)?？捎糜诒景l(fā)明的另一 個(gè)組織蛋白酶S小分子抑制劑是4 -嗎啉尿素-亮氨酸-高苯丙氨酸 - 乙 烯砜(LHVS)。可以使用的其他的組織蛋白酶S抑制劑例如是Thurmond 等，JMedChem. 2004 Sep 23; 47(20) : 47"_801描述的非肽類(lèi)組織蛋白酶S 抑制劑。
在另 一個(gè)實(shí)施方式中，組織蛋白酶S抑制劑是抗體分子，例如抗體或 抗體片段。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，"抗體"應(yīng)理解為指的是免疫球蛋白或其部分，或 者任何含有結(jié)合區(qū)域的多肽，所述結(jié)合區(qū)域是抗體結(jié)合區(qū)域或者與其同源 的區(qū)域。抗體包括但不限于單克隆、多克隆、單特異性和多特異性抗體及 其片段，以及含有融合到另 一個(gè)多肽的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)域的嵌合抗體。
完整(全)抗體包括由重鏈和輕鏈組成的免疫球蛋白分子，其中每條 鏈均帶有可變區(qū)，分別指定為VH和VL?？勺儏^(qū)由3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR， 也稱(chēng)為超變區(qū))和4個(gè)框架區(qū)(FR)或支架組成。CDR形成與抗原分子 互補(bǔ)的立體結(jié)構(gòu)并且決定抗體的特異性。
抗體片段可以保持完整抗體的結(jié)合能力并且可以用于替代完整抗體。 相應(yīng)地，除非上下文另有說(shuō)明，出于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)"抗體，，應(yīng)理解為 包括抗體片段?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、 Fab'、 F(ab')2、 Fd、 dAb和Fv 片段、scFv、雙特異性scFv、雙抗體、線性抗體(linear antibody)(參閱 美國(guó)專(zhuān)利5,641,870,實(shí)施例2; Zapata等,Protein Eng 8 (10) : 1057-1062 [1995]);單鏈抗體分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。
Fab片段由完整的L鏈(VL和CL )以及VH和CHI組成。Fab'片段 不同于Fab片段，其在CH1區(qū)的夢(mèng)4S端含有額外少量的殘基，包括一個(gè)或 多個(gè)來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸。F(ab')2片段包括兩個(gè)二硫鍵連接的Fab片段。
Fd片段由VH和CH1區(qū)組成。
Fv片段由單鏈抗體(single antibody)的VL和VH區(qū)組成。
單鏈Fv片段是含有由連接體連接的VH和VL區(qū)的抗體片段，其能使 scFv形成4元原結(jié)合<立點(diǎn)(參閱Pluckthun在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies (單克隆抗體藥理學(xué))中的記載，第113巻，Rosenburg和Moore 編輯，Springer-Verlag, New York,第269-315頁(yè)(1994))。
雙抗體是小的抗體片段，其通過(guò)用短的連接體(約5 - 10個(gè)殘基)構(gòu) 建scFv片段(參閱前段)而制備，所述短的連接體在VH和VL區(qū)之間， 這樣產(chǎn)生了鏈間而不是鏈內(nèi)配對(duì)的V區(qū)，形成多價(jià)體片段，即含有2個(gè)抗 原結(jié)合位點(diǎn)的片段(參閱例如EP404 097; WO 93/11161;和Hollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 : 6444-6448 ( 1993 ))。
片段進(jìn)一步包括單個(gè)的CDR。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，組織蛋白酶S抑制劑是抗體分子。在本 發(fā)明的一些實(shí)施方式中，抗體分子是抑制組織蛋白酶S蛋白水解活性的抗 體分子。這種適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合劑的一個(gè)例子是如本文描迷的抗體IEII，而且在 本申請(qǐng)人的共同待決的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO2006/109045中，要求 GB0507219.4和GB0507272.3的優(yōu)先權(quán)。本發(fā)明人鑒定了完整抗體1E11 的VH和VL區(qū)的氨基酸序列。此外，本發(fā)明人鑒定了這種抗體的6種CDR (SeqIDNo: 1、 2、 3、 4、 5和6)。
如上文描述，用于本發(fā)明第一至第十方面任一方面的抗體分子，不局 限于含有1E11抗體的特異性序列的抗體，和含有本文所公開(kāi)序列的VH、 VL和CDR，也延伸至例如抑制組織蛋白酶S蛋白水解活性的任何其他抗 體。例如1E11的變體，其保持抑制CatS的蛋白水解活性的能力，它可用 于本發(fā)明的一些實(shí)施方式。因此，1E11抗體的CDR氨基酸序列(其中一 個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被修飾)也可以用作CDR序列。CDR變體的氨基酸 序列中修飾的氨基酸殘基，在整個(gè)CDR內(nèi)優(yōu)選地是30%或更少，更優(yōu)選 20%或更少，最優(yōu)選10%或更少。這種變體可以使用本申請(qǐng)所教導(dǎo)內(nèi)容以及本領(lǐng)域已知技術(shù)來(lái)提供。CDR可以在含有抗體重鏈或輕鏈序列或其部分 的框架結(jié)構(gòu)中攜帶。優(yōu)選地，這種CDR位于相應(yīng)于天然存在的VH和VL 區(qū)的CDR位置的位置。這種CDR的位置可通過(guò)如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫重要的蛋白序列)，US Dept of Health and Human Services, Public Health Service, Nat'l Inst, of Health, NIH公布號(hào) 第 91-3242, 1991 以 及 在 線 www.kabatdatabase.com http:〃immuno.bme.nwu.edu描述的方式觀'J定。
此外，可以對(duì)可變區(qū)的框架區(qū)進(jìn)行可選擇地或另外的修飾。框架區(qū)的 這種變化可以改善穩(wěn)定性并且降低抗體的免疫原性。
然而，如上文描述以及如實(shí)施例所顯示，本發(fā)明人還顯示了使用結(jié)合 組織蛋白酶S但不抑制組織蛋白酶S蛋白水解活性的抗體分子，可以獲得 抗血管生成效應(yīng)。這種抗體分子可以用于本發(fā)明的任一方面。
用于本發(fā)明的抗體包括"嵌合"抗體，其中重鏈和/或輕鏈的 一部分與得 自特殊物種的抗體或?qū)儆谔厥饪贵w種類(lèi)或亞類(lèi)的抗體的相應(yīng)序列一致或 同源，而鏈的其余部分與得自另 一個(gè)物種的抗體或?qū)儆诹?一個(gè)抗體種類(lèi)或 亞類(lèi)的抗體的相應(yīng)序列一致或同源，以及這種抗體的片段，只要其顯示所 需的生物活性(參閱美國(guó)專(zhuān)利第4,816,567號(hào)；和Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 : 6851-6855 (1984))。本文所感興趣的嵌合抗體包括"靈 長(zhǎng)源"抗體，其包括得自非人類(lèi)靈長(zhǎng)動(dòng)物(例如舊大陸猴，猿等)的可變區(qū) 抗原結(jié)合序列，以及人類(lèi)恒定區(qū)序列。
用于本發(fā)明的抗體分子可以以任何適合的方法天然地或合成地產(chǎn)生。 這些方法可包括例如傳統(tǒng)的雜交瘤4支術(shù)(Kohler和Milstein (1975) Nature, 256 :495-499)，重組DNA技術(shù)(參閱例如美國(guó)專(zhuān)利第4,816,567號(hào))，或 者使用抗體文庫(kù)的噬菌體展示技術(shù)(參閱例如Clackson等.(1991) Nature, 352: 624-628和Marks等.(1992) Bio/ Technology, 10: 779-783 )。其他的抗 體產(chǎn)生技術(shù)在Using Antibodies: A Laboratory Manual (使用抗體實(shí)驗(yàn)室手 冊(cè))，編輯Harlow等，Cold Spring Harbor Laboratory, 1999中描述。
為引起能夠結(jié)合抗原的淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生，傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)通常包括 用抗原免疫小鼠或其他動(dòng)物。分離淋巴細(xì)胞并且與骨髓瘤細(xì)胞系融合而形
21成雜交瘤細(xì)胞，其然后在抑制親本骨髓瘤細(xì)胞但允許產(chǎn)生抗體的細(xì)胞生長(zhǎng) 的條件下培養(yǎng)。雜交瘤可以經(jīng)受遺傳突變，其會(huì)或不會(huì)改變所產(chǎn)生抗體的
結(jié)合特異性。使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)能產(chǎn)生合成的抗體(參閱例如，Knappik 等，J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86和Krebs等，J. Immunol. Meth. (2001) 2154 67-84 )。
可以使用任何適合的本領(lǐng)域已知技術(shù)對(duì)結(jié)合成分的VH、 VL或CDR 進(jìn)行^修飾，或者實(shí)際上在FR中進(jìn)行。例如，通過(guò)引入CDR例如CDR3到 缺乏這種CDR的VH或VL區(qū)，可以產(chǎn)生可變的VH和/或VL區(qū)。Marks 等.(1992) Bio/ Technology, 10: 779-783描述了一種改組技術(shù)，其中產(chǎn)生了 缺乏CDR3的VH可變區(qū)的所有組成成分，然后將其與特定抗體的CDR3 結(jié)合而產(chǎn)生新的VH區(qū)。使用類(lèi)似的技術(shù)可以產(chǎn)生含有本發(fā)明的CDR衍 生序列的新VH和VL區(qū)。
相應(yīng)地，用于本發(fā)明的抗體分子可以通過(guò)一種方法產(chǎn)生，其包括(a) 提供編碼可變區(qū)核酸的初始所有組成成分，其中所述可變區(qū)包括將被替代 的CDR1、 CDR2或CDR3，或者所述核酸缺乏對(duì)于這種CDR的編碼區(qū)；
(b)將所述所有組成成分與供體核酸結(jié)合，所述供體核酸編碼含有如Seq IDNo:l、 2、 3、 4、 5或6顯示序列的氨基酸序列，使得供體核酸插入到 所有組成成分中的CDR區(qū)，以提供編碼可變區(qū)核酸的所有組成成分產(chǎn)物；
(c )表達(dá)所有組成成分產(chǎn)物的核酸；(d)選擇對(duì)于Cat S特異的特異性抗 原結(jié)合片段；以及(e)回收特異性抗原結(jié)合片段或編碼其的核酸。本方法 可以包括任選的步驟測(cè)試抗體分子對(duì)于抑制組織蛋白酶S蛋白水解活性 的能力。
用于產(chǎn)生本發(fā)明抗體的可選擇的技術(shù)可以包括，編碼VH或VL區(qū)基 因的隨機(jī)謙變，使用例如易錯(cuò)PCR (參閱Gram等，1992, P.N.A.S. 89 3576-3580 )。另外地或可選擇地，為了誘變可以乾向CDR，例如使用由 Barbas等1991 PNAS 3809-3813和Scier 1996 J Mol Biol 263 551-567中描
述的分子進(jìn)化方法。
可以測(cè)試所產(chǎn)生的這種變體、抗體和片段對(duì)于Cat S的結(jié)合，以及抑 制組織蛋白酶S蛋白水解活性的能力。如本文描述，本發(fā)明人證明了可以用于本發(fā)明 一些方面中的抗體分子具有抗蛋白水解效應(yīng)。此外如實(shí)施例中描述，也證明了抗侵襲和抗血管生成活性。因而這就能使用本發(fā)明的抗體分子作為有活性的治療劑。用于本發(fā)明的抗體分子可以是"棵露的"抗體分子。"棵露的"抗體分子是沒(méi)有與"有活性的治療劑"結(jié)合的抗體分子。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，"有活性的治療劑"
是分子或原子，其結(jié)合到抗體部分(包括抗體片段，CDR等)而產(chǎn)生結(jié)合
物。這種"有活性的治療劑"的例子包括藥物、毒素、放射性同位素、免疫調(diào)節(jié)劑、螯合劑、硼化合物和染料等。
免疫結(jié)合物
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，用于本發(fā)明一些實(shí)施方式中的抗體分子可以是免疫結(jié)合物的形式，其包括結(jié)合到"有活性的治療劑"的抗體片段。治療劑可以是化療劑或另 一種分子。
產(chǎn)生免疫結(jié)合物的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是廣泛知曉的，例如參閱美國(guó)專(zhuān)利
第5,057,313號(hào)，Shih等，Int. J. Cancer 41: 832-839 (1988); Shih等,Int. J.Cancer 46: 1101-1106 (1990) , Wong, Chemistry Of Protein Conjugation AndCross-Linking(蛋白結(jié)合和交聯(lián)化學(xué))(CRC Press 1991); Upeslacis等，"Modification of Antibodies by Chemical Methods" in Monoclonal Antibodies:Principles And Applications (單克隆抗體中"化學(xué)方法修飾抗體"原理和應(yīng)用)，Birch等(編輯)，第187-230頁(yè)(Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Productionand Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in MonoclonalAntibodies: Production, Engineering And Clinical Application (單克隆抗體中"合成肽-衍生的抗體的產(chǎn)生和表征"產(chǎn)生、工程化和臨床應(yīng)用)，Ritter等(編輯)，第60-84頁(yè)(Cambridge University Press 1995)。
在期望采用組織蛋白酶S抑制劑和化療劑的聯(lián)合的本發(fā)明的那些方面中，可以使用含有抗組織蛋白酶S的抗體和化療劑的免疫結(jié)合物。
這種免疫結(jié)合物會(huì)有許多超過(guò)傳統(tǒng)治療的益處。組織蛋白酶s位于腫瘤細(xì)胞的證明使得能使用這種免疫結(jié)合物來(lái)將化療劑靶向紳瘤細(xì)胞。靶向的化療劑可以具有其細(xì)胞毒作用。其次，如上文描述，已發(fā)現(xiàn)常規(guī)使用的化療劑引起腫瘤細(xì)胞(如結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞)的細(xì)胞表面組織蛋白酶s的上調(diào)。通過(guò)采用抗組織蛋白酶S的抗體和化療劑的免疫結(jié)合物，免疫結(jié)合物的組織蛋白酶S的抗體部分會(huì)預(yù)期抵抗這種作用。而且，免疫結(jié)合物的抗體部分在體內(nèi)與化療劑相比會(huì)預(yù)期具有較長(zhǎng)的活性半衰期，并且因而可以抵抗結(jié)合化療劑而引起的組織蛋白酶S上調(diào)的效應(yīng)。
抗組織蛋白酶s的抗體分子和化療劑的免疫結(jié)合物，構(gòu)成了本發(fā)明的
另一個(gè)方面。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)蛋白酶例如組織蛋白酶，抗體分子從化療劑中可切割出來(lái)。
用于本發(fā)明的抗體分子可以包括進(jìn)一步的修飾。例如抗體能被糖基化、聚乙二醇化、或者連接到白蛋白或非蛋白質(zhì)聚合物?？贵w分子可以是免疫結(jié)合物的形式。
使用任何適合的方法，可以檢驗(yàn)藥劑例如小分子或抗體抑制組織蛋白
酶s蛋白水解活性的能力。例如可以使用熒光測(cè)定。在這種測(cè)定中，可以使用任何適合的熒光底物，例如Cbz-Phe-Arg-AMC。如果藥劑具有抑制組織蛋白酶S的活性而且達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的量的能力，則藥劑被認(rèn)為抑制組織蛋白酶S的蛋白水解活性。例如在一個(gè)實(shí)施方式中，用作組織蛋白酶S抑制劑的藥劑，當(dāng)與適當(dāng)?shù)膶?duì)照抗體相比時(shí)能夠抑制至少10%，例如具有至少25%、 50%、 70%、 80%或90%的抑制活性。
使用本領(lǐng)域已知的任何適合的侵襲測(cè)定可以檢驗(yàn)藥劑抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的能力。例如，使用如本領(lǐng)域已知的修改的博伊登室可以檢驗(yàn)這種能力。使用任何適合的肺瘤細(xì)胞系可以檢驗(yàn)抗體分子，例如前列腺癌細(xì)胞系例如pC3，星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系例如U251mg，結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系例如HCT116或者乳腺癌細(xì)胞系例如MDA-MB-231或MCF7。如果藥劑具有抑制侵襲達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的量的能力，則可以認(rèn)為藥劑抑制胂瘤細(xì)胞的侵襲。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，用作組織蛋白酶S抑制劑的藥劑，當(dāng)與適當(dāng)?shù)膶?duì)照抗體相比時(shí)能夠抑制至少10%,例如至少25%、 50%、 70%、80%或90%的侵襲。
使用本領(lǐng)域已知的任何適合的測(cè)定可以檢驗(yàn)藥劑抑制血管生成的能力。例如，使用測(cè)定部分中描述的和/或如實(shí)施例中描述的測(cè)定、例如基于基質(zhì)膠的測(cè)定，可以檢驗(yàn)這種能力。在本發(fā)明的某些方面，例如在測(cè)定細(xì)胞群體中腫瘤細(xì)胞存在的測(cè)定中，或者在體內(nèi)測(cè)定細(xì)胞存在的診斷技術(shù)中可以使用標(biāo)記的抗體分子?？梢允褂玫臉?biāo)記包括放射標(biāo)記，酶標(biāo)記例如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶，或者生物素。
核酸
用于本發(fā)明的核酸可包括DNA或RNA。其可以重組、合成或通過(guò)本領(lǐng)域可用的任何方法產(chǎn)生，包括使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的克隆。
核酸可以插入到任何適當(dāng)?shù)妮d體中，例如病毒(例如痘苗病毒，腺病毒等)、桿狀病毒；酵母載體、噬菌體、染色體、人工染色體、質(zhì)?；蛘沉NA。載體可以用于將核酸《1入到原核或真核的宿主細(xì)胞中。
用于操縱核酸，例如制備核酸構(gòu)建體、誘變、序列測(cè)定、引入DNA到細(xì)胞中和基因表達(dá)和分析蛋白質(zhì)的已知技術(shù)和方案的更多詳細(xì)內(nèi)容參閱，例如，Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學(xué)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)方案)，第5版,Ausubel等編輯，John Wiley和Sons, 2005和，Molecular Cloning:a Laboratory Manual(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè))第3版Sambrook等，ColdSpring Harbor Laboratory Press, 2001 。
化療劑
如上文描述，在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，化療劑可以用于例如與組織蛋白酶S抑制劑的耳關(guān)合治療方案中。在這些實(shí)施方式中，在本發(fā)明中可以使用任何適合的化療劑。例如可以使用的藥劑包括抗代謝藥、核苷類(lèi)似物、胸苷酸合成酶抑制劑、鉑細(xì)胞毒素劑或拓樸異構(gòu)酶抑制劑。在本發(fā)明中可以使用的胸苷酸合成酶抑制劑的例子包括5-FU、 MTA和TDX。在一個(gè)實(shí)施方式中，胸苷酸合成酶抑制劑是5-FU。可以使用的抗代謝藥的例子是拓優(yōu)得(tomudex) (TDX)?？梢允褂玫你K細(xì)胞毒素劑的例子包括順鉑和奧沙利4自。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，化療劑是順鉑。在本發(fā)明中可以使用任何適合的拓樸異構(gòu)酶抑制劑。可以使用的核苷類(lèi)似物的例子包括但不限于吉西他濱和阿糖胞香。
在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方式中，化療劑是拓樸異構(gòu)酶抑制劑。在本發(fā)明中可以使用任何適合的拓樸異構(gòu)酶抑制劑。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，拓樸異構(gòu)酶抑制劑是拓樸異構(gòu)酶I抑制劑，例如喜樹(shù)^t在本發(fā)明中可以
使用的適合的拓樸異構(gòu)酶I抑制劑是伊諾替康(irenotecan) (CPT-11)或它的活性代謝物SN-38。通過(guò)穩(wěn)定可逆的共價(jià)反應(yīng)中間體(指切割或切割復(fù)合物)，CPT-ll特異性地在細(xì)胞周期的S期發(fā)揮作用，并且也可以誘導(dǎo)G2-M
細(xì)胞周期停滯。
另外的或者代替上文引用特異性藥劑的、在本發(fā)明中可以使用的化療劑可以包括4克化劑；》克基石黃酸鹽；氮丙咬；乙撐亞胺；methylamelamines;氮芥；亞硝基脲(nitrosurea);抗代i射物；葉酸類(lèi)似物；噤呤類(lèi)似物；嘧啶類(lèi)似物；雄激素；抗腎上腺素；葉酸補(bǔ)充劑(folic acid replenisher);醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖普(ald叩hosphamide glycoside);氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil;比生群；依達(dá)曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；elfom池ine;依利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；蘑菇多糖；花菱草堿(ionidamine ); 米托胍腙；米托蒽醌。
在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方式中，化療劑是氟嘧啶例如5-FU或其代謝物。5-FU用于治療多種癌癥，包括胃腸癌、乳腺癌和頭頸癌。5-FU在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榉涣姿崦撗跄蜍誇dUMP， FdUMP與5,10-亞甲基四氫葉酸(CH2THF)—起與胸苷酸合成酶(TS )形成穩(wěn)定的三元復(fù)合物，產(chǎn)生酶的抑制。通過(guò)CH2THF, TS催化一磷酸脫氧尿苷(dUMP)的還原曱基化作用而產(chǎn)生一磷酸脫氧胸苷(dTMP)和二氬葉酸(Longley等Nat Rev Cancer,3:330- 338, 2003 )。因?yàn)檫@種反應(yīng)提供了僅有的細(xì)胞內(nèi)新生dTMP的來(lái)源，因而它對(duì)于DNA復(fù)制和修復(fù)是重要的，TS抑制產(chǎn)生DNA的破壞。對(duì)于5-FU也描述了細(xì)胞毒的非-TS -靶向機(jī)制，例如錯(cuò)摻氟代核苷酸到DNA和RNA中(Longley等Nat Rev Cancer, 3:330-338, 2003 )。
在參考特異性化療劑的情況下，應(yīng)理解可以使用保持所述特異性藥劑抗腫瘤活性的類(lèi)似物，所迷類(lèi)似物包括生物活性的衍生物和其大體上等價(jià)物。
治療
"治療"包括對(duì)人類(lèi)或非人類(lèi)動(dòng)物有益的任何方案。治療可以是關(guān)于現(xiàn)
26存的病癥或可以是預(yù)防性的(預(yù)防治療)。治療可以包含治愈、緩解或預(yù) 防效果。
"治療癌癥"包括治療由癌生長(zhǎng)和/或血管化引起的病癥，并且包括治療 腫瘤增殖或腫瘤。使用本發(fā)明能夠治療腫瘤的例子，例如肉瘤(包含成骨 和軟組織肉瘤)、癌(例如乳腺、肺、膀胱、甲狀腺、前列腺、結(jié)腸、直 腸、胰腺、胃、肝、子宮、前列腺、子宮頸和卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、肝
細(xì)胞癌)、淋巴瘤(包含Hodgkin和非Hodgkin淋巴瘤)、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、 黑素瘤、骨髓瘤、維爾姆斯瘤和白血病(包含急性成淋巴細(xì)胞性白血病和 急性成髓細(xì)胞性白血病)、星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和視網(wǎng)膜成神經(jīng)細(xì)胞 瘤。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明可以用于治療結(jié)腸直腸腫瘤。
本發(fā)明可特別用于治療現(xiàn)有癌癥并且用于預(yù)防初次手術(shù)治療后癌癥 的復(fù)發(fā)。
藥物組合物
根據(jù)本發(fā)明并且依照本發(fā)明使用的藥物組合物可包括，除了有效成分 以外的藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體、緩沖液穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員廣 ;乏^口曉的其寸也物質(zhì)(參閱侈'H口， (Remington: The Science and Practice of Pharmacy (雷明登氏藥劑學(xué)原理和實(shí)踐)，第21版，Gennaro AR等編輯.， Lippincott Williams & Wilkins, 2005 )。所述物質(zhì)可包括緩沖劑例如醋酸鹽、 Tris、磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸；抗氧化劑；防腐劑；蛋白質(zhì)例如， 血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白類(lèi)；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基 酸例如，甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴(lài)氨酸；碳水 化合物；螯合劑；張力調(diào)節(jié)劑(tonicifier)和表面活性劑。
藥物組合物也可含有一種或多種為治療特殊適應(yīng)癥所需選擇的另外 的有效化合物，優(yōu)選具有互補(bǔ)活性(complementary activity )，所述活性不 會(huì)不利地影響本發(fā)明組合物的活性。例如，在治療癌癥中，在使用聯(lián)合方 案的情況下，除了組織蛋白酶S抑制劑之外(例如抗組織蛋白酶S的抗體 分子和化療劑)，制劑或試劑盒可包括另外的組分，例如第二種或另一種組織蛋白酶S抑制劑，第二種或另一種化療劑，或者靶向組織蛋白酶S之 外的扭的抗體(例如耙向影響特殊癌癥生長(zhǎng)的生長(zhǎng)因子)。
有效成分(例如抗體分子和/或化療劑)可經(jīng)由微球、微嚢脂質(zhì)體
(microcapsules liposome)和其他孩i粒遞藥系統(tǒng)給藥。例如，如通過(guò)凝聚 技術(shù)或通過(guò)界面聚合(例如分別是幾曱基纖維素或明膠微嚢和聚-(曱基 丙烯酸酯)微嚢)，在膠體給藥系統(tǒng)中(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微 乳液、毫微型顆粒和毫微型膠囊)或在粗乳狀液中，有效成分可被包埋入 所制備的微嚢。關(guān)于更多詳細(xì)內(nèi)容，參閱Remington: the Science and Practice ofPharmacy(雷明登氏藥劑學(xué)原理和實(shí)踐)，第21版，Gennaro AR等編輯., Lippincott Williams & Wilkins, 2005。
持續(xù)釋放制劑可用來(lái)遞送活性劑。適合的持續(xù)釋放制劑例子包括固體 疏水聚合物(含有抗體)的半滲透基質(zhì)，所述基質(zhì)具有成形物品(shaped article)形式，例如膜、栓劑或微嚢。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水 凝膠(例如聚(2-羥乙基-異丁烯酸)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國(guó)專(zhuān)利第 3,773,919號(hào))、L-谷氨酸和L谷氨酸乙酯共聚物、非降解乙烯-醋酸乙烯酉旨、 可降解乳酸-羥乙酸共聚物和聚-D- (-)-3-羥基丁酸。
如上文描述的核酸也可用在治療方法中。使用本領(lǐng)域任何適合的已知 技術(shù)可將用于本發(fā)明的核酸遞送到目的細(xì)胞中。使用體內(nèi)或間接體內(nèi)技術(shù) 可將核酸(任選地包含在載體中)遞送到患者的細(xì)胞中。對(duì)于體內(nèi)技術(shù)， 可使用病毒載體(例如腺病毒、單純皰滲I型病毒或腺相關(guān)病毒)轉(zhuǎn)染和 基于脂質(zhì)的體系(例如，用于脂質(zhì)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的有用脂質(zhì)是DOTMA、 DOPE和DC-膽固醇)(參閱例如,Anderson等，Science 256 : 808-813 (1992).也可參閱WO 93/25673 )。
在間接體內(nèi)技術(shù)中，把核酸引入到患者分離細(xì)胞中，將修飾過(guò)的細(xì)胞 施用到患者，直接地或者例如被多孔膜包裹植入患者中(參閱例如美國(guó)專(zhuān) 利第4,892,538和5,283,187號(hào))。引入核酸到有活力細(xì)胞中的可用技術(shù)可 包括使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射、細(xì)胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸鉤沉淀等方法。
結(jié)合成分、藥劑、產(chǎn)物或組合物可用局部方式施用到肺瘤位點(diǎn)或其他所需位點(diǎn)，或者可以以把向腫瘤或其他細(xì)胞的方式遞送。通過(guò)使用靶向系 統(tǒng)例如抗體或細(xì)胞特異性配體，靶向治療可用來(lái)更特異地遞送活性劑到某 些類(lèi)型細(xì)胞中。多種原因期望實(shí)現(xiàn)靶向，例如如果藥劑具有不可接受的毒 性，或如果是非如此需要過(guò)高劑量，或如果是非如此不能進(jìn)入靶細(xì)胞。
試劑盒
本發(fā)明進(jìn)一步延伸至含有組織蛋白酶s抑制劑和化療劑的藥物試劑 盒，其通過(guò)同時(shí)、連續(xù)或單獨(dú)施用組織蛋白酶s抑制劑和化療劑而用于聯(lián)
合治療，選擇地含有用于(a)和(b)單獨(dú)、連續(xù)或同時(shí)施用的說(shuō)明書(shū)。 劑量
本發(fā)明的和用于本發(fā)明的組織蛋白酶s抑制劑、抗組織蛋白酶s的抗 體和/或化療劑，以適宜條件、以"治療有效量"適當(dāng)?shù)厥┯玫絺€(gè)體，這對(duì)于 個(gè)體足以顯示益處。實(shí)際給藥方案取決于許多因素，包括被治療的病癥， 其嚴(yán)重度、被治療的患者、所使用的藥劑，并由醫(yī)師酌情處理。
在耳關(guān)合治療方案中采用組織蛋白酶s抑制劑和化療劑的實(shí)施方式中， 組織蛋白酶s抑制劑和化療劑可以與化療劑同時(shí)、單獨(dú)或連續(xù)施用。在單
獨(dú)或連續(xù)施用的情況下，它們可以在任何適當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)，例如彼此在1、 2、 3、 6、 12、 24、 48或72小時(shí)內(nèi)施用。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，它們彼此可 以在6小時(shí)內(nèi)，優(yōu)選地在2小時(shí)內(nèi)，更優(yōu)選地在1小時(shí)內(nèi)，最優(yōu)選地在20 分鐘內(nèi)施用。
在聯(lián)合治療方案中在采用組織蛋白酶S抑制劑和化療劑的一個(gè)實(shí)施方 式中，以產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的劑量施用組織蛋白酶S抑制劑和化療劑。即以增 強(qiáng)比(potentiating ratio)施用。本發(fā)明范圍內(nèi)的術(shù)語(yǔ)"增強(qiáng)比"用于指示組 織蛋白酶S抑制劑和化療劑以一種比例存在，使得它們聯(lián)合的細(xì)胞毒活性 高于單獨(dú)組分的活性，或者高于基于單個(gè)組分活性的它們的聯(lián)合而預(yù)期具 有的加和活性。
因此在增強(qiáng)比情況下，單個(gè)組分協(xié)同地發(fā)揮作用。
使用許多方法可以定義協(xié)同效應(yīng)。
例如，使用如Romaneli (Cancer Chemother Pharmacol, 4/: 385-390,
291998"務(wù)改的Kern方法(Cancer Res, 4& 117-121, 1988)，協(xié)同效應(yīng)可以定義 為高于加和(unity)的RI。對(duì)于A和B的J[關(guān)合，RI可以計(jì)算為預(yù)期存活 細(xì)胞(Se/定義為單獨(dú)用藥物A觀察到的存活結(jié)果和單獨(dú)用藥物B觀察到 的存活結(jié)果)與觀察到的存活細(xì)胞(Sobs)的比率(RI=Sexp/Sobs )。
協(xié)同效應(yīng)可以隨后定義為高于加和的RI。
在另 一個(gè)方法中，依照Chou和Talalay的方法(Adv Enzyme Regul,": 27-55, 1984)通過(guò)計(jì)算合用指數(shù)(CI)可以測(cè)定協(xié)同效應(yīng)。1、 < 1和> 1的 CI值分別指示累加效應(yīng)、協(xié)同效應(yīng)和反協(xié)同效應(yīng)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，組織蛋白酶S抑制劑和化療劑以足以產(chǎn) 生小于1、優(yōu)選地小于0.85 CI的濃度存在。
優(yōu)選地，協(xié)同效應(yīng)使用由Romaneli (1998a, b)修改的Kern方法^皮定義 為高于加和的ri。對(duì)于a和b的聯(lián)合，ri可以計(jì)算為預(yù)期存活細(xì)胞(Sep, 定義為單獨(dú)用藥物A觀察到的存活結(jié)果和單獨(dú)用藥物B觀察到的存活結(jié) 果)與觀察到的存活細(xì)胞(Sobs)的比率(RI=Se/Sobs)。協(xié)同效應(yīng)可以隨后 定義為高于加和的Ri。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述組織蛋白酶S抑制劑和化療劑以足 以產(chǎn)生高于1.5、例如高于2.0、例如高于2.25RI的濃度提供。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在用于治療腫瘤細(xì)胞時(shí)，聯(lián)合的藥物因 而產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)。
測(cè)定
對(duì)化療劑響應(yīng)而引起腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞表面組織蛋白酶S上調(diào)的測(cè)定， 使得能夠提供檢測(cè)化療劑是否在患者組織中具有這種效應(yīng)的測(cè)定。因此在 本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種方法，其用于體外評(píng)估得自受治療者的 腫瘤細(xì)胞對(duì)化療劑存在的應(yīng)答，以預(yù)測(cè)在體內(nèi)腫瘤細(xì)胞對(duì)用化療劑治療的 應(yīng)答，所述方法包4舌
(a) 提供得自受治療者的含有腫瘤細(xì)胞的體外樣品；
(b) 將肺瘤細(xì)胞的所述樣品的一部分接觸所述化療劑；(C)對(duì)比所述細(xì)胞表面組織蛋白酶S的表達(dá)與未接觸所述化療劑的
所述樣品對(duì)照部分中的組織蛋白酶S的表達(dá)；其中在接觸所述化療劑的樣
品部分中增加的表達(dá)指示對(duì)于所述化療劑具有敏感性。
在本發(fā)明這個(gè)方面優(yōu)選的實(shí)施方式中，接觸所述化療劑的樣品的表達(dá) 如果是未接觸所述化療劑的所述樣品的對(duì)照部分中 一種或多種基因的表
達(dá)的至少3倍、優(yōu)選地至少4倍、更優(yōu)選地至少5倍、甚至更優(yōu)選地至少 7倍、仍舊更優(yōu)選地至少10倍，最優(yōu)選地至少12倍的話，那么表達(dá)就^皮 認(rèn)為是加強(qiáng)了。
這種測(cè)定可以用于確定在具體患者中使用化療劑和組織蛋白酶S抑制 劑的聯(lián)合治療的適合性。
這種方法可選擇地或另外地用于監(jiān)控疾病的發(fā)展，例如在不同時(shí)間使 用活檢樣品。在這種實(shí)施方式中，是將組織蛋白酶S的表達(dá)與較早時(shí)間點(diǎn) (例如在之前的天、周或月)從相同組織獲得的樣品的表達(dá)比較，而不是 將組織蛋白酶S的表達(dá)與未接觸所述化療劑的對(duì)照樣品的表達(dá)比較。
肺瘤或癌癥的性質(zhì)會(huì)決定用于本發(fā)明方法的樣品的性質(zhì)。樣品可以是 例如，得自腫瘤組織活檢的樣品、骨髓活檢的樣品或者循環(huán)腫瘤細(xì)胞(例 如血)的樣品?？蛇x擇地，例如在肺瘤是胃腸道腫瘤情況下，肺瘤細(xì)胞可 以從糞便樣品中分離。腫瘤細(xì)胞的其他來(lái)源可以包括血漿、血清、腦脊液、 尿、間隙液和腹水等。
例如，實(shí)體瘤可以在含有抗生素的完全組織培養(yǎng)基中收集。
細(xì)胞可以從腫瘤樣品中手工挑出，或者在需要的情況下，通過(guò)與膠原 酶/DNA酶共同孵育而酶促解聚，并且懸浮在含有例如人或動(dòng)物血清的適 當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中。
在其他的實(shí)施方式中，可以分離活檢樣品并且冷凍或固定在例如福爾 馬林的固定劑中。然后在后續(xù)階段可以檢驗(yàn)樣品的基因表達(dá)水平。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，可能期望檢驗(yàn)組織蛋白酶S的抗體分子 或聯(lián)合治療對(duì)于細(xì)胞活力、增殖或血管生成的效應(yīng)。使用本領(lǐng)域任何已知 的方法可以抬r驗(yàn)這些效應(yīng)。 一些適合的測(cè)定在實(shí)施例中描述。其他的包括細(xì)胞活力和增殖測(cè)定
可以檢驗(yàn)抗體對(duì)于肺瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒和增殖作用，例如，如先前描述
能檢驗(yàn)對(duì)于U251mg星形細(xì)胞瘤細(xì)胞的作用。筒單地說(shuō)，細(xì)胞以每孔1 x 104 細(xì)胞/200 pl的終濃度加入96孔微量滴定板(Coraing Costar)。加入適當(dāng)濃度 的單克隆抗體(IOO nM)或僅有載體的對(duì)照培養(yǎng)基。板分別在37'C和5°/。 C02 條件孵育24、 48、 72和96小時(shí)。孵育后，加入10 pl的10 mg/ml MTT并 且進(jìn)一步在37。C和5% C02條件孵育2小時(shí)。小心除去培養(yǎng)基并且將曱臜 (formazan)結(jié)晶溶解在100 pl/孔的DMSO中。按上文描述來(lái)測(cè)量吸光度并 且結(jié)果以相對(duì)于每種僅有載體對(duì)照的細(xì)胞活力和增殖百分比表示。所有檢 驗(yàn)以4個(gè)重復(fù)進(jìn)行。
可以使用許多測(cè)定來(lái)研究分子對(duì)于血管生成的效應(yīng)。在實(shí)施例中描述 了主動(dòng)脈環(huán)才莫型。其他的包括
創(chuàng)傷測(cè)定
這種體外遷移是Ashton等描述方法(1999)的改進(jìn)版。將HMEC-1鋪板 到載玻片單個(gè)室中并且過(guò)夜生長(zhǎng)達(dá)到90%匯合。除去培養(yǎng)基并且創(chuàng)傷單細(xì) 胞層。單細(xì)胞層用新鮮培養(yǎng)基重新補(bǔ)充并且加入所需量的抗體達(dá)到所需終 濃度。
直到創(chuàng)傷完全閉合才在固定時(shí)間點(diǎn)除去載玻片，然后在4%PBS緩沖 的低聚甲醛中固定。"創(chuàng)傷"閉合的程度由中立的研究者通過(guò)顯微鏡來(lái)盲評(píng) (blindly assess ),并且在放大20倍(Olympus BX 50 )情況下使用標(biāo)定 的目鏡測(cè)微尺(1 mm/100 刻度)來(lái)定量?？贵w治療的載玻片中的閉合 程度與時(shí)間匹配fi治療對(duì)照(time matched sham treated control)進(jìn)4亍對(duì)比， 并且計(jì)算了創(chuàng)傷閉合對(duì)比于時(shí)間匹配對(duì)照(time matched control)的抑制 %。
海綿測(cè)定(sponge assay)
聚醚海綿皮下植入到C57黑鼠中并且在隔日用10 ng bFGF或10 ng bFGF+抗體注射。治療14天后，收獲海綿，切開(kāi)并且用H&E(A)染色。
氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(OIR)新生小鼠模型本研究中采用的氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變的動(dòng)物模型是由Smith等描述，并 且其現(xiàn)在廣泛地用于研究對(duì)于視網(wǎng)膜新生血管生成的抗血管生成治療的 檢驗(yàn)(Smith等，1994)。成窩出生后小鼠和它們的哺乳母鼠在出生后第7 天(P7)被安置在75%氧環(huán)境下，并且在P12返回室內(nèi)空氣。組織內(nèi)氧過(guò) 多的5天期間中央視網(wǎng)膜毛細(xì)血管床(central retinal capillary bed)經(jīng)受了 血管退化并且停止發(fā)育。在返回室內(nèi)空氣時(shí)中央視網(wǎng)膜變得顯著缺氧，這 與VEGF家族的血管源性生長(zhǎng)因子的增加有關(guān)。強(qiáng)力的新生血管生成反應(yīng) 跟著發(fā)生在P15的視網(wǎng)膜外新生血管的生成。新生血管生成在P17達(dá)到最 大化并且在P21之后退化。
分割未固定的神經(jīng)視網(wǎng)膜并且使其在RIPA緩沖液中經(jīng)受超聲波破碎。 對(duì)于結(jié)合HP-蛋白的量化，制備P13和P17小鼠的視網(wǎng)膜樣品用于HP 酶聯(lián)竟?fàn)幟庖呶綔y(cè)定法(ELISA)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，雙份100 pi樣品或者標(biāo)準(zhǔn) 樣品在96孔聚苯乙烯測(cè)定板(Corning Inc., Corning, NY)中在PBS/5 %吐溫 20中連續(xù)稀釋?zhuān)⑶矣?5 pl抗HP的兔多克隆抗體(1:3300,在PBS/5% 吐溫中)在37。C孵育1小時(shí)。然后將每孔中的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到預(yù)包^皮有固相抗 原(1:5000，在碳酸鹽緩沖液中，pH 9.6 )的NUNC C96 Maxisorp板4°C 過(guò)夜，并且用1%明膠封閉1小時(shí)。固相和可溶抗原間的竟?fàn)幵?7。C進(jìn)行 1小時(shí)，在此之后孔用PBS/5 %吐溫4x5分鐘洗，然后在每孔中加入100 }xl 1:2000的堿性磷酸酶山羊抗兔IgG (Sigma-Aldrich)。然后用PBS/5 %吐溫4 x 5分鐘洗板，并且在每孔加入100 ^ 1 mg/ml的堿性磷酸酶底物，溶解在 10 % 二乙醇胺緩沖液(pH 9.6)中的六水合4-硝基苯磷酸二鈉鹽 (4-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate ) (Sigma-Aldrich)。用 Safire微板讀數(shù)儀(Tecan Instruments)在405 nm處在2小時(shí)內(nèi)每5分鐘測(cè)量 隨后反應(yīng)的顯色，并且使用Magellan 3軟件分析反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。通過(guò)對(duì)比 Lineweaver-Burk酶動(dòng)力學(xué)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)合HP-l的樣品，并且以樣品的 蛋白濃度比率表示。用于測(cè)定的固相抗原是HP，其還原性地結(jié)合到牛血 清白蛋白。使用Student's t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并且P值< 0.05認(rèn)為具有 顯著性。
現(xiàn)在在下述非限制性例子中進(jìn)一步描述本發(fā)明。參考附圖，其中

圖1說(shuō)明在有/沒(méi)有48小時(shí)CPT11治療情況下，在HCT116細(xì)胞和RKO 細(xì)胞中Cat S RNA表達(dá)的分析。
圖2說(shuō)明在有/沒(méi)有48小時(shí)CPT11治療情況下，在HCT116 +/+細(xì)胞、 RKO +/+細(xì)胞和HT29 p53突變細(xì)胞中，Cat S和y微管蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì) Western點(diǎn)雜交分析。
圖3說(shuō)明未治療(3A)和CPT11治療48小時(shí)(3B )的RKO+Z+細(xì)胞， 以及未治療(3C )和CPT11治療48小時(shí)(3D )的HCT116+Z+細(xì)胞的細(xì)胞 表面表達(dá)的Cat S的流式細(xì)胞檢測(cè)分析。細(xì)胞用Cat S單克隆抗體(綠色-每個(gè)圖上較低的峰(斜條紋))和同種型匹配對(duì)照(紅色-每個(gè)圖左側(cè)高 的峰(垂直條紋))染色。
圖4說(shuō)明未治療(4A)和CPT11治療48小時(shí)(4B )的H630細(xì)胞的 細(xì)胞表面表達(dá)的Cat S的流式細(xì)胞檢測(cè)分析。細(xì)胞用Cat S單克隆抗體(綠 色-每個(gè)圖上的雙峰(斜條紋))和同種型匹配對(duì)照(紅色-每個(gè)圖左側(cè) 單個(gè)較高的峰(垂直條紋))染色。
圖5說(shuō)明了顯示使用1E11的Cat S單克隆抗體的免疫細(xì)胞化學(xué)分析結(jié) 果的照片，揭示Cat S表達(dá)位于HCT116細(xì)胞的細(xì)胞表面。右側(cè)組顯示流 式細(xì)胞檢測(cè)分析的結(jié)果，在HCT116細(xì)胞中觀察到在用Cat S染色的情況 下，比用同種型對(duì)照增加了 38%的熒光強(qiáng)度。
圖6說(shuō)明在結(jié)腸直腸癌活檢樣品以及在正常脾和結(jié)腸樣品中，Cat S 表達(dá)的免疫組化檢測(cè)結(jié)果。
圖7說(shuō)明與對(duì)照(非腫瘤細(xì)胞)相比，在HCT116+Z+、結(jié)腸直腸癌細(xì) 胞中Cat S和P3整聯(lián)蛋白R(shí)NA表達(dá)的分析。在35個(gè)PCR循環(huán)后分析RNA 水平。
圖8a說(shuō)明未治療和治療的(CatS 1E11 + 5Fu (IC50))異種移植瘤模 型中的腫瘤上，CatSlEll的mAb的定位的免疫組化檢測(cè)。黑色(棕色) 染色指示陽(yáng)性染色。
圖8b說(shuō)明未治療和治療的(CatSlEll + 5Fu (IC50))異種移植瘤模 型中的腫瘤上，CatS 1E11的mAb的定位的免疫組化檢測(cè)。黑色(棕色)染色指示陽(yáng)性定位。
圖9顯示在異種移植瘤模型的器官中經(jīng)過(guò)9天給藥方案(CatS 1E11 + 5Fu(IC50))后，腸和肝切片的照片。
圖10說(shuō)明在5 - Fu治療的腫瘤切片中Cat S表達(dá)的免疫組化檢測(cè)。切 片用小鼠IgGl同種型對(duì)照或Cat S 1E11 MAb染色。
圖11.在未治療和5-Fu治療(15 mg/kg)的腫瘤切片中Cat S表達(dá)的 免疫組化^r測(cè)。切片用Cat S 1E11 mAb染色。
圖12說(shuō)明在未治療和CPT-ll治療(15 mg/kg)的腫瘤切片中Cat S表 達(dá)的免疫組化檢測(cè)。切片用Cat S 1E11 mAb染色。
圖13說(shuō)明在未治療和5 - Fu治療的腫瘤切片中Cat S表達(dá)的免疫組化 檢測(cè)。切片用小鼠IgG同種型對(duì)照(R&D Systems)或Cat S 1E11 mAb染色。
圖14說(shuō)明在對(duì)照(小鼠IgGl + 5 - Fu)和治療的(Cat S 1E11 + 5Fu (IC50))胂瘤切片中細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。切片用抗裂解細(xì)胞凋亡蛋白酶-3 (Cell Signalling Technology)染色。
圖15a顯示在僅有載體對(duì)照、同種型對(duì)照、抗組織蛋白酶S的抗體 (mAbl)或抗組織蛋白酶S的抗體(mAb2)中培養(yǎng)的HMEC細(xì)胞的照片；
圖15b說(shuō)明了圖示，其說(shuō)明在1E11 (靠上的組)或1E4 (下面的組) 存在的情況下，觀察到的毛細(xì)血管細(xì)胞分支的抑制。
圖16a說(shuō)明在對(duì)照抗體和抗組織蛋白酶S的抗體1E11存在下(以60、 300和600 nM濃度)培養(yǎng)的主動(dòng)脈的切片的照片。
圖16b (左上)說(shuō)明了圖示，其概述了抗體對(duì)如圖16a中顯示的血管 長(zhǎng)度的影響。
圖16b (右上)說(shuō)明了圖示，其概述了抗體對(duì)如圖16a中顯示的血管 數(shù)量的影響。
圖16b (下圖)說(shuō)明了圖示，其概述了抗體對(duì)如圖16a中顯示的最大 血管長(zhǎng)度的影響。
圖17a (1)和a (2 )說(shuō)明在對(duì)照抗體和抗組織蛋白酶S的抗體IE11
35存在下(以1 ug/ml、 5 ug/ml、 10 ug/ml以及100 ug/ml, 1 ug/ml濃度)培養(yǎng) 的主動(dòng)脈的切片分別在放大4倍和20倍情況下的照片。
圖17b說(shuō)明了曲線圖，其概述在圖17a說(shuō)明的實(shí)驗(yàn)中抗體對(duì)血管數(shù)量、 平均血管長(zhǎng)度和最大血管長(zhǎng)度的影響。
圖18說(shuō)明1E11抑制性抗體的Vh和Vt鏈的氨基酸序列，并且CDR 以加粗和下劃線突出顯示，其從VH和VL區(qū)的DNA測(cè)序而確定。
材泮+和方法
細(xì)胞系和培養(yǎng)條件
HCT116 (p53野生型)人結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞系維持在McCoys培養(yǎng)基中 (Invitrogen, UK)。 RKO (p53野生型)、H630 (p53突變型)和HT29 (p53突變 型)結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞系維持在Dulbecco's改進(jìn)的Eagle's培養(yǎng)基中 (DMEM, Invitrogen, UK)。所有的培養(yǎng)基用10 % FCS、 1 % pen / strep和1 % L-谷氨酰胺(都是Invitrogen, UK)補(bǔ)充。
用化療劑處理細(xì)胞系
將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以~20%的匯合程度接種到6孔組織培養(yǎng)板，并 且過(guò)夜孵育以允許細(xì)胞粘合到板上?？子肅PTll(Irinotecan)和5-Fu (Flourouracil)在不同濃度(包括7.5 pM)維持48小時(shí)治療。在對(duì)照孔的化療 被鹽水替代。
Western點(diǎn)雜交
在用如先前描述的含有蛋白酶抑制劑混合物(cocktail)(Calbiochem, UK) 的RIPA緩沖液裂解之前，細(xì)胞在PBS中洗滌(以1500 rpm離心5分鐘)。 全細(xì)胞裂解產(chǎn)物以相同濃度上樣到12% SDS-PAGE膠上。在以20V維持 45分鐘半干地轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(BioRad，UK)以前，以50V過(guò)夜跑膠。 使用PBS (3%奶粉)封閉硝酸纖維素膜約1小時(shí)，并且用PBS (0.01%吐 溫)洗滌3次，每次5分鐘。膜然后用在PBS (3%奶粉)中1: 1000稀 釋的Cat S Mab (1E4 Mab或1E11 Mab )探測(cè)1小時(shí)。加入在PBS ( 3 %奶粉)中1: 5000稀釋1小時(shí)的結(jié)合HRP的山羊抗鼠二抗(secondary goat anti mouse-HRP conjugated antibody) (BioRad, UK)之前，膜用PBS (0.01 %吐 溫)洗滌3次，每次5分鐘。在這之后在PBS ( 0.01 %吐溫)中洗3次每 次5分鐘。使用Super Signal kit (Pierce),膜通過(guò)ECL (增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光)'顯 影，。在曝光照相底片不同時(shí)間之前，膜在ECL溶液中孵育5分鐘。在洗 滌和千燥前，照相底片在顯影液(Sigma, UK)中洗1分鐘，然后以水洗 滌并且再用定影液(Sigma, UK)洗滌1分鐘。
流式細(xì)力包術(shù)
使用刮器從組織培養(yǎng)板中收集細(xì)胞并且在PBS (0.01%吐溫)中洗3 次(以1500 rpm離心5分鐘)。將約5xl05細(xì)胞^L置在適當(dāng)?shù)臉?biāo)記管中。細(xì) 胞用50 抗Cat S或同種型對(duì)照(Sigma, UK)在室溫下孵育1小時(shí)。孵育后 每管在PBS (0.01 %吐溫)中洗3次(以1500 rpm離心5分鐘)。樣品然后 與1:15稀釋的結(jié)合FITC的山羊抗鼠二抗(Sigma, UK)孵育(樣品保持在室 溫下的黑暗環(huán)境中)。孵育后每管在PBS( 0.01 %吐溫)中洗3次(以1500 rpm 離心5分鐘)。使用Cyan流式細(xì)胞儀(Dako, UK)立即分析之前，在0.5 ml PBS 中重懸樣品。
RT-PCR
使用PTC 225梯度循環(huán)儀(MJ Research Incorporated)進(jìn)行RT-PCR。 使用RNA STAT-60試劑(Tel-Test Friendswood, USA)依照廠商的技術(shù)說(shuō)明 書(shū)收集RNA，并且使用lug RNA和逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(GIBCO Invitrogen, Paisley, UK)合成cDNA。用于RT-PCR的引物組是Cat S正向引物5'- ACT CAG AAT GTG AAT CAT GGT G誦3'和Cat S反向引物5'國(guó)TTC TTG CCA TCC GAA TAT ATC C-3', 以及|33整聯(lián)蛋白引物5'-CCTA CATGACCGAAAATACCT- 3'和5'隱AATCCCTCCCCACAAATACTG-3'。使 用biomix PCR混合物(Bioline, UK)分析基因表達(dá)，所述混合物含有25 ul Biomix; 1.5|11正向引物；1.5pl反向引物；2 cDNA和20 pi dH20。 PCR 條件由初始的變性步驟95°C 10分鐘，隨后的32或45個(gè)循環(huán)的95 °C 30 秒、55°C 30秒和72。C 90秒，以及72。C 10分鐘的最后延伸組成。在UV 盒上分析之前，得自32和45個(gè)循環(huán)反應(yīng)的5 pl擴(kuò)增產(chǎn)物上樣到1.5%瓊脂糖凝膠(O.OOl %溴化乙錠)并以90V跑膠40分鐘。異種移植瘤模型
用2 x 106 HCT116+Z+人結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞植入6 - 8周大的雌性SCID小鼠的每個(gè)脅。收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞，在PBS中洗滌并且在HBSS中重懸。它們與等體積的基質(zhì)膠混合以達(dá)到5 x 106細(xì)胞/ml的終濃度。植入后第5天小鼠被隨機(jī)地分配到治療組中，并且用有/沒(méi)有5Fu的Cat S Mab或同種型對(duì)照Mab (10 mg/kg)的各種方案治療(15 mg/kg每天，或70mg/kg每周二次)。所有的藥物通過(guò)快速濃注施用。在不同的時(shí)間點(diǎn)殺死動(dòng)物并且取出肺瘤用于分析。
免疫組化
福爾馬林固定的異種移植物/器官組織樣品的石蠟包埋，切片和組織切片的H&E (蘇木精和曙紅)染色，按先前描述的內(nèi)容進(jìn)行。使用抗生物素蛋白-辣根過(guò)氧化物酶法(Vectorlabs ABC Kit)進(jìn)行免疫染色。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，切片脫蠟要經(jīng)過(guò)從二曱苯到酒精到流水。內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性通過(guò)與含3%11202的曱醇孵育IO分鐘而被封閉。切片然后在檸檬酸鹽緩沖液pH 6.0中煮沸22分鐘。在室溫下在5 %正常馬血清封閉液中進(jìn)行20分鐘孵育。切片與一抗在4。C過(guò)夜孵育。以相同的稀釋度使用合適的同種型對(duì)照，其作為一抗使用。
對(duì)于過(guò)氧化物酶染色，切片與生物素化的全-特異性(pan-specific)二抗(Vector Laboratories)在室溫下孵育30分鐘，之后與Vectastain Elite ABC試劑(VectorLaboratories)在室溫下再孵育30分鐘。對(duì)于顯色，切片用3,3'-二氨基聯(lián)苯胺染色并且用Gill's II蘇木精溶液復(fù)染。
染色使用切割的細(xì)胞凋亡蛋白酶-3多克隆抗體(Cell SignallingTechnology),依照廠商的技術(shù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。對(duì)于抗體定位的檢測(cè)，在先前施用到異種移植瘤才莫型后，不需要一抗孵育的步驟。
對(duì)于AccuMaxTM Array載玻片，依照廠商的技術(shù)說(shuō)明書(shū)使用1:100稀釋的Cat S單克隆抗體和生物素化的馬的二抗(Vector Laboratories, CA)進(jìn)行染色。在封固(mounting)和分析前載玻片用蘇木精復(fù)染。共聚焦顯微鏡
對(duì)于表達(dá)Cat S的HCT116細(xì)胞的染色使用如前所述的Cat S單克隆抗體。細(xì)胞在蓋玻片上生長(zhǎng)，使用冰冷的丙酮固定并且與1:100稀釋的CatS抗體孵育。用PBS洗滌蓋玻片并且與抗鼠AlexaFluor 488標(biāo)記的二抗孵育。再次用PBS洗滌蓋玻片，使用PermaFluor封固劑封固并且通過(guò)共聚焦顯微鏡顯像。
毛細(xì)血管樣血管生成的測(cè)定
Cat S mAb對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的影響按如下方式評(píng)估。二百微升的基質(zhì)膠(IO mg/ml)加入到預(yù)冷卻的48孔板中，在4。C孵育10分鐘并且隨后允許在37。C聚合1小時(shí)。細(xì)胞在含有200 nM適當(dāng)抗體的內(nèi)皮生長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基MV(Promocell)中懸浮。每孔加入五百微升(lx 105細(xì)胞)。關(guān)于對(duì)照，細(xì)胞與含有適當(dāng)體積PBS的、僅有載體的對(duì)照培養(yǎng)基孵育。在37。C和5% C02條件孵育24h后，使用Nikon Eclipse TE300顯微鏡觀察細(xì)胞。
細(xì)胞活力和增殖測(cè)定
如先前描述能檢驗(yàn)Cat S單克隆抗體對(duì)于U251mg星形細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒和增殖作用。簡(jiǎn)單地說(shuō)，細(xì)胞以每孔1 x 104細(xì)胞/200 的終濃度加入96孔微量滴定板(Coming Costar)。加入適當(dāng)濃度的單克隆抗體(100 nM)或僅有載體的對(duì)照培養(yǎng)基。板分別在37。C和5。/。C02條件孵育24、 48、 72和96小時(shí)。孵育后，加入10 pi的10 mg/mlMTT并且進(jìn)一步在37。C和5%C02條件孵育2小時(shí)。小心除去培養(yǎng)基并且將曱臜結(jié)晶溶解在100 pl/孔的DMSO中。按上文描述來(lái)測(cè)量吸光度并且緒果以相對(duì)于每種僅有載體對(duì)照的細(xì)胞活力和增殖的百分比表示。所有檢驗(yàn)以4個(gè)重復(fù)進(jìn)行。
創(chuàng)傷測(cè)定
這些研究中使用的體外遷移測(cè)定是Ashton等描述方法(1999)的改進(jìn)版。HMEC-l鋪板到載玻片單個(gè)室中并且過(guò)夜生長(zhǎng)達(dá)到90。/o匯合。除去培養(yǎng)基并且創(chuàng)傷單細(xì)胞層。單細(xì)胞層用新鮮培養(yǎng)基重新補(bǔ)充并且加入所需量的抗體達(dá)到所需終濃度。
直到創(chuàng)傷完全閉合才在固定時(shí)間點(diǎn)除去載玻片，然后在4%PBS緩沖的低聚曱醛中固定。"創(chuàng)傷，，閉合的程度由中立的研究者通過(guò)顯微鏡來(lái)盲評(píng)，
并且在放大20倍(Olympus BX 50)情況下使用標(biāo)定的目鏡測(cè)微尺(1mm/100 pm刻度)來(lái)定量?？贵w治療的載玻片中的閉合程度與時(shí)間匹配假治療對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，并且計(jì)算了創(chuàng)傷閉合對(duì)比于時(shí)間匹配對(duì)照的抑制％ 。
大鼠主動(dòng)Ji^漠型
處死雄性Wistar大鼠，無(wú)菌地取出胸主動(dòng)脈并且切成lcm厚的環(huán)。在無(wú)菌培養(yǎng)基中洗環(huán)十次以除去任何細(xì)菌，并且包埋到24孔板的基質(zhì)膠中?？子? ml的培養(yǎng)基和增加濃度的抗體補(bǔ)充。板孵育8天并且孵育后基質(zhì)膠和環(huán)在4%PBS緩沖的低聚甲醛中固定并且儲(chǔ)存在PBS中。血管生成的程度由中立的研究者通過(guò)顯微鏡來(lái)盲評(píng)，并且在放大20倍(Olympus BX 50 )情況下使用標(biāo)定的目鏡測(cè)微尺(1 mm/100 pm刻度)來(lái)定量。測(cè)量了每個(gè)視野內(nèi)的血管長(zhǎng)度、最大血管長(zhǎng)度和血管數(shù)量的范圍，并且與時(shí)間匹配假對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，并且計(jì)算了抑制％ 。
海綿測(cè)定
聚醚海綿皮下植入到C57黑鼠中并且在隔日用10 ng bFGF或10 ngbFGF+抗體注射。治療14天后，收獲海綿，切開(kāi)并且用H&E(A)染色。
氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(OIR)新生小鼠模型
本研究中采用的氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變的動(dòng)物模型是由Sm他等描述，并且其現(xiàn)在廣泛地用于研究對(duì)于視網(wǎng)膜新生血管生成的抗血管生成治療的檢驗(yàn)(Smith等，1994)。成窩出生后小鼠和它們的哺乳母鼠在出生后第7天(P7)被安置在75%氧環(huán)境下，并且在P12返回室內(nèi)空氣。組織內(nèi)氧過(guò)多的5天期間中央視網(wǎng)膜毛細(xì)血管床經(jīng)受了血管退化并且停止發(fā)育。在返回室內(nèi)空氣時(shí)中央視網(wǎng)膜變得顯著缺氧，這與VEGF家族的血管源性生長(zhǎng)因子的增加有關(guān)。強(qiáng)力的新生血管生成反應(yīng)跟著發(fā)生在P15的視網(wǎng)膜外新生血管的生成。新生血管生成在P17達(dá)到最大化并且在P21之后退化。
分割未固定的神經(jīng)視網(wǎng)膜并且使其在RIPA緩沖液中經(jīng)受超聲波破碎。對(duì)于結(jié)合HP-蛋白的量化，制備P13和P17小鼠的視網(wǎng)膜樣品用于HP酶聯(lián)竟?fàn)幟庖呶綔y(cè)定法(ELISA)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，雙份100 ^樣品或者標(biāo)準(zhǔn)樣品在96孔聚苯乙烯測(cè)定板(Corning Inc., Corning, NY)中在PBS/5 %吐溫20中連續(xù)稀釋?zhuān)⑶矣?5 nl抗HP的兔多克隆抗體(l:3300,在PBS/5 %吐溫中)在37。C粹育1小時(shí)。然后將每孔中的內(nèi)含物轉(zhuǎn)移到預(yù)包被有固相抗原(1:5000，在碳酸鹽緩沖液中，pH9.6)的NUNC C96 Maxisorp板4。C過(guò)夜，并且用1%明膠封閉1小時(shí)。固相和可溶抗原間的竟?fàn)幵?7。C進(jìn)行1小時(shí)，在此之后孔用PBS/5 %吐溫4x5分鐘洗滌，然后在每孔中加入100 pl 1:2000的堿性磷酸酶山羊抗兔IgG (Sigma-Aldrich)。然后用PBS/5%吐溫4x5分鐘洗板，并且在每孔加入100 jxl 1 mg/ml的堿性磷酸酶底物，溶解在1(T/。二乙醇胺緩沖液(pH 9.6)中的六水合4-硝基苯磷酸二鈉鹽(Sigma-Aldrich)。用Safire微板讀數(shù)儀(Tec肌Instruments)在405 nm處在2小時(shí)內(nèi)每5分鐘測(cè)量隨后反應(yīng)的顯色，并且使用Magellan 3軟件分析反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。通過(guò)對(duì)比Lineweaver-Burk酶動(dòng)力學(xué)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)合HP-1的樣品，并且以樣品的蛋白濃度比率表示。用于測(cè)定的固相抗原是HP，其還原性地結(jié)合到牛血清白蛋白。使用Student's t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并且P值—0.05認(rèn)為具有顯著性。
結(jié)果
本項(xiàng)研究研究了結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系上的CatS表達(dá)，以及化療誘導(dǎo)CatS表達(dá)的能力。本研究進(jìn)一步檢驗(yàn)了抗Cat S特異性單克隆抗體對(duì)于腫瘤發(fā)展的影響以及體外和體內(nèi)的活力。
實(shí)施例1至3
對(duì)在mRNA、蛋白和細(xì)胞表面水平的Cat S表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)施例1
RT半定量PCR用于檢測(cè)在有/沒(méi)有7.5 CPT11治療情況下，4種結(jié)腸直腸細(xì)胞系(HCT116 +/+、 RKO +/+、 H630 p53突變型和HT29 p53突變型)中Cat S的mRNA水平。在32和45個(gè)PCR循環(huán)之后，分析RNA水平以確定治療和未治療樣品之間表達(dá)中的相對(duì)差異。所有4種細(xì)胞系均顯示了 Cat S的基礎(chǔ)表達(dá)，而HCT116 +/+和RKO +/+細(xì)胞系顯示了對(duì)于化療(如圖1中顯示)的響應(yīng)而產(chǎn)生表達(dá)的增加。
實(shí)施例2
通過(guò)對(duì)從3種細(xì)胞系(HCT116 +/+、 RKO +/+和HT29 )制備的全細(xì)胞 裂解產(chǎn)物制品進(jìn)行Western點(diǎn)雜交分析，在蛋白水平檢測(cè)Cat S表達(dá)。關(guān)于 HCT116 +/+和1110) +/+細(xì)胞系的全細(xì)胞裂解產(chǎn)物，在有/沒(méi)有48小時(shí)CPTll 治療(7.5 pM)的樣品上制備。所有3種細(xì)胞系顯示Cat S的陽(yáng)性表達(dá)(圖2 )， 在治療和未治療的HCT116 +/+或RKO +/+樣品之間，全蛋白表達(dá)水平?jīng)]有 明顯差異。
實(shí)施例3
使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Cat S的細(xì)胞表面表達(dá)。在有/沒(méi)有CPT11治療情 況下，分析HCT116 +/+、 RKO +/+和11630 p53突變型細(xì)胞的細(xì)胞表面的 表達(dá)。RKO +/+細(xì)胞系顯示38 %的陽(yáng)性的基礎(chǔ)的細(xì)胞表面表達(dá)，在化療誘 導(dǎo)后(圖3 A-B)其增加至49。/。。 HCT116+Z+細(xì)胞系顯示39%的陽(yáng)性的基礎(chǔ) 的細(xì)胞表面表達(dá)，在化療誘導(dǎo)后(圖3 C-D)其增加至59% 。 H630 p53突變 型細(xì)胞系顯示37%的陽(yáng)性的基礎(chǔ)的細(xì)胞表面表達(dá)，在化療誘導(dǎo)后(圖4 A-B) 其增加至41 % 。
實(shí)施例4
使用共聚焦顯微鏡進(jìn)一步確認(rèn)腫瘤細(xì)胞表面組織蛋白酶S的存在。對(duì) 于表達(dá)Cat S的HCT116細(xì)胞的染色使用如前所述的Cat S單克隆抗體。結(jié) 果顯示在圖5中。使用1E11的CatS單克隆抗體的免疫細(xì)胞化學(xué)分析揭示 了 Cat S表達(dá)位于HCT116細(xì)胞的細(xì)胞表面，這也通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)分析 而確認(rèn)，其中在HCT116細(xì)胞中觀察到在用Cat S染色的情況下，比用同 種型對(duì)照增加了 38%的熒光強(qiáng)度。
實(shí)施例5
相反，結(jié)腸的正常切片沒(méi)有顯示、如對(duì)于結(jié)腸直腸癌所證明的細(xì)胞表 面組織蛋白酶S的表達(dá)。圖6顯示在結(jié)腸直腸癌活檢樣品中Cat S表達(dá)的 免疫組化檢測(cè)結(jié)果。使用抗成熟的人Cat S蛋白酶的單克隆抗體，對(duì)組織 切片進(jìn)行Cat S表達(dá)的染色。人結(jié)腸正常切片的染色證明了對(duì)于Cat S產(chǎn)生略微的染色或沒(méi)有染色，而結(jié)腸直腸癌活檢切片對(duì)于CatS產(chǎn)生深的染色。 實(shí)施例6
據(jù)報(bào)道血管成形術(shù)后在動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄中，組織蛋白酶S與整 聯(lián)蛋白av(33共同存在(co-localise),作為血管平滑肌細(xì)胞表面的受體 (Cheng等，Am J Pathology, 2006, 168:685-694 )。
本發(fā)明人研究了本文所證明的腫瘤細(xì)胞表面組織蛋白酶S的定位是否 與這種整聯(lián)蛋白有關(guān)。如在圖7中顯示，其顯示了在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞 HCT116 +/+中Cat S和(33整聯(lián)蛋白R(shí)NA表達(dá)的分析結(jié)果。在35個(gè)PCR 循環(huán)后，盡管組織蛋白酶S強(qiáng)烈表達(dá)，但沒(méi)有證明P3整聯(lián)蛋白R(shí)NA的表 達(dá)，顯示腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞表面組織蛋白酶S的定位在動(dòng)脈粥樣硬化條件下 與血管平滑肌細(xì)胞中整聯(lián)蛋白的表達(dá)不相關(guān)。
實(shí)施例7
然后使用化療劑5Fu和組織蛋白酶S抑制性抗體lEll(本文也指的是 CatSMab)，進(jìn)行了聯(lián)合治療效果的研究。
如在共同待決的PCT申請(qǐng)WO2006/109045 (其內(nèi)容通過(guò)引用并入本 文，并且其要求GB0507219.4和GB0507272.3的優(yōu)先權(quán))中顯示，這種抗 體具有有效的抑制活性。在使用熒光底物的熒光測(cè)定中，所述抗體抑制Cat S的蛋白水解活性。在使用PC3前列腺癌細(xì)胞系、U251mg星形細(xì)胞瘤細(xì) 胞系、HCT116結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系、MDMB231乳腺癌細(xì)胞系和MCF 7乳 腺癌細(xì)胞系的侵襲測(cè)定中，所述抗體進(jìn)一步還顯示有效地抑制腫瘤細(xì)胞的 侵襲。此外，在基質(zhì)膠測(cè)定中證明了這種抗體的抗血管生成效應(yīng)，其中所 述抗體顯示抑制了毛細(xì)血管生成(參閱下文)。
在結(jié)腸直腸癌異種移植瘤模型中進(jìn)行了 Cat S體內(nèi)表達(dá)的研究。模型 用化療劑5Fu、 CPT-11和奧沙利鉑(15mg/kg-70mg/kg劑量)單獨(dú)治療，或 者與10 mg/kg的1E11 Cat S單克隆抗體Jf關(guān)合治療。治療后石蠟包埋的組織 切片用于抗體位置的檢測(cè)。從CatSMab與5-Fu聯(lián)合治療的動(dòng)物中獲得的 胂瘤樣品IgG染色陽(yáng)性(圖8a和8b )，顯示Cat S Mab能成功地靶向陽(yáng)性 表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。實(shí)施例8
治療后檢測(cè)所有主要小鼠器官的構(gòu)造變化。沒(méi)有觀察到病理變化的征 兆。圖9顯示在異種移植瘤模型器官中9天給藥方案(Cat S 1E11+ 5Fu (IC50))后腸和肝切片的照片。體內(nèi)研究表示用10 mg/kg的1E11 Mab與化 療聯(lián)合的重復(fù)治療沒(méi)有有害的毒性作用(圖9)。
實(shí)施例9
使用1E11 mAb染色肺瘤切片以檢測(cè)Cat S表達(dá)(圖10 )。小鼠IgG同 種型用作對(duì)照。圖11和13顯示，從用5-Fu治療的小鼠中獲得的胂瘤切片 觀察到Cat S表達(dá)的上調(diào)，圖12顯示從用CPT-ll治療的小鼠中獲得的切 片具有相似的結(jié)果。
實(shí)施例10
使用抗切割細(xì)胞凋亡蛋白酶-3多克隆抗體檢測(cè)聯(lián)合治療對(duì)于腫瘤組 織的影響(圖14)。在治療的組織中觀察到細(xì)胞凋亡蛋白酶3活性的增力口， 指示Cat S Mab對(duì)細(xì)胞凋亡有影響。
實(shí)施例11CatS抗體能抑制人內(nèi)皮細(xì)胞中血管樣的形成
使用由Grant等(Cell 1989 Sep 8; 58 (5) : 933-43 )描述的基質(zhì)膠形態(tài)發(fā) 生測(cè)定(matrigel morphogenesis assay),用在基質(zhì)膠上培養(yǎng)的人微血管內(nèi) 皮細(xì)胞(HMEC )進(jìn)行毛細(xì)血管形成測(cè)定，使得內(nèi)皮細(xì)胞形成血管樣結(jié)構(gòu)， 并且侵襲芽(invasive sprout)從單個(gè)細(xì)胞延伸出以接觸附近的內(nèi)皮細(xì)胞。 圖15a說(shuō)明在兩種Cat S抗體(1E11和1E4 )或同種型對(duì)照存在下，培養(yǎng) 的HMEC細(xì)胞的結(jié)果。廣泛的血管樣結(jié)構(gòu)明顯地存在于僅有載體對(duì)照和同 種型對(duì)照抗體(200nM)的組中；然而在1E11 (mAbl )或1E4 (mAb2)抗 體(200 nM)存在下，這種血管生成幾乎被完全消除。這些結(jié)果隨后如在圖 15b中定量顯示，其說(shuō)明在1E11 (靠上的組)或1E4 (靠下的組)存在下， 觀察到毛細(xì)血管細(xì)胞分支的抑制。
兩種抗體先前顯示特異性結(jié)合Cat S而與其他組織蛋白酶、具體而言 指與Cat S具有最高同源性的那些，沒(méi)有交叉反應(yīng)性?？贵w1E11和1E4 兩者特征在于它們抑制Cat S催化活性的能力；1E11能特異性地抑制Cat S的活性而1E4沒(méi)有可辨別的效應(yīng)。因此，毛細(xì)血管測(cè)定的結(jié)果顯示從內(nèi)皮
細(xì)胞分泌的有活性的Cat S被抑制性或非抑制性Cat S mAb的隔離，足以 防止內(nèi)皮細(xì)胞形成血管樣結(jié)構(gòu)的遷移和排列(migration and arrangement )。
實(shí)施例12在大鼠主動(dòng)脈弓間接體內(nèi)模型中Cat S抗體能抑制血管樣
生成
為進(jìn)一步評(píng)估Cat S在血管生成中的作用，進(jìn)行間接體內(nèi)大鼠主動(dòng)脈 弓測(cè)定。主動(dòng)脈的切片(l mm)在抑制性抗體和適當(dāng)對(duì)照存在下，在基質(zhì)膠 薄層內(nèi)培養(yǎng)。監(jiān)控主動(dòng)脈中血管樣管的生成，并且在7天后通過(guò)測(cè)量與對(duì) 照相比的血管數(shù)量、平均血管長(zhǎng)度和最大血管長(zhǎng)度的減少而量化。
圖16說(shuō)明在Cat S 1E11抗體存在下血管生成的顯著抑制。環(huán)切片的 照片顯示在圖16a中而結(jié)果概述在圖16b中。大鼠主動(dòng)脈環(huán)切片與最高達(dá) 600 nM的1E11共同孵育，導(dǎo)致血管總數(shù)、平均血管長(zhǎng)度和最大血管長(zhǎng)度 超過(guò)80%的減少(圖16b )。
圖17說(shuō)明在Cat S 1E11抗體存在下的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中血管生成的顯著抑 制。環(huán)切片的照片顯示在圖17a中而結(jié)果概述在圖17b中。大鼠主動(dòng)脈環(huán) 切片與高達(dá)10pg/ml的1E11共同孵育，導(dǎo)致血管總數(shù)70%的減少，并且 導(dǎo)致平均血管長(zhǎng)度和最大血管長(zhǎng)度60 %的減少。
所有涉及本說(shuō)明書(shū)的文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。在不脫離本發(fā)明的范圍 和精神情況下，可以制定對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯可知的本發(fā)明所描述實(shí) 施方式的各種修改和變化。盡管本發(fā)明已聯(lián)系具體優(yōu)選的實(shí)施方式進(jìn)行描 述，但是應(yīng)理解如權(quán)利要求所述本發(fā)明不應(yīng)不當(dāng)?shù)厥芟抻谶@些具體的實(shí)施 方式。實(shí)際上，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯可知的、執(zhí)行本發(fā)明所描述實(shí)施 方式的各種修改，都預(yù)期包括在本發(fā)明中。
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4權(quán)利要求
1. 一種抑制化療誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞表面組織蛋白酶S上調(diào)的方法，所述方法包括施用組織蛋白酶S抑制劑到所述細(xì)胞。
2. —種治療腫瘤性疾病的方法，其包括同時(shí)、連續(xù)或單獨(dú)施用組織 蛋白酶S抑制劑和化療劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述化療劑M于鉑的抗腫瘤 劑、抗代謝藥、核苷類(lèi)似物、胸苷酸合成酶抑制劑或拓樸異構(gòu)酶抑制劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述化療劑是CPT-ll。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述化療劑是5-FU。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組織蛋白酶S抑 制劑是小分子抑制劑、肽抑制劑、抗體分子、或者編碼組織蛋白酶S抑制 劑的肽或組織蛋白酶S抑制劑的抗體分子的核酸。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述組織蛋白酶S抑制劑是抗 體分子。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述抗體分子和所述化療劑以 免疫結(jié)合物提供。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述抗體分子通過(guò)蛋白酶作用 從所述化療劑中可切割出來(lái)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述抗體分子和所迷化療劑是 單獨(dú)的分子。
11. 根據(jù)權(quán)利要求7至IO任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體分子結(jié)合 組織蛋白酶S并且抑制其蛋白水解活性。
12. 根據(jù)權(quán)利要求7至11任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體分子包括 抗原結(jié)合區(qū)域，所述抗原結(jié)合區(qū)域包括(i )至少一種CDR，其具有選自由Seq ID No: 1 、 Seq ID No : 2、 Seq ID No : 3或其變體組成的組的氨基酸序列，其中在至少一種CDR中進(jìn)行5個(gè)或更少，例如4、 3、 2或1個(gè)氨基酸置換，和/或(ii)至少一種CDR，其具有由SeqIDNo: 4、 SeqlDNo:5、 SeqID No : 6或其變體組成的氨基酸序列，其中在至少一種CDR中進(jìn)行5個(gè)或更 少，例如4、 3、 2或1個(gè)氨基酸置換；其中所述抗體分子保持抑制組織蛋白酶S的蛋白水解活性的能力。
13. 根據(jù)權(quán)利要求7至12任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體分子包 括抗原結(jié)合區(qū)域，所述抗原結(jié)合區(qū)域包括至少兩種具有選自由Seq ID No: 1 、 Seq ID No : 2和Seq ID No : 3組成的組的氨基酸序列的CDR，和/或至 少兩種具有由Seq ID No: 4、 Seq ID No : 5和Seq ID No : 6組成的氨基酸序 列的CDR。
14. 根據(jù)權(quán)利要求7至13任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體分子包 括具有SEQ ID No : 5氨基酸序列的CDR,和/或具有SEQ ID No : 6氨基酸 序列的CDR。
15. 根據(jù)權(quán)利要求7至14任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體分子包 括抗體Vh區(qū)和抗體Vl區(qū)，其中所述抗體VH區(qū)包括至少一種具有選自由 Seq ID No: 1 、 Seq ID No : 2和Seq ID No : 3組成的組的氨基酸序列的CDR, 以及所述抗體VL區(qū)包括至少一種具有由Seq ID No: 4、 Seq ID No : 5和Seq ID No : 6組成的氨基酸序列的CDR。
16. 根據(jù)權(quán)利要求7至15任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體Vh區(qū)包 括以Seq ID No: 1 、 Seq ID No : 2和Seq ID No : 3的氨基酸序列分別作為 CDR 1 、 2和3的CDR。
17. 根據(jù)權(quán)利要求7至16任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體VH區(qū)包 括Seq ID No :7的氨基酸序列。
18. 根據(jù)權(quán)利要求7至147任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體VL區(qū) 包括以Seq ID No: 4、 Seq ID No : 5和Seq ID No : 6的氨基酸序列分別作為 CDR 1 、 2和3的CDR。
19. 根據(jù)權(quán)利要求7至18任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體Vl區(qū)包 括Seq ID No :8的氨基酸序列。
20. 組織蛋白酶S抑制劑和化療劑在制備通過(guò)同時(shí)、連續(xù)或單獨(dú)施用組織蛋白酶s抑制劑和化療劑而用于治療腫瘤性疾病的聯(lián)合治療的藥物中的用途。
21. —種藥物組合物，其包括組織蛋白酶S抑制劑和化療劑。
22. —種藥物試劑盒，其包括通過(guò)同時(shí)、連續(xù)或單獨(dú)施用組織蛋白酶 S抑制劑和化療劑而用于聯(lián)合治療的組織蛋白酶S抑制劑和化療劑。
23. 組織蛋白酶S作為用于腫瘤細(xì)胞的生物標(biāo)記的用途。
24. —種抑制腫瘤細(xì)胞表面組織蛋白酶S表達(dá)的方法，所述方法包括 施用組織蛋白酶S抑制劑。
25. —種抑制化療誘導(dǎo)的紳瘤細(xì)胞表面組織蛋白酶S上調(diào)的方法，所 述方法包括施用組織蛋白酶S抑制劑到所述細(xì)胞。
26. —種誘導(dǎo)抗腫瘤細(xì)胞的、抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用的方 法，所述方法包括施用抗組織蛋白酶S的抗體分子到所述細(xì)胞，其中所述 抗體或其片段不抑制組織蛋白酶S的蛋白水解活性。
27. —種殺死肺瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括施用抗組織蛋白酶S的 抗體分子到所述細(xì)胞，其中所述抗體或其片段不抑制組織蛋白酶S的蛋白 水解活性。
28. —種在受治療者中治療腫瘤性疾病的方法，所述方法包括施用抗 組織蛋白酶S的抗體分子到所述受治療者，其中所述抗體或其片段不抑制 組織蛋白酶S的蛋白水解活性。
29. 結(jié)合組織蛋白酶S的抗組織蛋白酶S的抗體或其片段在制備用于 治療腫瘤性疾病的藥物中的用途，其中所述抗體或其片段不抑制組織蛋白 酶S的蛋白水解活性。
30. 根據(jù)權(quán)利要求26至28中任一項(xiàng)所述的方法或者根據(jù)權(quán)利要求29 所述的用途，其中所述抗組織蛋白酶S的抗體或其片段在不存在另一種化 療劑的情況下施用。
31. —種在一組細(xì)胞、組織或器官中抑制血管生成的方法，所述方法包括施用抗體分子或編碼所述抗體分子的核酸到所述細(xì)胞、組織或器官， 其中所述抗體分子特異性結(jié)合組織蛋白酶S但不抑制組織蛋白酶S的蛋白 水解活性。
32. —種在有相應(yīng)治療需要的患者中治療與組織蛋白酶S活性相關(guān)病 癥的方法，所述方法包括施用抗體分子或編碼所述抗體分子的核酸到所述 患者，其中所述抗體分子特異性結(jié)合組織蛋白酶S但不抑制組織蛋白酶S 的蛋白水解活性。
33. 抗體分子在制備用于治療與組織蛋白酶S異?；钚浴⒖贵w分子或 編碼所述抗體分子的核酸有關(guān)的病癥的藥物中的用途，其中所述抗體分子 特異性結(jié)合組織蛋白酶S但不抑制組織蛋白酶S的蛋白水解活性。
34. 根據(jù)權(quán)利要求32所迷的方法或根據(jù)權(quán)利要求33所述的用途，其 中所述病癥與組織蛋白酶S異常表達(dá)有關(guān)。
35. 根據(jù)權(quán)利要求32或權(quán)利要求34所述的方法、或根據(jù)權(quán)利要求33 或34所述的用途，其中所述病癥與血管生成有關(guān)。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法或用途，其中所述疾病是癌癥。
37. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法或用途，其中所述疾病是炎性病癥。
38. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法或用途，其中所述疾病是眼部疾病。
39. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法或用途，其中所述疾病是動(dòng)脈粥樣 硬化。
40. —種用于藥物的抗體分子或編碼所迷抗體分子的核酸，其中所述 抗體分子特異性結(jié)合組織蛋白酶S但不抑制組織蛋白酶S的蛋白水解活 性。
41. 一種藥物組合物，其包括抗體分子或編碼所述抗體分子的核酸， 其中所述抗體分子特異性結(jié)合組織蛋白酶S但不抑制組織蛋白酶S的蛋白 水解活性。
42. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的藥物組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包 括VEGF的抑制劑。
43. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的藥物組合物，其中所述抑制劑是抗VEGF 抗體。
44. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的藥物組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包 括EGF受體的抑制劑。
45. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的藥物組合物，其中所述抑制劑是抗EGF 受體的抗體。
46. —種在細(xì)胞群體中鑒定腫瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括使對(duì)于組 織蛋白酶S具有結(jié)合特異性的配體與所述細(xì)胞群體接觸并且確定所述配體 與所述群體中細(xì)胞的結(jié)合存在與否，其中結(jié)合指示所述細(xì)胞群體內(nèi)腫瘤細(xì) 胞的存在。
47. 根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述方法是在體外或間接體內(nèi) 進(jìn)行的。
48. —種方法，其用于體外評(píng)估得自受治療者的肺瘤細(xì)胞對(duì)于存在的 化療劑的應(yīng)答，以預(yù)測(cè)在體內(nèi)腫瘤細(xì)胞對(duì)于用化療劑治療的應(yīng)答，所述方 法包括(a) 提供得自受治療者的含有腫瘤細(xì)胞的體外樣品；(b) 將腫瘤細(xì)胞的所述樣品的一部分接觸所述化療劑；(c) 比較所述細(xì)胞表面組織蛋白酶S的表達(dá)與未接觸所述化療劑的 所述樣品對(duì)照部分中細(xì)胞表面組織蛋白酶S的表達(dá)；其中在暴露于所迷化 療劑的樣品部分中表達(dá)的增加指示對(duì)于所述化療劑具有敏感性。
49. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中在接觸所述化療劑的樣品部 分中表達(dá)的增加指示除了所述化療劑外、適合用組織蛋白酶S的抑制劑治 療患者。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抑制化療誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞表面組織蛋白酶S上調(diào)的方法，所述方法包括施用組織蛋白酶S抑制劑到所述細(xì)胞。也提供了一種含有抗組織蛋白酶S的抗體的療法，具體而言所述抗組織蛋白酶S的抗體不抑制組織蛋白酶S的蛋白水解活性然而卻抑制血管生成，以及提供了一種含有組織蛋白酶S抑制劑和治療劑的聯(lián)合治療。
文檔編號(hào)C07K16/18GK101466736SQ200780021396
公開(kāi)日2009年6月24日 申請(qǐng)日期2007年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月10日
發(fā)明者喬奎因·托馬斯, 克里斯多佛·斯科特, 朱莉·葛姆雷, 羅伯塔·波爾登, 詹姆士·約翰斯頓, 謝恩·奧維爾, 達(dá)雷格·麥克米爾 申請(qǐng)人:弗森抗體有限公司