專利名稱：：抗微生物線性肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有抗微生物活性的線性肽，其對(duì)于抵抗植物病原菌特別有效，并且可以用于控制植物病害的組合物中?，F(xiàn)有技術(shù)植物病原菌引起植物生產(chǎn)中極大的經(jīng)濟(jì)重要的損失。其中，我們可以強(qiáng)調(diào)，例如，由梨火疫病歐文氏菌(^rw^22'sa/z7//o^ra)，洋丁香葉斑病假單胞菌(/^ei/ifo/z70i2asS7r/z^ae)和辣椒斑點(diǎn)病黃單胞菌(Ja/7f/o歷o/2as^es/c"or/s)引起的細(xì)菌病害。目前，在歐洲，只有一些產(chǎn)品經(jīng)批準(zhǔn)可用于保護(hù)植物對(duì)抗細(xì)菌病害，這些產(chǎn)品主要基于二價(jià)銅衍生物，具有不足的控制功效。直到近些年才在一些國(guó)家得到批準(zhǔn)的抗生素，如春雷霉素或鏈霉素，在歐洲目前還沒有得到批準(zhǔn)?？股劓溍顾睾退沫h(huán)素在如美國(guó)等國(guó)家中得到批準(zhǔn)，但在許多病例中，病原體抗性株的出現(xiàn)使得它們使用無效變得明顯。在由植物致病真菌引起的真菌病的病例中，盡管存在可利用的活性物質(zhì)，但是不斷需要新的殺真菌劑，這部分是由于抗性以一定頻率的出現(xiàn)所引起的。此外，許多最有效的已知抗微生物化合物殘留在環(huán)境中，這是不利的。近些年來，已經(jīng)加強(qiáng)了可能影響細(xì)菌抗性的新的類型抗生素的制備。其中，我們可以強(qiáng)調(diào)從自然界分離的化合物，例如，肽，其存在于植物和動(dòng)物中，并且其中一些具有抗微生物特性。天蠶素是作為對(duì)細(xì)菌感染的應(yīng)答而存在于^/a/a/7力oracecro//a蝴蝶的血淋巴中的抗微生物肽。特別地，天蠶素A是由37個(gè)氨基酸形成的線性肽，其具有對(duì)抗革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌的有效溶胞活性。然而，因?yàn)槠渚哂邢喈?dāng)?shù)拈L(zhǎng)度，并且針對(duì)蛋白酶降解的穩(wěn)定性低，推定它生產(chǎn)成本高，因此對(duì)于將其用于控制植物病害的應(yīng)用存在保留。在Ali等的Mol.Plant-MicrobeInteract.，2000，13，847-859中，描述了抵抗一些植物病原菌，如胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種(i>『//7/<3carofoyorasw6^p.carofopwa)和胡蘿卜軟腐歐文氏菌黑腐亞種(i"rw//72'(3ca_rc^c>pwasw6早"rose/7〃")的活性肽。它是Cavallarin等首次制得的十一氨基酸多肽(Mol.Plant-MicrobeInteract.,1998，11，218-227)，其由氨基酸序列Trp-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Val-Leu形成，并且C-末端氨基酸具有氨甲?；鶊F(tuán)。所述肽是由天然來源的天蠶素A和蜂毒素的肽片段形成的雜合肽。具體而言，由天蠶素A的氨基酸2-8和蜂毒素的氨基酸6-9構(gòu)成。還沒有描述將所述十一氨基酸肽用于抵抗其他植物致病菌，如梨火疫病歐文氏菌，辣椒斑點(diǎn)病黃單胞菌和洋丁香葉斑病假單胞菌的用途，這是特別相關(guān)的，因?yàn)樗鼈冇绊懢哂泻艽蠼?jīng)濟(jì)重要性的植物，并且迄今為止用于對(duì)抗它們的方法是相當(dāng)無效的。因此，對(duì)新的抗微生物化合物仍然存在需求，該化合物具有良好的對(duì)抗植物致病菌的功效，特別地，對(duì)抗細(xì)菌梨火疫病歐文氏菌，辣椒斑點(diǎn)病黃單胞菌和/或洋丁香葉斑病假單胞菌。發(fā)明目的本發(fā)明的作者研發(fā)了新的肽，除了在真核細(xì)胞中具有低細(xì)胞毒性和對(duì)蛋白酶降解的良好穩(wěn)定性之外，其還容易制備并且能高效率地抑制植物致病菌的生長(zhǎng)。本發(fā)明的目的是提供具有抗微生物特性的線性肽。本發(fā)明的目的還在于所述肽作為抗微生物劑的用途。本發(fā)明的目的還在于含有本發(fā)明的肽和助劑的控制植物病害的組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是預(yù)防由細(xì)菌引起的植物感染和病害的方法。發(fā)明描述ft本發(fā)明的目的是提供對(duì)應(yīng)于通式(I)的線性肽X「X2-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile~Leu-Lys-X「Leu-NH2(I)其中X:是氫，乙?；?，對(duì)曱苯磺?；?，節(jié)基或苯甲酰基。X2是Lys,Tyr，Leu,Phe或Trp，和X3是Lys，Tyr,Val,Phe或Trp,附帶條件是特別排除其中Xi是氫，X2是Trp和X3是Val的肽。在該通式中，當(dāng)t是氫時(shí)，其表示為H，乙?；硎緸锳c,對(duì)甲苯磺酰基為Ts,千基為Bn,苯甲?；鶠锽z。用于該描述中的氨基酸的縮寫遵照IUPAC-IUB的生化命名委員會(huì)(CommissiononBiochemicalNomenclature)的標(biāo)準(zhǔn)，如描述于BiochemicalNomenclatureandRelatedDocuments(生化命名和相關(guān)文件)一書中，第2版，Portland出版社，1992，倫敦[ISBNl-85578-005-4]。因此，Leu是L-亮氨酸，Lys表示L-賴氨酸，lie是L-異亮氨酸，Phe是L-苯丙氨酸，Tyr是L-酪氨酸，Trp是L-色氨酸，Val是L-纈氨酸。根據(jù)所述的標(biāo)準(zhǔn)，用氨基酸縮寫表示肽，這些氨基酸由表示肽鍵的短劃線來連接。因此，例如，三甘氨肽表示為Gly-Gly-Gly。這需要表示甘氨酸H2N-CH2-COOH的符號(hào)Gly有三種不同形式的變型(i)"Gly-，，表示H2N-CH2-CO(ii)"Gly-，，表示HN-CH廣CO-，和(iii)"Gly-，，表示H2N-CH2-COOH。因此，當(dāng)將短劃線置于符號(hào)右側(cè)時(shí)，情況(i)，表示氨基酸羧基的0H基團(tuán)已經(jīng)除去，而當(dāng)將短劃線置于符號(hào)左側(cè)時(shí)，情況(iii)，表示已經(jīng)從氨基酸的氨基中除去了氫原子；在情況(ii)中，這兩種變型都應(yīng)用于相同的符號(hào)上。氨基酸Gly-構(gòu)成該肽的N-末端，而氨基酸-Gly構(gòu)成該肽的C-末端。如從通式(I)中可得知的，本發(fā)明的所有肽都具有氨甲酰形式的C-末端的氨基酸Leu，由-Leu-冊(cè)2來表示。構(gòu)成本發(fā)明的肽的N-末端的氨基酸主要保持氨基沒有被衍生化，或其可以用乙?；瑢?duì)甲苯磺酰，苯曱?；蚱S基官能化，如通式(I)中所示的。在所述氨基沒有被衍生化的情況下，即，當(dāng)Xi是氫時(shí)，在此描述中認(rèn)為符號(hào)H-X-等同于符號(hào)X-，這是在上述情況(i)中IUPAC所采用的形式。根據(jù)通式(I)限定了本發(fā)明的肽的結(jié)構(gòu)。限定本發(fā)明的肽的結(jié)構(gòu)的另一種形式由使用氨基酸序列SEQ-ID-NO:1至SEQ-ID—N0:25組成，并且進(jìn)一步詳細(xì)說明了它們?cè)陔牡腘-末端和C-末端所具有的官能化。如所示的，本發(fā)明的所有肽都具有形成氨曱酰形式的C-末端的氨基酸。所述序列具有表I中所示的氨基酸8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>23Leu-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-lle-Leu-Lys-Trp-Leu24Phe-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-lle-Leu-Lys-Trp-Leu25Trp-l_ys-L>eii-Phe-Lys-Lys-ne-l_eu-Lys-Trp-l_eu稱為SEQ_ID_N0:15的序列對(duì)應(yīng)于由Cavallarin等Mol.Plant-MicrobeInteract,1998,11，218-227描述的肽的序列，本發(fā)明特別排除了其在該序列C-末端的氨甲酰衍生物。在本發(fā)明的肽中，優(yōu)選的是由序列SEQ-ID-NO:1至SEQ-ID-NO:14和SEQ-ID-NO:16至SEQ-ID-NO:25所限定的肽，并且其在C-末端具有氨曱?；问降陌被帷Ｔ摻M中特別優(yōu)選的是由序列SEQ-ID-NO:6至SEQ-ID一NO:11，SEQ-ID-NO:13,SEQ—ID—NO:16，SEQ-ID-NO:18至SEQ-ID-NO:22和SEQ_ID_NO-25所限定的肽，并且其在C-末端具有氨曱?；问降陌被帷Ｌ貏e優(yōu)選的是由序列SEQ_ID_NO:6和SEQ_ID_NO:16所限定的肽，并且其在C-末端具有氨甲酰基形式的氨基酸。這兩種優(yōu)選肽中的最后一種具有結(jié)構(gòu)H-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-1le-Leu-Lys-Phe-Leu-NH2，對(duì)應(yīng)于通式(I)，其中X,是H，X2是Lys,而X3是Phe。還優(yōu)選的是由序列SEQ_ID_NO:1至SEQ-ID-NO:25所限定的肽，并且其具有用乙?；倌芑腘-末端的氨基酸，并且其C-末端氨基酸是氨曱?；问降摹Ｔ谠摻M中，特別優(yōu)選的是由序列SEQ-ID-NO:16所限定的肽，其具有N-末端乙?；倌芑陌被?，并且其C-末端氨基酸是氨甲?；问降摹Ｋ鲭木哂薪Y(jié)構(gòu)Ac-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Phe-Leu-NH2，對(duì)應(yīng)于通式(I)，其中X!是乙?；?Ac)，X是Lys,而乂3是Phe。還優(yōu)選的是由SEQ-ID—NO:1至SEQ-ID-NO:25所限定的肽，并且其具有用對(duì)曱苯磺?；倌芑腘-末端的氨基酸，并且其C-末端氨基酸是氨甲?；问降?。10該組內(nèi)特別優(yōu)選的是由SEQ—ID_N0:1，6，11和16所限定的肽，并且其具有用對(duì)甲苯磺?；倌芑腘-末端的氨基酸，并且其C-末端氨基酸是氨甲?；问降?。更優(yōu)選的是由序列SEQ-ID-NO:1所限定的肽，并且其具有用對(duì)甲苯磺酰基官能化的N-末端的氨基酸，并且其C-末端氨基酸是氨甲?；问降?。所述肽具有結(jié)構(gòu)Ts-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Phe-Leu-NH2，對(duì)應(yīng)于通式(I)，其中X!是對(duì)曱苯磺?；?Ts)，Xa是Lys，而X3是Lys。還優(yōu)選的是由氨基酸序列SEQ-ID-NO:1至SEQ-ID一N0:25所限定的肽，并且其具有用節(jié)基官能化的N-末端的氨基酸，并且其C-末端氨基酸是氨甲?；问降?。在該組中特別優(yōu)選的是由SEQ-ID-NO:15所限定的肽，并且其具有用千基官能化的N-末端的氨基酸，并且其C-末端氨基酸是氨甲?；问降摹Ｋ鲭木哂薪Y(jié)構(gòu)Bn-Tr對(duì)Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-11e-Leu-Lys-Va卜Leu-NH2，對(duì)應(yīng)于通式(I)，其中Xi是芐基(Bn)，X2是Trp，而X3是Val。還優(yōu)選的是由氨基酸序列SEQ—ID-NO:1至SEQ-ID一N0:25所限定的肽，并且其具有用苯甲?；倌芑腘-末端的氨基酸，并且其C-末端氨基酸是氨曱?；问降摹Ｔ谠摻M中特別優(yōu)選的是由SEQ-ID—NO:1和SEQ一ID—NO:ll所限定的肽，并且其具有用苯甲酰基官能化的N-末端的氨基酸，并且其C-末端氨基酸是氨曱酰基形式的。所述肽具有結(jié)構(gòu)Bz-Lys-:LyS"Leu-Phe-Lys-Lys-Ile"Leu-Lys-Lys-Leu-NH2,對(duì)應(yīng)于通式(I)，其中X!是苯甲?；?Bz)，X2是Lys,而X3是Lys。本發(fā)明中所述的肽由11個(gè)氨基酸形成，這使得它們適于使用固相肽合成的常見方法來制備，如R.B.Merrifield.J.Am.Chem.Soc.，1963，85.2149-2154中所述的。其中，我們可以提及使用用氨基官能化的4-甲基-二苯甲胺樹脂(MBHA)作為固體支持物。在所述固體支持物上進(jìn)行結(jié)合成肽的不同氨基酸之間偶聯(lián)的連續(xù)反應(yīng)。所述方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且描述于，例如，S.A.Kates，F(xiàn).Albericio編輯，Solid-PhaseSynthesis.Apracticalguide(固相合成。實(shí)踐指南)，MarcelDekker，NewYork,2000[ISBN:0-8247-0359-6]，或K.Burgess編輯，Solid-PhaseOrganicSynthesis(固相有機(jī)合成)，Wiley,John&Sons,NewYork,1999[ISBN:0471318256]。當(dāng)將MBHA樹脂用作固體支持物時(shí)，通常將所述樹脂摻入對(duì)酸介質(zhì)敏感的雙官能間隔物中，這使得一旦合成就可以在溫和條件下使肽脫錨。例如，合適的雙官能間隔物是由SennChemicals公司(瑞士)銷售的Fmoc-Rink-Linker(CAS編號(hào):145469-56-3)。所述間隔物，一旦通過其羧基結(jié)合到MBHA樹脂的氨基上，并且除去了保護(hù)基團(tuán)Fmoc，它就具有游離氨基，其使得可以錨定具有游離羧基的氨基酸。在市場(chǎng)上，可以在SennChemicals公司獲得Fmoc-Rink-MBHA,其已經(jīng)具有摻入的所述間隔物。用于制備本發(fā)明的肽的方法可以是例如以下所述的方法。所述方法使用了Fmoc基團(tuán)(9-芴甲氧羰基)的化學(xué)性質(zhì)作為用于制備本發(fā)明的肽的氨基酸的"-氨基的保護(hù)物。為了保護(hù)賴氨酸(Lys)和色氨酸(Trp)的側(cè)鏈，使用了叔丁氧羰基(Boc)基團(tuán)。為了保護(hù)酪氨酸(Tyr)的側(cè)鏈，使用了叔丁基(卜Bu)基團(tuán)。在第一個(gè)階段中，除去存在于雙官能間隔物的氨基中的保護(hù)基團(tuán)Fmoc。接著，發(fā)生氨基酸亮氨酸的錨定，這是因?yàn)榫哂斜籉moc基團(tuán)保護(hù)的or-氨基。繼續(xù)進(jìn)行新的偶聯(lián)之前，從錨定在樹脂上的亮氨酸中除去Fmoc保護(hù)基團(tuán)。重復(fù)偶聯(lián)-去保護(hù)循環(huán)直至完成肽結(jié)構(gòu)。為了完成氨基酸與錨定于樹脂中的肽的偶聯(lián)反應(yīng)，通常通過2或3個(gè)連續(xù)的偶聯(lián)來進(jìn)行肽的最后兩個(gè)氨基酸的摻入。在與從形成該肽的氨基酸側(cè)鏈除去保護(hù)基團(tuán)的同時(shí)，在酸性條件下進(jìn)行從固體支持物上切除肽。常規(guī)分離處理后，荻得本發(fā)明具有良好純度的肽，純度通常超過90%，通過HPLC測(cè)定，以粉末固體的形式，并且通過質(zhì)傳(ESI-MS)來表征它們。令人驚訝地，已經(jīng)證實(shí)了本發(fā)明的肽具有抗微生物活性，其對(duì)于抵抗植物的致病微生物特別有效，如細(xì)菌梨火疫病歐文氏菌，辣椒斑點(diǎn)病黃單胞菌和/或洋丁香葉斑病假單胞菌。本發(fā)明目的的一部分是本發(fā)明的肽用于制備抗微生物組合物的用途。優(yōu)選，本發(fā)明的肽用作抗微生物劑來抵抗植物的病原菌。優(yōu)選，植物致病菌選自梨火疫病歐文氏菌，辣椒斑點(diǎn)病黃單胞菌和/或洋丁香葉斑病假單胞菌。在本發(fā)明的肽中，優(yōu)選用作抗微生物劑來抵抗植物病原菌的是該相同部分中上述的那些優(yōu)選肽。所述細(xì)菌是測(cè)定可以用于抵抗植物中由細(xì)菌引起的感染和病害的化合物的抗微生物活性的合適指示劑。梨火疫病歐文氏菌是革蘭氏陰性細(xì)菌，其引起稱為梨火疫的病害，其侵襲薔薇科的植物，其中特別是具有極大經(jīng)濟(jì)重要性的果樹，如蘋果樹和梨樹，觀賞植物，如山梨樹，山楂和criping結(jié)有果實(shí)的花楸樹。在歐洲，將該細(xì)菌歸類為農(nóng)業(yè)中的檢疫菌。梨火疫幾乎影響所有的植物器官，并且常常涉及患病樹木或灌木叢的死亡。目前不存在有效的方法來控制梨火疫，并且為了消滅或減少種菌需要聯(lián)合采用不同的措施。辣椒斑點(diǎn)病黃單胞菌是革蘭氏陰性細(xì)菌，其引起茄科植物中稱為細(xì)菌性果實(shí)斑病的病害，茄科植物具有極大的經(jīng)濟(jì)重要性，如西紅柿和辣椒。該病害侵襲葉，莖和果實(shí)，引起其萎蔫或死亡。洋丁香葉斑病假單胞菌是革蘭氏陰性細(xì)菌，其引起園藝和木質(zhì)栽培植物如果樹中大量稱為細(xì)菌性壞死的病害。許多情況中，洋丁香葉斑病假單胞菌的致病機(jī)理在于它的冰晶核形成活性(IM+)，其加強(qiáng)由于水造成的損害和各種植物毒素，如丁香霉素的產(chǎn)生。優(yōu)選，可以用本發(fā)明的肽處理的植物選自果樹，園藝植物和觀賞植物。在果樹中，我們可以提及仁果(蘋果，梨)和核果樹(桃樹，杏樹，李子樹，櫻桃樹)以及香蕉樹。在園藝植物中，我們有茄科(西紅柿，辣椒，馬鈴薯)和葫,科(甜瓜，西瓜)。在園藝植物中，有山梨樹，康乃馨，山楂和criping結(jié)有果實(shí)的花楸樹。控制植物病害的組合物含有以下成分的控制植物病害的組合物也是本發(fā)明目的的一部分-線性肽，其對(duì)應(yīng)于通式(I):X「X2~Lys-Leu-Phe-Lys~Lys-Ile~Leu-Lys-X3~Leu_NH2(I)其中Xi是氫，乙?；瑢?duì)甲苯磺?；S基或苯甲?；?。XHys,Tyr，Leu，Phe或Trp，和X3是Lys，Tyr，Val,Phe或Trp,附帶條件是特別排除其中t是氫，X2是Trp和X3是Val的肽，和-助劑。在本發(fā)明的肽中，優(yōu)選形成所述控制植物病害的組合物的一部分的是前面稱為肽的部分中作為優(yōu)選的所提及的肽。本發(fā)明的控制植物病害的組合物具有良好的抗微生物特性以抵抗植物的病原菌。通常，在抗微生物組合物中，將各種活性成分合并來獲得更大功效的更寬作用范圍。在這種情況下，本發(fā)明的控制植物病害的組合物也可以含有其他抗微生物活性以獲得更大的抗微生物功效，如例如，本發(fā)明幾種肽的組合，或它們與其他不同活性物質(zhì)的組合。本發(fā)明的肽還可以與抗真菌劑結(jié)合，并且因此展開更寬的抗微生物作用。構(gòu)成控制植物病害組合物的一部分的肽的量可以根據(jù)如植物類型，植物中病原菌的濃度，病害的蔓延等因素而改變。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法可以容易地測(cè)定和調(diào)節(jié)肽的有效濃度。通常，肽的有效濃度為0.01至0.5g/1。在所述控制植物病害組合物中與本發(fā)明的肽共存的助劑可以具有幾個(gè)功能，如，例如，有助于肽的劑量給藥，提供容易處理的產(chǎn)品，改善用控制植物病害組合物潤(rùn)濕植物。所述助劑可以選自溶劑，稀釋劑，惰性填充劑，潤(rùn)濕表面活性劑，緩沖劑，分散劑，抗結(jié)塊劑，潤(rùn)滑劑，紫外線輻射過濾劑和/或其混合物。優(yōu)選，所述助劑選自溶劑，表面活性劑，緩沖劑，紫外線輻射過濾劑和/或其混合物。非常優(yōu)選，所述溶劑是水。組合物可以呈液體形式或固體形式。例如，在液體制劑的情況中，本發(fā)明的組合物可以是即可使用的稀釋組合物的形式，或是濃縮劑的形式，其在使用前需要進(jìn)行稀釋，通常用水。在含水液體組合物的情況中，潤(rùn)濕表面活性劑的存在有助于用所述組合物噴霧時(shí)植物的潤(rùn)濕。本發(fā)明的肽的優(yōu)點(diǎn)在于它們可以容易地溶解于水中，并且通?？梢耘渲茷樗芤?，而不需要使用另外的有機(jī)溶劑。固體形式的組合物可以是顆粒或粉末形式，其中將本發(fā)明的肽和磨碎的惰性填充劑混合，惰性填充刑為例如高嶺土，硅藻土，白云石，碳酸鉤或滑石。它們也可以以可分散的顆粒或粉末的形式存在，其包括潤(rùn)濕劑來促進(jìn)其在液體中的分散。15本發(fā)明的一部分目的還在于是預(yù)防或治療由細(xì)菌引起的植物感染的方法，其包括使植物接觸包括本發(fā)明肽的控制植物病害組合物。在本發(fā)明的方法中，控制植物病害的組合物可以以預(yù)防的形式施加于植物來避免由細(xì)菌引起的感染和病害的出現(xiàn)。預(yù)防性處理在本發(fā)明的肽抑制植物病原菌生長(zhǎng)的事實(shí)中具有其基礎(chǔ)。在本發(fā)明的方法中，一旦在植物中檢測(cè)到存在時(shí)，控制植物病害的組合物還可以用來治療所述感染和病害，因?yàn)楸景l(fā)明的肽抑制引起所述感染和病害的細(xì)菌的生長(zhǎng)。在本說明書中，術(shù)語感染指的是致病微生物對(duì)器官的入侵和破壞，例如，葉，花或果實(shí)。因此，這是局部的過程。實(shí)際上，術(shù)語病害指的是影響植物的過程，其產(chǎn)生癥狀。優(yōu)選，本發(fā)明的方法用于預(yù)防和治療由植物病原菌引起的感染和病害，病原菌選自梨火疫病歐文氏菌，辣椒斑點(diǎn)病黃單胞菌和/或洋丁香葉斑病假單胞菌。優(yōu)選，可以用本發(fā)明的肽處理的植物選自果樹，園藝樹木和觀賞植物。在本發(fā)明的方法中，可以使組合物接觸植物的一部分，這些部分選自種子，根，莖，葉或果實(shí)，或接觸土壤或圍繞植物途徑的任何生長(zhǎng)方法。在本發(fā)明的方法中，可以通過任何常規(guī)技術(shù)使控制植物病害的組合物接觸植物，這些技術(shù)中應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是噴霧，浸漬或灌溉。例如，可以制備本發(fā)明的肽的水溶液，并將受影響或易于受影響的植物進(jìn)行噴霧。如果是來自果樹的果實(shí)，例如，還可以在采收前或釆收后通過噴霧或浸漬來進(jìn)行處理。例如，可以使用將肽分散于惰性填充劑中的固體組合物，或通過所述水溶液的噴霧或通過灌溉施加來進(jìn)行根的處理。生物檢驗(yàn)已經(jīng)通過測(cè)定抑制微生物生長(zhǎng)需要的最小肽濃度評(píng)價(jià)了本發(fā)明的16肽抵抗植物病原菌的抗微生物活性。通常，所述濃度稱為最小抑制濃度(MIC)。這種類型的檢驗(yàn)是微生物學(xué)中常用的并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。所用方法的描述可以在以下文獻(xiàn)中找到，例如，M.J.Pelczar，E.C.S.Chan,N.R.Krieg，Microbiology:ConceptsandApplications.(微生物:概念與應(yīng)用)NewYork:McGraw-Hill,1997。為了評(píng)價(jià)本發(fā)明的肽的所述抗微生物效果，使用了以下的致病菌菌林梨火疫病歐文氏菌PMV6076(INRA，Angers,法國(guó))，辣椒斑點(diǎn)病黃單胞菌2133-2(IVIA，Valencia,西班牙)和洋丁香葉斑病假單胞菌EPS94(IN-TEA，赫羅納大學(xué)，西班牙)。已經(jīng)證實(shí)了含有溶解于水中的濃度為2.5至7.5|aM的本發(fā)明的肽的組合物能有效抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，如梨火疫病歐文氏菌，辣椒斑點(diǎn)病黃單胞菌和洋丁香葉斑病假單胞菌。這些結(jié)果表明本發(fā)明的肽的抗微生物活性的功效，因?yàn)锳vrahami等的Biochemistry,2001，40，12591-12603中，認(rèn)為低于50jaM的最小抑制濃度是有意義的。本發(fā)明的肽對(duì)于抵抗所述細(xì)菌比Cavallarin等所述的肽更有效，因?yàn)閷?duì)抗梨火疫病歐文氏菌，辣椒斑點(diǎn)病黃單胞菌和洋丁香葉斑病假單胞菌測(cè)試時(shí)，這種肽具有超過7.5iiM的最小抑制濃度，這種肽由序列SEQ_ID_N0:15所限定并且其具有氨甲?；问降腃-末端。肽的溶血活性是真核細(xì)胞毒性的指標(biāo)，并且是接觸人體的那些化合物通常被測(cè)定的一個(gè)特征。如果用本發(fā)明的肽處理過的水果或蔬菜含有其殘留物并且被人食用，或在施加或制備過程中由操作員操作時(shí)，這將是個(gè)問題。通過測(cè)定將所述肽的溶液接觸含有5%體積/體積來自新鮮人血液的紅細(xì)胞懸浮液的TRIS緩沖液時(shí)產(chǎn)生的血紅蛋白釋放評(píng)價(jià)了所述的溶血活性。將所述測(cè)定的結(jié)果表示為對(duì)于已知濃度的肽所產(chǎn)生的溶血作用百分比。用于測(cè)定溶血活性的方法的描述可以在0ren等，Biochemistry,2000，39，6103-6114和Raguse等，J.Am.Chem.Soc,，172002，124，12774-12785中找到。已經(jīng)證實(shí)了本發(fā)明的大部分肽在高于它們抑制植物病原菌生長(zhǎng)的活性濃度十倍至一百倍之間的濃度具有顯著的溶血活性。肽對(duì)蛋白酶降解的穩(wěn)定性是可以評(píng)價(jià)肽在合理的半衰期過程中在植物環(huán)境中未改變的一個(gè)特征。肽可以被植物組織中和植物外的(ephyticic)微生物中存在的蛋白酶所降解。已經(jīng)通過含有蛋白酶K(Sigma-Aldrich)的TRIS緩沖液中的肽溶液的處理評(píng)價(jià)了肽對(duì)蛋白酶降解的穩(wěn)定性，并且以不同的時(shí)間間隔通過HPLC監(jiān)控它們的降解。將該降解表示為測(cè)定時(shí)間間隔后通過HPLC從天然肽的峰面積的減少計(jì)算出的降解肽的百分比。測(cè)定對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性所用的方法的描述可以在Rozek等，Biochemistry,2003,42，14130-14138中找到。已經(jīng)證實(shí)了本發(fā)明的一些肽比Cavallarin等所述的肽對(duì)蛋白酶的降解更穩(wěn)定。接著，為了使前面的描述足夠完整的目的，給出了以下的實(shí)施例。實(shí)施例在以下的實(shí)施例中，所用以下縮寫Ac:乙?；?；Ac20:乙酸酐；Bn:千基；Boc:叔丁氧羰基；t-Bu:叔丁基；Bz:苯曱酰；MIC:最小抑制濃度；DIAE:N，N-二異丙基乙胺;DMF:N，N-二曱基甲酰胺;EDTA:乙二胺四乙酸；ESI-MS:電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)鐠；Fmoc:9-芴甲氧羰基；HBTU:N-[1H-苯并三唑(l-基)(二甲基氨基)亞曱基]-N-甲基甜菜堿六氟磷酸鹽-N-氧化物；HPLC:高效液相色語；LB:LuriaBertani;MBHA:4-曱基-二苯曱胺；NMP:N-甲基-吡咯烷酮；TFA:三氟乙酸；TIS:三異丙基硅烷；TRIS:三(羥基甲烷)氨基甲烷；TS:對(duì)甲苯磺?；?；TSB:胰胨豆胨培養(yǎng)液；UV:紫外線。產(chǎn)品Fmoc-Lys(Boc)-0H，F(xiàn)畫-Phe-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH,Fmoc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-0H，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-0H，F(xiàn)moc-Va卜OH，氨基官能化的Fmoc-Rink-MBHA樹月旨和HBTU從SennChemicals獲得。產(chǎn)品節(jié)基氯，苯甲酰氯，三氟乙酸，N-甲基-吡咯烷酮和TIS獲自Aldrich。產(chǎn)品甲苯磺酰氯，哌咬和DIAE獲自Fluka。以下關(guān)于制備肽的方法的指示具有通性-使用具有用Fmoc基團(tuán)保護(hù)的oc-氨基的氨基酸。-對(duì)于賴氨酸和色氨酸側(cè)鏈的保護(hù)，使用基團(tuán)叔丁氧羰基(Boc)。對(duì)于酪氨酸側(cè)鏈的保護(hù)，使用基團(tuán)叔丁基(t-Bu)。-在合并了微孔過濾器的2或5ml注射器中進(jìn)行反應(yīng)。-所有轉(zhuǎn)化和洗滌都在25'C下進(jìn)行，除非另外指出。-以1.Oral/分鐘的流速進(jìn)行HPLC分析，使用Kromasil反相柱(4.6x40mm;粒徑3.5jum)。使用0.1%乙腈中0.1。/。含水TFA的線性梯度，在7分鐘的時(shí)間過程中，使用0.98:0.02至0.98:0.1的比例，使用220nm波長(zhǎng)的UV檢測(cè)。-使用四極Navigator儀器獲取ESI-MS光i普；以陽離子模式(ES+)運(yùn)行，使用30kV的樣品電壓。-溶劑之間所有的比例都是體積/體積，除非規(guī)定是另一種類型的比例。實(shí)施例1.-H~Lys~Lys~Leu~Phe~Lys~Lys-Ile~Leu~Lys-Val~Leu-NH2(通式(I)其中X!是氫，X2是Lys和X3是Val)的制備在在其下半部分裝有微孔過濾器的2ml容量的注射器中，放入用0.66mmol/g(相當(dāng)于19.8iamol)氨基官能化的30mgFmoc-Rink-MBHA樹脂，并且根據(jù)以下的順序?qū)⑷軇┭b入注射器中來溶脹-洗滌樹脂CH2C12(1x20分鐘)和DMF(1x20分鐘)。表述CH2C12(1x20分鐘)指的是1次洗滌用二氯甲烷進(jìn)行20分鐘的情況。每個(gè)洗滌階段后，通過多重真空過濾器(來自PromegaDistribuidora的VacManLaboratoryVacuumManifold)來除去溶劑。溶脹-洗滌樹脂后，用哌啶和DMF的混合物(3:7，1x2分鐘和1xl0分鐘)進(jìn)行處理，以除去雙官能間隔物的氨基中存在的Fmoc基團(tuán)，然后，用DMF洗滌(6xl分鐘)。19接著，用0.lmlDMF中的21mgFmoc-Leu-OH(59ymol)，22mgHBTU(59mio1)和llialDIAE(63|amol)處理樹脂。4小時(shí)后，用DMF洗滌(6xl分鐘)樹脂，并且進(jìn)行檢查，茚三酮測(cè)試是陰性的(Kaiser等，Anal.Biochem.，1970，34,595-598)。如上所述進(jìn)行Fmoc基團(tuán)的去除和隨后的洗滌。對(duì)于以下四種用基團(tuán)IT-Fmoc保護(hù)的氨基酸重復(fù)偶聯(lián)-去保護(hù)循環(huán)Fmoc-Va卜OH,Fmoc-Lys(Boc)-0H，F(xiàn)moc-Leu-OH和Fmoc-Ile-OH。在每個(gè)階段中，用DMF洗滌(6xl分鐘)。摻入第五個(gè)氨基酸后，除去Fmoc基團(tuán)，以相同的方式進(jìn)行偶聯(lián)-去保護(hù)循環(huán)和相應(yīng)的洗滌，在這些情況中，DMF由NMP替代。結(jié)合最后六個(gè)用Na-Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH和Fmoc-Leu-0H。為了摻入最后兩個(gè)氨基酸，進(jìn)行2-3次連續(xù)的結(jié)合來獲得陰性茚三酮測(cè)試。除去最后一個(gè)偶聯(lián)的氨基酸的Fmoc基團(tuán)后，如已經(jīng)描述過的，用NMP(6x1分鐘)和CH2C12(6xl分鐘)洗滌樹脂，并且獲得結(jié)合樹脂的線性肽H-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Va卜Leu-Rink-MBHA。接著，在2小時(shí)的過程中通過用lmlTFA，水和TIS(95:2，5:2.5)混合物的處理從樹脂上分離肽。通過正氮壓將濾出液收集于小瓶中。用TFA,水和TIS的混合物(95:2,5:2.5，2x0.5ml)洗滌樹脂。合并濾出液并在氮流下幾乎蒸發(fā)至干，直至獲得油狀物。用二乙醚沉淀所述油狀物，將其離心并潷去醚。該過程重復(fù)3或4次。最后，將獲得的固體產(chǎn)物溶解于水中并凍干。獲得粉末狀固體，通過HPLC分析具有超過90%的純度(停留時(shí)間4.39分鐘)，并且通過ESI-MS證實(shí)其結(jié)構(gòu)。還以更大的規(guī)模，使用200mg用0.66mmol/g(相當(dāng)于132jamole)氨基官能化的Fmoc-Rink-MBHA樹脂，使用實(shí)施例1中所述的相同方法進(jìn)行了該肽的合成。實(shí)施例2—Ac—Lys—Lys—Leu—Phe—Lys—Lys—Ile—Leu—Lys—Val—Leu—NH2(通式(I)，其中X,是乙酰基(Ac),X2是Lys和Xs是Val)的制備在環(huán)境溫度下的1小時(shí)過程中用0.2ml乙酸酐(Ac20)，吡啶和CH2C12(1:1:1)的混合物處理實(shí)施例1中獲得的肽酰樹脂H"Lys-LyS"Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Val-Leu-Rink-MBHA。然后，用CH2Clr冼滌樹脂(6xl分鐘)。接著，按照實(shí)施例1中所述的方法從樹脂分離出肽并分離。通過HPLC測(cè)定的所獲得肽的純度為大于90%(停留時(shí)間4.59分鐘)，并且通過EMI-ES證實(shí)其結(jié)構(gòu)。實(shí)施例3-Ts-Lys-Lys-Uu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Val-Leu-NH2(通式(I)，其中X:是對(duì)甲苯磺?；?Ts)，X2是Lys和X3是Val)的制備在環(huán)境溫度下的1小時(shí)過程中，用0.2mlCH2Cl2和NMP(9:1)混合物中的對(duì)甲苯磺酰基氯(TsCl)(792jamole)和DIAE(1.58mmole)處理實(shí)施例1中獲得的肽酰樹脂H"LyS"Lys-Leu-Phe-Lys"Lys-Ile-Leu-Lys-Val-Leu-Rink-MBHA。然后，用NMP(6x1分鐘)洗滌樹脂。接著，按照實(shí)施例1中所述的方法從樹脂分離出肽并分離。通過HPLC測(cè)定的所獲得肽的純度為大于90%(停留時(shí)間4.59分鐘)，并且通過EMI-ES證實(shí)其結(jié)構(gòu)。實(shí)施例4一Bz-Lys~Lys-Leu-Phe~Lys~Lys-Ile-Leu-Lys-Val-I>eu-NH2(通式(I)，其中X:是苯曱?；?Bz)，X2是Lys和X3是Val)的制備在環(huán)境溫度下的1小時(shí)過程中，用0.2mlCH2Ch和NMP(9:1)混合物中的苯甲酰氯(BzCl)(792iamole)和DIAE(1.58mmole)處理實(shí)施例1中獲得的肽酰樹脂H"Lys-Lys"Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu"Lys-Val-Leu-Rink-MBHA。然后，用NMP(6xl分鐘)洗滌樹脂。21接著，按照實(shí)施例1中所述的方法從樹脂分離出肽并分離。通過HPLC測(cè)定的所獲得肽的純度為大于90%(停留時(shí)間5.OO分鐘)，并且通過EMI-ES證實(shí)其結(jié)構(gòu)。實(shí)施例5—Bn-Lys-Lys-Leu-Phe-LyS"Lys-Ile-Leu-Lys-Val-Leu-NH2(通式(I)，其中X!是芐基(Bn)，X2是Lys和Xg是Val)的制備在環(huán)境溫度下的48小時(shí)過程中，用0.2mlCH2CL和NMP(9:1)混合物中的千基溴(BnBr)(792jamole)和DIAEU.58mmole)處理實(shí)施例1中獲得的肽酰樹脂H-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Val-Leu-Riiik-MBHA。然后，用NMP(6x1分鐘)洗滌樹脂。接著，按照實(shí)施例1中所述的方法從樹脂分離出肽并分離。通過HPLC測(cè)定的所獲得肽的純度為大于90%(停留時(shí)間4.73分鐘)，并且通過EMI-ES證實(shí)其結(jié)構(gòu)。實(shí)施例6-固相中線性肽化學(xué)文庫(kù)的制備設(shè)計(jì)化學(xué)文庫(kù)來獲得125個(gè)肽，其對(duì)應(yīng)于通式(I):X廣X2-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu"Lys-X3-Leu-NH2(I)其中X,是氫，乙?；?，對(duì)甲苯磺?；S基或苯甲?；2是Lys，Tyr，Uu，Phe或Trp，和X3是Lys，Tyr，Val,Phe或Trp，附帶條件是從本發(fā)明的肽中特別排除其中Xi是氫，t是Trp和X3是Val的肽。在五個(gè)適當(dāng)標(biāo)記并在下半部分裝有微孔過濾器的5ml容積注射器中，放入350mg用0.66mmol/g(相當(dāng)于231pmole)氨基官能化的Fmoc-Rink-MBHA樹脂。根據(jù)以下的順序?qū)⑷軇┭b入注射器中來溶脹-洗滌樹脂CH2C12(1x20分鐘)和DMF(1x20分鐘)。每個(gè)洗滌階段后，通過多重真空過濾器(來自PromegaDistribuidora的VacManLaboratoryVacuumManifold)來除去溶齊寸。溶脹-洗涂樹脂后，用哌咬和DMF的混合物(3:7，1x2分鐘和1xIO分鐘)來處理，以除去雙官能間隔物的氨基中存在的Fmoc基團(tuán)，然后，用DMF洗滌(6xl分鐘)。然后，用0.8mlDMF中的245mgFmoc-Leu-0H(693|amol)，263mgHBTU(693jumol)和121y1DUE(693|amol)處理五種樹脂。4小時(shí)后，用DMF洗滌(6xl分鐘)樹脂，并且證實(shí)茚三酮測(cè)試是陰性的(Kaiser,Anal.Biochem.，1970，34，595-598)。接著，如上所述進(jìn)行Fmoc基團(tuán)的去除和相應(yīng)的洗滌。然后，將相應(yīng)的氨基酸X3與每種樹脂偶聯(lián):Fmoc-Val-0H，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-0H，F(xiàn)moc-Tyr(Boc)-0H，F(xiàn)moc-Phe-0H或F陽-Lys(Boc)-0H，按照用于結(jié)合受保護(hù)的氨基酸Fmoc-Leu-OH的方法。如上所述進(jìn)行Fmoc基團(tuán)的去除和隨后的洗滌。對(duì)于以下三個(gè)氨基酸重復(fù)偶聯(lián)-去保護(hù)循環(huán)。這樣，按順序偶聯(lián)了以下殘基Fmoc-Lys(Boc)-0H，F(xiàn)moc-Leu-0H和Fmoc-Ile-0H。五種樹脂的每一種都進(jìn)行這些結(jié)合。在每個(gè)階段種，用DMF進(jìn)行洗滌(6x1分鐘)。五個(gè)氨基酸結(jié)合后，以相同的方式進(jìn)行Fmoc基團(tuán)的去除，偶聯(lián)-去保護(hù)循環(huán)和相應(yīng)的洗滌，在這些情況種，用NMP替代DMF的使用。該程序之后，五種樹脂中的每一種按順序偶聯(lián)兩個(gè)Fmoc-Lys(Boc)-OH殘基，一個(gè)Fmoc-Phe-0H和一個(gè)Fmoc-Leu-OH。在每個(gè)階段中，用NMP洗滌(6xl分鐘)。對(duì)于第十個(gè)殘基的摻入，需要具有雙重偶聯(lián)來獲得陰性茚三酮測(cè)試。一旦偶聯(lián)了笫十個(gè)殘基，將五個(gè)注射器中所含的每一種肽酰樹脂分成五個(gè)部分。獲得25個(gè)部分，對(duì)應(yīng)于大約46pmole每種肽酰，放入25個(gè)適當(dāng)標(biāo)記并在下半部分裝有微孔濾器的2ml容積注射器中。然后，如上所述除去Fraoc并進(jìn)行相應(yīng)的洗涂。給具有結(jié)合相應(yīng)X2的相同X3氨基酸的五個(gè)樹脂部分中的每一個(gè)都偶聯(lián)Fmoc-Trp(Boc)-0H，F(xiàn)畫-Phe-0H，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-0H,Fmoc-Lys(Boc)或Fmoc-Leu-0H。使用0.3mlNMP中的138iamol相應(yīng)保護(hù)的氨基酸Not-Fmoc，138jamolDIAE進(jìn)行偶聯(lián)。為了結(jié)合這些氨基酸，需要進(jìn)行雙重偶聯(lián)來獲得陰性茚三酮測(cè)試。接著，將之前125個(gè)部分的每一個(gè)分成5個(gè)等份。獲得125個(gè)部分，對(duì)應(yīng)于大約9.2jumol肽酰樹脂，放入125個(gè)適當(dāng)標(biāo)記并在下半部分裝有微孔濾器的2ml容積注射器中。接著，如上所述除去Fmoc基團(tuán)并進(jìn)行相應(yīng)的洗滌。從之前25個(gè)部分中每一個(gè)獲得五個(gè)樹脂部分中的四個(gè)，各自通過乙?；?，曱苯磺酰化，苯曱?；蚯Щ贜-末端進(jìn)行衍生。通過在室溫下的1小時(shí)過程中使用0.2mlAc20，吡咬和CH2C12(1:1:1)的混合處理來進(jìn)行乙酰化。通過在室溫下的1小時(shí)過程中使用0.2mlCH2Cl2和NMP(9:1)混合物中的TsCl(368jumol)和DIAE(736jamol)處理來進(jìn)行甲苯磺?；Ｍㄟ^在室溫下的1小時(shí)過程中使用0.2mlCH2Ch和NMP(9:1)混合物中的BzCl(368nmol)和DIAE(736nmol)處理來進(jìn)行苯甲?；?。通過在室溫下的48小時(shí)過程中使用0.2mlCH2Cl2和NMP(9:1)混合物中的BnCl(368iamol)和DIAE(736jamol)處理來進(jìn)行千基化。這些處理后，用NMP洗滌樹脂(6xl分鐘)。最后，按照實(shí)施例1中所述的方法，在相應(yīng)的注射器中進(jìn)行125個(gè)樹脂肽的切除并分離每一種。通過HPLC分析所獲得的肽并通過ESI-MS證實(shí)它們的結(jié)構(gòu)。所有情況中都獲得超過90%的純度。實(shí)施例7—^:生物活性測(cè)試測(cè)定了本發(fā)明的肽對(duì)抗以下細(xì)菌菌林的抗微生物效果梨火疫病歐文氏菌PMV6076(INRA，Angers，法國(guó))，辣椒斑點(diǎn)病黃單胞菌2133-2(IVIA，Valencia,西班牙)和洋丁香葉斑病假單胞菌EPS94(IN-TEA，UniversitatdeGirona，西班牙)將所有細(xì)菌在補(bǔ)充20%甘油體積/體積的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中-8(TC存儲(chǔ)。在25'C生長(zhǎng)24小時(shí)后獲得梨火疫病歐文氏菌PMV6076和洋丁香葉斑病假單胞菌EPS94的懸浮液，在LB瓊脂中25。C培養(yǎng)48小時(shí)后獲得辣椒斑點(diǎn)病黃單胞菌2133-2的樣品。在所有情況中，將它們懸浮于無菌水中，以獲得調(diào)節(jié)至0.2至60nm吸光值的懸浮液，這大約對(duì)應(yīng)于108菌落形成單位。為了測(cè)定最小抑制濃度(MIC)，將肽溶解于milli-Q無菌水中，直至IOOOjliM的終濃度，并且將它們通過0.22jam孔徑的濾器進(jìn)行過進(jìn)行本發(fā)明肽的稀釋以獲得濃度為750,500，250，200，150，125，100,75，50和25/aM的溶液。將20ju1的每個(gè)稀釋液與20ml相應(yīng)的細(xì)菌指示劑懸浮液和160ja1TSB(胰胨豆胨培養(yǎng)液)液體培養(yǎng)基混合，直至獲得微平板每個(gè)孔中的200ial總體積。因此，所測(cè)試的細(xì)菌懸浮液的有效濃度為75，50，25，20，15，12.5，10，7.5，5和2.5|aM。對(duì)于每個(gè)菌抹，濃度和所研究的肽，進(jìn)行兩次重復(fù)。陽性對(duì)照含有替代肽的水，而陰性對(duì)照含有肽而沒有細(xì)菌懸浮液。使用MicrobiologyAnalyserBioscreenC(Labsystems)通過600nm處的光密度自動(dòng)測(cè)定微生物生長(zhǎng)。將微量平板在25。C培養(yǎng)48小時(shí)，每小時(shí)測(cè)量吸光值之前攪拌20秒鐘。每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩次。作為MIC，取實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)產(chǎn)生的細(xì)菌生長(zhǎng)的最低肽濃度。表II顯示了對(duì)于本發(fā)明不同的肽抵抗梨火疫病歐文氏菌，辣椒斑點(diǎn)病黃單胞菌和洋丁香葉斑病假單胞菌，在25'C培養(yǎng)48小時(shí)后，包括MIC的濃度范圍，以nM來表示。用通式(I)中出現(xiàn)的參量L，X2和X3來識(shí)別表II的肽。此外，表II包括關(guān)于實(shí)施例6中制得的化學(xué)文庫(kù)的參考數(shù)。表II包括比較實(shí)施例，其結(jié)果對(duì)應(yīng)于Cavallarin等描述的肽，這沒有形成本發(fā)明的一部分。表II<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>可以證實(shí)本發(fā)明的肽對(duì)于抑制梨火疫病歐文氏菌，辣椒斑點(diǎn)病黃單胞菌和/或洋丁香葉斑病假單胞菌具有良好的功效。此外，本發(fā)明肽的功效高于已知肽的，已知肽的結(jié)果呈現(xiàn)于上表中第一行，名稱為比較實(shí)施例。實(shí)施例8-溶血活性測(cè)試通過測(cè)定將肽溶液接觸5%體積來自新鮮人血液的紅細(xì)胞懸浮液時(shí)產(chǎn)生的血紅蛋白釋放來評(píng)價(jià)本發(fā)明的肽的溶血活性。使用VactainerK2E系統(tǒng)(Belliver,英國(guó))和EDTA無菌收集血液，并存儲(chǔ)于4'C，少于2個(gè)小時(shí)。將血液在6000g離心5分鐘來分離紅細(xì)胞。用TRIS緩沖液(10mMTRIS，150mMNaCl，pH7.2)洗涂三次，并將它們重懸浮于TRIS緩沖液中，直至獲得含有10%體積紅細(xì)胞的懸浮液。將肽溶解于TRIS緩沖液中，直至獲得IOO，300和500MM的終濃度。對(duì)于每個(gè)肽和濃度，使用復(fù)制品。在96-孑L平板(Micro-Amp⑧，AppliedBiosystems,美國(guó))的每個(gè)孔中，將65u110%紅細(xì)胞懸浮液與65m1肽溶液混合(5%體積紅細(xì)胞)，并將混合物在37。C攪拌培養(yǎng)1小時(shí)。以這種方式，使紅細(xì)胞懸浮液接受50，150和250)iM的肽濃度。接著，將平板在3500g離心IO分鐘，并將80ju1上清液的等份試樣轉(zhuǎn)移至具有100個(gè)孔的微量平板中(Bioscreen)，用80jalmilli-Q水將其稀釋。使用Bioscreen平板閱讀儀從540nm處的吸光值測(cè)定溶血程度。在含有200iaM蜂毒素(Sigma-Aldrich，西班牙)的TRIS緩沖液中測(cè)定完全陽性溶血對(duì)照。使用以下等式測(cè)定溶血(H)百分比H-100x/(0m-0b)]其中OP作為測(cè)量的光學(xué)密度用于測(cè)定肽濃度，Ob是緩沖液的光學(xué)密度，而Om是含有蜂毒素的陽性對(duì)照的光學(xué)密度。表III顯示了溶血活性的結(jié)果，對(duì)于對(duì)應(yīng)于50，150和250mM的本發(fā)明的肽濃度，用根據(jù)之前等式計(jì)算的溶血百分比來表示。用通式(I)中出現(xiàn)的參量X"X2和Xs來識(shí)別表III的肽。此外，表III包括關(guān)于實(shí)施例6中制得的化學(xué)文庫(kù)的參考號(hào)表III<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>在所有情況中，觀察到發(fā)生顯著溶血的濃度為高于本發(fā)明的肽具有抗微生物活性的濃度10至IOO倍之間。實(shí)施例9-對(duì)蛋白酶降解的穩(wěn)定性測(cè)試通過蛋白酶K(Sigma-AldrichCorporation,Madrid,西班牙)的肽消化來測(cè)定本發(fā)明的肽對(duì)蛋白酶降解的穩(wěn)定性。在室溫使用pH7.6的100mMTRIS緩沖液中50yg/ml肽和1yg/ml蛋白酶K的溶液。在5至45分鐘之間的時(shí)間通過色鐠測(cè)定肽切除的進(jìn)展。為此，使用反相C8柱(K醒a(bǔ)sil，4.6x40mm;3.5jam粒徑)，7分鐘的過程中從0.98:0.02至0:1的線性梯度，通過220nm的紫外線吸光值來進(jìn)行檢測(cè)。表IV呈現(xiàn)了對(duì)蛋白酶降解的穩(wěn)定性的結(jié)果，表示為45分鐘后每個(gè)肽的降解百分比。用通式(I)中出現(xiàn)的參量XnX2和X3來識(shí)別表IV的肽。此外，表IV包括關(guān)于實(shí)施例6中制得的化學(xué)文庫(kù)的參考數(shù)。表IV包括比較實(shí)施例，其結(jié)果對(duì)應(yīng)于由Cavallarin等所述的肽，這沒有形成本發(fā)明的一部分表IV參考號(hào)X,x2x345分鐘內(nèi)的比較實(shí)施例HTrpVal100BP008AcTrpVal100BP077AcLysPhe84BP009TsTrpVal100BP125TsLysLys67BP010BzTrpVal100BP126BzLysLys53BP015HLysVal100BP019HTrpPhe87BP020HTrpTyr85BP033HLeuVal100BP076HLysPhe49BP100HLysTyr6029可以觀察到本發(fā)明的一些肽比Cavallarin等所述的肽(比較實(shí)施例)對(duì)蛋白酶降解更穩(wěn)定。特別地，對(duì)應(yīng)于通式U)的肽，其中X,是氫，X2是Lys和X3是Phe,或X:是苯曱?；琗2是Lys和X3是Lys,穩(wěn)定性比比較實(shí)施例的肽高兩倍。權(quán)利要求1.線性肽，其特征在于它們對(duì)應(yīng)于通式(I)X1-X2-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-X3-Leu-NH2(I)其中X1是氫，乙?；瑢?duì)甲苯磺?；S基或苯甲?；?，X2是Lys，Tyr，Leu，Phe或Trp，和X3是Lys，Tyr，Val，Phe或Trp，附帶條件是特別排除其中X1是氫，X2是Trp和X3是Val的肽。2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其特征在于它們由序列SEQ-ID-N0:1至SEQ-ID-N0:14和SEQ-ID-N0:16至SEQ_ID_N0:25來限定，并且在于它們具有氨曱?；问降腃-末端氨基酸。3.根據(jù)權(quán)利要求2的肽，其特征在于它們由序列SEQ-ID-N0:6至SEQ-ID—N0:11，SEQ-ID-N0:13，SEQ—ID一N0:16，SEQ-ID-N0:18至SEQ-ID一N0:22和SEQ—ID—N0:25來限定，并且在于它們具有氨曱?；问降腃-末端的氨基酸。4.根據(jù)權(quán)利要求3的肽，其特征在于它們由序列SEQ-ID-N0:6和SEQ-ID_N0:16來限定，并且在于它們具有氨曱?；问降腃-末端的氨基酸。5.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其特征在于它們由序列SEQ-ID—N0:1至SEQ一ID—NO:25來限定，并且在于它們具有用乙?；倌芑腘-末端的氨基酸和氨甲酰基形式C-末端的氨基酸。6.根據(jù)權(quán)利要求5的肽，其特征在于它們由序列SEQ_ID_N0:16來限定，并且在于它們具有用乙?；倌芑腘-末端的氨基酸和氨甲酰基形式的C-末端的氨基酸。7.根據(jù)權(quán)利要求l的肽，其特征在于它們由序列SEQ-ID一N0:1至SEQ—ID_N0:25來限定，并且在于它們具有用對(duì)甲苯磺?；倌芑腘-末端的氨基酸和氨甲酰基形式的C-末端的氨基酸。8.根據(jù)權(quán)利要求7的肽，其特征在于它們由序列SEQ一ID-NO:1，6,11和16來限定，并且在于它們具有用對(duì)甲苯磺酰基官能化的N-末端的氨基酸和氨甲?；问降腃-末端的氨基酸。9.根據(jù)權(quán)利要求8的肽，其特征在于它由序列SEQ-ID-N0:1來限定，并且在于它具有用對(duì)甲苯磺?；倌芑腘-末端的氨基酸和氨曱?；问降腃-末端的氨基酸。10.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其特征在于它由序列SEQ-ID-N0:1至SEQ_ID_NO:25來限定，并且在于它們具有用千基官能化的N-末端的氨基酸和氨甲?；问降腃-末端的氨基酸。11.根據(jù)權(quán)利要求10的肽，其特征在于它由序列SEQ-ID-N0:15來限定，并且在于它們具有用節(jié)基官能化的N-末端的氨基酸和氨甲?；问降腃-末端的氨基酸。12.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其特征在于它由序列SEQ-ID-NO:l至SEQ-ID_NO:25來限定，并且在于它們具有用苯曱?；倌芑腘-末端的氨基酸和氨曱?；问降腃-末端的氨基酸。13.根據(jù)權(quán)利要求12的肽，其特征在于它由序列SEQ—ID-N0:1和SEQ_ID_N0:11來限定，并且在于它們具有用苯曱?；倌芑腘-末端的氨基酸和氨曱?；问降腃-末端的氨基酸。14.根據(jù)權(quán)利要求13的肽，其特征在于它由序列SEQ一ID—N0:1來限定，并且在于它具有用芐基官能化的N-末端的氨基酸和氨曱?；问紺-末端的氨基酸。15.根椐權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)的肽用于制備抗微生物組合物的用途。16.根據(jù)權(quán)利要求15的用途，作為抗微生物劑來抵抗植物的病原菌。17.根據(jù)權(quán)利要求16的用途，其特征在于該植物的病原菌選自梨火疫病歐文氏菌(^n^/z/aa邁j^orara)，辣椒斑點(diǎn)病黃單胞菌(Ja/f力o/zo/jasres/catorj.a)和'洋丁香葉斑病假單i包菌(尸sewcfo歷o/2ass/W/^(Se)。18.根據(jù)權(quán)利要求16或17的用途，其特征在于所述植物選自果樹，園藝樹木和觀賞植物。19.控制植物病害的組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)的肽和助劑。20.根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其特征在于肽濃度為0.01至0.5g/1。21.根據(jù)權(quán)利要求19或20的組合物，其特征在于所迷助劑選自溶劑，表面活性劑，緩沖劑，紫外線照射過濾劑和/或其混合物。22.根據(jù)權(quán)利要求21的組合物，其特征在于所述溶劑是水。23.預(yù)防和治療由細(xì)菌引起的植物感染和病害的方法，其包括使植物接觸根據(jù)權(quán)利要求19至22任一項(xiàng)的控制植物病害的組合物。24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其特征在于所述細(xì)菌選自梨火疫病歐文氏菌(frp^'"/aa/ff/7oyora)，辣椒斑點(diǎn)病黃單胞菌(Xsi3Mo邁oi7as7e"'c"or/a)和洋丁香葉斑病假單胞菌(/^e油衡加ss/W/^ae)。25.根據(jù)權(quán)利要求23或24的方法，其特征在于所述植物選自果樹，園藝樹木和觀賞植物。26.根據(jù)權(quán)利要求23至25任一項(xiàng)的方法，其特征在于使組合物接觸選自以下的植物部分種子，根，莖，葉或果實(shí)，或接觸土壤或任何圍繞植物根部的其他生長(zhǎng)介質(zhì)。27.根據(jù)權(quán)利要求23至26任一項(xiàng)的方法，其特征在于通過噴霧，浸漬或灌溉使控制植物病害的組合物接觸植物。全文摘要本發(fā)明涉及新的具有抗微生物活性的線性肽。所述肽由11個(gè)氨基酸構(gòu)成，并且它們具有構(gòu)成非衍生形式或用乙?；?，對(duì)甲苯磺?；S基或苯甲?；倌芑腘-末端的氨基酸氨基。構(gòu)成所述肽C-末端的氨基酸是氨甲酰形式的。本發(fā)明描述了所述肽的合成以及作為抗微生物劑來抵抗植物病原菌的用途。本發(fā)明還涉及含有所述肽和助劑的組合物，以及預(yù)防和治療由病原菌引起的植物感染和病害的方法。文檔編號(hào)C07K14/435GK101466731SQ200780021678公開日2009年6月24日申請(qǐng)日期2007年4月24日優(yōu)先權(quán)日2006年4月28日發(fā)明者E·巴多薩羅馬喬,E·巴爾達(dá)希羅德里格斯,E·蒙特西諾斯塞吉,L·費(fèi)利烏索利,M·普拉納斯各拉布萊達(dá),R·費(fèi)雷馬拉貢申請(qǐng)人:赫羅納大學(xué)