專利名稱：控制基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及以控制基因體內(nèi) 和體外表達(dá)為目標(biāo)的、具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性的組合物和方法。
背景技術(shù)：
表觀遺傳學(xué)涉及由細(xì)胞或多細(xì)胞組織向其子代傳遞的、并非由基因的核苷酸序列 編碼的信息。通常通過對(duì)DNA或染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾實(shí)現(xiàn)表觀遺傳控制。例如，可以通 過對(duì)與基因組DNA結(jié)合的組蛋白進(jìn)行甲基化和乙?；哉{(diào)節(jié)基因表達(dá)。組蛋白的甲基化和 乙?；０l(fā)生在組蛋白的末端，此域?yàn)橥饴兜谋砻娌⑶矣捎诰哂写罅咳缇彼?R)和賴氨 酸(K)的氨基酸殘基而帶有凈正電荷。組蛋白末端的化學(xué)修飾受具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活 性(MTase)和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性(HAT)的酶調(diào)節(jié)。表觀遺傳修飾可發(fā)生在生物體正常發(fā)育的不同時(shí)段，并且也發(fā)生在正常細(xì)胞向癌 細(xì)胞轉(zhuǎn)化期間。此類修飾常造成特定基因的沉默或活化。大量文獻(xiàn)證明，在癌癥中多數(shù)腫 瘤細(xì)胞都顯示出異常的DNA表觀遺傳印記(FeinbergAP & Vogelstein B, (1983)Nature 1 (5895) 89-92)。干細(xì)胞是能夠在很大程度上進(jìn)行自我更新并且能夠分化成祖細(xì)胞的細(xì)胞。就這一 點(diǎn)而言，干細(xì)胞也是癌癥起源的潛在因素。干細(xì)胞可具有長(zhǎng)的壽命，在此期間干細(xì)胞發(fā)生的 遺傳突變和表觀遺傳修飾會(huì)增加其惡性化趨勢(shì)。根據(jù)假設(shè)，由于干細(xì)胞所在的環(huán)境處于增 殖和分化的競(jìng)爭(zhēng)性細(xì)微平衡中，微小而意義深遠(yuǎn)的表觀遺傳變化能夠?qū)⑺銎胶馔葡蚰[瘤 干細(xì)胞表型一側(cè)。對(duì)調(diào)控表觀遺傳修飾的原因和方式的鑒定對(duì)于癌癥的理解、檢測(cè)和治療， 尤其是對(duì)于腫瘤干細(xì)胞的治療特別重要。實(shí)際上，人們認(rèn)為復(fù)發(fā)和惡性癌癥病例難以治療 的因素之一為所述癌癥可能包含不對(duì)常規(guī)治療做出反應(yīng)的腫瘤干細(xì)胞。體細(xì)胞核移植(SCNT)被用于產(chǎn)生用于畜牧業(yè)生產(chǎn)(克隆或干細(xì)胞治療)、蛋白質(zhì) 生物制備和建立疾病模型的動(dòng)物(Wilmut I, Beau jean N，de SousaPA，Dinnyes A, King TJ， Paterson LA, Wells DN, Young LE. (2002)Nature. OctlO ；419 (6907) :583_6)。與 SCNT 功 效和成功率相關(guān)的問題之一是體細(xì)胞基因組包含妨礙成功重編程(r印rogramming)的大 量穩(wěn)定的表觀遺傳標(biāo)記。此外，受體卵細(xì)胞可以包含發(fā)揮表觀遺傳作用的因子，這些因子也 會(huì)導(dǎo)致所述方法的失敗。因此，需要提供改進(jìn)SCNT功效的組合物和方法，并以此通過這種 方式促進(jìn)生物加工的應(yīng)用。小鼠原始生殖細(xì)胞(PGC)的特化為分析體內(nèi)表觀遺傳修飾作用提供了有吸引力 的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｊ紫仍谛∈笈咛7. 5期發(fā)現(xiàn)約45個(gè)PGC的起始群(Ginsburg，M. ,Snow,M. H. & McLaren, A. (1990) Development 110，521_8)。其后，這些 PGC 遷移并從 E10. 5 期起進(jìn)入生 殖脊，在生殖脊中對(duì)生殖細(xì)胞繼續(xù)執(zhí)行進(jìn)一步的大量表觀遺傳程序。在E13. 5期，雌性體內(nèi) 生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂前期，而雄性體內(nèi)生殖細(xì)胞在雄性腺中進(jìn)入有絲分裂阻滯。PGC特化后馬上發(fā)生顯著的表觀遺傳修飾，包括分別通過HMTase和HAT對(duì)組蛋 白末端進(jìn)行甲基化和乙酰化(Surani et al. , 2004 (CSHSymposium) ；Seki et al. ,2004 ；Lachner, M. , 0 ‘ Sullivan，R. J. & Jenuwein，T. (2003)J Cell Sci 116,2117-24 ；和 Vaquero, A. ,Loyola,A. & Reinberg,D. (2003) Sci Aging Knowledge Environ 2003,RE4)o 在假定能調(diào)控PGC的這些表觀遺傳變化的候選基因中有屬于保守性SET/TO域蛋白質(zhì)家族 的 HMTase。因此，需要提供改進(jìn)細(xì)胞內(nèi)表觀遺傳調(diào)控機(jī)制控制的試劑和方法。特別地，需要可 以更好地控制基因表達(dá)的組合物和方法以影響干細(xì)胞和癌細(xì)胞的細(xì)胞命運(yùn)決定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了包含至少一個(gè)具有位點(diǎn)特異性DNA結(jié)合活性的第一 域和至少一個(gè)具有精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性的第二域的分離多肽復(fù)合物，其中所述第二域能 夠甲基化位于組蛋白H2A末端區(qū)域的精氨酸殘基。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述第二域具有精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性，可提 供精氨酸殘基的對(duì)稱性NG，N' G-二甲基化，如位于組蛋白H2A末端區(qū)域第3位點(diǎn)的精氨 酸殘基(H2AR3)的對(duì)稱性NG，N' G-二甲基化。任選地，所述第二域還能夠甲基化位于組 蛋白H4末端區(qū)域的精氨酸殘基，如位于組蛋白H4末端區(qū)域第3位點(diǎn)的精氨酸殘基(H4R3)。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性歸屬于Prmt5精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶域或 其衍生物或同源物。根據(jù)本發(fā)明，所述第一域能夠特異性地靶向結(jié)合于哺乳動(dòng)物基因組DNA中參與基 因表達(dá)控制的一個(gè)或多個(gè)共有序列。此類位點(diǎn)通常位于但不限于非編碼啟動(dòng)子區(qū)、非翻譯 區(qū)或內(nèi)含子中。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA結(jié)合域能夠結(jié)合PRDI/Blimpl型結(jié) 合位點(diǎn)，此類結(jié)合位點(diǎn)為具有四個(gè)GGGAAAG基序的共有序列，其中兩個(gè)基序位于靶基因的 5'-啟動(dòng)子區(qū)，另外兩個(gè)基序位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游。適合地，DNA結(jié)合域包含Blimpl 蛋白質(zhì)，PRDI/Blimpl多肽的DNA結(jié)合部分，或其同源物或其衍生物。本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了適于誘導(dǎo)多肽復(fù)合物在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的核酸 表達(dá)載體構(gòu)建物，所述載體包含可操作性地連接于啟動(dòng)子序列的一個(gè)或多個(gè)編碼序列，其 中，所述一個(gè)或多個(gè)編碼序列編碼至少一個(gè)具有位點(diǎn)特異性DNA結(jié)合活性的第一多肽域和 至少一個(gè)具有精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性的第二多肽域，其中所述第一域特異性地靶向結(jié)合哺 乳動(dòng)物基因組DNA中參與基因表達(dá)控制的一個(gè)或多個(gè)共有序列，而所述第二域具有精氨酸 甲基轉(zhuǎn)移酶活性，可向位于多肽底物中的精氨酸殘基提供對(duì)稱性NG，N' G- 二甲基化。依照本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述多肽底物是組蛋白。任選地，所述第二多肽 域能夠甲基化位于組蛋白H2A末端區(qū)域第3位點(diǎn)的精氨酸殘基(H2AR3)，并且也能夠甲基化 位于組蛋白H4末端區(qū)域的精氨酸殘基。適合的表達(dá)載體包括質(zhì)粒、粘粒、病毒載體和如YAC的人工染色體。啟動(dòng)子序列可 任選選自組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。適合的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括特征明顯的Tet或三苯 氧胺調(diào)控系統(tǒng)。其它的系統(tǒng)可包括熱激敏感型啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包含表達(dá)盒，在所述表達(dá)盒中，第一編 碼序列編碼第一多肽域，而第二編碼序列表達(dá)第二多肽域。任選地，所述第一編碼序列編碼 PRDI/Blimpl多肽，而第二編碼序列編碼Prmt5多肽。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過一個(gè)或 多個(gè)插入序列分隔所述第一和第二編碼序列是有利的。所述一個(gè)或多個(gè)插入序列可適當(dāng)?shù)匕辽僖粋€(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，以促進(jìn)細(xì)胞中第一和第二編碼序列的雙順反子 表達(dá)。本發(fā)明的表達(dá)載體還可以包含一個(gè)或多個(gè)核酸序列，該序列編碼選自選擇標(biāo)記、抗生 素抗性標(biāo)記和報(bào)告子的多肽。本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因表達(dá)的方法，包括誘導(dǎo)細(xì)胞 中多肽復(fù)合物的形成，其中所述多肽復(fù)合物包含至少一個(gè)具有位點(diǎn)特異性DNA結(jié)合活性的 第一域和至少一個(gè)具有精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性的第二域，其中所述第二域能夠甲基化位 于組蛋白H2A末端區(qū)域的精氨酸殘基。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過在細(xì)胞中誘導(dǎo)PRDI/ Blimpl多肽或其同源物或其衍生物的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞中多肽復(fù)合物的形成。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過使用編碼Blimpl多肽或其衍生物或同源物的表達(dá) 載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)PRDI/Blimpl多肽的表達(dá)。任選地，通過使用上文所述的表達(dá) 載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)PRDI/Blimpl多肽的表達(dá)。典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞為來(lái)自組織的 或細(xì)胞系形式的人類細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為腫瘤細(xì) 胞或細(xì)胞系或癌細(xì)胞或細(xì)胞系。合適地，本發(fā)明此方面的方法可在體外或體內(nèi)實(shí)施。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，基因表達(dá)控制導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)選自以下組 的基因的表達(dá)控制c-Myc、Dhx38、Pcdh7、Q8C9T7、Xyltl、DnaHl、Baip2、Nek7、Dusp2、 ENSMUSG00000027041、Sirt4和Blimpl的。在細(xì)胞中誘導(dǎo)所述多肽復(fù)合物會(huì)導(dǎo)致這些基因 中一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)降低。本發(fā)明的第四個(gè)方面提供了促進(jìn)干細(xì)胞自我更新并抑制其分化的方法，該方法包 含抑制干細(xì)胞中Blimpl/Prmt5復(fù)合物的形成。所述干細(xì)胞可任選為哺乳動(dòng)物干細(xì)胞，合適 的干細(xì)胞是人類干細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞選自成體干細(xì)胞、始 祖干細(xì)胞和多能干細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)了解的是，本發(fā)明無(wú)意于人類的生殖性克隆或以促進(jìn)人類生 殖性克隆為目的而操作或使用人類胚胎。在本發(fā)明此方面的一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過使干細(xì)胞接觸Blimpl抑制劑化 合物、Prmt5抑制劑化合物和/或Blimpl/Prmt5復(fù)合物抑制劑化合物來(lái)抑制所述細(xì)胞中 Blimpl/Prmt5復(fù)合物的形成。適合的抑制劑化合物可選自小分子抑制劑、與BlimplmRNA 或Prmt5mRNA結(jié)合的siRNA分子、與BlimplmRNA或Prmt5 mRNA結(jié)合的反義寡核苷酸以及 Blimpl或Prmt5多肽的負(fù)顯性形式。本發(fā)明的另一方面提供了控制細(xì)胞中Prmt5定位，特別是內(nèi)源Prmt5定位的方法， 該方法包括在所述細(xì)胞中誘導(dǎo)Blimpl多肽的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞中Blimpl/Prmt5復(fù)合物 的形成。在細(xì)胞中誘導(dǎo)的Blimpl可以是內(nèi)源Blimpl或外源Blimpl。適合的細(xì)胞可以是哺 乳動(dòng)物干細(xì)胞。本發(fā)明的另一方面提供了本發(fā)明的多肽復(fù)合物以及包含上述表達(dá)載體構(gòu)建物的 細(xì)胞(適合的細(xì)胞為哺乳動(dòng)物/人類細(xì)胞)在治療癌癥中的用途。附圖簡(jiǎn)述

圖1 (a)顯示E7. 5-E12. 5期間小鼠生殖細(xì)胞特化和發(fā)育的關(guān)鍵事件的總結(jié)；(b) 顯示通過兩個(gè)代表性起始PGC(灰色)和兩個(gè)體細(xì)胞(白色)的單細(xì)胞cDNA PCR的候選 SET/PR域基因表達(dá)分析。黑色區(qū)域表明檢測(cè)到PGC和體細(xì)胞中的表達(dá)。圖2 顯示免疫沉淀(IP)的小鼠Blimpl復(fù)合物具有精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性。(a) 在293T細(xì)胞中表達(dá)Myc標(biāo)記的小鼠Blimpl或相應(yīng)的對(duì)照，使用抗Myc抗體通過Western
7印跡分析Myc免疫沉淀物；(b)使用同樣的免疫沉淀物用于針對(duì)純化組蛋白H3、H2A和重組 H2A(rH2A)的HMTase分析，分別顯示其熒光圖(F)和麗春紅染色膜⑵；(c)放射性同位素 標(biāo)記rH2A的微測(cè)序，X軸表示rH2A中第1位至第14位的氨基酸，Y軸表示以每分鐘次數(shù) (cpm)計(jì)的單個(gè)氨基酸殘基的[3H]摻入；和(d)顯示H4和H2A. 1氨基最末端序列保守性的 比對(duì)。圖3 顯示生殖細(xì)胞中Blimpl和Prmt5的重疊表達(dá)形成特異的H2A/H4R3me圖譜。 (a、b、c)顯示通過抗81111^1(￡1)、抗？1~1^5 03)和抗Prmtl(c)特異性抗體免疫染色而檢測(cè)到 的不同發(fā)育階段PGC中Blimpl、Prmt5和Prmtl的表達(dá)圖譜，使用抗Stella/PGC7、抗0ct4 或抗TG1/SSEA1抗體檢測(cè)到的生殖細(xì)胞，與DAPI染色的DNA圖像一起形成的復(fù)合圖像；(d、 e)顯示在293T細(xì)胞中表達(dá)Myc標(biāo)記的小鼠Blimpl或相應(yīng)的對(duì)照；使用抗Prmt5抗體(anti Prmt5)、抗Myc 抗體(anti Myc)或抗Prmtl 抗體(anti Prmtl)通過Western 印跡分析Myc、 Prmt5或Prmtl免疫沉淀物，信號(hào)標(biāo)記(*)為非特異性信號(hào)；(f)使用抗H4R3me2s抗體通過 所示不同發(fā)育階段PGC的免疫染色來(lái)分析生殖細(xì)胞中H2A/H4 R3的甲基化；使用抗階段特 異性標(biāo)記物(即0ct4或TG1/SSEA1)的抗體對(duì)生殖細(xì)胞進(jìn)行共染色；與DAPI染色的DNA圖 像一起形成復(fù)合圖像；比例尺10 y m (各圖的比例相同)。圖4 顯示基因座Dhx38內(nèi)Blimpl/Prmt5結(jié)合元件的體內(nèi)鑒定。(a)Dhx38轉(zhuǎn)錄 起點(diǎn)(TS)和起始密碼子(ATG)附近推定的Blimpl結(jié)合位點(diǎn)的位置，(A、B、C、D)顯示用于 ChIP分析的擴(kuò)增序列；(b)ChIP分析中內(nèi)源Prmt5與基因座Dhx38的基因組DNA的相互作 用，使用抗Prmt5抗體或IgG抗體(anti-IgG)免疫沉淀E10. 5胚胎單獨(dú)生殖嵴細(xì)胞提取物 的上清(s)或細(xì)胞核(n)部分，使用末端基因組DNA(+)和水(-)作為對(duì)照。圖5 顯示將Blimpl和Prmt5由細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)后生殖細(xì)胞中Dhx38的表達(dá) 上調(diào)，造成H2A/H4R3me2s修飾水平的下降；在所示發(fā)育階段生殖脊的冷凍切片上進(jìn)行(a) Dhx38、(b)Blimpl 和 Prmt5 以及(c)H2A/H4R3me2s 的免疫染色；使用抗 Prmt5、抗 Myc 或 抗Prmtl特異性抗體檢測(cè)生殖細(xì)胞；與DAPI染色的DNA圖像一起形成復(fù)合圖像；比例尺 10ym(各圖的比例相同)。圖6 顯示多能EG和胚胎癌(EC)細(xì)胞中Blimpl、Prmt5和Dhx38的分析。(a)對(duì) EG細(xì)胞進(jìn)行的Blimpl、Prmt5和Dhx38免疫染色；與DAPI染色的DNA圖像一起形成復(fù)合圖 像，注意Dhx38和Blimpl表達(dá)之間的反向關(guān)系；(b)對(duì)ES、EG或EC(P19)提取物中Blimpl 和0ct4的Western印跡分析；(c)Myc標(biāo)記的小鼠Blimpl在所示P19多能EC細(xì)胞中的表達(dá)； 使用抗Prmt5、抗Myc或抗Prmtl抗體通過Western印跡分析Prmt5免疫沉淀物，使用抗微 管蛋白抗體檢測(cè)起始物(input)上樣量相等的泳道中的微管蛋白水平，發(fā)現(xiàn)向EC(P19)細(xì) 胞中引入Blimpl時(shí)Dhx38受到抑制；(d)通過ChIP分析發(fā)現(xiàn)在Myc-Blimpl轉(zhuǎn)染的EC (P19) 細(xì)胞中Dhx38基因座上H4R3me2s水平增加；使用抗Myc或抗H4R3me2s抗體免疫沉淀來(lái)自 P19細(xì)胞的細(xì)胞提取物；A、B、C、D是指如圖4所示的Dhx38基因座中包含Blimpl結(jié)合位點(diǎn) 的區(qū)域。圖7 顯示(a)由圖1所示E7. 5期PCR表達(dá)篩選所得候選SET/TO域基因的免疫 熒光分析，其中使用抗特異性組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的特異性抗體對(duì)從E8. 5期胚胎分離的細(xì) 胞進(jìn)行免疫染色，使用生殖細(xì)胞特異性抗體(抗0ct4或抗Stella/PGC7抗體)檢測(cè)生殖細(xì) 胞；(b)使用相應(yīng)抗體在E8. 5期PGC中免疫共染色Blimpl和Prmt5，通過組織非特異性堿性磷酸酶(AP)的表達(dá)標(biāo)記生殖細(xì)胞；與DAPI染色的DNA圖像一起形成復(fù)合圖像；比例尺 10ym(各圖的比例相同)。圖8 顯示抗H4R3me2s抗體的特征描述；可以使用單甲基基團(tuán)(a)，對(duì)稱排列的雙 甲基基團(tuán)(b)或不稱排列的雙甲基基團(tuán)(c)修飾精氨酸；先使用帶有對(duì)稱脫甲基化R3的 H4合成肽產(chǎn)生抗H4R3me2s抗體(Abeam )，然后進(jìn)行Western印跡分析測(cè)定其特異性；(d) 所述抗體針對(duì)有或沒有與Blimpl-Myc免疫沉淀物(即Myc-Blimpl或Myc)溫育的小牛胸 腺組蛋白(H4、H3、H2A、H2B)進(jìn)行的Western印跡，和(e)在與包含未經(jīng)修飾的、R3me2s和 R3me2a的H4多肽進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)后，所述抗體仍能高效識(shí)別對(duì)稱二甲基化的肽。
具體實(shí)施方案在詳細(xì)闡明本發(fā)明之前，提供有助于理解本發(fā)明的多個(gè)定義。本文引用的所有文 獻(xiàn)通過參考方式全文并入本文。除非另有定義，否則本文使用的科技術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬 領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。本文所用術(shù)語(yǔ)“重編程”是指改變或除去細(xì)胞核中表觀遺傳修飾的步驟。重編程 有利于降低細(xì)胞命運(yùn)定型，并以此降低細(xì)胞整體并尤其是細(xì)胞核的分化狀態(tài)。大體而言， 重編程包括使分化的或定型的體細(xì)胞核回復(fù)到胚胎細(xì)胞、生殖細(xì)胞或干細(xì)胞具有的基因表 達(dá)、表觀遺傳和功能狀態(tài)。體細(xì)胞核的重編程是如SCNT等程序優(yōu)選的第一步驟，其對(duì)于控 制細(xì)胞分化狀態(tài)(潛能)的其它程序也很重要。本文所用術(shù)語(yǔ)“癌”是指位于腫瘤內(nèi)的或具有與腫瘤相關(guān)的性質(zhì)的組織或細(xì)胞。腫 瘤通常具有區(qū)別于正常組織和正常細(xì)胞的特征。這些特征包括但不限于退變程度、細(xì)胞形 態(tài)改變、形狀的不規(guī)則性、細(xì)胞粘附性的降低、轉(zhuǎn)移能力、血管新生水平的升高、細(xì)胞侵襲性 的增加、細(xì)胞凋亡水平的下降和細(xì)胞惡性化的普遍增加。與“癌(cancer) ”相關(guān)且通常具有 相同含義的術(shù)語(yǔ)包括肉瘤、惡性腫瘤(carcinoma)、瘤(tumor)、上皮瘤、白血病、淋巴瘤、息 肉、轉(zhuǎn)化、腫瘤和類似術(shù)語(yǔ)。術(shù)語(yǔ)“表觀遺傳修飾”是指基因組的化學(xué)標(biāo)記。表觀遺傳標(biāo)記可包括DNA甲基化 (印記)以及與DNA相連蛋白質(zhì)(例如，組蛋白)的甲基化和乙?；Ｓ捎诒碛^遺傳修飾， 經(jīng)常在哺乳動(dòng)物中觀察到親源特異性基因的表達(dá)(來(lái)自母系或父系染色體)。在親本種系 中，表觀遺傳修飾可導(dǎo)致穩(wěn)定的基因沉默或活化?！吧锛庸ぁ笔侵甘褂没罴?xì)胞或其組分生產(chǎn)所需終產(chǎn)物的技術(shù)。在本發(fā)明中，可 通過細(xì)胞的表觀遺傳修飾增強(qiáng)這些細(xì)胞用于生物加工的能力。典型的生物加工技術(shù)包括 SCNT。本文所用術(shù)語(yǔ)DNA結(jié)合域和/或精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的“衍生物或同源物”是指分 別與本發(fā)明分子具有基本相似的序列同一性的mRNA和多肽。認(rèn)為衍生物和同源物包含來(lái) 自其它物種所述序列的直系物以及仍具有高水平等價(jià)功能的突變體。所述“基本相似的序 列同一性”是指序列相似性水平為約50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %至約99 %的同一性。 可以使用常規(guī)方法(Henikoff and Henikoff Proc. Natl. Acad. Sci. USA1992 ；89 10915 ； andAltschul et al.，Nucleic Acids Res. 1997 ；25 :3389_3402)測(cè)定序列同一性百分比。 或者，本發(fā)明多肽的同源物可以是能夠在高、中或低嚴(yán)格條件下具有與本文所述序列雜交 能力的那些序列。
所用術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”是指可將合適大小的另一 DNA序列片段整合到其內(nèi)部的線 性或環(huán)狀DNA分子。此類DNA片段可包括用于所述DNA序列片段編碼基因轉(zhuǎn)錄的其它片 段。所述其它片段可包括但不限于啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、增強(qiáng)子、內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、非翻 譯區(qū)、多聚腺苷酸信號(hào)、選擇性標(biāo)記、復(fù)制起點(diǎn)等類似物。表達(dá)載體通常衍生自質(zhì)粒、粘粒、 病毒載體和酵母人工染色體，載體通常是包含多個(gè)來(lái)源的DNA序列的重組分子。在用于如表達(dá)載體等的DNA序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)“可操作性連接”是指對(duì)序列進(jìn)行排列使 其合作發(fā)揮功能，從而達(dá)到其預(yù)期目的，即啟動(dòng)子序列可啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄并通過所連接的編碼序 列直至終止信號(hào)?！岸嗪塑账帷笔侵竼捂溁螂p鏈的共價(jià)連接的核苷酸序列，其中通過磷酸二酯鍵連接 各個(gè)核苷酸的3'和5'末端。所述多核苷酸可由脫氧核糖核酸堿基或核糖核酸堿基組成。 多核苷酸包括DNA和RNA，并且可通過體外合成或由天然來(lái)源分離制備。多核苷酸的大小通 常表示為雙鏈多核苷酸中堿基對(duì)(bp)的數(shù)目，或在單鏈多核苷酸的情況下，表示為核苷酸 (nt)的數(shù)目。lOOObp或lOOOnt等于1千個(gè)堿基(kb)。長(zhǎng)度小于約40個(gè)核苷酸的多核苷 酸通常被稱為“寡核苷酸”。本文所用術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”是指基因中可與轉(zhuǎn)錄因子和/或RNA聚合酶結(jié)合以控制 相關(guān)編碼序列表達(dá)的區(qū)域。啟動(dòng)子通常但不總位于基因的5'-非編碼區(qū)和翻譯起始密碼 子的上游?；虻膯?dòng)子區(qū)域可包含一個(gè)或多個(gè)共有序列，其作為DNA結(jié)合蛋白的序列特 異性DNA結(jié)合域的可識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)。此外，此類結(jié)合位點(diǎn)也可位于啟動(dòng)子外的區(qū)域，例如位 于內(nèi)含子中的增強(qiáng)子區(qū)域或位于編碼序列的下游。應(yīng)用于多肽或多肽復(fù)合物時(shí)，術(shù)語(yǔ)“分離”是指從其天然起源的生物體中移出的多 肽。優(yōu)選的分離多肽基本不含有其起源生物體蛋白質(zhì)組中固有的其它多肽。最優(yōu)選的分離 多肽為至少95%純度的形態(tài)，更優(yōu)選大于99%的純度。在本文中，術(shù)語(yǔ)“分離”意在包括處 于不同物理形態(tài)的相同多肽，無(wú)論所述多肽是天然形態(tài)、變性形態(tài)、二聚/多聚、糖基化、結(jié) 晶化或衍生的形態(tài)。而本文提及使用的“復(fù)合物”包括第一和第二多肽域包含在單個(gè)多肽 鏈中的情況，以及第一和第二域包含在彼此非共價(jià)結(jié)合的分別的多肽鏈中的情況，還有形 成翻譯后共價(jià)鍵以將單獨(dú)的域連接起來(lái)從而形成結(jié)合功能單位的情況。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了 Blimpl和Prmt5的新型復(fù)合物，所述新型復(fù) 合物能夠通過表觀遺傳控制機(jī)制調(diào)控哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá)。體細(xì)胞通常沿分化途徑由較低特化度發(fā)育成較高特化度或定型狀態(tài)。較低特化度 的體細(xì)胞可顯示出作為始祖干細(xì)胞產(chǎn)生多種不同細(xì)胞類型的能力。以特定干細(xì)胞作為祖細(xì) 胞產(chǎn)生這些不同細(xì)胞類型的量通常被稱為這種干細(xì)胞的“潛能”。因此，多能干細(xì)胞可作為 很多不同分化細(xì)胞類型的祖細(xì)胞。如果一種細(xì)胞可分化成體內(nèi)的所有細(xì)胞，則是全能細(xì)胞。 如果一種細(xì)胞可分化成大多數(shù)細(xì)胞類型，則是多能細(xì)胞。因?yàn)槟軌虍a(chǎn)生除胚外組織(即滋 養(yǎng)外胚層)之外哺乳動(dòng)物的大多數(shù)細(xì)胞類型，所以胚胎干細(xì)胞通常被稱為多能細(xì)胞。本發(fā) 明提供了在基因表達(dá)控制水平控制細(xì)胞命運(yùn)決定的方法。本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合物在表達(dá)或 引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，可使細(xì)胞命運(yùn)決定遠(yuǎn)離多能性。相反地，在干細(xì)胞中抑制本發(fā)明蛋 白質(zhì)復(fù)合物的活性或僅抑制Blimpl組分的活性可使細(xì)胞命運(yùn)決定傾向于多能性和自我更 新。本發(fā)明可應(yīng)用的另一個(gè)相關(guān)領(lǐng)域是癌癥治療。即使不是全部也是大多數(shù)癌癥都發(fā)
10生表觀遺傳變化，其包括腫瘤抑制基因的顯著下調(diào)和沉默以及致癌基因的上調(diào)。腫瘤抑制 基因的重新活化由于能夠下調(diào)致癌基因從而可改善癌癥表型。因此，控制體內(nèi)基因表達(dá)和 細(xì)胞命運(yùn)決定的方法是一種很有前景的癌癥治療途徑。B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的成熟蛋白(Blimpl)Blimpl是包含5個(gè)DNA結(jié)合鋅指基序的lOOkDa蛋白質(zhì)(GENBANK登錄 號(hào)NM_007548)。Blimpl的人類同源物被稱為PRDI-BF1或PRDM1 (GENBANK登錄號(hào) NM_000198)。最初，通過細(xì)胞因子IL-2和IL-5處理后B細(xì)胞淋巴細(xì)胞系(BCL1)的消減篩選 來(lái)分離Blimpl cDNA。Blimpl的異常表達(dá)足以導(dǎo)致BCL:細(xì)胞的終末分化。Blimpl被認(rèn)為是 終末 B 細(xì)胞發(fā)育的“總調(diào)節(jié)因子” (Yu J.et al. (2000)Mol. Cell. Biol. 20(7) :2592_2603)。在人體中，小鼠Blimpl的人直系物PRDI-BF1能夠與H3賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶G9a形 成復(fù)合物?，F(xiàn)已證明這種復(fù)合物能夠通過染色質(zhì)介導(dǎo)的機(jī)制在基因的啟動(dòng)子區(qū)域沉默人干 擾素 3 (IFN-3 )基因(Gyory I. et al. (2004)Nat. Imm. 5 :299_308)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Blimpl與參與表觀遺傳修飾的因子形成復(fù)合物。包含Blimpl和組蛋白 脫乙酰化酶(HDAC)的復(fù)合物被認(rèn)為通過組蛋白末端賴氨酸殘基的脫乙?；瘉?lái)改變核小體 結(jié)構(gòu)并抑制基因轉(zhuǎn)錄。由于賴氨酸殘基的乙?；捎行е泻推湔姾?，因而脫乙酰化會(huì)恢 復(fù)其帶電性，并且由于硬脂酸和其它作用會(huì)導(dǎo)致核小體結(jié)構(gòu)的修飾。Blimpl 的已知靶標(biāo)包括 c-Myc、IFN-3、CD23、CD22、II 類 MHC、BSAP (Pax5)、早期 B細(xì)胞因子和CIITA。所有這些基因均被Blimpl轉(zhuǎn)錄抑制。B細(xì)胞分化期間c-Myc基因的 轉(zhuǎn)錄被Blimpl抑制，c-Myc基因是BCQ淋巴細(xì)胞中Blimpl的重要靶標(biāo)。Blimpl對(duì)c_Myc 啟動(dòng)子的抑制需要Blimpl分子中的多個(gè)區(qū)域，包括N-末端酸性區(qū)和第99位與第464位氨 基酸之間的區(qū)域(Yu J. et al.，見上文)。致癌蛋白c-Myc對(duì)于生長(zhǎng)控制、凋亡和/或分化的調(diào)節(jié)至關(guān)重要，并且其失調(diào)還是 多種腫瘤的起因。B細(xì)胞中c-Myc的表達(dá)失調(diào)常常是致瘤的。c-Myc基因至Ig基因座的染 色體易位出現(xiàn)于大多數(shù)的人類Burkitt淋巴瘤和鼠漿細(xì)胞瘤中(Lin K. I. et al. , (2000) Mol. Cell Biol. (20)23:8684-8695)。可以通過LIF/STAT3依賴性信號(hào)維持小鼠ES細(xì)胞作為多能性、自我更新群?，F(xiàn)已 證明STAT3調(diào)控Myc轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。還認(rèn)為成體干細(xì)胞需要Myc的活化。RT-PCR分析 表明ES細(xì)胞中Myc的轉(zhuǎn)錄提高。ES細(xì)胞通常需要包含LIF的培養(yǎng)基，否則ES細(xì)胞會(huì)傾向 于分化而不是自我更新?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)從培養(yǎng)條件中除去LIF后，ES細(xì)胞中的Myc水平迅速下 降，說(shuō)明LIF可能是ES細(xì)胞分化的必要條件。實(shí)驗(yàn)表明與LIF相當(dāng)水平的Myc獨(dú)自能維持 ES細(xì)胞的狀態(tài)(即，多能表型)，并且在Myc失活時(shí)，干細(xì)胞群減少(CartwrightP. et al., (2005) Development 132:885—896)。蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(Prmt5)已知有兩類組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMTase)，其包含主要發(fā)現(xiàn)于具有賴氨酸特異性甲 基化酶活性的蛋白質(zhì)中的SET(Suvar3-9，Enhancer of Zeste, Trithorax)域，或發(fā)現(xiàn)于 PRMT的精氨酸特異性甲基化酶催化域。PRMT可被分成I型和II型1型PRMT催化精氨酸殘 基的單甲基化和不對(duì)稱的脫甲基化，而II型PRMT催化形成單甲基化和對(duì)稱二甲基化的精 氨酸。在六種已知的PRMT中，只有PRMT5 (GENBANK登錄號(hào)NM_006109 (人)；NM_013768(小 鼠))表現(xiàn)為可以靶向組蛋白的II型PRMT。特別地，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)PRMT5靶向H3和H4N-末端
11的特定精氨酸殘基。PRMT5可結(jié)合基于BRG1和hBRM的hSWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合體。在此類復(fù)合體中， PRMT5具有通過甲基化組蛋白H3中第8位精氨酸殘基(H3R8)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)和非錨定依賴 性生長(zhǎng)的能力，并以此降低如ST7和匪23等已知具有腫瘤抑制作用的基因的表達(dá)(Richard S. et al.，(2005)Biochem. J. 388 :379_386)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn) PRMT5 還參與 CYCLINE 和 CAD 的轉(zhuǎn) 錄抑制。Blimpl/Prmt5 復(fù)合物因?yàn)樯形窗l(fā)現(xiàn)Blimpl本身具有特異的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，因此本發(fā)明人著 手鑒定BlimplSET/ra域可能具有的活性。發(fā)明人現(xiàn)已證明Blimpl能夠與PRMT5形成新型 復(fù)合物，在體內(nèi)所述復(fù)合物持續(xù)存在于小鼠生殖細(xì)胞譜系中直至PGC進(jìn)入生殖脊，這表明 Blimpl在哺乳動(dòng)物早期生殖細(xì)胞譜系中具有持續(xù)的作用。下文更詳細(xì)的描述進(jìn)一步分析表 明新型Blimpl/Prmt5復(fù)合物通過甲基化組蛋白H2A和H4產(chǎn)生獨(dú)特的表觀遺傳特征?？梢?相信，這個(gè)證據(jù)首次證明組蛋白H2A末端甲基化是表觀遺傳調(diào)節(jié)的機(jī)制。此外，下文更詳細(xì) 描述的實(shí)驗(yàn)證明多能EG和ES細(xì)胞中存在Prmt5而不存在Blimpl。Blimpl在多能EC細(xì)胞系P19中的表達(dá)導(dǎo)致對(duì)已知在多能細(xì)胞中高水平表達(dá)的基 因的抑制。該實(shí)驗(yàn)表明Blimpl/Prmt5復(fù)合物是重要的基因表達(dá)調(diào)控因子，并且可對(duì)細(xì)胞命 運(yùn)選擇產(chǎn)生顯著影響，特別是多能性和分化方面。因此，發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了在利用 生物活性(如Blimpl/Prmt5復(fù)合物在體外和體內(nèi)的生物活性)的基礎(chǔ)上進(jìn)行基因控制的 機(jī)制。盡管不希望受理論的束縛，發(fā)明人相信由于具有5個(gè)鋅指DNA結(jié)合域，Blimpl可以 在所述復(fù)合物中提供基因靶向功能。Prmt5在定位到DNA時(shí)可作為HMTase提供精氨酸甲基 轉(zhuǎn)移酶活性，從而導(dǎo)致基因表達(dá)的抑制。已知Blimpl的人類直系物可結(jié)合到人IFN-3啟 動(dòng)子區(qū)域的 PRDI 位點(diǎn)上(Keller A. D. & Maniatis T. (1991)Genes Dev. 5 :868_879)。如上 所述，也發(fā)現(xiàn)Blimpl能夠抑制c-Myc的表達(dá)。依照本發(fā)明，現(xiàn)已鑒定出作為Blimpl/Prmt5 復(fù)合物特異性靶標(biāo)的新基因亞群，這些基因的表達(dá)可受到所述新型復(fù)合物的調(diào)控。此亞群 包括具有不同功能的基因，而這些基因被認(rèn)為在調(diào)節(jié)細(xì)胞潛能、細(xì)胞周期、分化、細(xì)胞粘附、 表觀遺傳重編程以及可能的腫瘤抑制方面起重要作用。根據(jù)本發(fā)明，Blimpl/Prmt5抑制復(fù)合物的存在與生殖細(xì)胞中高水平的H2A/ H4R3me2s相關(guān)。然而，在B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化的期間，Blimpl靶向G9a依賴性H3K9me2。 因此，Blimpl能夠通過結(jié)合不同的結(jié)合伴侶指導(dǎo)多種細(xì)胞命運(yùn)的決定和性質(zhì)，而染色質(zhì)重 塑可能是這些過程的核心。Blimpl除在小鼠生殖細(xì)胞特化早期中具有明顯重要作用之外， 本發(fā)明證明如在PGC特化后生殖細(xì)胞中所觀察到的那樣，Blimpl還參與染色質(zhì)獨(dú)特表觀遺 傳特征的形成。然而，E10. 5期后，當(dāng)在生殖細(xì)胞中檢測(cè)到大量的基因組范圍內(nèi)的編程時(shí)， Blimpl/Prmt5脫離PGC細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。因此，對(duì)Blimpl/Prmt5復(fù)合物、H2A/H4第3 位精氨酸的對(duì)稱性二甲基化以及隨后生殖細(xì)胞中大量基因組范圍內(nèi)的重編程三者之間關(guān) 系的認(rèn)識(shí)，使得對(duì)此關(guān)鍵過程的潛在機(jī)制以及如何在細(xì)胞內(nèi)控制核重編程有了更深入的了 解。本發(fā)明還使得對(duì)Blimpl/Prmt5在多能胚胎生殖腺(EG)細(xì)胞中的功能有了更深入 的了解，其中由PGC向EG細(xì)胞的演變過程與Blimpl的缺失明顯相關(guān)。本發(fā)明提供了直接證據(jù)證明，Blimpl對(duì)抑制新生和使PGC遠(yuǎn)離獲得明顯的多能干細(xì)胞樣表型是至關(guān)重要的。 因此，Blimpl/Prmt5活性的激動(dòng)劑和拮抗劑可分別在調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)決定遠(yuǎn)離或傾向于多能 性表型的方面起重要作用。此外，細(xì)胞內(nèi)的Blimpl表達(dá)提供了一種機(jī)制以削減Prmt5的核 內(nèi)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性并使其遠(yuǎn)離潛在的細(xì)胞質(zhì)底物。此種作用在干細(xì)胞分化期間以及 所需細(xì)胞或細(xì)胞系的一般細(xì)胞周期進(jìn)程中是有利的。本發(fā)明中作為Blimpl和/或Prmt5抑制劑使用的特定核酸小分子是被稱為小干 擾RNA(siRNA)的小片段雙鏈RNA。此類干擾RNA (RNAi)技術(shù)可在體內(nèi)選擇性地使基因功能 失活。在本發(fā)明中，可使用RNAi敲除細(xì)胞內(nèi)Blimpl和/或Prmt5的表達(dá)。在此方法中，雙 鏈mRNA被RNA酶dicer識(shí)別并切割，從而產(chǎn)生長(zhǎng)度為21-23個(gè)核苷酸的RNAi片段。這些 RNAi可與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)結(jié)合，并被RISC解旋。隨后，反義單鏈引導(dǎo)RISC接 近包含互補(bǔ)序列的mRNA，從而對(duì)所述mRNA進(jìn)行核酸內(nèi)切酶切割(Elbashir et al.，(2001) Nature 411 ;494_498)。因此，此技術(shù)提供了在體細(xì)胞中靶向降解Blimpl和/或Prmt5 mRNA 的方法，所述體細(xì)胞將應(yīng)用于生物加工或需要提高其自我更新的多能性表型中。本領(lǐng)域中 已有關(guān)于產(chǎn)生靶向Prmt5的siRNA技術(shù)的描述(Richard S.，見上文)。靶向人PRMT5的合 適siRNA序列的實(shí)例包括5' -CTCATTTGCTGACAATGAA-3‘ [SEQ ID NO 1]5' -GGACCTGAGAGATGATATA-3‘ [SEQ ID NO 2]5' -GTTTCAAGAGGGAGTTCAT-3‘ [SEQ ID NO 3]本發(fā)明的Blimpl/Prmt5復(fù)合物也可用于鑒定與其在細(xì)胞環(huán)境中相互作用的其它 蛋白質(zhì)和多肽?？墒褂描b定蛋白質(zhì)間相互作用的常規(guī)方法(例如，酵母雙雜交篩選)來(lái)鑒 定Blimpl/Prmt5復(fù)合物相互作用活性的潛在激動(dòng)劑和拮抗劑。鑒定抑制Blimpl與Prmt5 結(jié)合的小分子也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，例如，通過掩蔽或破壞與Blimpl中已知直接與其它 蛋白質(zhì)相互作用的那些域之間的相互作用來(lái)抑制Blimpl與Prmt5結(jié)合的小分子(Yu J. et al.，見上文)?？墒褂萌鏐IAcore 等技術(shù)研究blimpl、Prmt5和/或Blimpl/Prmt5復(fù)合 物蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用或蛋白質(zhì)與小分子間的相互作用，其中BIAcore 使用表 面等離子共振檢測(cè)分子間相互作用(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ 另參見www, biacore. com)。可通過自動(dòng)化高通量篩選方法來(lái)篩選與Blimpl/Prmt5復(fù)合物結(jié)合的分子和蛋白 質(zhì)。因此，本發(fā)明提供了通過檢測(cè)Blimpl/Prmt5復(fù)合物和靶分子之間陽(yáng)性結(jié)合相互作用來(lái) 鑒定與Blimpl/Prmt5復(fù)合物相互作用的分子的方法?？墒褂眠M(jìn)一步的篩選步驟測(cè)定所鑒 定的陽(yáng)性結(jié)合相互作用是否具有藥理學(xué)重要性，即靶分子是否能夠調(diào)節(jié)Blimpl、Prmt5和/ 或Blimpl/Prmt5復(fù)合物的生物學(xué)活性或功能。如果鑒定出具有正調(diào)控作用的分子，則將此 分子列為“命中”，并隨后將其作為潛在的候選藥物進(jìn)行評(píng)定。此時(shí)或之前可考慮其它因素， 例如所述分子的吸收、分布、代謝和排泄(ADME)、生物利用度和毒性特征。如果潛在的藥物 分子滿足藥理學(xué)需要，則可被認(rèn)為是藥學(xué)上相容的。可配制合適的組合物以依照本領(lǐng)域已 知的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)試其體外和體內(nèi)活性。實(shí)施例方法和試劑胚胎分離從遠(yuǎn)系小鼠MF1不同發(fā)育階段的胚胎中分離原始生殖細(xì)胞。將陰栓形成的當(dāng)天記為 E0. 5。由先前公布的文獻(xiàn)(Saitou, M.，Barton, S. C. &Surani, M. A. (2002) Nature 418，293-300)建立單細(xì)胞 cDNA 文庫(kù)。免疫染色使用胰蛋白酶處理切好的包含生殖細(xì)胞的胚胎片以制備單細(xì)胞懸浮 液。隨后，將細(xì)胞放置在包被有聚(L-賴氨酸)的載玻片上，用2%PFA固定并用PBS清 洗3次，以進(jìn)行下一步處理。將E11.5期的完整胚胎生殖脊切下，用PBS清洗，用4% PFA 在4°C下固定2小時(shí)，用PBS清洗，并在4°C下于20%蔗糖中放置過夜。將所得物包埋在 0. C. T(BDH)中并冷凍切片。使用IF緩沖劑(PBS ；0. 1 % Triton ； 10mg/mL BSA)對(duì)單細(xì) 胞或切片進(jìn)行滲透處理。在4°C下與一抗溫育過夜，隨后用IF緩沖劑清洗3次，并與二 抗(Alexa564、Alexa 488，Molecular Probes)在室溫下溫育2小時(shí)，并用PBS清洗。隨 后在含 DAPI 的 Vectashields (Vector laboratories)中封固(mount)載玻片。使用 BioRad Radiance 2000共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光。使用了以下抗體和稀釋液PGC7 (T. Nakano 產(chǎn)；1:2500)、0ct4(BD Transduction Laboratories ；1:200)、TGI (小鼠生殖細(xì)胞 特異性抗 SSEA1 單克隆抗體；1:1)、Blimpl(K. Calame 產(chǎn)；1:10)、Prmt5 (Upstate ；1:250)、 Prmtl (Upstate ； 1 200)、H4R3me2s (Abeam ； 1 1000)、Dhx38/Prpl6 (Proteintech Group ；
1 200)、Ezh2 (Upstate ； 1 50)、G9a (Abeam ； 1 100)、Pfml (Abeam ； 1 50)、Setl (得自 ff. Herr ； 1 200)免疫沉淀試驗(yàn)和核提取物的制備通過RT-PCR擴(kuò)增小鼠Blimpl的編碼區(qū)，并 將產(chǎn)物克隆到pcDNA3-MycHisA中以獲得pCMV-MycBlimpl構(gòu)建物。使用PBS清洗轉(zhuǎn)染有 原始載體(稱為pCMV-Myc)和pCMV-MycBlimpl的293T或P19細(xì)胞，并在IP緩沖液(包 含 150mMNaCl、l % NP40.0. 1 % Triton,50mM Tris(pH 8. 0)和完全蛋白酶抑制劑混合 物(Roche))中裂解所述細(xì)胞。通常免疫沉淀反應(yīng)使用2xl07個(gè)細(xì)胞。將全細(xì)胞提取物與
2ii g的Myc抗體(New England Biolabs) 一同溫育?；蛘呤褂每筆rmt5或抗Prmtl抗體 (Upstate)在4°C下溫育過夜。隨后，加入30y L蛋白A/G的瓊脂糖微珠，在4°C反應(yīng)2小 時(shí)。用IP緩沖劑清洗所述微珠5次。通過在Laemli樣品緩沖劑中煮沸以洗脫被結(jié)合的蛋 白。根據(jù)廠商的使用說(shuō)明(細(xì)胞核提取試劑盒；Active Motif)制備ES、EG或P19細(xì)胞的 核提取物，每次上樣使用25 u g核部分。體外甲基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)將從轉(zhuǎn)染有pCMV-Myc或pCMV-MycBlimpl的293T細(xì)胞免疫 沉淀試驗(yàn)中獲得的微珠用HMTase緩沖劑(25mM NaCl,25mMTris, pH 8.8)再次清洗兩次， 并用于稍作改良的如文獻(xiàn)16所述的HMTase檢測(cè)。簡(jiǎn)要而言，將1 P g的H3或H2A (Roche) 或重組H2A(A.Brehm惠贈(zèng))作為底物，2yCi的S-腺苷_L_[甲基-3H]蛋氨酸([3H]SAM； AmershamBiosciences)作為甲基供體，兩者在20 ii L的HMTase緩沖液混合物中于37°C 溫育3小時(shí)。將蛋白溶解于18% SDS-PAGE凝膠中，轉(zhuǎn)移到PDVF膜上，并通過麗春紅染色 和熒光顯影得到可視化。通過連續(xù)Edman降解法(Protein andNucleic acid Chemistry Facility, Cambridge University,UK)在體外對(duì)甲基化rH2A進(jìn)行微測(cè)序，隨后通過閃爍計(jì) 數(shù)法測(cè)定單個(gè)氨基酸中3H的摻入。為了檢測(cè)H2A/H4特異性甲基化，在存在有免疫沉淀的 Blimpl復(fù)合物和上述SAM的條件下，將H4、H3、H2A和H2B (Roche)溫育，并使用抗H4R3me2s 抗體(Abcam ，Cambridge, UK)進(jìn)行Western印跡分析，其中檢測(cè)H4R3me2s抗體的特異性 已經(jīng)通過競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)得到檢測(cè)(參見所附數(shù)據(jù)圖8)。染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)克隆和ChIP 在室溫下將單細(xì)胞懸液在1 %甲醛中交聯(lián)10分鐘。隨后將這些細(xì)胞破碎，并在50mM Tris(pH8. 0)、lOmMEDTA、1 % SDS中裂解細(xì)胞核， 隨后進(jìn)行超聲破碎。如上文所述，對(duì)所述提取物進(jìn)行免疫沉淀，同時(shí)加入純化的IgG(Santa Cruz)作為陰性對(duì)照。隨后，微珠在50mM NaHC03>l% SDS中洗脫兩次，所得上清在65°C下用 蛋白酶K處理5小時(shí)，然后進(jìn)行苯酚/氯仿純化和乙醇沉淀。隨后，使用以下引物(正向引物 1 ccaggaggggtttcatcaactg(SEQ ID No. 4)禾口反向弓丨物 1 :tgttaccgtctcacttggtgtttg(SEQ ID No. 5)；正向弓| 物 2 :acctcacaactgctgggattac(SEQ ID No. 6)禾口 反向弓| 物 2 ttcgttttctgcgtccgtg(SEQ ID No. 7)；正向弓丨物 3 :tttgtcgcagtgtcttatcgtaac(SEQ ID No. 8)和反向引物 3 :taggaaggtgttggggaggg(SEQ ID No. 9)；正向引物 4: atgaggtttgagaagtgtggc (SEQ ID No. 10)禾口 J^ 向弓 L 4 :atcagcggtggtggtgacagc (SEQ ID No. 11))，通過標(biāo)準(zhǔn)的 PCR 反應(yīng)分析 PRMT5(Upstate)或 H4R3m32 (Abeam )的 ChIP 樣品。當(dāng) 用于ChIP克隆試驗(yàn)時(shí)，使用抗Myc抗體進(jìn)行連續(xù)兩輪免疫沉淀。之后，DNA沉淀經(jīng)T4DNA聚 合酶平端化，然后連接到退火的JW102和JW10325上。隨后，使用JW102通過PCR擴(kuò)增所述連 接產(chǎn)物(55°C 2min、72°C 5min、94°C 2min 的 1 個(gè)循環(huán)，94°C 30s、55°C 30s、72°C lmin 的 20個(gè)循環(huán)，和72°C 5min的最后一個(gè)循環(huán))。將PCR產(chǎn)物克隆到pGEM_T (Promega)中，通過 PCR檢測(cè)菌落的插入物，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。隨后，使用如Ensembl (http:// www, ensembl. org)的在線生物信息資源進(jìn)行BLAST檢索。實(shí)施例1 :Blimpl活性的鑒定小鼠PGC特化后馬上發(fā)生顯著的表觀遺傳修飾，包括分別通過甲基轉(zhuǎn)移酶 (HMTase)和乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)對(duì)組蛋白末端進(jìn)行甲基化和乙?；?。在可能對(duì)PGC中這 些表觀遺傳變化進(jìn)行調(diào)控的候選基因中有屬于保守性SET/TO域蛋白質(zhì)家族的HMTase。 在E7. 5PGC和周邊體細(xì)胞中對(duì)25個(gè)含有SET/TO域的候選基因進(jìn)行了表達(dá)分析，并發(fā)現(xiàn) Blimpl、G9a、Setl、Ezh2和Pfml在包含PGC的胚胎區(qū)域中表達(dá)(圖lb和圖7)。然而，只 有Blimpl的表達(dá)被限定于E7. 5期PGC，其后在生殖細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)。為了研究Blimpl SET/TO域的活性，首先要確定使用抗Myc抗體可以使293T細(xì)胞 中瞬時(shí)表達(dá)的帶Myc標(biāo)記小鼠Blimpl被有效地免疫沉淀(圖2a)。隨后，利用免疫沉淀物 對(duì)組蛋白H3進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)放射性組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶試驗(yàn)(Rea，S. et al. , (2000) Nature406, 593-9)。在H3的對(duì)應(yīng)位置觀察到相對(duì)較弱的信號(hào)，但令人驚訝的是，在組蛋白H2A和H4的 對(duì)應(yīng)位置還檢測(cè)到顯著條帶(圖2b)，通過Western印跡(數(shù)據(jù)未出示)確定后者是H3制 備物中存在的低水平污染。推斷體外H3位置的微弱信號(hào)可能是由先前在B細(xì)胞中報(bào)道的 Blimpl相關(guān)G9a造成的(Gyory et al.，見上文)。然而，生殖細(xì)胞并不顯現(xiàn)出顯著的組蛋 白H3第9位賴氨酸的二甲基化(H3K9me2 ；這是G9a造成的初級(jí)修飾)，也未發(fā)現(xiàn)G9a功能 損失在可檢測(cè)的程度上影響PGC的特化。因此，決定將重點(diǎn)落在觀察到的免疫沉淀Blimpl 對(duì)組蛋白H2A和H4的活性上。基于H2A末端甲基化的新發(fā)現(xiàn)，決定首先檢測(cè)免疫沉淀物對(duì)小牛胸腺和重組H2A 制備物的甲基轉(zhuǎn)移酶活性，并發(fā)現(xiàn)所述免疫沉淀物對(duì)這種組蛋白具有強(qiáng)烈的甲基化活性 (圖2b)。對(duì)甲基轉(zhuǎn)移酶試驗(yàn)的放射性標(biāo)記重組蛋白產(chǎn)物進(jìn)行連續(xù)Edman降解，以測(cè)定H2A 末端的氨基酸殘基靶標(biāo)。由釋放氨基酸片段的閃爍計(jì)數(shù)法檢測(cè)rH2A R3的放射性標(biāo)記(圖 2c)。使用小牛胸腺和重組H4制備物獲得了相同的結(jié)果(數(shù)據(jù)未出示)。考慮到組蛋白H2A 和H4的N-末端起始幾個(gè)殘基間的氨基酸序列保守性(圖2d)，這一發(fā)現(xiàn)是一致的。已知，
15H4 R3甲基化在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起重要作用。然而，這些結(jié)果預(yù)示著存在對(duì)組蛋白H2A上R3的 其它新型甲基化。實(shí)施例2 :Blimpl/Prmt5復(fù)合物的鑒定由于SET/TO域與僅在賴氨酸殘基上的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性相關(guān)，可以推定上 述檢測(cè)到的精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性可能不歸于Blimpl，并且必然暗示免疫沉淀物中存在 其它HMTase。先前已有報(bào)道稱兩種蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶Prmtl和Prmt5介導(dǎo)組蛋白 H4 R3的甲基化。Prmtl是在不同類型底物上產(chǎn)生NG-單甲基精氨酸(Rmel)和不對(duì)稱NG， N' G- 二甲基精氨酸(Rme2a)的I型精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶。如上所述，Prmt5屬于II型精氨 酸甲基轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)精氨酸的單甲基化(Rmel)和對(duì)稱性NG，N' G-二甲基化(Rme2S)(圖 8)2°。使用上述單細(xì)胞cDNA文庫(kù)分析新生PGC和周邊體細(xì)胞中這些蛋白的表達(dá)，以檢測(cè)這 些蛋白之一是否能在體內(nèi)與Blimpl結(jié)合。發(fā)現(xiàn)E7. 5期PGC中不存在Prmtl，而Prmt5則 出現(xiàn)在PGC和體細(xì)胞內(nèi)(數(shù)據(jù)未出示)。但在蛋白質(zhì)水平上，Prmt5顯示出核染色，并且與 從E8. 5期起的體細(xì)胞相比高度富集于PGC中(圖3a、圖3b;圖Sib并參考下文)。另一方 面，檢測(cè)到Prmtl主要在這些階段的生殖細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。接著，決定研究與Blimpl相互作用的是否是Prmt5或Prmtl。實(shí)際上，發(fā)現(xiàn)Myc標(biāo) 記的Blimpl能夠有效地在免疫共沉淀293T細(xì)胞中的內(nèi)源性Prmt5(圖3d)。反之，Prmt5也 可以沉淀Myc標(biāo)記的Blimpl (圖3d)。相反，對(duì)Myc標(biāo)記的Blimpl和內(nèi)源Prmtl的檢測(cè)未 發(fā)現(xiàn)兩者之間的任何相互作用(圖3e)。這些試驗(yàn)確認(rèn)在293T細(xì)胞中Blimpl和Prmt5能 夠形成復(fù)合物?？紤]到這些蛋白在PGC中的重疊表達(dá)(圖3a、圖3b ；圖Sib)，可推定Blimpl 和Prmt5是PGC中同一蛋白質(zhì)復(fù)合物的一部分，并且所述復(fù)合物也可在發(fā)育過程中出現(xiàn)在 其它部位或成體的正常組織和腫瘤組織中。實(shí)施例3 :Blimpl/Prmt5復(fù)合物在體內(nèi)的活性測(cè)試針對(duì)H4R3me2s產(chǎn)生的抗體的特異性，結(jié)果顯示所述抗體可高效識(shí)別來(lái)自小 牛胸腺的組蛋白H2A和H4(圖8b左側(cè)；H2A和H4也作為污染物出現(xiàn)在H3和H2B制備物 中)。在競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中，此抗體被包含R3me2s的H4(1_9C)多肽有效地滴定(圖S2c)。此外， 此抗體還識(shí)別H4和H2A的Blimpl/Prmt5HMTase試驗(yàn)產(chǎn)物(圖S2b右側(cè))，因此進(jìn)一步證明 這是由所述復(fù)合物造成的Prmt5的對(duì)稱性二甲基化活性而不是Prmtl的不對(duì)稱二甲基化活 性。使用H2/H4R3me2s修飾的特異性抗體通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法分析從早期胚胎分 離的PGC。在E8. 5期的PGC和體細(xì)胞中均可見明顯的H2A/H4R3me2s(圖3f)，但是E10. 5 期，主要在生殖細(xì)胞中觀察到較多的H2A/H4R3me2s積累(圖3f)。然而，在使用識(shí)別單甲基 化和/或不對(duì)稱二甲基化的H4R3 (H4R3mel和H4R3me2a)的抗體時(shí)，發(fā)現(xiàn)PGC中的此類修飾 發(fā)生在E8.5期而不是E10.5期(數(shù)據(jù)未出示)。將兩種抗體所得的數(shù)據(jù)組合可見，從E8. 5 期至E10. 5期，PGC中趨向于H2A/H4R3me2s的發(fā)展。這些結(jié)果說(shuō)明生殖細(xì)胞發(fā)育期間存在 特異染色質(zhì)特征，認(rèn)為這是由于Prmt5和Blimpl同時(shí)存在的結(jié)果。重要的是注意到，有多 種其它的組蛋白末端修飾對(duì)生殖細(xì)胞的特異染色質(zhì)狀態(tài)起作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，Blimpl的功能 損失導(dǎo)致停止增殖的起始PGC樣細(xì)胞異常發(fā)育(Ohinata, Y. et al. , (2005) Nature 5，5)。實(shí)施例4 :Blimpl/Prmt5復(fù)合物體內(nèi)靶標(biāo)的鑒定如上所述，Blimpl可通過將相互作用因子招募到特定位點(diǎn)來(lái)引導(dǎo)細(xì)胞分化期間的基因調(diào)控。采用染色質(zhì)免疫沉淀克隆法鑒定推定的Blimpl靶標(biāo)，其中首先在293T細(xì)胞中 過表達(dá)Myc標(biāo)記的Blimpl。隨后，使用抗Myc抗體免疫沉淀來(lái)自這些293T細(xì)胞的核提取 物，提取免疫沉淀的DNA并純化，由連接接頭平滑化，經(jīng)PCR擴(kuò)增并克隆。選擇多個(gè)克隆，并 通過測(cè)序進(jìn)行分析，隨后通過BLAST分析對(duì)克隆插入物進(jìn)行定位。在32個(gè)克隆中，有11個(gè) 克隆與已知基因的可能調(diào)控序列之內(nèi)或其附近的區(qū)域相對(duì)應(yīng)(參見表1)。表 1 實(shí)施例5 :Blimpl/Prmt5復(fù)合物對(duì)Dhx38基因表達(dá)控制的特征描述在被鑒定的Blimpl推定靶標(biāo)之中，選擇Dhx38進(jìn)行進(jìn)一步的研究。Dhx38是編碼 含有RNA解旋酶的DEAH盒的保守基因(也稱為Prpl6)，在線蟲(C. elegans)精子向卵母細(xì) 胞轉(zhuǎn)化期間其對(duì)性別決定基因的翻譯后調(diào)控至關(guān)重要(Graham，P. L. & Kimble，J. (1993). Genetics 133,919—31)。在仔細(xì)檢查Dhx38基因座時(shí)發(fā)現(xiàn)其包含與Blimpl共有結(jié)合位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的4個(gè) GGGAAAG基序；其中兩個(gè)位于5'-區(qū)域，另兩個(gè)位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游(圖4a)。雖然 現(xiàn)有的抗Blimpl抗體在免疫染色過程中有效，但其不能有效免疫沉淀Blimpl (數(shù)據(jù)未出 示)。因此，使用Prmt5確定Dhx38是否是Blimpl/Prmt5在生殖細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)。使用抗 Prmt5抗體對(duì)E10. 5期胚胎生殖脊細(xì)胞懸液中包含的PGC進(jìn)行ChIP試驗(yàn)，其中E10. 5期是 Blimpl和Prmt5在生殖細(xì)胞核中共表達(dá)的時(shí)期(見上文)。實(shí)際上確實(shí)發(fā)現(xiàn)抗Prmt5抗體 能夠沉淀所選的+7152至+7541位核苷酸序列，該序列包含Dhx38基因的、包含Blimpl共 有結(jié)合位點(diǎn)的第11個(gè)外顯子(圖4b)。在本ChIP試驗(yàn)中，其它3個(gè)推定的結(jié)合位點(diǎn)不與所 述抗Prmt5抗體結(jié)合。這些結(jié)果說(shuō)明Prmt5被招募到如Dhx38的Blimpl靶標(biāo)，并由此說(shuō)明 Blimpl/Prmt5復(fù)合物調(diào)控生殖細(xì)胞中此類靶基因的表達(dá)?；贒hx38是Blimpl/Prmt5復(fù)合物在生殖細(xì)胞中的靶標(biāo)的證據(jù)，對(duì)PGC中Dhx38 的表達(dá)/抑制進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)在E10.5和E11.5期檢查不到Dhx38(圖5a)。然而，在 E12. 5期雌性和雄性PGC中Dhx38均被上調(diào)(圖5a)，這明顯地伴隨著E11. 5期生殖細(xì)胞 中Prmt5和Blimpl從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的重新定位而發(fā)生(圖5b)。在E12. 5期，Prmt5和 Blimpl均不存在于PGC細(xì)胞核中(數(shù)據(jù)未出示)。雌性和雄性生殖細(xì)胞中緊隨Dhx38上調(diào) 之后分別是減數(shù)分裂和有絲分裂阻滯。因此，Blimpl/Prmt5和Dhx38的表達(dá)之間具有反向 關(guān)系。這些結(jié)果說(shuō)明Blimpl和Prmt5可在生殖細(xì)胞中對(duì)如Dhx38等靶基因起到轉(zhuǎn)錄抑制的 作用。這種抑制作用在生殖細(xì)胞進(jìn)入生殖脊且Blimpl和Prmt5完成細(xì)胞核至細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移
17后開始減弱。應(yīng)注意到組蛋白精氨酸甲基化主要與轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)，雖然最近發(fā)現(xiàn)Prmt5相 關(guān)的H3R8me活性與基因表達(dá)下降有關(guān)(Pal S. et al.，見上文)。此外，據(jù)先前報(bào)道Blimpl 和Prmt5都是轉(zhuǎn)錄抑制因子，因此，本文所述生殖細(xì)胞中Blimpl/Prmt5復(fù)合物相關(guān)的對(duì)稱 性精氨酸二甲基化可能會(huì)促進(jìn)基因抑制。實(shí)施例6 多能干細(xì)胞中的Blimpl_Prmt5復(fù)合物決定檢查多能胚胎生殖細(xì)胞(EG)以進(jìn)一步了解Blimpl/Prmt5的作用。EG細(xì)胞 可衍生自體外的分離PGC，因此被認(rèn)為是等價(jià)于PGC的最接近的細(xì)胞系。已發(fā)現(xiàn)EG細(xì)胞也 是Prmt5陽(yáng)性，但與PGC不同，其缺乏Blimpl (圖6a和圖6b)。與此觀測(cè)結(jié)果一致的是發(fā)現(xiàn) EG細(xì)胞也是Dhx38陽(yáng)性，這表明Dhx38基因的表達(dá)可能歸因于Blimpl的缺失(圖6a和圖 6b)。在EG細(xì)胞中過表達(dá)Myc標(biāo)記的Blimpl以重建Blimpl/Prmt5抑制復(fù)合物。然而，此 類嘗試在細(xì)胞轉(zhuǎn)染僅12小時(shí)后即導(dǎo)致強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性，而由pCMV-Myc轉(zhuǎn)染的對(duì)照EG細(xì)胞 的細(xì)胞存活能力則沒有受到影響(數(shù)據(jù)未出示)。在多能胚胎干細(xì)胞(ES)中也獲得了類似 的結(jié)果(數(shù)據(jù)未出示)。隨后，選擇具有類似于EG和ES細(xì)胞的多能性特征的多能小鼠胚胎癌(EC)細(xì)胞系 P19。與ES/EG類似，P19細(xì)胞的確顯示出Prmt5和Dhx38的表達(dá)，但沒有表達(dá)Blimpl (圖 6b和圖6c)。然而，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞能夠耐受Blimpl的表達(dá)，因此可用于免疫沉淀，而在所述 免疫沉淀中的確證實(shí)過表達(dá)的Myc-Blimpl與小鼠EC細(xì)胞中內(nèi)源Prmt5之間存在相互作用 (圖6c)。特別地，在P19細(xì)胞中此瞬時(shí)表達(dá)的Blimpl/Prmt5復(fù)合物隨后導(dǎo)致了 Dhx38的 下調(diào)(圖6c)。ChIP分析證實(shí)所述Dhx38的下調(diào)伴隨著Dhx38基因座上H2A/H4R3me2s水 平的升高(圖6d)。這些觀察印證了 Blimpl/Prmt5復(fù)合物是造成如Dhx38等靶基因抑制的 觀點(diǎn)，這也可能在PGC中存在。雖然本文詳細(xì)公開了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但這些以實(shí)施例方式的公開僅出于 說(shuō)明的目的。上述實(shí)施方案并非有意限制以下權(quán)利要求書的范圍。發(fā)明人認(rèn)為對(duì)本發(fā)明進(jìn) 行的多種替換、變更和改進(jìn)均不脫離權(quán)利要求書規(guī)定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
一種分離多肽復(fù)合物，其包含至少一個(gè)具有位點(diǎn)特異性DNA結(jié)合活性的第一域和至少一個(gè)具有精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性的第二域，其中所述第二域能夠甲基化位于組蛋白H2A末端區(qū)域的精氨酸殘基。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽復(fù)合物，其中所述第二域具有精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性，提 供精氨酸殘基的對(duì)稱性NG，N' G-二甲基化。
3.如權(quán)利要求1和2任一項(xiàng)所述的多肽復(fù)合物，其中所述第二域能夠甲基化位于組蛋 白H2A末端區(qū)域中第3位點(diǎn)的精氨酸殘基(H2AR3)。
4.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽復(fù)合物，其中所述第二域還能夠甲基化位于組 蛋白H4末端區(qū)域的精氨酸殘基。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽復(fù)合物，其中所述第二域能夠甲基化位于組蛋白H4末端區(qū) 域第3位點(diǎn)的精氨酸殘基(H4R3)。
6.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽復(fù)合物，其中所述精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性歸屬 于Prmt5精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶域或其衍生物或其同源物。
7.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽復(fù)合物，其中所述第一域特異性地靶向結(jié)合于 哺乳動(dòng)物基因組DNA中參與基因表達(dá)控制的一個(gè)或多個(gè)共有序列。
8.如權(quán)利要求7所述的多肽復(fù)合物，其中所述第一域特異性地結(jié)合于PRDI/Blimpl型 共有結(jié)合位點(diǎn)。
9.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽復(fù)合物，其中所述第一域包含PRDI/Blimpl多 肽、PRDI/Blimpl多肽的DNA結(jié)合部分、或其衍生物。
10.一種分離多肽，其包含具有位點(diǎn)特異性DNA結(jié)合活性的第一域和至少一個(gè)具有精 氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性的第二域，其中所述第一域特異性地靶向結(jié)合于哺乳動(dòng)物基因組DNA 中參與基因表達(dá)控制的一個(gè)或多個(gè)共有序列，并且所述第二域具有精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活 性，其提供精氨酸殘基的對(duì)稱性NG，N' G- 二甲基化。
11.如權(quán)利要求10所述的分離多肽，其中所述第一域特異性地結(jié)合于PRDI/Blimpl型 共有結(jié)合位點(diǎn)。
12.如權(quán)利要求10或11所述的分離多肽，其中所述精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性歸屬于 Prmt5精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶域或其衍生物或其同源物。
13.適于誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中多肽復(fù)合物表達(dá)的核酸表達(dá)載體構(gòu)建物，所述載體包含可操作性地連接于啟動(dòng)子序列的一個(gè)或多個(gè)編碼序列，其中，所述一個(gè)或多個(gè)編碼序 列編碼至少一個(gè)具有位點(diǎn)特異性DNA結(jié)合活性的第一多肽域和至少一個(gè)具有精氨酸甲基 轉(zhuǎn)移酶活性的第二多肽域，其中所述第一域特異性地靶向結(jié)合于哺乳動(dòng)物基因組DNA中參 與基因表達(dá)控制的一個(gè)或多個(gè)共有序列，而所述第二域具有精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性，向位 于多肽底物中的精氨酸殘基提供對(duì)稱性NG，N' G- 二甲基化。
14.如權(quán)利要求13所述的表達(dá)載體，其中所述多肽底物是組蛋白。
15.如權(quán)利要求13和14任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中所述第二多肽域能夠甲基化位于 組蛋白H2A末端區(qū)域中第3位點(diǎn)的精氨酸殘基(H2AR3)。
16.如權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中所述第二多肽域還能夠甲基化 位于組蛋白H4末端區(qū)域的精氨酸殘基。
17.如權(quán)利要求16所述的表達(dá)載體，其中所述第二域能夠甲基化位于組蛋白H4末端區(qū) 域第3位點(diǎn)的精氨酸殘基(H4R3)。
18.如權(quán)利要求13-17中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中所述精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性歸 屬于Prmt5精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶域或其衍生物或其同源物。
19.如權(quán)利要求13-18中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中所述第一域特異性地靶向結(jié)合 于哺乳動(dòng)物基因組DNA中參與基因表達(dá)控制的一個(gè)或多個(gè)共有序列。
20.如權(quán)利要求19所述的表達(dá)載體，其中所述第一域特異性地結(jié)合于PRDI/Blimpl型 共有結(jié)合位點(diǎn)。
21.如權(quán)利要求20所述的表達(dá)載體，其中所述第一域包含PRDI/Blimpl多肽、PRDI/ Blimpl多肽的DNA結(jié)合部分、或其衍生物。
22.如權(quán)利要求13-21中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
23.如權(quán)利要求13-21中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中所述啟動(dòng)子是組成型活性啟動(dòng)子。
24.如權(quán)利要求13-23中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中所述載體包含表達(dá)盒，在所述表 達(dá)盒中第一編碼序列編碼第一多肽域，第二編碼序列表達(dá)第二多肽域。
25.如權(quán)利要求24所述的表達(dá)載體，其中所述第一編碼序列編碼PRDI/Blimpl多肽，所 述第二編碼序列編碼Prmt5多肽。
26.如權(quán)利要求13-24中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中所述第一編碼序列和第二編碼 序列通過一個(gè)或多個(gè)插入序列分隔。
27.如權(quán)利要求26所述的表達(dá)載體，其中所述一個(gè)或多個(gè)插入序列包含至少一個(gè)內(nèi)部 核糖體進(jìn)入序列(IRES)。
28.如權(quán)利要求13-27中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其還包含一個(gè)或多個(gè)核酸序列，所述 核酸序列編碼選自選擇標(biāo)記、抗生素抗性標(biāo)記和報(bào)告子的多肽。
29.控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因表達(dá)的方法，其包括在所述細(xì)胞中誘導(dǎo)多肽復(fù)合物的形 成，其中所述多肽復(fù)合物包含至少一個(gè)具有位點(diǎn)特異性DNA結(jié)合活性的第一域和至少一個(gè) 具有精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性的第二域，其中所述第二域能夠甲基化位于組蛋白H2A末端區(qū) 域的精氨酸殘基。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中通過在細(xì)胞中誘導(dǎo)PRDI/Blimpl多肽或其同源物 或其衍生物的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞中所述多肽復(fù)合物的形成。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中通過使用編碼Blimpl多肽或其衍生物或其同源物 的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，從而在所述細(xì)胞中誘導(dǎo)PRDI/Blimpl多肽的表達(dá)。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其中通過使用如權(quán)利要求13-28中任一項(xiàng)所述的表達(dá) 載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，從而在所述細(xì)胞中誘導(dǎo)PRDI/Blimpl多肽的表達(dá)。
33.如權(quán)利要求29-32中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人類細(xì)胞。
34.如權(quán)利要求29-33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞或癌 細(xì)胞。
35.如權(quán)利要求29-34中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法在體外進(jìn)行。
36.如權(quán)利要求29-34中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法在體內(nèi)進(jìn)行。
37.如權(quán)利要求29-36中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基因表達(dá)控制導(dǎo)致對(duì)選自于c-Myc、Dhx38、Pcdh7、Q8C9T7、Xyltl、DnaHl、Baip2、Nek7、Dusp2、ENSMUSG0000002704U Sirt4和Blimpl的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)控制。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中細(xì)胞中多肽復(fù)合物的誘導(dǎo)導(dǎo)致權(quán)利要求37中列出 的一個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)的下降。
39.促進(jìn)干細(xì)胞自我更新并抑制其分化的方法，其包含抑制所述干細(xì)胞中Blimpl/ Prmt5復(fù)合物的形成。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述干細(xì)胞是哺乳動(dòng)物干細(xì)胞。
41.如權(quán)利要求39和40中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述干細(xì)胞是人干細(xì)胞。
42.如權(quán)利要求39-41中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述干細(xì)胞選自成體干細(xì)胞、始祖干 細(xì)胞和多能干細(xì)胞組成的組。
43.如權(quán)利要求39-42中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過使所述干細(xì)胞接觸Blimpl抑制 劑化合物、Prmt5抑制劑化合物和/或Blimpl/Prmt5復(fù)合物抑制劑化合物來(lái)抑制所述干細(xì) 胞中Blimpl/Prmt5復(fù)合物的形成。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述抑制劑化合物選自以下組成的組小分子抑 制劑、與Blimpl或Prmt5mRNA結(jié)合的siRNA分子、與Blimpl或Prmt5mRNA結(jié)合的反義寡核 苷酸以及Blimpl或Prmt5多肽的負(fù)顯性形式。
45.控制細(xì)胞中Prmt5定位的方法，其包括誘導(dǎo)細(xì)胞中Blimpl多肽的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì) 胞中Blimpl/Prmt5復(fù)合物的形成。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物干細(xì)胞。
47.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的分離多肽復(fù)合物在癌癥治療中的應(yīng)用。
48.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的分離多肽復(fù)合物在制備癌癥治療藥物中的應(yīng)用。
49.細(xì)胞，其包含權(quán)利要求13-28中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體。
50.如權(quán)利要求49所述的細(xì)胞，其為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
51.如權(quán)利要求50所述的細(xì)胞，其為人類細(xì)胞。
全文摘要
一種包含至少一個(gè)具有位點(diǎn)特異性DNA結(jié)合活性的第一域和至少一個(gè)具有精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性的第二域的表觀遺傳調(diào)控多肽復(fù)合物，其中所述第二域能夠甲基化位于組蛋白H2A末端區(qū)域的精氨酸殘基。所述復(fù)合物能夠調(diào)控細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)，特別是通過控制組蛋白H2A和H4末端區(qū)域中R3的甲基化調(diào)控哺乳動(dòng)物干細(xì)胞中的基因表達(dá)。所述復(fù)合物的實(shí)例包括具有Blimp1的DNA結(jié)合活性和Prmt5的精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽復(fù)合物。
文檔編號(hào)C07K14/47GK101855343SQ200780021848
公開日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2007年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月5日
發(fā)明者烏爾麗克·朗格, 卡蒂婭·安瑟蘭, 彼得拉·哈伊科娃, 阿齊姆·蘇拉尼 申請(qǐng)人:劍橋?qū)崢I(yè)有限公司