專利名稱：：TGF-β超家族的蛋白質(zhì)和肽用于純化和治療方法的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及TGF-P超家族的肽和蛋白質(zhì)及其突變體的用途。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞生長、分化和功能的天然調(diào)控因子為治療干預(yù)提供了重要的藥物、臨床和實驗工具、以及靶標(biāo)。多種這樣的調(diào)控因子已顯示對1^出的細(xì)胞分化和發(fā)育途徑有著深遠(yuǎn)影響。轉(zhuǎn)化生長因子j3(TGF-P)超家族是多功能蛋白質(zhì)的大家族，所述多功能蛋白質(zhì)調(diào)控多種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞增殖、遷移、分化和凋亡?；境蓡TTGF-P，已顯示在從胚胎才莫式形成到成體組織的細(xì)胞生長調(diào)控中起多種作用。TGF-p通過信號傳導(dǎo)級聯(lián)最終激活和/或抑制特定基因集合來行使其生物功能。其它TGF-p超家族成員包括TGF-p家族、生長分化因子(GDF)、激活素、抑制素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)和其它相關(guān)的配體。BMP介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)對于多種正常過程包括骨骼的生長以及神經(jīng)系統(tǒng)、目艮和器官如腎的功能均很重要。BMP在不同生物環(huán)境中有不同的生物活性，包括對軟骨、骨胳和結(jié)締組織的誘導(dǎo)作用，以及在腎、牙齒、腸、皮膚和毛發(fā)發(fā)育中的作用。BMP可在實驗室中制備，但是純化這些物質(zhì)便利方法很少，純化方法的研發(fā)常常特別耗時，純化過程有時需要長達(dá)6個月的時間來研發(fā)。因此期望有更有效的方法來純化BMP和TGF-p超家族的其它成員。定義如在本文和隨附的權(quán)利要求書中所使用的那樣，除非上下文中另有清楚表明，否則單數(shù)形式"一個/一種"和"所述，，包括復(fù)數(shù)含義。因此，例如提到"一個/一種細(xì)胞"包括多個/多種這樣的細(xì)胞，提到"一個/一種抗體"指一個/一種或多個/多種抗體和本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其等同物，等等。術(shù)語"多核苷酸"、"核苷酸序列"、"核酸"、"核酸分子，，、"核酸序列"和"寡核苷酸"指DNA和RNA中的一串核苷酸堿基(也稱"核苷酸")，意指具有兩個或多個核苷酸的任意鏈。多核苷酸可為嵌合混合物或衍生物或其修飾形式，可為單鏈或雙鏈。寡核苦酸可在堿基部分、糖部分或磷酸骨架上被修飾，例如用以改善分子的穩(wěn)定性、雜交參數(shù)等。反義寡核苷酸可包含修飾的堿基部分，其選自包括但不限于下列物質(zhì)的組5-氟尿嘧咬、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃噤呤、黃噤呤、4-乙酰胞嘧咬、5-(羧基羥基曱基)尿嘧啶、5-羧甲基氨曱基-2-硫代尿苷、5-羧曱基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、(3-D-半乳糖Q核苷(P-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-異戊烯腺噤呤、1-曱基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺噪呤、2-甲基鳥噪呤、3-甲基胞嘧淀、5-曱基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-曱基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基曱基-2-硫尿嘧啶、p-D-甘露糖Q核苷((3-D-mannosylqueosine)、5，-曱氧基羧基曱基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯腺噤呤、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-巰基胞嘧咬、5-曱基-2畫硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧咬-5-羥乙酸甲酉旨、尿嘧啶-5-羥乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。核苷酸序列通常攜帶遺傳信息，包括細(xì)胞^L器用來制造蛋白質(zhì)和酶的信息。這些術(shù)語包括雙鏈或單鏈基因組DNA和cDNA、RNA、任何合成和基因改造的(geneticallymanipulated)多核苷酸、有義多核苷酸和反義多核苷酸兩者。這包括單鏈和雙鏈分子，即DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA雜合體，堿基和氨基酸骨架綴合形成的"蛋白質(zhì)核酸"(PNA)。這還包括包含修飾堿基的核酸，例如硫尿嘧咬、硫鳥嘌呤和氟尿嘧，定，或包含糖或脂的核酸。本發(fā)明的實施方案所使用的多核苷酸可用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法合成，例如通過使用DNA自動合成4義(如由商業(yè)途徑購自生物技術(shù)y〉司(Biosearch)、應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystems)等)合成。作為例子，硫代磷酸寡核普酸可用Stein等人，Nucl.AcidsRes.，16，3209,(1988)的方法合成，曱基膦酸酯寡核苷酸可通過使用可控多孔玻璃聚合物支持物(controlledporeglasspolymersupportXSarin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85，7448-7451,(1988)制備，等等。已研發(fā)出許多方法將反義DNA或RNA遞送至細(xì)胞內(nèi)，例如可直接將反義分子注射ii7^組織位點，或可全身給藥設(shè)計為靶向期望細(xì)胞的經(jīng)修飾的反義分子(反義分子與肽或抗體連接，所述肽或抗體與耙細(xì)胞表面表達(dá)的受體或抗原特異性結(jié)合)?？蛇x地，RNA分子可通過體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)錄編碼反義RNA分子的DNA序列產(chǎn)生。這樣的DNA序列可摻入多種載體中，其中載體并入適合的RNA聚合酶啟動子如T7或SP6聚合酶啟動子?？蛇x地，取決于所^吏用的啟動子組成型或誘導(dǎo)型合成反義RNA的反義cDNA構(gòu)建體可穩(wěn)定地引入細(xì)胞系中。但是，細(xì)胞內(nèi)的反義分子通常難以達(dá)到足以抑制內(nèi)源mRNA翻譯的濃度。因此優(yōu)選使用重組DNA構(gòu)建體的方法，其中反義寡核苷酸處于強(qiáng)啟動子的控制下。使用這樣的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染患者體中的靶細(xì)胞，能轉(zhuǎn)錄足量的單鏈RNA，與內(nèi)源耙基因轉(zhuǎn)錄物形成互補(bǔ)堿基對，從而防止靼基因mRNA的翻譯。例如，可體內(nèi)引入載體，從而被細(xì)胞才HA，指導(dǎo)反義RNA的轉(zhuǎn)錄。只要能夠轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生期望的反義RNA，這樣的載體可以保持游離或整合在染色體中。這樣的載體可以通過本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)方法構(gòu)建。載體可為質(zhì)粒、病毒、或本領(lǐng)域已知的用于在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)的其它載體。編碼反義RNA的序列可使用本領(lǐng)域已知在哺乳動物優(yōu)選人細(xì)胞中起作用的任何啟動子進(jìn)行表達(dá)。這樣啟動子可為誘導(dǎo)型或組成型。這才羊的啟動子包括^f旦不限于SV40早期啟動子區(qū)(Bernoist和Chambon,Nature,2卯，304-310,(1981))、勞斯肉瘤病毒(Roussarcomavirus)3，長末端重復(fù)中包含的啟動子(Yamamoto等人，Cell,22，787-797,(1980))、皰滲胸苷激酶啟動子(Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78,1441—1445,(1981))、金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster等人，Nature296,39-42，(1982))等?？墒褂萌魏晤愋偷馁|(zhì)粒、粘粒、酵母人工染色體或病毒載體，來制備能直接引入組織位點的重組DNA構(gòu)建體?？蛇x地，可使用選擇性感染期望組織的病毒載體，在這種情況下，給藥可以通過另一途徑實現(xiàn)(例如，全身給藥)。多核苷酸可以側(cè)接天然調(diào)控(表達(dá)控制)序列，或可以與異源序列相連，包括啟動子、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)和其它核糖體結(jié)合位點序列、增強(qiáng)子、反應(yīng)元件、抑制基因、信號序列、多聚腺苷酸化序列、內(nèi)含子、5，-和3，_非編碼區(qū)等。還可用本領(lǐng)域已知的許多方法修飾核酸。這樣的j奮飾的非限制性例子包括曱基化、加帽("caps")、用類似物取代一個或多個天然存在的核苷酸、以及核苷酸間修飾例如，不帶電的核苷酸間鍵合(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基曱酸酯等)和帶電的核苷酸間鍵合(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。多核苷酸可包含一個或多個另外的共價連接的部分，例如，蛋白質(zhì)(例如，核酸酶、毒素、抗體、信號肽、多聚左旋賴氨酸等)、嵌合劑(例如，吖啶、補(bǔ)骨脂素等)、螯合劑(例如，金屬、放射性金屬、鐵、氧化金屬等)和烷化劑。多核苷酸可通過形成甲基磷酸三酯或乙基磷酸三酯或烷基氨基磷酰胺酯連接而衍生。此外，本文的多核苷酸還可用能夠提供可直接或間接檢測的信號的標(biāo)記修飾。例示性標(biāo)記包括i欠射性同位素、熒光分子、生物素等。如本領(lǐng)域公知的那樣，"同一性"或"相似性"是通過序列對比測定的、兩個或多個多肽序列或兩個或多個多核苷酸序列之間的關(guān)系。本領(lǐng)域中，同一性還指由這樣的序列串之間的匹配測定的、多肽序列之間的相關(guān)程度。同一性和相似性均可由已知方法容易地計算，如在下列文獻(xiàn)中描述的方法ComputationalMolecularBiology,Lesk，A.M.編，牛津大學(xué)出版社，紐約，1988;Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.編，學(xué)術(shù)出版社，紐約，1993;SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHdnje，G.，學(xué)術(shù)出版社，1987;ComputerAnalysisofSequenceData,第一部分，Griffin,A.M.和Griffin,H.G.編，Humana出版社，新澤西，1994和SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.和Devereux，J.編，斯托克頓出版社(MStocktonPress),紐約，1991。通常用來測定序列之間的同一性或相似性的方法包括但不限于Carillo,H.和Lipman，D.，SIAMJAppliedMath.,48:1073(1988)公開的方法。測定同一性和相似性的方法編碼在公眾可得的計算機(jī)程序中。測定兩個序列之間同一性和相似性的優(yōu)選計算機(jī)程序包括但不限于，GCG程序包，Devereux，J.等人，NucleicAcidsResearch,12(1),387(1984)),BLASTP,BLASTN，和FASTAAtschul，S.F.等人，JMolec.Biol.，215，403(19卯))。"同源"指兩種聚合物(即多肽分子或核酸分子)之間的序列相似性程度。本文中所指的同源性百分比數(shù)字反映兩種聚合物之間的最大可能同源性，即兩種聚合物以具有最多數(shù)量的匹配(同源)位置進(jìn)行比對時的同源性百分比。術(shù)語"同源性百分比"指多肽之間M酸的序列同一性程度。任意兩種多肽之間的同源性是在任一序列中給定位置匹配的M酸總數(shù)的直接函數(shù)，例如，如果任一序列中M酸總數(shù)的一半相同，則i人為兩個序列顯示50%同源性。術(shù)語"片斷"、"類似物"和"衍生物"指多肽時，指的是可能保留了與原始多肽基本相同的生物功能或活性的多肽。因此，類似物可包括前體蛋白，能通過切割前體蛋白部分而活化，產(chǎn)生活性成熟多肽。多肽的片斷、類似物或衍生物可為其中一個或多個氨基酸被保守或非保守氨基酸殘基所取代，這樣的氨基酸殘基可由遺傳密碼編碼或不由遺傳密碼編碼；或其中一個或多個氨基酸殘基包括取代基；或其中多肽與化合物如聚乙二醇融合，以延長多肽的半衰期；或其中另外的氨基酸與多肽融合，如信號肽或序列如多聚組氨酸標(biāo)簽，用于純化多肽或前體蛋白。認(rèn)為這樣的片斷、類似物或衍生物落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。術(shù)語"多肽"指氨基酸聚合物，不考慮聚合物的長度；因此，"肽"、"寡肽，，和"蛋白質(zhì)，，涵蓋在多肽的定義中，在本文中可互換使用。盡管作為具體實施方案可能包括或排除這些多肽的化學(xué)或表達(dá)后修飾，但此術(shù)語并不指定或排除本發(fā)明多肽的化學(xué)或表達(dá)后修飾。因此，例如，術(shù)語多肽清楚地涵蓋對多肽的修飾，包括共價附著糖基、乙?；?、磷酸基、脂基等。此外，具有這些修飾的多肽可能被指定為個別種類，包括在本發(fā)明中或排除在其外。天然或其它化學(xué)修飾，如上述例子中所列舉的那些，可發(fā)生在多肽的任何地方，包括肽骨架、氨基酸側(cè)鏈和氨基端或羧基端。應(yīng)意識到相同類型的修飾可在給定多肽的數(shù)個位點以同樣或變化的程度出現(xiàn)。同樣，給定多肽可包含多種類型的修飾。多肽可以分枝，例如由于泛素化作用分枝；多肽可為環(huán)狀，有分枝或沒有分枝。l務(wù)飾包括乙?；?、?；l)P-核糖基化、酰胺化、共價附著黃素、共價附著血紅素部分、共價附著核苷酸或核苷酸衍生物、共價附著脂或脂衍生物、共價附著磷脂酰肌醇、交聯(lián)、環(huán)化、形成二硫鍵、去甲基化、形成共價交聯(lián)、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、Y-羧化作用、糖基化、形成糖基化磷脂酰肌醇錨點(GPIanchor)、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻?；?、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)的在蛋白質(zhì)上添加氨基酸，如精氨?；头核鼗?參見例如，proteins—structureandmolecularproperties,第二版，T.E.Creighton,W.H.FreemanandCompany出版公司，紐約(1993);posttranslationalcovalentmodificationofproteins,b.c.Johnson編,學(xué)術(shù)出版社，紐約，第1-12頁，1983;Sdfter等人，MethEnzymol182:626-646,19卯；Rattan等人，AnnNYAcadSci663:48-62，1992)。涵蓋在該定義中的還有包含氨基酸的一種或多種類似物的多肽(包括例如，非天然存在的氨基酸、僅在不相關(guān)的生物系統(tǒng)中天然存在的氨基酸、來自哺乳動物系統(tǒng)的修飾的氨基酸、多種氨基酸的立體異構(gòu)體等)，具有取代的連接的多肽，以及具有其它本領(lǐng)域已知的、天然存在和非天然存在的修飾的多肽。術(shù)語"多肽"還可與術(shù)語"蛋白"或"肽，，交換使用。術(shù)語"指狀結(jié)構(gòu)-l肽類似物"指與TGF-P超家族成員的指狀結(jié)構(gòu)-1區(qū)部分至少75。/。同源的寡肽。在一些實施方案中，指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物與野生型序列至少80%,至少85%，至少90%，或至少95%同源。在某些實施方案中，寡肽包括至少8個氬基酸殘基，至少16個氨基酸殘基，或至少24個氨基酸殘基。指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物可為突變體，其中一個或多個氨基酸經(jīng)改變或缺失，可包括非天然或修飾的^lL基酸殘基。術(shù)語"肽"指兩個或多個氨基酸的任意聚合物，其中各氨基酸通過相鄰氨基酸的NKb和COOH基團(tuán)之間形成的肽鍵(-CONH-)與一個或兩個另外的氨基酸連接。在一個實施方案中，氨基酸為天然存在的氨基酸，特別是L-對映體形式的(x-氨基酸。但是，肽中可包括其它氨基酸、對映體形式和氨基酸4汙生物。肽包括"多肽"，其在水解時產(chǎn)生多于兩個氨基酸。多肽可包括蛋白質(zhì)，其通常包含50個或更多氨基酸。根據(jù)本發(fā)明實施方案的多肽可以以分離形式提供，可純化至同質(zhì)性。某些情況中的多肽和多核苷酸為至少90%純，至少95°/。純，至少98%純，或至少99%純。術(shù)語"多肽"指氨基酸聚合物，不考慮聚合物的長度；因此，"肽，，、"寡肽"和"蛋白質(zhì)"涵蓋在多肽的定義中，在本文中可互換使用。盡管作為具體實施方案可能包括或排除這些多肽的化學(xué)或表達(dá)后修飾，但此術(shù)語并不指定或排除本發(fā)明多肽的化學(xué)或表達(dá)后修飾。因此，例如，術(shù)語多肽清楚地涵蓋對多肽的修飾，包括共價附著糖基、乙?；⒘姿峄?、脂基等。此外，具有這些修飾的多肽可能^皮指定為個別種類，包括在本發(fā)明中或排除在其外。天然或其它化學(xué)修飾，如上述例子中所列舉的那些，可發(fā)生在多肽的任何地方，包括肽骨架、氨基酸側(cè)鏈和氨基端或羧基端。應(yīng)意識到相同類型的修飾可在給定多肽的數(shù)個位點以同樣或變化的程度出現(xiàn)。同樣，給定多肽可包含多種類型的修飾。多肽可以分枝，例如由于泛素化作用分枝；多肽可為環(huán)狀，有分枝或沒有分枝。修飾包括乙?；Ⅴ；?、ADP-核糖基化、酰胺化、共價附著黃素、共價附著血紅素部分、共價附著核苷酸或核苷酸衍生物、共價附著脂或脂衍生物、共價附著磷脂酰肌醇、交聯(lián)、環(huán)化、形成二硫鍵、去甲基化、形成共價交聯(lián)、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲?；?、"羧化作用、糖基化、形成糖基化磷脂酰肌醇錨點(GPIanchor)、羥基化、碘化、曱基化、豆蔻?；⒀趸?、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)的在蛋白質(zhì)上添加氨基酸，如精氨?；头核鼗?。(參見例如，proteins—structureandmolecularproperties,第二版，T.E.Creighton，W.H.FreemanandCompany出版z〉司，紐約(1993);posttranslationaleovalentmodificationofproteins,b.c.Johnson，編，學(xué)術(shù)出版社，紐約，第1-12頁，1983;Seifter等人，MethEnzymol182:626-646，19卯；Rattan等人，AnnNYAcadSci663:48-62,1992)。涵蓋在該定義中的還有包含氨基酸的一種或多種類似物的多肽(包括例如，非天然存在的氨基酸、僅在不相關(guān)的生物系統(tǒng)中天然存在的氨基酸、來自哺乳動物系統(tǒng)的修飾的氨基酸等)，具有取代的連接的多肽，以及具有其它本領(lǐng)域已知的、天然存在和非天然存在的修飾的多肽。術(shù)語"多肽"還可與術(shù)語"蛋白"或"肽"交換使用。術(shù)語"肽"指兩個或多個氨基酸的任意聚合物，其中各氨基酸通過相鄰氨基酸的NHz和COOH基團(tuán)之間形成的肽鍵(--CONH—)與一個或兩個另外的氛基酸連接。優(yōu)選氨基酸為天然存在的氨基酸，特別是L-對映體形式的a-氨基酸。但是，肽中可包括其它氨基酸、對映體形式和M酸衍生物。肽包括"多肽，，，其在水解時產(chǎn)生多于兩個氨基酸。多肽可包括蛋白質(zhì)，其通常包含50個或更多氨基酸。術(shù)語"分離的"指將物質(zhì)從其原始或自然環(huán)境(例如天然環(huán)境，如果其為天然存在的)中取出。因此，活體動物中具有的天然存在的多肽不是分離的，但同一多肽通itA為干預(yù)與天然系統(tǒng)的一些或所有共存物質(zhì)分開后，則是分離的。多肽可以是組合物的一部分，而仍是分離的，因為這樣的載體或組合物不是其在自然中所存在的環(huán)境的一部分。相似地，術(shù)語"基本上純的"指通過人為干預(yù)，從其天然存在的當(dāng)前化學(xué)環(huán)境中分離或取出的物質(zhì)?；旧匣亩嚯目赏ㄟ^本領(lǐng)域眾所周知的許多技術(shù)和方法中的任意技術(shù)和方法獲得或制備。術(shù)語"純化"指增加樣品中特定多肽的比活或濃度。在一個實施方案中，比活表達(dá)為樣品中靶多肽的活性與總多肽濃度的比值。在另一實施方案中，比活表達(dá)為靶多肽的濃度與總多肽濃度的比值。純化方法包括但不限于透析、離心和柱層析技術(shù)，為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法。參見例如，Young等人，1997，"Productionofbiopharmaceuticalproteinsinthemilkoftransgenicdairyanimals,"BioPharm10(6):34-38。"與…締合，，如本文中所描述的那樣，當(dāng)兩個實體彼此"締合，，時，它們通過直接或間接的共價或非共價相互作用連接。優(yōu)選締合是共價的。期望的非共^介相互作用包括氫鍵、范德瓦耳斯相互作用、疏7jc相互作用、靜電相互作用等。術(shù)語"分離的"指將物質(zhì)從其原始或自然環(huán)境(例如天然環(huán)境，如果其為天然存在的)中取出。因此，活體動物中具有的天然存在的多核苷酸或多肽不是分離的，但同一多核苷酸或多肽通過人為干預(yù)與天然系統(tǒng)的一些或所有共存物質(zhì)分開后，則是分離的。例如，"分離的核酸片斷"是RNA或DNA的單鏈或雙鏈聚合物，任選地包含合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的分離的核酸片斷可包含cDNA、基因組DNA或合成DNA的一個或多個區(qū)段，并與糖、脂、蛋白質(zhì)或其它物質(zhì)相結(jié)合。這樣的多核苷酸可為載體的一部分和/或這樣的多核香酸或多肽可以是組合物的一部分，而仍是分離的，因為這樣的載體或組合物不是其在自然中所存在的環(huán)境的一部分。相似地，術(shù)語"基本上純的"指通過人為干預(yù)，從其天然存在的當(dāng)前化學(xué)環(huán)境中分離或取出的物質(zhì)?；旧霞兊亩嚯目赏ㄟ^本領(lǐng)域眾所周知的許多:R術(shù)和方法中的任意^^支術(shù)和方法獲得或制備。術(shù)語"基本上純的，，和"分離的，，并不旨在排除多肽與這樣的物質(zhì)的混合物，所述物質(zhì)在自然中不與所述多^目伴。哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生的外來蛋白質(zhì)的表達(dá)和回收的一般方法在例如Etcheverry，"ExpressionofEngineeredProteinsinMammalianCellCulture"，ProteinEngineering:PrinciplesandPractice,Cleland等人(編)，163頁(Wiley-Liss出版公司，1996)中提供?；厥沼杉?xì)菌系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在例如Grisshammer等人，"Purificationofover-producedproteinsfromE.colicells",DNACloning2:ExpressionSystems,第二版，Glover等人(編)，59-92頁(牛津大學(xué)出版社1995)中提供。轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞和從中生產(chǎn)外來多肽的方法在Guarino等人，US5162222和WIPO公開號WO94/06463中7>開。從桿狀病毒系統(tǒng)中分離重組蛋白的方法還在Richardson(編)，"BaculovirusExpressionProtocols"(Humana出版社，1995)中有所描述。在一個實施方案中，本發(fā)明的多肽可用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)(見Luckow等人，Bio/Technology,1988，6，47，"BaculovirusExpressionVectors:aLaboratoryManual"，O，Rielly等人(編)，W.H.FreemanandCompany出版^>司，紐約，1992，US4，879，236，其全部內(nèi)容在此通過引用并入本文)。另外，MAXBACTM完整桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(英駿公司，Invitrogen)可用于例如在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)多肽。根據(jù)本發(fā)明多種實施方案的多肽還可通過利用其特定性質(zhì)進(jìn)行分離。例如，固定化金屬離子吸附層析法(IMAC)可用于純化富含組氨酸的蛋白質(zhì)，包括含有多聚組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。簡短地說，首先用二價金屬離子使凝膠帶電，以形成螯合物(Sulkowski,TrendsinBiochem.3:l(1985))。取決于所使用的金屬離子，富含組氨酸的蛋白質(zhì)會以不同的親和力吸附到基質(zhì)上，通過竟?fàn)幭疵?、降低pH或使用強(qiáng)螯合劑洗脫。其它純化方法包括用凝集素親和層析法和離子交換層析法純化糖基化蛋白(M.Deutscher，(編)，Meth.Enzymol.182:529(1990))。在本發(fā)明另外的實施方案中，可構(gòu)建目的多肽和親和標(biāo)簽(例如麥芽糖結(jié)合蛋白、免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域)的融合物以促進(jìn)純化。術(shù)語"體外，，指人工環(huán)境和發(fā)生在人工環(huán)境中的反應(yīng)或過程。體外環(huán)境包括但不限于試管和細(xì)胞培養(yǎng)物。術(shù)語"體內(nèi)"指天然環(huán)境(例如，動物或細(xì)胞)和發(fā)生在天然環(huán)境中的反應(yīng)或過程。術(shù)語"表型"指細(xì)胞或生物的可見特征。這樣的可見特征可包括物理外觀、和細(xì)胞或生物中特定生理組合物存在的水平。術(shù)語"信號傳導(dǎo)途徑"指將胞外信號通過細(xì)胞膜傳^"成為胞內(nèi)信號的分子。然后此信號能刺激細(xì)胞應(yīng)答。參與信號傳導(dǎo)過程的多肽分子可為受體和非受體蛋白酪氨酸激酶。"受體"指細(xì)胞內(nèi)或在細(xì)胞表面的分子結(jié)構(gòu)，其特征通常為能與特定物質(zhì)選擇性結(jié)合。術(shù)語"化合物"或"藥劑"在本文中可互換使用，指化合物或物質(zhì)的組合物，當(dāng)向受試者(人或動物)給藥時，其通過局部和/或全身作用誘導(dǎo)期望的藥理和/或生理效果。術(shù)語"受試者"指任何哺乳動物，包括人或非人受試者。非人受試者可包括實驗動物、測試動物、農(nóng)業(yè)動物、表演動物和寵物。受試者可為人。受試者可為家養(yǎng)動物，如狗、貓、母牛、山羊、綿羊、豬等，受試者可為實驗動物，如小鼠、大鼠、兔、猴子等。本文所使用的術(shù)語"小分子"用于指分子量相對低的分子，無論是天然存在或人工制造的(例如通過化學(xué)合成)。在許多實施方案中，小分子為單體，分子量少于約1500g/mo1。優(yōu)選小分子有生物活性，在動物、優(yōu)選哺乳動物、更優(yōu)選人中產(chǎn)生局部或全身效果。在某些優(yōu)選實施方案中，小分子為藥物。優(yōu)選但非必要地，藥物已經(jīng)過適當(dāng)?shù)恼块T或機(jī)構(gòu)認(rèn)定其使用為安全有效。例如，美國食品和藥物管理局(FDA)在美國聯(lián)邦法規(guī)(C.F.R.)21條第330.5,331到361，和440到460部分列出的人用藥物;美國食品和藥物管理局(FDA)在美國聯(lián)邦法規(guī)(C.F.R.)21條第500到589部分列出的獸醫(yī)用藥物，通過引用并入本文，依據(jù)本發(fā)明均認(rèn)為可以使用。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明為包含肽衍生的層析樹脂的層析介質(zhì)，其中肽與TGF-(3超家族成員的蛋白質(zhì)的一部分至少75%同源。該成員可為TGF-卩、生長分化因子(GDF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、激活素或抑制素。肽可為基本上完整的蛋白質(zhì)分子。肽可與該成員的指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少75。/。，至少80%，至少85%，至少卯％,或至少95%同源。另一方面，本發(fā)明為純化包含生長因子的樣品的方法，其中生長因子為TGF-p超家族成員。所述方法包括提供包含肽f;t生的層析樹脂的層析柱，其中肽與TGF-卩超家族成員的蛋白質(zhì)的一部分至少75%同源，在生長因子傾向于聚集的條件下在柱中上樣樣品，在生長因子傾向于溶解的條件下從柱上洗脫生長因子。其中肽不需要為生長因子的一部分。另一方面，本發(fā)明為包含肽衍生的層析樹脂的層析介質(zhì)，其中肽與TGF-p超家族成員的指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少75%同源。另一方面，本發(fā)明為處于溶劑中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶液，包含預(yù)定濃度的預(yù)定骨形態(tài)發(fā)生蛋白和預(yù)定濃度的肽，其中肽與TGF-p超家族成員的指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少75%同源。所述TGF-p超家族的成員可以、但不需要是所述預(yù)定骨形態(tài)發(fā)生蛋白。另一方面，本發(fā)明為穩(wěn)定骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶液的方法。所述方法包括在骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶液中加入預(yù)定濃度的肽，其中肽與TGF-P超家族成員的指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少75%同源。另一方面，本發(fā)明為組合物，包括與TGF-p超家族成員的指狀結(jié)構(gòu)-l肽的一部分至少75。/。同源的肽骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶液和載體。載體可為凝膠、聚合物、脫礦骨、縫線、外科用網(wǎng)片、陶瓷、膠束、或上述物質(zhì)的任意組合。例如，載體可包括緩沖液、膠原、膠原海綿、或基于纖維素的物質(zhì)。載體可選地或可另外包括一種或多種烷基纖維素(包括羥基烷基纖維素)，包括曱基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素和羧甲基纖維素。在一些實施方案中，栽體可包括聚葡糖酸酯(polyglyconate)、透明質(zhì)酸、聚乳酸、聚乙二醇、海藻酸鈉、聚乙二醇、聚氧乙烯氧化物(polyoxyethyleneoxide)、聚羧乙烯和聚乙烯醇。肽可由以下的一種或多種物質(zhì)穩(wěn)定綴合的聚丙二醇、綴合的唾液酸基、綴合的多聚唾液酸鏈、摻入修飾的氨基酸、摻入非天然M酸、鏈間共價鍵、鏈內(nèi)共價鍵、鏈間非共價鍵、鏈內(nèi)非共價鍵、和提呈增強(qiáng)子(presentationenhancer)。另一方面，本發(fā)明為測定方法，包括將細(xì)胞群與肽相接觸，其中肽與TGF-P超家族成員的指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少75%同源，檢測肽存在與不存在的情況下相比時細(xì)胞特征的改變。所述特征可以選自細(xì)胞周期中的階段、基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)、可見的或可測量的表型特征、基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、來自受體的信號傳導(dǎo)。所述方法還可以包括將細(xì)胞與TGF-j3超家族成員的蛋白質(zhì)相接觸?？梢韵拗齐臑樘囟?gòu)型。另一方面，本發(fā)明為測定方法，包括將受體群與已知量的肽相接觸，其中肽與TGF-P超家族成員指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少75%同源，檢測不與受體結(jié)合的肽量的改變。受體可以與TGF-P超家族成員的蛋白質(zhì)相接觸。另一方面，本發(fā)明為組合物，包含與TGF-p超家族成員的指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少75%同源的肽，和就從動物體內(nèi)排除而言增加肽體內(nèi)穩(wěn)定性的藥劑。另一方面，本發(fā)明為測定方法，包括將受體群與已知量的肽和小分子相接觸，其中肽與TGF-p超家族成員指狀結(jié)構(gòu)-l肽的一部分至少75%同源，檢測當(dāng)小分子存在與不存在的情況下相比時，不與受體結(jié)合的肽量的改變。附圖簡述本發(fā)明參照若干附圖進(jìn)行說明，其中，圖1BMP-2的示意圖，顯示指狀結(jié)構(gòu)區(qū)、多個螺旋和P-折疊(改自Scheufler，等人，J.Mol.Bio.(1999),287:103-115)。圖2才艮據(jù)本發(fā)明例示性實施方案的親和層析法示意圖。圖3層析鐠(A)和SEC膠的照片(B)，顯示從^f吏用固定化BMP-12的柱中洗脫BMP-3。圖4層析鐠(A)和SEC膠的照片(B),顯示從使用固定化BMP-2的柱中洗脫腿P-3。圖5層析i昝(A)和SEC膠的照片(B)，顯示從使用固定化BMP-12的柱中洗脫BMP-12。圖6層析鐠(A)和SEC膠的照片(B)，顯示從使用固定化BMP-2的柱中洗脫BMP-12。圖7—組SEC膠的照片(A:非還原，B:還原)，顯示從使用固定化BMP的反相高效液相層析HPLC柱中洗脫多種BMP。圖8層析鐠(A)和SEC膠的照片(B)，顯示從使用固定化BMP-2突變體片斷的柱中洗脫BMP-3。圖9層析譜(A)和SEC膠的照片(B)，顯示從使用固定化BMP-12野生型片斷的柱中洗脫BMP-3。圖10層析傳(A)和SEC膠的照片(B)，顯示從使用固定化BMP-2突變體片斷的柱中洗脫BMP-12。圖11層析鐠(A)和SEC膠的照片(B)，顯示從使用固定化BMP-2突變體片斷的柱中洗脫BMP-12。圖12層析鐠(A)和SEC膠的照片(B)，顯示從使用固定化BMP-2突變體片斷的柱中洗脫GDF-9。圖13顯示對于處于50mMTris，pH8中的不同濃度NaCl和2-曱基-2,4-戊二醇而言，0.5mg/mLBMP-12溶液的濁度。圖M在多種條件下從綴合BMP-指狀結(jié)構(gòu)肽、上樣BMP-12的樹脂中洗脫的洗脫液的SEC膠照片。某些優(yōu)選實施方案的詳細(xì)說明在某些實施方案中，使用BMP的第一指狀結(jié)構(gòu)肽的一部分進(jìn)行親和層析。TGF-p超家族成員的典型二級結(jié)構(gòu)是兩個反平行的p-折疊被4轉(zhuǎn)角a-螺旋隔開，ot-螺旋與J3-折疊中的鏈近乎垂直。兩個P-折疊中的第二個具有扭曲的交叉構(gòu)象。此結(jié)構(gòu)通常由半胱氨酸結(jié)穩(wěn)定，半胱氨酸結(jié)由多對形成鏈內(nèi)二硫鍵的半胱氨酸殘基形成。TGF-J5超家族的一些成員通過形成二聚體或更高級別的多聚物進(jìn)一步得到穩(wěn)定。圖1顯示例示性BMP即BMP-2中的指狀結(jié)構(gòu)區(qū)和多個螺旋和P-折疊。對于TGF-J3超家族的許多成員，p-折疊可細(xì)分為9條(3鏈。BMP-2的其它特征，如a-2螺旋和p5a鏈，并不是在TGF-P超家族的所有成員中都能找到的，有些成員可能顯示在BMP-2中沒有的額外螺旋和(5-鏈(Scheufler等人，/Afo/.祝汰(1999)，287:103-115)。TGF-p超家族的例示性成員包括4旦不限于BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8A、BMP8B/OP2、BMP9/GDF2、BMPIO、BMP11/GDF11、BMP12/GDF7、BMP13/GDF6、BMP15、BMP16/nodal、BMP17/LeftyB、BMP18/Lefty2/TGF|54、a抑制素、抑制素(3A、抑制素卩B、抑制素PC、抑制素J3E/BMP14/GDF12、TGF卩l(xiāng)、TGF卩2、TGF[33、GDF1、GDF3/Vgr-2、GDF5、GDF8、GDF9、GDF10/BMP3B、GDF15、artemin、GDNF(膠質(zhì)細(xì)胞4汙生的神經(jīng)營養(yǎng)因子)、米勒管抑制物質(zhì)、neuturin和persephin。盡管下文討論的焦點是BMP,但本文的教導(dǎo)可應(yīng)用于任何TGF-p超家族的成員。BMP在生理pH傾向于聚集和沉淀(Ruppert等人，五wr/5/oc/^附.1996，237(1):295-302)。在一些實施方案中，利用此傾向，將整個BMP或從其第一指狀結(jié)構(gòu)域衍生而來的指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物作為配體，與瓊脂糖珠子相連接來制備親和層析樹脂。^浙圖2圖解說明了根據(jù)本發(fā)明某些實施方案的親和純化的原則。BMP或指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物固定在層析介質(zhì)上。例示性介質(zhì)包括瓊脂糖(例如，SepharOSeTM)、聚苯乙烯、硅膠、右旋糖酐和丙烯酰胺。然后根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)將介質(zhì)灌入柱中。在利于BMP沉淀的條件下，向柱中上樣含有BMP的溶液。在一個實施方案中，BMP上樣至用CHO-條件介質(zhì)制備的柱，CHO-條件介質(zhì)包含例如100ng/ml疏酸葡聚糖或肝素，處于生理pH。在一些實施方案中，溶液還可包含1.2MNaCl。其它雜質(zhì)可從柱上洗脫，而BMP保持聚集在柱上。然后在促進(jìn)溶解的條件下將BMP從柱上洗脫。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到對于固定化指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物和被純化物質(zhì)的多種組合而言，可以優(yōu)化上樣溶劑的離子強(qiáng)度和pH。在一些實施方案中，可使用添加劑優(yōu)化被純化物質(zhì)的溶解性或不溶解性。例如，在細(xì)胞表達(dá)和分泌BMP時，可在培養(yǎng)基中加入石克酸葡聚糖或肝素以促進(jìn)溶解。在層析柱上樣之前，可將條件介質(zhì)調(diào)整為高離子強(qiáng)度以促進(jìn)層析過程中有效的捕獲和聚集。例示性BMP增溶劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，包括但不限于乙酸、三氟乙酸、鹽酸、醇、乙腈、丙二醇、甘油、吐溫-80、CHAPS(3-((3-膽酰胺基丙基)二甲氨基)-l-丙磺酸)、L-精氨酸、6M尿素和6M鹽酸胍。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到這些溶劑對于增溶BMP的強(qiáng)度不同。在某些實施方案中，用500mM精氨酸溶液或50mM乙酸洗脫BMP。例示性BMP沉淀劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，包括但不限于pH高于約5的溶劑，鹽溶液包括例如氯化鈉、磷酸鹽、銨和鈉的硫酸鹽、和檸檬酸鹽。促進(jìn)沉淀的氯化鈉的濃度取決于溶液的pH。一些TGF-J3蛋白會在高鹽濃度低pH或相反條件的溶液中沉淀。本領(lǐng)域技術(shù)人員會知道對于特定蛋白質(zhì)，如何優(yōu)化鹽濃度和pH以得到期望的沉淀特點。BMP指狀結(jié)構(gòu)肽的片斷可以代替完整的指狀結(jié)構(gòu)區(qū)使用。用于層析或下文描述的用途的具體序列可具有至少8，至少16，或至少24個氨基酸殘基。所述序列可與天然蛋白質(zhì)的相應(yīng)區(qū)域至少75%,至少80%,至少85%，至少卯％，或至少95%同源。在一些實施方案中，可用絲氨酸殘基代替天然序列中的半胱氨酸殘基形成突變體。這能夠降低瓊脂糖珠子上的肽鏈之間的交聯(lián)，交聯(lián)可能會干擾BMP聚集體的成核作用。還可以修飾肽序列以改善肽對基質(zhì)的附著。例如，賴氨酸封端的肽通過形成酰胺鍵會容易地附著到層析珠子上。如果期望肽的天然序列不是賴氨酸封端的，可通過修飾加上賴氨酸殘基。可選地或另外地，可以酰胺化肽的N端，而乙?；疌端，以確保只有肽的一個末端會附著到基質(zhì)珠子上。在可選的實施方案中，可在肽和基質(zhì)珠子之間插入間隔物。間隔物為肽提供額外的構(gòu)象靈活性，使其能更自由地形成對于肽聚集體成核最優(yōu)化的二級結(jié)構(gòu)。間隔物可為簡單的有機(jī)鏈或可為非結(jié)合的氨基酸序列。序列可為一種或兩種M酸的寡聚物，或可以與TGFp超家族成員蛋白質(zhì)或一些其23它蛋白質(zhì)的非結(jié)合部分顯示至少部分同源性。可選地或另外地，間隔物可具有與TGFJ3超家族成員蛋白質(zhì)的一部分顯示部分同源性的部分、和不顯示同源性的部分。在一些實施方案中，取決于游離端是C端或N端，結(jié)合肽的功效可以有所不同。如本文所描述的或根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法，還可缺失、修飾或替換個別氨基酸。5Tkf尸溶濕《I;C浙在一些實施方案中，指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物可用于穩(wěn)定處于多種可藥用載體中的BMP溶液。在一些實施方案中，將BMP溶于含有特定濃度指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物的溶液。在一些實施方案中，濃度的比例為1:1，但可大于或小于此比例。不受任何特定理論束縳，i/v為指狀結(jié)構(gòu)-l肽類似物會與蛋白的第一指狀結(jié)構(gòu)區(qū)相竟?fàn)?，防止單體或二聚體BMP的多聚化。因此，可能期望肽濃度高于蛋白質(zhì)濃度，例如2:1、5:1、10:1、20:1、或30:1。在一些實施方案中，待遞送的蛋白質(zhì)濃度范圍為約0.01到約4mg每cc或ml載體，例如約0.05mg/cc到約1.5mg/cc。BMP的例示性載體包括下文所討論的用于治療組合物的物質(zhì)、水凝膠形成物質(zhì)、以及其它聚合物和載體，如美國專利號6,620,406中所公開的，其內(nèi)容通過引用并入本文?？k法在另一實施方案中，指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物用于生物測定法。例如，指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物可以與BMP受體相互作用，_秀導(dǎo)BMP相關(guān)的生物應(yīng)答，例如信號傳導(dǎo)。測定法還可測定諸如細(xì)胞周期的改變、特定基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)、可見或可測量的表型改變、蛋白質(zhì)水平或修飾狀態(tài)的改變或其它細(xì)胞特征等應(yīng)答。此應(yīng)答可使用商業(yè)途徑可得的測定法或篩選試驗試劑盒測量。可使用指狀結(jié)構(gòu)-l肽類似物測試特定細(xì)胞，以簡單測定細(xì)胞是否響應(yīng)BMP，或識別細(xì)胞對其更敏感或更不敏感的特定BMP。例如，可通過代謝活動的改變例如，通過特定蛋白質(zhì)、多核苷酸、代謝物或其它細(xì)胞成分生產(chǎn)的增加或減少，來識別響應(yīng)指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物的細(xì)胞。在另外的實施方案中，用指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物作為BMP竟?fàn)巹?。在此實施方案中，指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物和完整的BMP蛋白竟?fàn)幣c細(xì)胞受體的結(jié)合。例如，可測定癌細(xì)胞、細(xì)菌和疾病相關(guān)的其它細(xì)胞中特定BMP受體或其它受體的存在，所述受體與指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物的結(jié)合抑制細(xì)胞的特定功能?？蛇x地或另外地，可用分離的受體而不是細(xì)胞實施測定法。在一些實施方案中，可以用使用已知受體的高通量篩選方法測定受體-肽相互作用。第一指狀結(jié)構(gòu)肽類似物可用作BMP激動劑的例示性實施方案包括但不限于BMP-2第一指狀結(jié)構(gòu)肽類似物用于治療骨質(zhì)疏松癥、骨折的修復(fù)或再生和軟骨再生，BMP-12第一指狀結(jié)構(gòu)肽類似物用于肌腱修復(fù)，BMP-9第一指狀結(jié)構(gòu)肽類似物用于誘導(dǎo)膽堿能神經(jīng)元分化，以及GDF-19第一指狀結(jié)構(gòu)肽類似物用于治療心力衰竭。第一指狀結(jié)構(gòu)肽類似物可用作BMP拮抗劑的例示性實施方案包括但不限于BMP3的第一指狀結(jié)構(gòu)肽類似物用于治療骨質(zhì)疏;^癥、骨折和骨骼疾病，BMP15和GDF9用于避孕，GDF3用于治療II類糖尿病、肥胖和代謝綜合征，BMP4用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)或周圍神經(jīng)組織的修復(fù)或再生，TGF-p用于治療多種癌癥和腫瘤，或GDF8用于治療肌營養(yǎng)不良癥、少肌癥、虛弱或神經(jīng)障礙。在此實施方案中，第一指狀結(jié)構(gòu)肽片斷與完整蛋白質(zhì)竟?fàn)幗Y(jié)合受體，但隨后阻止細(xì)胞或組織的應(yīng)答，而完整蛋白則會促進(jìn)應(yīng)答。肽結(jié)合可以用放射性受體測定法更直接地測量或測定，其中樣品中的標(biāo)記的肽和未標(biāo)記的BMP竟?fàn)幣c特定細(xì)胞或受體的結(jié)合，或以相反形式進(jìn)行?？梢杂?25I、35S、"P或其它適合的放射性同位素進(jìn)行標(biāo)記。當(dāng)指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物的結(jié)合增加時，則降低能夠結(jié)合的BMP的量。而后將受體-BMP復(fù)合物從游離配體中分離出來，例如通過洗滌(在粘附細(xì)胞系的情況下)，速濾或離心(在粘附細(xì)胞系或受體與固相支持物結(jié)合的情況下)，或用抗體、聚乙二醇或其它沉淀劑沉淀受體-配體復(fù)合物后過濾或離心(在可溶性受體的情況下)。與由已知濃度的標(biāo)記配體制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，能夠準(zhǔn)確定量樣品中肽或蛋白質(zhì)的濃度。然后通常通過y計數(shù)，并與已知的標(biāo)準(zhǔn)比較，來定量復(fù)合物中標(biāo)記配體的量。這些方法在文獻(xiàn)中有所描述，254吏用的是其它受體(M.Williams,Med.Res.Rev.，11:147-184(1991);M.Higuchi和B.B.Aggarwal,AnalBiochem.，204:53-58(1992);M.J.Cain,R.K.Garlick和P.M.Sweetman，J.Cardiovasc.Pharm.，17:S1S0-S151(1991);各通過引用并入本文)，可容易地改變以適合本系統(tǒng)。定量肽或BMP的其它方法包括4，857，456中描述的放射性免疫測定和EUSA?？蛇x地或另外地，一旦特定指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物得到鑒定，可進(jìn)一步優(yōu)化，通過替換個別氨基酸以穩(wěn)定特定的二級結(jié)構(gòu)、防止形成鏈間半胱氨酸-半胱氨酸連接、或與細(xì)胞受體形成更好匹配?？梢杂糜嬎惴e一莫型或用生物才支術(shù)鑒定這樣的突變。例如，蛋白質(zhì)誘變的例示性方法可在Sambrook等人，分子克隆實驗指南(MolecularCloning:ALaboratoryManual.)，第二版(冷泉港，紐約冷泉港實驗室出版社)(19卯)中找到。在這樣的實施方案中，可期望將肽或優(yōu)化的肽作為BMP;f莫擬物用作治療劑。在其它實施方案中，可以化學(xué)修飾個別氮基酸殘基或肽，例如，通過糖基化或聚乙二醇衍生修飾。在另一實施方案中，指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物直接與完整BMP蛋白相互作用。例如，可通過用指狀結(jié)構(gòu)-l肽類似物阻止蛋白質(zhì)的同二聚化或異二聚化測定BMP蛋白。在此實施方案中，可期望修飾指狀結(jié)構(gòu)-l肽類似物，使其可以被細(xì)胞內(nèi)在化，二聚化通常發(fā)生在此。可選地或另外地，可使用肽正向調(diào)節(jié)BMP蛋白的二聚化。指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物和BMP蛋白的相互作用可以用上述任何技術(shù)測定。另外，可使用蛋白質(zhì)大小的測定法例如，非變性凝膠電泳、質(zhì)譜法或凝膠過濾層析法，來表征指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物的影響。在一些實施方案中，通過防止BMP的正當(dāng)功能，指狀結(jié)構(gòu)-l肽類似物可作為BMP拮抗劑用作治療劑。在另一實施方案中，指狀結(jié)構(gòu)-l肽類似物可用于篩選鑒定正或負(fù)調(diào)節(jié)BMP-BMP或BMP-受體相互作用的物質(zhì)，例如小分子。例示性受體包括但不限于絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，例如，ACVR1/ALK2、ACVR1B/ALK4、ACVR1C/ALK7、ACVR2/ACTRI1、ACVR2B/ACTRIIB、ACVRL1/ALK1、BMPR1緣LK3、BMPR1B/ALK6、BMPR2/T-ALK、TGF卩R1/ALK5和TGF(3R2，和共受體如RGMa、RGMb/DRAGON、RGMc/HFE2、TGF卩R3、Cripto、Cryptic和內(nèi)皮因子。例如，可使用高通量測定法鑒定BMP的小分子抑制劑?？蓪嵤┡c熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)測定法相似的無細(xì)胞測定法，其中的篩選檢測的是對BMP-肽相互作用的破壞。例如，BMP或指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物中的任一可用供體分子修飾，而另一個用受體分子^f，飾。在另一實施方案中，可修-飾指狀結(jié)構(gòu)-l肽類似物以限制其為特定構(gòu)型，從而保持給定的二級結(jié)構(gòu)。例如，用半胱氨酸替換指狀結(jié)構(gòu)-l肽類似物中的特定氨基酸，會形成二硫鍵，穩(wěn)定特定構(gòu)象。可選地或另外地，半胱氨酸可加在指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物的N端和C端末尾，以限制肽或穩(wěn)定特定構(gòu)象。在一些實施方案中，可期望解折疊野生型或突變型指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物，再令其以另外的構(gòu)型重折疊。例如，指狀結(jié)構(gòu)-l肽類似物可以用離液劑溶解變性。將指狀結(jié)構(gòu)-l肽類似物從離液劑中分離，使其能夠以熱力學(xué)有利的構(gòu)型重折疊。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的一級氨基^列中有半胱氨酸殘基時，可期望在允許正確形成二石危鍵的環(huán)境中完成重折疊(例如，氧化還原系統(tǒng))。Kohno，Meth.Enzym.，185:187-195(19卯)中公開了重折疊的一般方法。還可使用伴侶蛋白介導(dǎo)折疊。鑒定為具有治療潛力的指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物可以用緩沖溶液的形式施用于組織。例示性緩沖溶液為這樣的組合物，除了肽還包括約1.0到約10.0%(w/v)甘氨酸，約0.1到約5.0。/。(w/v)糖例如蔗糖，約l到約20mM谷氨酸鹽酸鹽，和任選的約0.01到約0.1%非離子型表面活性劑，如聚山梨醇酯80或吐溫。例示性溶液為約1%到約20%w/v纖維質(zhì)載體/緩沖液。如果期望的話可加入鹽。更多粘性材料也可用作載體。這樣的材料可包括具有粘性和極性的可藥用材料，從而當(dāng)其與指狀結(jié)構(gòu)-l肽類似物組合時，形成對于組織位點而言具有適當(dāng)操作特性的組合物。例如，相較于用于骨折部位的材料，可期望在牙周部位使用粘度相對較低(但仍不傾向流動)的材料。在肽中加入載體使得指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物能在疾病或病變部位停留足夠長的時間，令指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物能通過上調(diào)或下調(diào)多種代謝活動而對局部細(xì)胞起作用。載體還可使得指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物能在一定時間間隔后從病變、缺陷或疾病部位釋放。用于肽的給藥的例示性載體家族為多孔顆粒聚合物，在美國專利號5,171,579中有詳細(xì)說明，其全部內(nèi)容通過引用并入本文?？捎糜诒景l(fā)明的可選載體為成骨蛋白、多孔顆粒聚合物和另一多價螯合劑或載體物質(zhì)如纖維質(zhì)材料的制劑?？捎米鬏d體或多價螯合劑的其它材料包括羧甲基纖維素、透明質(zhì)酸、海藻酸鈉、聚乙二醇、聚氧乙烯氧化物(polyoxyethyleneoxide)、聚羧乙烯和聚乙烯醇。這些組合物在公布的PCT申請WO93/00050中有所說明，其全部內(nèi)容在此通過引用并入本文。多價螯合劑存在的濃度可為約1到約10%(w/v植入物)。當(dāng)使用多孔顆粒聚合物作為載體時，多孔顆粒聚合物/纖維質(zhì)多價螯合劑可任選地進(jìn)一步與作為稀釋劑的水性甘油組合，例如甘油濃度約10到約80%(v/v)，多價螯合劑/液體溶液:多孔微粒聚合物的例示性比例為約0.1到約0.9(v/v)。另一例示性載體家族;U^原物質(zhì)。適合的膠原物質(zhì)包括Collastat和HelistatTM膠原海綿(IntegraLifeSciences公司，平原市(Plainsboro)，新澤西州)。適合用于本發(fā)明的其它膠原物質(zhì)在美國專利號5,206,028;美國專利號5,024,841;美國專利號5,256,418中有所說明。膠原載體可為海綿形式?？赏ㄟ^在期望體積和濃度的肽中將海綿浸泡適當(dāng)時間，在給藥前將膠原海綿負(fù)載上肽。月交原海綿可以約10%到約150%v/v[ml蛋白質(zhì)/cc干海綿的范圍浸濕負(fù)載上肽，例如約10到約60%v/v?？蛇x地，肽可在生產(chǎn)過程中吸附到膠原海綿中。這種情況下，可在生產(chǎn)過程中將肽加入膠原海綿，凍干以形成整體產(chǎn)品。加入肽的比例可為約IO到約150%v/v，例如約60到約80%v/v的范圍。另一例示性載體家族為基于纖維素的物質(zhì)，如烷基纖維素(包括羥基烷28基纖維素)，包括甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素和羧甲基纖維素，例如羧甲基纖維素(CMC)的陽離子鹽。可改變這些物質(zhì)和本文說明的任何其它聚合物載體的交聯(lián)和分子量，以調(diào)整包封肽的遞送速率并在體內(nèi)穩(wěn)定肽。在纖維質(zhì)載體的情況下，載體可為水合的纖維質(zhì)粘性凝膠形式。纖維質(zhì)物質(zhì)的粘度可通過機(jī)械方法增加，如高速攪拌一段適當(dāng)時間，而后高壓滅菌。肽和纖維質(zhì)載體可處于適當(dāng)緩沖液的溶液中。例示性緩沖液為這樣的組合物，包含約1.0到約10.0%(w/v)甘氨酸，約0.1到約5.0%(w/v)糖，優(yōu)選蔗糖，約1到約20mM谷氨酸鹽酸鹽，任選約0.01到約0.1%非離子型表面活性劑如聚山梨醇酯80。例示性溶液為約1%到約20%w/v纖維質(zhì)載體/緩沖液。如果期望，可加入鹽。與粘性凝膠載體組合的肽的量可在約0.05到約1.5mg的范圍，例如約0.1到約1.0mg/cm3需要的檔人物質(zhì)。根據(jù)多種實施方案，可以適合用作指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物載體的其它物質(zhì)包括但不限于脫礦骨、聚葡糖酸酯、透明質(zhì)酸、外科用網(wǎng)片或縫線、溫度敏感的聚合物、礦物質(zhì)和陶瓷，如磷酸釣類、羥基磷灰石等，以及這些物質(zhì)的組合。其它可能的載體包括用于可注射的BMP制劑的載體。適合可注射制劑的載體包括例如，可溶性膠原、透明質(zhì)酸、聚乳^/聚乙二醇和聚合物。用于此實施方案中的指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物可以只是與載體和完整蛋白質(zhì)組合，或可以固定在載體上。例如，可以用標(biāo)準(zhǔn)聚合物化學(xué)技術(shù)將胺封端的肽附著到羧化的載體上。在另一例子中，肽可以為氛基-NHS封端，附著到胺化的聚合物上?？蛇x地或另外地，肽可為生物素化的，與已用抗生蛋白鏈菌素功能化的載體配位。指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物可選的載體包括膠束。例如，可用Gref等人，S"'ew"，1994，263:1600-1603描述的雙乳化法將治療組合物包封在膠束中，隨后可用本文描述的任何技術(shù)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它遞送技術(shù)對受試者施用。在一些實施方案中，膠束表面可包括靶向劑。靶向劑可共價附著在膠束上，或可通過配體-受體相互作用(例如，生物素-抗生蛋白鏈菌素)或靜電相互作用保留在膠束上。例示性靶向劑包括抗體和抗體片斷、核酸配體(例如適體)、寡核苷酸、寡肽、多糖、低密度脂蛋白(LDL)、葉酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、脫唾液酸糖蛋白、人免疫缺陷病毒(HIV)的gpl20包膜蛋白、糖類、多糖、酶受體配體、唾液酸、糖蛋白、脂、小分子、生物活性劑、生物分子、免疫反應(yīng)片斷如Fab、Fab，或F(ab，)2片斷等?？尚揎椨米髦委焺┑碾模蕴岣唧w內(nèi)穩(wěn)定性、延長循環(huán)時間、降低從身體中排除的速率。例如，肽可用聚烷撐二醇鏈如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)功能化或與其組合。這樣的聚合物鏈的最佳分子量可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)最優(yōu)化?？蛇x地或另外地，肽可以與唾液酸基或多唾液酸鏈綴合。還可以通過用較小的化學(xué)基團(tuán)如甲基、硫酸根等化學(xué)修飾氨基酸殘基來修飾肽。還可以用非天然氨基酸如D-立體異構(gòu)體或j5-殘基替換個別的氨基酸殘基。在一些實施方案中，可用鏈間或鏈內(nèi)共價或非共價鍵穩(wěn)定肽?？梢酝ㄟ^給肽加上適當(dāng)氨基酸殘基，或通過用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)如硫醇、氬鍵供體和受體等修飾肽中的氨基酸，來促進(jìn)這些連接。肽還可與作為提呈增強(qiáng)子的天然或合成蛋白質(zhì)的全長蛋白質(zhì)或片斷締合或融合(例如，在N端或C端或內(nèi)部)。例示性蛋白質(zhì)為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，包括牛血清白蛋白。處于適當(dāng)緩沖液中或與上述那些適當(dāng)載體組合的指狀結(jié)構(gòu)-1肽類似物，可直接應(yīng)用于組織和/或需要組織修復(fù)的位點。例如，可將肽物理施用于組織，通過噴霧或藥浴(dipping)、或用刷子、或其它適當(dāng)涂藥器，如用注射器注射?？蛇x地或另外地，肽可直接施用于需要組織修復(fù)的位點。在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明實施方案治療組合物可直接施用于受試者，或可先依據(jù)任何可用的遞送路徑配制，路徑包括但不限于腸胃夕卜(例如靜脈內(nèi))、真皮內(nèi)、皮下、口服、鼻腔、支氣管、目艮、經(jīng)皮(局部)、經(jīng)粘膜、直腸和陰道。本發(fā)明的藥物組合物可包括由哺乳動物細(xì)胞系表達(dá)的純化的多肽或蛋白質(zhì)、和遞送劑(即上述陽離子聚合物、肽分子運載蛋白、表面活性劑等)，與可藥用栽體組合使用。本文使用的用語"可藥用載體"包括溶劑、*介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等，與藥物施用相容。組合物中也可摻入增補(bǔ)的活性化合物。藥物組合物配制為與其預(yù)期的給藥路徑相容。用于腸胃外、真皮內(nèi)或皮下施用的溶液或懸液可包括下列成分無菌稀釋劑如注射用水、鹽溶液、不揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑如苯甲醇或?qū)αu基苯曱酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氬鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及調(diào)節(jié)張度的藥劑如氯化鈉或右旋糖。可用酸或堿調(diào)節(jié)pH，如鹽酸或氬氧化鈉。腸胃外制劑可包裝在安瓿瓶、一次性注射器、或玻璃或塑料制的多劑量小瓶中。適合可注射用途的藥物組合物通常包括無菌水性溶液(當(dāng)為水溶性時)或分散液和無菌粉劑，用于臨時制備無菌可注射溶液或^:液。對于靜脈內(nèi)給藥，適合的載體包括生理鹽水、抑菌水、聚氧乙烯蓖麻油(Crem叩horELTM，巴斯夫公司(BASF)、帕西波尼市(Parsippany)，新澤西)或褲酸鹽緩沖液(PBS)。在所有情況中，組合物應(yīng)為無菌，且應(yīng)具有易于注射的流動性。例示性藥物制劑在生產(chǎn)和儲存條件下是穩(wěn)定的，并在抗孩i生物如細(xì)菌和真菌污染作用的條件下保存。一般而言，相應(yīng)載體可為溶劑分散介質(zhì)，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、及其適當(dāng)?shù)幕旌衔?。例如通過使用包衣如卵磷脂、在分散的情況下通過保持所需的顆粒大小、以及通過使用表面活性劑，能夠保持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。微生物作用的預(yù)防能通過多種抗菌劑和抗真菌劑實現(xiàn)，例如對羥苯甲酸類、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在許多情況下，期望組合物中包括等滲劑例如糖，多元醇如甘露醇、山梨醇，或氯化鈉。通過在組合物中包含延緩吸收的藥劑例如單硬脂酸鋁和明膠，能延長可注射組合物的吸收。無菌可注射溶液的制備可在適當(dāng)溶劑中摻入所需量的純化多肽或蛋白質(zhì)，依需要加入上列一種或多種成分，然后過濾除菌。通常，M液的制備是在包含基本分散介質(zhì)和所需的其它上列成分的無菌介質(zhì)中，摻入由哺乳動物細(xì)胞系表達(dá)的純化的多肽或蛋白質(zhì)。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉劑的情況中，例示性制備方法為真空干燥和冷凍干燥，由先前經(jīng)過無菌過濾的溶液產(chǎn)生具有活性成分和任何其它期望的成分的粉劑。口服組合物可包括惰性稀釋劑或可食用載體。為口服治療給藥目的，純化的多肽或蛋白質(zhì)可與賦形劑摻在一起，以片劑、錠劑或膠嚢例如明膠膠嚢的形式使用?？诜M合物還可用流質(zhì)載體制備，用作漱口藥?？砂ㄋ幬锵嗳莸恼澈蟿┖?或佐劑物質(zhì)作為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠嚢、錠劑等可包含任何下列成分或性質(zhì)相似的化合物粘合劑如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖；崩解劑如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes;助流劑如二氧化硅膠體；甜味劑如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑如薄荷、水楊酸甲酯或橙p木調(diào)p^K口服遞送的制劑最好可摻入改善其在胃腸道中的穩(wěn)定性和/或增強(qiáng)吸收的藥劑。對于吸入給藥，本發(fā)明的組合物包含由哺乳動物細(xì)胞系表達(dá)的純化的多肽或蛋白質(zhì)和遞送劑，優(yōu)選從壓力容器、或包含適宜推進(jìn)物如氣體如二氧化碳的分配器或噴霧器中以氣霧劑的形式遞送。本發(fā)明考慮用鼻腔噴霧、吸入器、或其它直4妻遞送方式對上呼吸道和/或下呼吸道遞送組合物。鼻腔內(nèi)給藥對抗流感病毒的DNA疫苗已顯示誘導(dǎo)CD8T細(xì)胞應(yīng)答，表明當(dāng)以此路徑遞送時，至少呼吸道中的一些細(xì)胞能夠吸收DNA,本發(fā)明的遞送劑會增強(qiáng)細(xì)胞吸收。根據(jù)本發(fā)明某些實施方案，組合物包含由哺乳動物細(xì)胞系表達(dá)的純化的多肽和遞送劑，配制為大的多孔顆粒用于氣霧劑給藥。使可增強(qiáng)根據(jù)本發(fā)明實施方案組合物經(jīng)上皮的吸收。通過經(jīng)粘膜或經(jīng)皮方法也能夠進(jìn)行全身給藥。對于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮給藥，制劑中使用適于待穿透屏障的穿透劑。這樣的穿透劑通常為本領(lǐng)域已知，例如對于經(jīng)粘膜給藥而言包括去污劑、膽汁鹽和夫西地酸衍生物。經(jīng)粘膜給藥能通過^f吏用鼻腔噴霧或栓劑完成。對于經(jīng)皮給藥，純化的多肽或蛋白質(zhì)和遞送劑如本領(lǐng)域所7〉知的那樣配制成為軟膏劑、油膏劑、凝膠劑或霜劑。對于直腸遞送，還可以用檢劑(例如與常規(guī)栓劑基質(zhì)一起制備，如可可脂和甘油酯)或4果留灌腸劑形式制備組合物。在一個實施方案中，組合物與防止多肽或蛋白質(zhì)從體內(nèi)快速消除的藥32劑組合使用，如控釋制劑，包括植入物和微嚢遞送系統(tǒng)。所述藥劑還可作為組合物的載體。可使用生物可降解、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這樣制劑的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見。材料還可以由商業(yè)途徑購自阿爾扎公司(AlzaCorporation)和諾華制藥有限公司(Novapharmaceuticals,Inc.)。月旨質(zhì)體懸液(包括脂質(zhì)體，以針對病毒抗原的單克隆抗體靼向受感染細(xì)胞)也可以用作可藥用載體。這些可依據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的例如美國專利號4,522,811中描述的方法制備。為方便給藥，做到劑量統(tǒng)一，最好以劑量單位形式配制口服或腸胃外組合物。此處使用的劑量單位形式，指物理上分離的單位，適合待治療受試者的單位劑量；每單位包含經(jīng)計算能產(chǎn)生期望療效的、預(yù)定量的活性多肽或蛋白質(zhì)，以及必需的藥物載體。根據(jù)本發(fā)明實施方案的多肽或蛋白質(zhì)可以按需要以多種間隔延續(xù)不同時期給藥。技術(shù)人員會意識到某些因素能影響有效治療受試者所需的劑量和時機(jī)，包括但不限于疾病或病癥的嚴(yán)重性、先前的治療、受試者的整體健康和/或年齡，以及存在的其它疾病。通常，用本文描述的多肽或蛋白質(zhì)治療受試者可以包括單次治療，或者在許多情況下可以包括系列治療。此外應(yīng)理解適當(dāng)?shù)膭┝靠梢匀Q于多肽或蛋白質(zhì)的效能，可以任選地才艮據(jù)特定接受者進(jìn)行調(diào)整，例如給藥漸增的劑量直到實現(xiàn)預(yù)選的期望反應(yīng)為止。應(yīng)理解特異于任何特定動物受試者的劑量水平可以取決于許多因素，包括所用的具體多肽或蛋白質(zhì)的活性，受試者的年齡、體重、整體健康、性別和飲食，給藥時間，給藥路徑，排泄速率，任何藥物組合，以及表達(dá)或活性待調(diào)節(jié)的程度。本發(fā)明包括本發(fā)明組合物在治療非人動物中的用途。因此，給藥的劑量和方法可以根據(jù)已知的獸醫(yī)藥理學(xué)和醫(yī)學(xué)原理進(jìn)行選擇。指導(dǎo)方針可見〈列:i口Adams，R.(編)，KefenViflfjP/m/TMflo^/ogj;T7renipe",/cs,第8版,愛荷華州立大學(xué)出版社；ISBN:0813817439;2001。本發(fā)明的藥物組合物可以與給藥說明一起裝在容器、包裹或分配器中。實施例以約20mg:4mL的比例將BMP-12固定的在NHS活化的瓊脂糖珠子上，得到的介質(zhì)與水或中性鹽緩沖液組合制備柱。將用1.2MNaCl增強(qiáng)的CHO條件介質(zhì)裝入柱中。在一些情況下，介質(zhì)在裝柱之前就BMP而言進(jìn)行預(yù)濃縮。用15CV(柱體積)處于40mMNa2HP04，pH7.2中的1.2MNaCl洗滌柱，而后用處于20mMTris，pH7.5中的0.5M精氨^/0.5MNaCl(15CV)和低鹽洗劑(50mM乙酸銨pH7，15CV)洗滌。再用5CV梯度達(dá)50mM，pH3的乙酸洗脫柱，而后用15CV追加液洗脫。最后，用5CV的6M鹽酸胍(GuHCl)乙酸溶液洗脫柱。BMP-3被層析介質(zhì)有效捕獲，并被乙酸洗脫(圖3A)。用HPLC分析洗脫液。如圖3B中可見，前肽片斷與成熟蛋白質(zhì)共純化，在胍峰中還見到痕量成熟BMP-3。BMP-2如實施例1中所述固定在瓊脂糖珠子上，用于測試BMP-3的負(fù)載和洗脫。如圖4所示，BMP-3被高離子強(qiáng)度溶液有效捕獲，并被乙酸洗脫。同BMP-12柱一樣，前肽片斷與成熟蛋白質(zhì)共純化，在胍峰中還見到痕量成熟BMP-3。如實施例1中所述上樣BMP-12，從BMP-12親和柱上洗脫。使用高鹽溶液，BMP-12被柱有效捕獲，并被乙酸和胍洗脫(圖5)。BMP-12的單體和二聚體形式均被捕獲。如實施例1和2所述上樣BMP-12,從BMP2親和柱上洗脫。使用高34離子強(qiáng)度溶液，BMP-12被柱有效捕獲，并被乙酸和胍洗脫(圖6)。如實施例1和2所述，用BMP-12和BMP-2制備BMP親和樹脂，用于制備HPLC柱。這些柱用BMP-3和BMP-12負(fù)載投入使用。如圖7所示，對于反相HPLC，BMP-12和BMP-2作為親和配體同等有效。在一些情況下，采用尺寸排阻或反相層析技術(shù)來加強(qiáng)純化?！蹲田椧?mg肽/mL樹脂的比例f」'BMP-2指狀結(jié)構(gòu)1肽的突變體(SDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGEK)與瓊脂糖珠子相連。用4mL得到的樹脂(1.6x2.0cm)制備柱。如實施例1所述用BMP-3負(fù)載柱并洗脫。如圖8所示，使用高鹽溶液，BMP-3被柱有效捕獲，與前肽片斷一起在乙酸中洗脫。一般而言，使用固定化肽比使用完整蛋白質(zhì)的層析法獲得的產(chǎn)物純度更高。如實施例1中所述，用野生型BMP-12指狀結(jié)構(gòu)1肽(KELGWDDWIIAPLDYEAYHCEGLC)純化BMP-3。如圖9所示，使用高鹽溶液，BMP-3被柱有效捕獲，在乙酸中洗脫。洗脫的前肽片斷比實施例6中少。一般而言，固定化的BMP-12不如BMP-2突變體有效。SDS-PAGE顯示了固定化BMP-12肽的寡聚化，這可能是由于游離半胱氨酸殘基的存在而導(dǎo)致。實滋維用實施例6中所述以BMP-2突變體肽制備的柱純化BMP-12。如圖10所示，使用高鹽溶液，BMP-12被柱有效捕獲，在乙酸中洗脫。少量BMP-12在6MGuHCl中洗脫。敘匈9用實施例7所述以BMP-12野生型肽制備的柱純化BMP-12。如圖11所示，使用高離子強(qiáng)度溶液，BMP-12被柱有效捕獲，在乙酸中洗脫。少量BMP-12在6MGuHCl中洗脫。用實施例6所述以BMP-2指狀結(jié)構(gòu)1肽的突變體制備的柱純化GDF-9。如圖12所示，使用高鹽溶液，GDF-9被柱有效捕獲，用500mM精氨酸和乙酸兩者均能洗脫。還存在分子量較低的污染物。-滋辨//-^^^應(yīng),^謬付:^^/,磁辨。用下列肽的一種或多種制備BMP親和樹脂表l:用于制備親和樹脂的例示性肽序列<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>BMP3Mutl:ADIGWSEWIISPKSFDAYYCSGAK溶席j謬逸-使用帝肯自動移液儀(Tecanliquid-handlingrobot)混合試劑主平板，800x1.25濃縮液(對于各溶液而言；見表2和3),各處于50mMTris緩沖液pH8中。用8道移液器從主平板中轉(zhuǎn)移80pL材料至一半面積的UV微孔板中，從各樣品中讀取A32Q以定義空白對照。用重復(fù)移液器(repeat-pipettor)加入20jiL處于0.1%TFA中的2.5mg/mLBMP-12,以得到0.5mg/mL溶液，而后在14000rpm振蕩。讀取UV吸收(A320)，減去空白對照吸收以確定溶解度。用更大濃度范圍的2-曱基-2，4-戊二醇(MPD)和更精細(xì)的鹽濃度集合(表4)重復(fù)此方法。圖13顯示相對于NaCl和MPD濃度而言BMP-12溶液濁度的線圖。表2NaCl,!VIl-丙醇，％02.5510152501.7241.8482.1342.0003.1721.4190.11.7452.1352.2121,9453.1990.1040.251.8042.3972.3002.1051.3920.0220.51.9532.1701.6291.3130.305-0.0010.751.9112.0231.5411.0320.094-0.00311.988l扁1.817l細(xì)0.040-0.0101.251.7021.3761.6431.0180.0330.0221.51.9811.3581.5980.9730.0360.47837表3<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>偶聯(lián)親和樹脂與表5中列出的肽。將偶聯(lián)的樹脂和作為對照的未綴合的樹脂，懸浮在25。/。v/v比的16%乙醇，150mMNaCl，和20mMTris緩沖液pH7.5中(例如，25%乙醇，75。/。Tris緩沖液)。使用帝肯自動移液儀將各漿液的200小份移入96孔聚苯乙烯濾板(0.45jtm親水過濾器，沃特曼公司(Whatman)目錄號770-1806)八行中的一行。在1200g離心3分鐘除去液相，在過濾器上留下50pL濕樹脂。然后用表6中列出的負(fù)載緩沖液平衡樹脂(K為表征在特定緩沖液中蛋白質(zhì)與特定樹脂結(jié)合強(qiáng)度的系數(shù))。在96孔板的260pL各負(fù)載緩沖液中加入40低分子量尺寸排阻層析(LMWSEC)溶液(BEP，在0.1%TFA中透析，濃縮至3.76mg/mL)制備BMP-12負(fù)載板，在每孔中得到0.48mg/mL蛋白質(zhì)。負(fù)載樹脂從負(fù)載板中轉(zhuǎn)移150nL至濾板，然后在搖床上孵育20分鐘以促進(jìn)結(jié)合。離心濾板，將濾液收集在96孔UV板中。濾液或流出液中的蛋白質(zhì)濃度計算為(A，-A32o)/l丄然后150nL100mM乙酸洗滌濾板，再用150pL4M鹽酸胍和50mM乙酸鈉pH4.0洗滌。依上述方法測量新濾液中的蛋白質(zhì)濃度。如表6所示，偶聯(lián)肽747、747、748和749的樹脂在負(fù)載緩沖液1-5中與BMP12以高親和力結(jié)合。但是，對于肽750和751，在25mMMESpH6中結(jié)合強(qiáng)，但在具有0.1MNaCl的50mM乙酸pH3.0中結(jié)合弱，這使得結(jié)合-洗脫過程能有效進(jìn)行，而無需離液劑或有機(jī)試劑。通過凝膠來電泳分析板中第四列的流出液和乙酸洗脫樣品(用MESpH6負(fù)載)(圖")。表5肽名稱ID肽BMP2N-trun1S751Ac-SDVGWNDWIVAPPGYHAFYSHGEKBMP2N-trun1750Ac-SDVGWNQWIVAPPGYHAFYQHGEKBMP12N-trun1S749Ac-ELGWDDWIIAPLDYEAYHSEGLKBMP5748Ac-RDLGW(3DWIIAPEGYAAFYSDGEKBMP2Full747Ac-LYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYSHGEKBMP2C-trunc2746AC"LYV"SDVGWNDWIVKBMP2N-trunc2745Ac隱VAPPGYHAFYSHGEK39表6<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>通過考察本文公開的說明書或本發(fā)明的實施，本發(fā)明的其它實施方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見。應(yīng)認(rèn)為說明書和實施例僅為例示性，本發(fā)明的真正范圍和精神由下文的權(quán)利要求書表明。權(quán)利要求1.層析介質(zhì)，包含肽衍生的層析樹脂，所述肽與TGF-β超家族成員蛋白質(zhì)的一部分至少75％同源。2.權(quán)利要求1所述的層析介質(zhì)，其中所述成員為TGF-P、生長分化因子(GDF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、激活素或抑制素。3.權(quán)利要求l所述的層析介質(zhì)，其中所述肽為基本上完整的蛋白質(zhì)分子。4.權(quán)利要求1所述的層析介質(zhì)，其中肽與所述成員的指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少75%同源。5.權(quán)利要求1所述的層析介質(zhì)，其中肽與所述成員的指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少80%同源。6.權(quán)利要求1所述的層析介質(zhì)，其中肽與所述成員的指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少85%同源。7.權(quán)利要求1所述的層析介質(zhì)，其中肽與所述成員的指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少卯％同源。8.權(quán)利要求1所述的層析介質(zhì)，其中肽與所述成員的指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少95%同源。9.純化包含生長因子的樣品的方法，所述生長因子為TGF-P超家族成員，所述方法包括提供包含肽衍生的層析樹脂的層析柱，所述肽與TGF-P超家族成員蛋白質(zhì)的一部分至少75%同源；在生長因子傾向于聚集的條件下在柱中裝入樣品；和在生長因子傾向于溶解的條件下從柱上洗脫生長因子。10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述肽不是生長因子的一部分。11.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述成員為TGF-p、生長分化因子(GDF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、激活素或抑制素。12.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述肽為基本上完整的蛋白質(zhì)分子。13.權(quán)利要求9所述的方法，其中肽與所述成員的指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少75%同源。14.權(quán)利要求9所述的方法，其中肽與所述成員的指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少80%同源。15.權(quán)利要求9所述的方法，其中肽與所述成員的指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少85%同源。16.權(quán)利要求9所述的方法，其中肽與所述成員的指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少90%同源。17.權(quán)利要求9所述的方法，其中肽與所述成員的指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少95%同源。18.層析介質(zhì)，包含肽衍生的層析樹脂，所述肽與TGF-P超家族成員的指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少75%同源。19.權(quán)利要求18所述的層析介質(zhì)，其中肽與所述部分至少80%同源。20.權(quán)利要求18所述的層析介質(zhì)，其中肽與所述部分至少90%同源。21.權(quán)利要求18所述的層析介質(zhì)，其中肽與所述部分至少95%同源。22.權(quán)利要求18所述的層析介質(zhì)，其中所述成員為TGF-p、生長分化因子(GDF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、激活素或抑制素。23.溶劑中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶液，包含預(yù)定濃度的預(yù)定骨形態(tài)發(fā)生蛋白；預(yù)定濃度的肽，所述肽與TGF-(3超家族成員的指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少75%同源。24.權(quán)利要求23所述的溶液，其中所述TGF-J3超家族的成員不是所述預(yù)定骨形態(tài)發(fā)生蛋白。25.權(quán)利要求23所述的溶液，其中所述TGF-P超家族的成員是所述預(yù)定骨形態(tài)發(fā)生蛋白。26.權(quán)利要求23所述的溶液，其中所述成員為TGF-p、生長分化因子(GDF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、激活素或抑制素。27.權(quán)利要求23所述的溶液，其中肽與所述部分至少80%同源。28.斥又利要求23所述的溶液，其中肽與所述部分至少85%同源。29.權(quán)利要求23所述的溶液，其中肽與所述部分至少卯％同源。30.權(quán)利要求23所述的溶液，其中肽與所述部分至少95%同源。31.穩(wěn)定骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶液的方法，包括在骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶液中加入預(yù)定濃度的肽，所述肽與TGF-p超家族成員的指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少75%同源。32.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述TGF-P超家族的成員不是所述預(yù)定骨形態(tài)發(fā)生蛋白。33.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述TGF-P超家族的成員是所述預(yù)定骨形態(tài)發(fā)生蛋白.34.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述成員為TGF-j3、生長分化因子(GDF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、激活素或抑制素。35.權(quán)利要求31所述的方法，其中肽與所述部分至少80%同源。36.權(quán)利要求31所述的方法，其中肽與所述部分至少85%同源。37.權(quán)利要求31所述的方法，其中肽與所述部分至少90%同源。38.權(quán)利要求31所述的方法，其中肽與所述部分至少95%同源。39.組合物，包含與TGF-p超家族成員的指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少75%同源的肽；和載體。40.權(quán)利要求39所述的組合物，其中載體為溶劑、凝膠、聚合物、脫礦骨、縫線、外科用網(wǎng)片、陶瓷、膠束、或上述物質(zhì)的任意組合。41.權(quán)利要求39所述的組合物，其中載體為緩沖液。42.權(quán)利要求39所述的組合物，其中載體包含膠原。43.權(quán)利要求39所述的組合物，其中載體為膠原海綿。44.權(quán)利要求39所述的組合物，其中載體為基于纖維素的物質(zhì)。45.權(quán)利要求39所述的組合物，其中載體包含一種或多種烷基纖維素(包括羥基烷基纖維素)，包括甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基曱基纖維素和羧曱基纖維素。46.權(quán)利要求39所述的組合物，其中載體包含聚葡糖酸酯、透明質(zhì)酸、聚乳酸、聚乙二醇、海藻酸鈉、聚乙二醇、聚氧乙烯氧化物、聚羧乙烯和聚乙烯醇。47.權(quán)利要求39所述的組合物，其中肽由以下的一種或多種穩(wěn)定綴合的聚丙二醇、綴合的唾液酸基、綴合的多聚唾液酸鏈、摻入修飾的氨基酸、摻入非天然氨基酸、鏈間共價鍵、鏈內(nèi)共價鍵、鏈間非共價鍵、鏈內(nèi)非共價鍵、和提呈增強(qiáng)子(presentationenhancer)。48.權(quán)利要求39所述的組合物，其中所述成員為TGF-p、生長分化因子(GDF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、激活素或抑制素。49.權(quán)利要求39所述的組合物，其中所述成員為BMP-2、BMP-12、BMP-9、GDF-19、BMP畫3、BMP-15、GDF-9、GDF-3、BMP國4、TGF-p或GDF畫8。50.權(quán)利要求39所述的組合物，其中肽與所述部分至少80%同源。51.^又利要求39所述的組合物，其中肽與所述部分至少85%同源。52.權(quán)利要求39所述的組合物，其中肽與所述部分至少90%同源53.權(quán)利要求39所述的組合物，其中肽與所述部分至少95%同源。54.組合物，包含與TGF-p超家族成員的指狀結(jié)構(gòu)-l肽的一部分至少75%同源的肽；和就從動物體內(nèi)排除而言增加肽的體內(nèi)穩(wěn)定性的藥劑。55.權(quán)利要求54所述的組合物，其中所述藥劑包括乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。56.權(quán)利要求54所述的組合物，其中所述藥劑為微嚢遞送系統(tǒng)或脂質(zhì)體懸液。57.權(quán)利要求54所述的組合物，其中所述藥劑為聚烷撐二醇。58.權(quán)利要求54所述的組合物，其中所述藥劑共價或非共價附著在肽上，其中所述藥劑選自聚烷撐二醇、唾液酸基、多唾液酸鏈、甲基、硫酸根、非天然氨基酸、P-殘基、提呈增強(qiáng)子、或具有硫醇基的氨基酸殘基、氫鍵受體或氫鍵供體。59.權(quán)利要求54所述的組合物，其中所述成員為TGF-P、生長分化因子(GDF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、激活素或抑制素。60.權(quán)利要求54所述的組合物，其中所述成員為BMP-2、BMP-12、BMP-9、GDF-19、BMP-3、BMP-15、GDF-9、GDF-3、BMP-4、TGF-p或GDF-8。61.權(quán)利要求54所述的組合物，其中肽與所述部分至少80%同源。62.權(quán)利要求54所述的組合物，其中肽與所述部分至少85%同源。63.斥又利要求54所述的組合物，其中肽與所述部分至少90%同源。64.4又利要求54所述的組合物，其中肽與所述部分至少95%同源。65.測定方法，包括將細(xì)胞群與肽相接觸，其中肽與TGF-P超家族成員的指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少75%同源；和檢測肽存在與不存在的情況下相比時細(xì)胞特征的改變。66.權(quán)利要求65所述的測定方法，其中所述成員為TGF-P、生長分化因子(GDF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、激活素或抑制素。67.沖又利要求65所述的測定方法，其中肽與所述部分至少80%同源。68.權(quán)利要求65所述的測定方法，其中肽與所述部分至少85%同源。69.外又利要求65所述的測定方法，其中肽與所述部分至少卯％同源。70.權(quán)利要求65所述的測定方法，其中肽與所述部分至少95%同源。71.權(quán)利要求65所述的測定方法，其中所述特征選自細(xì)胞周期中的階段、基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)、可見的或可測量的表型特征、基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、來自受體的信號傳導(dǎo)。72.權(quán)利要求65所述的測定方法，還包括將細(xì)胞與TGF-p超家族成員的蛋白質(zhì)相接觸。73.權(quán)利要求65所述的測定方法，其中限制肽為特定構(gòu)型。74.測定方法，包括將受體群與已知量的肽相接觸，其中肽與TGF-P超家族成員指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少75%同源；和檢測不與受體結(jié)合的肽量的改變。75.權(quán)利要求74所述的測定方法，其中限制肽為特定構(gòu)型76.權(quán)利要求74所述的測定方法，還包括將受體與TGF-p超家族成員的蛋白質(zhì)相接觸。77.權(quán)利要求74所述的測定方法，其中所述成員為TGF-p、生長分化因子(GDF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、激活素或抑制素。78.權(quán)利要求74所述的測定方法，其中肽與所述部分至少80%同源。79.權(quán)利要求74所述的測定方法，其中肽與所述部分至少85%同源。80.4又利要求74所述的測定方法，其中肽與所述部分至少90%同源。81.權(quán)利要求74所述的測定方法，其中肽與所述部分至少95%同源。82.測定方法，包括將受體群與已知量的肽和小分子相接觸，其中肽與TGF-p超家族成員指狀結(jié)構(gòu)-1肽的一部分至少75%同源；和檢測當(dāng)小分子存在與不存在的情況下相比時，不與受體結(jié)合的肽量的改變。83.權(quán)利要求82所述的測定方法，其中限制肽為特定構(gòu)型。84.權(quán)利要求82所述的測定方法，還包括將受體與TGF-p超家族成員的蛋白質(zhì)相接觸。85.權(quán)利要求82所述的測定方法，其中所述成員為TGF-p、生長分化因子(GDF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、激活素或抑制素。86.^又利要求82所述的測定方法，其中肽與所述部分至少80%同源。87.權(quán)利要求82所述的測定方法，其中肽與所述部分至少85%同源。88.權(quán)利要求82所述的測定方法，其中肽與所述部分至少卯％同源。89.權(quán)利要求82所述的測定方法，其中肽與所述部分至少95%同源。全文摘要本發(fā)明提供了采用TGF-β超家族成員和基于所述成員蛋白質(zhì)的肽片斷來純化包含成員蛋白質(zhì)的溶液的用途，和作為治療劑的用途。文檔編號C07K17/02GK101511859SQ200780027841公開日2009年8月19日申請日期2007年6月1日優(yōu)先權(quán)日2006年6月2日發(fā)明者C·T·布朗,E·S-M·申,P·J·亞沃爾斯基,S·H·奧蘭德,偉劉,呂志堅,張冀民申請人:惠氏公司