專利名稱：抗-il-6單克隆抗體及其用途的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及單克隆抗體及其用于疾病和病癥的治療的領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合細胞因子IL-6的單克隆抗體，以及所述抗體用于治療與IL-6活性或表達相關(guān)的疾病或病癥的用途。
相關(guān)技術(shù)
白介素-6(IL-6)是一種22到27kDa的分泌的糖蛋白，其顯示出生長刺激和促炎活性。IL-6還被稱作干擾素-β2(IFN-β2)，IL-1可誘導26-kDa蛋白，肝細胞刺激因子，細胞毒性T-細胞分化因子，和B-細胞刺激因子(Trikha等，Clin.Cancer Res.P4653-4665(2003))。IL-6被多種細胞類型分泌。IL-6通過結(jié)合高親和性受體復合體而發(fā)揮其活性，所述高親和性受體復合體由兩種膜糖蛋白組成一種以低親和性結(jié)合IL-6的80kDa組成受體(IL-6R)和一種自身不結(jié)合IL-6但對于IL-6被復合體高親和性結(jié)合必需的130kDa的單-轉(zhuǎn)導組分(gp130)(見

圖11；BioCarta)。IL-6R可被跨膜金屬蛋白酶剪切以產(chǎn)生可溶IL-6R。

在多種感染性，炎性和自身免疫疾病中和在與被感染，創(chuàng)傷和免疫學攻擊刺激的其他細胞因子提高的合成相關(guān)的癌癥中，IL-6血水平是提高的(Trikha等，Clin.Cancer Res.94653-4665(2003))。

IL-6與多種疾病或病癥相關(guān)，例如多發(fā)性骨髓瘤(Rossi等，Bone Marrow Transplantation 36111-119(2005))，淋巴瘤(Emilie等，Blood 842412-2419(1994))，神經(jīng)病癥例如神經(jīng)變性，星形細胞增多癥和腦血管發(fā)生(Campbell等，Proc.Natl.Acad.ScL 9010061-10065(1993))，自身免疫病癥(例如，類風濕性關(guān)節(jié)炎)，炎性疾病，阿爾茨海默氏疾病，心肌梗死，Paget′s疾病，骨質(zhì)疏松癥，實體腫瘤，前列腺和膀胱癌(Trikha等，Clin.Cancer Res.94653-4665(2003))，膿毒性休克，移植，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性感染，心臟粘液瘤(Wijdenes等，MoI.Immunol.251183-1192(1991))，腫瘤誘導惡病質(zhì)(Cahlin等，Cancer Res.505488-5489(2000))，癌癥相關(guān)抑郁癥，和腦瘤續(xù)發(fā)的腦水腫(Musselman等，Am.J.Psychiatry 7551252-1257(2001))。

另外，抗-IL-6抗體已經(jīng)顯示出在治療幾種疾病和病癥中是有效的。例如，抗-IL-6單克隆抗體已經(jīng)顯示出在體內(nèi)和體外阻斷骨髓瘤細胞的增殖(Rossi等，Bone Marrow Transplantation 36111-779(2005))。發(fā)現(xiàn)抗-IL-6抗體對慢性類風濕性關(guān)節(jié)炎患者的給藥減輕了疾病的癥狀(Wendling等，J.Rheumatol.20259-262(1993))?？?IL-6抗體還已經(jīng)顯示出在治療AIDS相關(guān)淋巴瘤(Emilie等，Blood 842472-2419(1994))，和腎細胞轉(zhuǎn)移癌(Blay等，Int.J.Cancer 72424-430(1997)中是有效的。涉及治療多種其他疾病和病癥的抗-IL-6抗體的給藥的臨床結(jié)果概述于Trikha等，Clin.Cancer Res.94653-4665(2003)。

抗-IL-6抗體是本領(lǐng)域已知的。例如，在美國專利號5,618,700和5,856,135中描述了源于小鼠單克隆抗體(SK2)的重組人(即，人化的)抗-IL-6單克隆抗體。其他的抗-IL-6抗體包括稱作CLB-6/8(Brakenhoff等，J.Immunol.745561-568(1990))的抗體，及其稱作cCLB8(Van Zaanen等，J.Clin.Invest.951441-1448(1996)的嵌合形式。命名為B-E8的鼠抗-IL-6單克隆抗體(mAb)已經(jīng)在臨床上用于治療多種IL-6相關(guān)疾病和病癥(見例如，Bataille等，Blood 55685-691(1995)，Rossi等，Bone Marrow Transplantation 36111-119(2005)，Haddad等，Blood751590-1597(2001)，和Emilie等，Blood 842412-2419(1994))。

鼠抗體，包括鼠抗-IL-6抗體，的使用由于例如對于靶抗原可變的選擇性，短的血清半衰期，和人抗-鼠抗體(HAMA)的發(fā)展而受阻。通過發(fā)展嵌合抗體(其中嚙齒動物的恒定區(qū)被它們的人對應物取代)或人化/CDR-移植/重組抗體(其中僅僅CDRs是非人來源的)，這些問題在一定程度被降低(一般性地見Vaughan等，Nat.Biotech.75535-539(1998))。然而，人化抗體涉及大量的實踐限制，例如(1)有效構(gòu)建人化mAbs途徑的有限數(shù)量的選擇，(2)對于抗體結(jié)構(gòu)或造型的詳細了解的需要，(3)由于親和性保持和引入的外源氨基酸之間的妥協(xié)的不可預料的免疫原性，和(4)原始mAb起源的對于動物的抗體庫的限制(Vaughan等，Nat.Biotechnol.76535-539(1998))。這些限制可通過利用人單克隆抗體而解決(Lonberg，Nat.Biotechnol.231117-1125(2005))。

因此，在本領(lǐng)域中需要用于臨床應用的另外的抗-IL-6單克隆抗體，包括人抗-IL-6mAbs。本發(fā)明解決了本領(lǐng)域中這種現(xiàn)存的需要。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了特異性結(jié)合IL-6的新的單克隆抗體。本發(fā)明的抗體包含選自本文公開的任何VH區(qū)及其氨基酸變體的可變重鏈(VH)區(qū)，和/或選自本文公開的任何VL區(qū)及其氨基酸變體的可變輕鏈(VL)區(qū)。

在本發(fā)明的一個示例性實施方式中，多個VH和VL區(qū)獲自人VH和VL基因文庫。包含獲自文庫的人VH區(qū)的抗體重鏈與來自已知鼠抗-IL-6mAb(即，B-E8)的輕鏈配對。類似地，包含獲自文庫的人VL區(qū)的抗體輕鏈與來自已知鼠抗-IL-6mAb(即，B-E8)的重鏈配對。篩選產(chǎn)生的抗體的特異性結(jié)合IL-6抗原的能力。從本方法，18種VL(SEQ IDNOs1到18所代表)和7種人VH(SEQ ID NOs19到25所代表)被鑒定。

所有的鑒定的VL與所有鑒定的VH交叉配對。通過ELISA測試產(chǎn)生的抗體的與IL-6的結(jié)合親和性，以及阻斷IL-6-誘導的細胞增殖的能力。從本方法，鑒定了顯示出顯著結(jié)合親和性和阻斷活性的33個人VH/VL對。

向通過上述方法鑒定的某些人VH和VL中引入氨基酸取代。變體VH和VL分別與人VL和VH配對，并且再次測試產(chǎn)生的抗體的IL-6結(jié)合親和性和阻斷活性。從這些實驗，鑒定了具有與原始鼠B-E8抗體(或其嵌合體)相差不大的結(jié)合和阻斷活性的幾種抗體。因此本發(fā)明還包括包含通過上述和下面實施例詳述的方法獲得的變體VH和VL的任何組合的抗體。

本發(fā)明還包括編碼本文公開的任何VH和/或VL區(qū)的核酸分子，以及包含所述核酸分子的載體和宿主細胞。

在某些實施方式中，本發(fā)明的新的單克隆抗體顯示出種特異性，結(jié)合人IL-6或輔助其檢測。在一些實施方式中，本發(fā)明的新的單克隆抗體結(jié)合人和猴IL-6或輔助其檢測，但不結(jié)合鼠或大鼠IL-6或輔助其檢測。

在一些實施方式中，本發(fā)明的新的單克隆抗體抑制IL-6-誘導的細胞增殖例如鼠B9(ECACC)骨髓瘤細胞或人U266骨髓瘤細胞的增殖。

在一些實施方式中，本發(fā)明的新的單克隆抗體結(jié)合IL-6但不結(jié)合其他IL-6超家族成員。

在一些實施方式中，本發(fā)明的新的單克隆抗體特異性結(jié)合IL-6，抑制IL-6結(jié)合它的受體。

本發(fā)明還包括生產(chǎn)本發(fā)明的抗體的方法，所述方法包括(i)培養(yǎng)表達編碼本發(fā)明抗體的一種或多種核酸序列的宿主細胞，和(ii)從培養(yǎng)基中回收抗體。

本發(fā)明還包括包含本發(fā)明的抗體的藥物組合物。所述藥物組合物可進一步包含藥學上可接受的載體、佐劑或其組合。

本發(fā)明還包括預防或治療與IL-6活性或表達相關(guān)的疾病和/或病癥的方法，其中所述方法包含給予有此需要的患者本發(fā)明的抗體。在一個實施方式中，本方法包括給予有此需要的患者治療或預防有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含本發(fā)明的抗體和藥學上可接受的載體。在一些實施方式中，所述疾病或病癥包括由IL-6的作用介導，與其相關(guān)，或由其引起的任何疾病或病癥。在一些實施方式中，所述待治療的疾病或病癥選自自身免疫疾病或病癥，與異?；虿贿m當?shù)难馨l(fā)生相關(guān)的疾病或病癥，癌癥，骨關(guān)節(jié)炎，特發(fā)性青少年關(guān)節(jié)炎，和纖維變性病癥。

本發(fā)明還包括本發(fā)明的抗體在制備用于治療由IL-6的作用介導，與其相關(guān)，或由其引起的疾病或病癥的藥物中的用途。在特定實施方式中，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的抗體在制備用于治療疾病或病癥的藥物中的用途，所述疾病或病癥選自自身免疫疾病或病癥，與異?；虿贿m當?shù)难馨l(fā)生相關(guān)的疾病或病癥，癌癥，骨關(guān)節(jié)炎，特發(fā)性青少年關(guān)節(jié)炎，和纖維變性病癥。

本發(fā)明還包括用于治療由IL-6的作用介導，與其相關(guān)，或由其引起的疾病或病癥的本發(fā)明的抗體。在一個特定實施方式中，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的抗體在制備用于治療疾病或病癥的藥物中的用途，所述疾病或病癥選自自身免疫疾病或病癥，與異常或不適當?shù)难馨l(fā)生相關(guān)的疾病或病癥，癌癥，骨關(guān)節(jié)炎，特發(fā)性青少年關(guān)節(jié)炎，和纖維變性病癥。
附圖簡述
圖1顯示了SEQ ID NOs19-25代表的示例性的人VH區(qū)的比對，其可包括在本發(fā)明的抗體中。

圖2顯示了IL-6結(jié)合抑制測定結(jié)果，其中生物素化人重組IL-6與多種抗-IL-6抗體培養(yǎng)，然后添加包含IL-6受體的U266細胞。利用流式細胞術(shù)定量在多種抗-IL-6抗體濃度的IL-6結(jié)合的抑制百分比。

圖3描繪了用于從定點突變產(chǎn)生的文庫中的mAbs的親和性選擇的一般方法。

圖4顯示了IL-6結(jié)合抑制測定的結(jié)果，其中人重組IL-6與多種抗-IL-6抗體培養(yǎng)，然后添加包含IL-6受體的U266細胞。然后添加純化的小鼠IL-6抗體和APC-綴合多克隆山羊-抗-小鼠二抗。利用流式細胞術(shù)定量測定在多種抗-IL-6抗體濃度的IL-6阻斷活性。

圖5A和5B顯示了結(jié)合特異性實驗的結(jié)果，其中通過ELISA測試對照mAb88(嵌合B-E8)(圖5A)，或候選的親和性提高的人mAb1339(圖5B)與一組IL-6超家族成員的結(jié)合。

圖6A和7A顯示了實驗結(jié)果，其中通過流式細胞術(shù)的分析測試了IL-6-特異性mAbs的抑制IL-6和在U266細胞上表達的IL-6受體的相互作用的能力。每個柱代表三個實驗的平均值+/-標準偏差。

在圖6A中，mAb的濃度是0.5μg/ml。對于每種mAb，從左到右的四個柱顯示分別在IL-6濃度100.0、50.0、25.0和12.5ng/ml的對IL-6結(jié)合IL-6受體的抑制百分比。

在圖7A中，IL-6濃度是500ng/ml。對于圖7A中每種mAb，從左到右的8個柱顯示了分別在mAb濃度5000、2500、1250、625.0、156.3、78.1和39.1ng/ml的對IL-6結(jié)合IL-6受體的抑制百分比。

圖6B和7B顯示了在100ng/ml IL-6的單個代表性實驗的結(jié)果，其例示了通過流式細胞術(shù)的分析的多種抗-IL-6mAbs對于IL-6和U266細胞上表達的IL-6受體的相互作用的抑制效果。黑體實線代表在不存在mAb的情況下單獨100ng/ml的IL-6；淺色實線代表在mAb存在的情況下100ng/ml的IL-6；虛線代表在不存在IL-6的情況下單獨的mAb。在圖6B中，mAb的濃度，如果存在的話，是0.5μg/ml mAb。在圖7B中，mAb的濃度，如果存在的話，是0.3μg/ml mAb。

圖8是顯示三個獨立的IL-6結(jié)合抑制測定的結(jié)果的示意圖。

圖9是mAb1339雙基因載體(表達包含H1579重鏈可變區(qū)的重鏈和包含L298輕鏈可變區(qū)的輕鏈)的圖譜。

圖10顯示了用表達mAb1339雙基因載體的多種基于CHO的細胞系分離物獲得的mAb產(chǎn)量。

圖11是代表IL-6信號傳導途徑(可獲自BioCarta)的示意圖。

圖12顯示了實驗結(jié)果，其中測試IL-6特異性mAb的抑制鼠B9(ECACC)骨髓瘤細胞系的IL-6-依賴的增殖的能力。IgGlκ和mB-Z1分別是人和小鼠同種型對照抗體。對于每種mAb，從左到右的七個柱分別顯示了在mAb濃度100、10、1、0.1、0.01、0.001和0.0001ng/ml的IL-6(10pg/ml)-誘導的B9細胞增殖的抑制百分比。每個柱代表三個實驗的平均值+/-標準偏差。

圖13顯示了實驗結(jié)果，其中測試了IL-6-特異的mAb的抑制人U266骨髓瘤細胞系的IL-6-依賴的增殖的能力。對于每種mAb，從左到右的六個柱分別顯示了在mAb濃度1000、333、111、37、12和4ng/ml的IL-6(500pg/ml)-誘導的U266細胞增殖的抑制百分比。每個柱代表三個實驗的平均值+/-標準偏差。

圖14和15顯示了實驗結(jié)果，其中通過ELISA測試了IL-6-特異的mAbs的檢測鼠IL-6(圖14)或大鼠IL-6(圖15)的能力。生物素化多克隆抗體(pAb)對照是抗-人IL-6，抗-大鼠IL-6，和抗-人IL-2。例如，“0”，沒有添加抗體。對于每個樣品，從左到右的四個柱分別顯示了在抗體濃度100、50、25和12.5ng/ml的與結(jié)合100ng/ml鼠或大鼠IL-6相關(guān)的光密度。每個柱代表兩個實驗的平均值+/-標準偏差。

圖16顯示了實驗結(jié)果，其中測試了IL-6特異mAb的從用LPS活化24小時的外周血單核細胞(PBMNC)中檢測人單核細胞中的天然胞漿內(nèi)IL-6的能力。粗線代表從LPS-刺激的單核細胞的IL-6的mAb檢測，而細線代表沒有添加的抗體。

圖17和18顯示了實驗結(jié)果，其中測試了IL-6-特異mAb從血漿中檢測IL-6的能力。沒有添加mAb的“僅僅血清”樣品用作參考。與“僅僅血清”樣品相比IL-6-特異抗體樣品的光密度信號的下降意味著血清IL-6與抗體的相互作用。在5μg/ml測試抗體。

在圖17中，四個柱從左到右顯示了在血清稀釋1、1/2、1/4和1/8的人血清中與人IL-6檢測相關(guān)的光密度。每個柱代表兩個實驗的平均值+/-標準偏差。

在圖18中，四個柱從左到右顯示了在血清稀釋1/10、1/20、1/40、1/80、1/160、1/320和1/640的獼猴血清中與猴IL-6檢測相關(guān)的光密度。
發(fā)明詳述
除非另外定義，本文使用的所有的技術(shù)和科學術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的意思。
抗體
本發(fā)明提供了特異性結(jié)合IL-6的單克隆抗體。

如本文所用，術(shù)語“抗體”包括免疫球蛋白分子，其包含四條多肽鏈，通過二硫鍵相互連接的兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(本文縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個結(jié)構(gòu)域組成，CH1，CH2和CH3。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文縮寫為VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。來自任何脊椎動物種的抗體(免疫球蛋白)的輕鏈可基于它們的恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列分配為兩種明顯不同類型之一，稱為kappa(K)和lambda(λ)。本文中kappa輕鏈可變區(qū)稱作VK。如本文所用，表述VL意圖包括來自kappa-型輕鏈(VK)和來自lambda-型輕鏈的可變區(qū)。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域組成，VL。VH和VL區(qū)包括超變區(qū)，稱為互補決定區(qū)(CDRs)，散布著更保守的區(qū)域，稱為框架區(qū)(FR)。每個VH和VL由三個CDRs和四個FRs組成，從氨基末端到羧基末端以下列順序排列FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

根據(jù)它們重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，抗體可分為不同類別。有五種主要類型的完整抗體IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且這些中的幾種可進一步分為亞類(同種型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。對應于不同類的抗體的重鏈恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類的免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象是熟知的。本發(fā)明包括任何前述類或亞類(同種型)的抗體。

本文使用的術(shù)語“抗體”還意圖包括抗體，其消化片段，特定部分和變體，包括抗體模擬物，或抗體部分，所述抗體部分包含模擬抗體或其特定片段或部分，包括單鏈抗體及其片段，每種包含至少一個CDR。功能性片段包括結(jié)合IL-6抗原的抗原結(jié)合片段。例如，能夠結(jié)合IL-6或其部分的抗體片段，包括但不限于Fab(例如，被木瓜蛋白酶消化)，facb(例如，被血纖維蛋白溶酶消化)，pFc’(例如，被胃蛋白酶或血纖維蛋白溶酶消化)，F(xiàn)d(例如，被胃蛋白酶消化，部分還原和重聚集)，F(xiàn)v或scFc(例如，通過分子生物技術(shù))，被本發(fā)明包括?？贵w片段還意圖包括，例如，結(jié)構(gòu)域缺失的抗體，雙價抗體(diabodies)，線性抗體，單鏈抗體分子，和從抗體片段中形成的多特異性抗體。

本文使用的術(shù)語“單克隆抗體”指獲自基本上同源的抗體的群體的抗體，例如，包含除了可能的天然存在的突變或可能存在的微小的翻譯后變異之外基本上同一的群體的個體抗體。單克隆抗體是高度特異的，針對單個抗原位點。而且，與典型地包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的普通(多克隆)抗體制劑相比，每種單克隆抗體針對抗原上單個決定簇。修飾語“單克隆”表示抗體的特征為獲自基本上同源的抗體群體，并且不解釋為需要通過任何特定方法產(chǎn)生抗體。本發(fā)明的單克隆抗體優(yōu)選通過重組DNA方法產(chǎn)生，或通過本文別處描述的篩選方法獲得。

本文使用的術(shù)語“單克隆抗體”包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重和/或輕鏈的部分與源于特定種或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體的對應序列同一或同源，同時所述鏈的剩余部分與源于另一種(例如小鼠或大鼠)或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的抗體的對應序列同一或同源，以及所述抗體的片段，只要它們顯示出期望的生物學活性即可(Morrison等，Proc.Natl.Acad.ScL USA 576851-6855(1984))。本文中感興趣的嵌合抗體包括“靈長類動物化”抗體，其包含源于非人靈長類動物(例如，舊大陸猴(Old World Monkey)，如狒狒，恒河猴或獼猴)的可變區(qū)抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列(美國專利號5,693,780)。

因此，本發(fā)明包括，例如，包含嵌合重鏈和/或嵌合輕鏈的嵌合單克隆抗體。嵌合重鏈可包含融合于非人抗體的重鏈恒定區(qū)的任何本文所述的重鏈可變(VH)區(qū)或其突變體或變體。嵌合輕鏈可包含融合于非人抗體的輕鏈恒定區(qū)的任何本文所述的輕鏈可變(VL)區(qū)或其突變體或變體。

本文使用的術(shù)語“人抗體”包括具有對應于如Kabat等所述的人種系免疫球蛋白序列(見Kabat等，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，F(xiàn)ifth Edition，U S.Department of Health和Human Services，NIH Publication No.91-3242)的可變和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可包括不被人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過在體外隨機或點特異突變引入的突變，或通過在體內(nèi)的體細胞突變)，例如在CDR中特別地在CDR3中。人抗體可具有用一個氨基酸殘基，例如，不被人種系免疫球蛋白序列編碼的活性增強氨基酸殘基，取代的至少一個位點。在本發(fā)明的上下文中，人抗體可具有用不是人種系免疫球蛋白的部分的氨基酸殘基取代的多至二十個位點。在其他實施方式中，多至十，多至三或多至兩個位點被取代。然而，本文使用的術(shù)語“人抗體”不意圖包括其中源于另一哺乳動物種例如小鼠的種系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗體。

短語“重組人抗體”包括通過重組方式制備，表達，創(chuàng)造或分離的人抗體，例如利用轉(zhuǎn)染入宿主細胞的重組表達載體表達的抗體，分離自重組組合人抗體文庫的抗體，分離自轉(zhuǎn)基因了人免疫球蛋白基因的動物的抗體，或通過涉及將人免疫球蛋白基因序列與其他DNA序列拼接的任何其他方法制備，表達，創(chuàng)造或分離的抗體。所述重組人抗體具有源于人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)(見Kabat，E.A.，等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，F(xiàn)ifth Edition，U.S.Department of Health和Human Services，NIH Publication No.91-3242)。根據(jù)本發(fā)明，重組人抗體包括已經(jīng)進行了體外突變的人種系免疫球蛋白序列(或，當使用轉(zhuǎn)基因了人Ig序列的動物時，體內(nèi)體細胞突變)并且因此重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列是當源于和涉及人種系VH和VL序列時可能不在體內(nèi)天然存在于人抗體種系庫中的序列。在某些實施方式中，然而，所述重組抗體是選擇性突變方法或回復突變或兩者的結(jié)果。

本發(fā)明的抗體可以是分離的抗體。本文使用的“分離的抗體”包括基本上沒有具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體。而且，分離的抗體可以基本上沒有其他細胞材料和/或化學制品。

本發(fā)明的抗體優(yōu)選特異性結(jié)合IL-16抗原。本文使用的“IL-16抗原”意圖包括，例如，完整IL-16蛋白或IL-16蛋白片段。術(shù)語“IL-16抗原”意圖包括天然存在的IL-16(例如，純化自在正常條件下表達IL-6的細胞的IL-6)以及重組IL-16和其變體和突變體。優(yōu)選地，IL-6抗原能夠結(jié)合IL-6受體。

本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合IL-6抗原，也就是說，例如，本發(fā)明抗體結(jié)合IL-6抗原并且不顯示對于非IL-6分子的任何顯著結(jié)合。在某些實施方式中，抗體特異性結(jié)合IL-6抗原，也就是說，抗體以其結(jié)合IL-6抗原以外的抗原的親和性的至少1000倍，至少500倍，至少200倍，至少100倍，至少90倍，至少80倍，至少70倍，至少60倍，至少50倍，至少40倍，至少30倍，至少20倍，至少10倍或至少2倍的親和性結(jié)合IL-6抗原。

本發(fā)明的抗體是否特異性結(jié)合IL-6抗原可例如通過結(jié)合測定如ELISA利用一組包括IL-6抗原以及至少一種其他非IL-6抗原的抗原而確定。評價特異性的示例性方法在下面的實施例5中闡述。在此，通過ELISA測試本發(fā)明的人抗IL-6抗體(mAb1339)與非相關(guān)抗原例如人胰島素，人血清白蛋白，人血紅蛋白，和小牛血清白蛋白的結(jié)合。由于沒有觀察到與非IL-6抗原的結(jié)合，mAb1339被認為特異性結(jié)合IL-6。

在某些實施方式中，本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合IL-6但不結(jié)合其他IL-6超家族成員。在某些實施方式中，本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合IL-6抗原，也就是說，抗體以其結(jié)合IL-6超家族成員例如CNFT、制瘤素M、IL-11或NNT-1的親和性的至少1000倍，至少500倍，至少200倍，至少100倍，至少90倍，至少80倍，至少70倍，至少60倍，至少50倍，至少40倍，至少30倍，至少20倍，至少10倍或至少2倍的親和性結(jié)合IL-6抗原。例如，通過ELISA，mAb1339顯示出結(jié)合IL-6，并且顯示出結(jié)合CNFT、制瘤素M、IL-11或NNT-1的不顯著水平(見實施例5和圖5B)?？衫眠@種或類似的測定評價任何抗體是否特異性結(jié)合IL-6抗原。

在其他實施方式中，當解離常數(shù)(Kd)為大約10-8M時，本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合IL-6抗原。在某些實施方式中，當Kd為大約5×10-9M時，抗體被認為以“高親和性”特異性結(jié)合IL-6抗原，并且當Kd為大約5×10-10M時，抗體被認為以“非常高的親和性”特異性結(jié)合IL-6抗原。

在本發(fā)明的上下文中，抗體是否特異性結(jié)合IL-6抗原還可通過功能性測定而確定。例如，可利用其中表達IL-6受體的細胞在測試抗體存在下與IL-6一起培養(yǎng)的測定。在平行測定中，表達另一受體的細胞在測試抗體存在下與該受體的配體一起培養(yǎng)。如果抗體在第一測定(其包括IL-6和表達IL-6受體的細胞)中顯示出抑制性效果但在第二測定(其包括不同的配體和表達該配體的受體的細胞)中不顯示抑制性效果，這可得出結(jié)論該抗體特異性結(jié)合IL-6抗原。確定抗體是否抑制IL-6結(jié)合細胞上的IL-6受體的生物學效果的測定在本文別處進行討論。例如，實施例5顯示了本發(fā)明的人抗IL-6抗體抑制IL-6誘導的人骨髓瘤細胞增殖的能力。

在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體抑制IL-6誘導的細胞增殖，例如鼠B9(ECACC)或人U266骨髓瘤細胞的增殖。在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體以100％(即完全)的抑制水平抑制IL-6誘導的細胞增殖。例如鼠B9(ECACC)或人U266骨髓瘤細胞的增殖。在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體以90％或更高的抑制水平抑制IL-6誘導的細胞增殖，例如鼠B9(ECACC)或人U266骨髓瘤細胞的增殖。在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體以80％或更高的抑制水平抑制IL-6-誘導的細胞增殖，例如鼠B9(ECACC)或人U266骨髓瘤細胞的增殖。在一些實施方式中，本發(fā)明抗體以70％或更高，60％或更高，50％或更高，40％或更高，30％或更高，20％或更高，10％或更高，或5％或更高，或1％或更高的抑制水平抑制IL-6-誘導的細胞增殖，例如鼠B9(ECACC)或人U266骨髓瘤細胞的增殖。

在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合IL-6，抑制IL-6與其受體的結(jié)合。在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合IL-6，以100％的抑制水平(即，完全)抑制IL-6與其受體的結(jié)合。在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合IL-6，以90％或更高的抑制水平抑制IL-6與其受體的結(jié)合。在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合IL-6，以80％或更高的抑制水平抑制IL-6與其受體的結(jié)合。在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合IL-6，以70％或更高，60％或更高，50％或更高，40％或更高，30％或更高，20％或更高，10％或更高，5％或更高，或1％或更高的抑制水平抑制IL-6與其受體的結(jié)合。

在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體顯示出種特異性，結(jié)合人IL-6或輔助其的檢測。在一些實施方式中，本發(fā)明新的單克隆抗體結(jié)合人或猴IL-6或輔助其的檢測，但不結(jié)合鼠或大鼠IL-6或輔助其的檢測。

本發(fā)明的人抗體可通過多種方法獲得。例如，可選擇結(jié)合IL-6的人單克隆抗體，例如通過用IL-6或其部分篩選一種或多種人VL和VH cDNA文庫，例如通過噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，Nature348552-554(1990))。本發(fā)明的人抗體還可以獲自轉(zhuǎn)基因動物例如轉(zhuǎn)基因小鼠(Jakobovits，Curr.Opin.Biotechnol.5561-566(1995))。本發(fā)明包括通過本領(lǐng)域用于制備人抗體的任何已知方法獲得的人抗-IL-6抗體。

可用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的示例性方法公開于，例如，美國專利申請公開號2005/0196755，其全部內(nèi)容在此引入作為參考。

本發(fā)明因此包括了包含人重鏈可變區(qū)(VH)的單克隆抗體，其中人VH當與非人抗-IL-6單克隆抗體(例如，B-E8)的可變輕鏈區(qū)(VL)配對時產(chǎn)生了特異性結(jié)合IL-6抗原的抗體。

本發(fā)明還包括了包含人輕鏈可變區(qū)(VL)的單克隆抗體，其中人VL當與非人抗-IL-6單克隆抗體(例如，B-E8)的可變重鏈區(qū)(VH)配對時產(chǎn)生特異性結(jié)合IL-6抗原的抗體。在某些實施方式中，人VL為kappa亞型(即，VK)。

本發(fā)明還包括了包含人重鏈可變區(qū)(VH)和人輕鏈可變區(qū)(VL)的單克隆抗體，其中人VH當與非人抗-IL-6單克隆抗體(例如B-E8)的可變輕鏈區(qū)(VL)配對時產(chǎn)生特異性結(jié)合IL-6抗原的抗體，并且其中人VL當與非人抗-IL-6單克隆抗體(例如B-E8)的可變重鏈區(qū)(VH)配對時產(chǎn)生特異性結(jié)合IL-6抗原的抗體。

在某些實施方式中，本發(fā)明的單克隆抗體包含可變重鏈區(qū)(VH)，所述可變重鏈區(qū)包含選自下列的氨基酸序列H415(SEQ IDNO19)，H884(SEQ ID NO20)，H1077(SEQ ID NO21)，H1078(SEQ IDNO22)，H1079(SEQ ID NO23)，H1081(SEQ ID NO24)，H1089(SEQ IDNO25)，H1511(SEQ ID NO26)，H1420(SEQ ID NO27)，H1432(SEQ IDNO28)，H1515(SEQ ID NO29)，H1362(SEQ ID NO30)，H1437(SEQ IDNO31)，H1461(SEQ ID NO32)，H1519(SEQ ID NO38)，H1520(SEQ IDNO39)，H1521(SEQ ID NO40)，H1522(SEQ ID NO41)，H1553(SEQ IDNO42)和H1579(SEQ ID NO43)，其中所述抗體特異性結(jié)合IL-6抗原。

在某些實施方式中，本發(fā)明的單克隆抗體包含可變輕鏈區(qū)(VL或VK)，所述可變輕鏈區(qū)包含選自下列的氨基酸序列L112(SEQID NO1)，L151(SEQ ID NQ2)，L158(SEQ ID NO3)，L159(SEQ IDNO4)，L164(SEQ ID NO5)，L165(SEQ ID NO6)，L166(SEQ ID NO7)，L167(SEQ ID NO8)，L168(SEQ ID NO9)，L169(SEQ ID NO10)，L170(SEQ ID NO11)，L171(SEQ ID NO12)，L172(SEQ ID NO13)，L173(SEQ ID NO14)，L174(SEQ ID NO15)，L175(SEQ ID NO16)，L189(SEQ ID NO17)，L198(SEQ ID NO18)，L314(SEQ ID NO33)，L305(SEQ ID NO34)，L303(SEQ ID NO35)，L298(SEQ ED NO36)和L321(SEQ ID NO37)，其中抗體特異性結(jié)合IL-6抗原。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解本發(fā)明上下文所述的“包含可變重鏈區(qū)(VH)的抗體”和“包含可變輕鏈區(qū)(VL或VK)的抗體”可包括通常在抗體分子中發(fā)現(xiàn)的一種或多種另外的區(qū)域(或“結(jié)構(gòu)域”)，例如，一種或多種恒定重鏈區(qū)(例如，CH1、CH2和/或CH3)，和/或恒定輕鏈區(qū)(CL)。

在某些實施方式中，本發(fā)明的抗體可包含可變重鏈區(qū)(VH)，所述可變重鏈區(qū)包含至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一于SEQ ID NOs19到32或38到43中任一個的氨基酸序列，其中所述抗體特異性結(jié)合IL-6抗原。

在某些實施方式中，本發(fā)明的抗體可包含可變輕鏈區(qū)(VL或VK)，所述可變輕鏈區(qū)包含至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一于SEQ ID NOs1到18或33到37中任一個的氨基酸序列，其中所述抗體特異性結(jié)合IL-6抗原。

本文使用的術(shù)語“同一”指如通過比對和比較序列確定的兩種或更多種多肽分子的序列之間的關(guān)系?！巴恍园俜直取北硎驹诒容^的分子中的氨基酸序列之間同一的殘基的百分比，并且基于最小的比較的分子的大小進行計算。對于這些計算，比對的缺口(gap)(如果有的話)必須通過特定的數(shù)學模型或計算機程序(即“算法”)解決?？捎糜谟嬎惚葘Φ亩嚯牡耐恍缘姆椒òㄏ率鲋兴龅哪切〤omputationalMolecular Biology，(Lesk，A.M.，ed.)，1988，New YorkOxford UniversityPress；Biocomputing Informatics和Genome Projects，(Smith，D.W.，ed.)，1993，New YorkAcademic Press；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，(Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，eds.)，1994，New JerseyHumanaPress；von Heinje，G.，1987，Sequence Analysis in Molecular Biology，NewYorkAcademic Press；Sequence Analysis Primer，(GribskoV，M.和Devereux，J.，eds.)，1991，New YorkM.Stockton Press；和Carillo等，1988，SIAM J.Applied Math.481073。

在計算同一性百分比中，被比較的序列以產(chǎn)生序列之間最大匹配的方式比對。用于確定同一性百分比的計算機程序可以是GCG程序包，其包括GAP(Devereux等，1984，Nucl Acid Res 12387；GeneticsComputer Group，University of Wisconsin，Madison，Wise)。計算機算法GAP用于比對序列同一性百分比待確定的兩種多肽。為它們各自氨基酸的最佳匹配比對序列(“匹配跨度”，如所述算法所確定)。缺口開放罰分(gap opening penalty)(其計算為3×平均對角(average diagonal)，其中“平均對角(average diagonal)”是使用的比較矩陣的對角平均值；“對角”是分配給每個通過特定比較矩陣的完美的氨基酸匹配的得分或數(shù)值)和缺口延伸罰分(gap extension penalty)(其通常是缺口開放罰分的1/10)，以及比較矩陣例如PAM250或BLOSUM 62與所述算法一起使用。在某些實施方式中，所述算法還使用標準比較矩陣(見Dayhoff等，1978，Atlas of Protein Sequence和Structure 5345-352 for the PAM 250comparison matrix；Henikoff et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-10919 for the BLOSUM 62 comparison matrix)。

使用GAP程序確定多肽的同一性百分比的推薦參數(shù)如下 算法Needleman等，1970，J.MoL Biol.48443-453； 比較矩陣BLOSUM 62，來自Henikoff等，1992，上述； 缺口罰分12(但對于末端缺口不罰分)； 缺口長度罰分4； 類似性閾值0。

用于比對兩個氨基酸序列的某種比對方案可導致僅僅兩個序列的一段短區(qū)域匹配，并且這段小的匹配區(qū)域可具有非常高的序列同一性，即使兩個全長序列之間沒有顯著性的關(guān)系。相應地，如果期望產(chǎn)生跨越靶多肽的至少50個鄰接氨基酸的比對，選擇的比對方法(GAP程序)可被調(diào)整。

預期了本文所述的抗-IL-6抗體的氨基酸序列修飾。例如，可期望提高抗-IL-6抗體的結(jié)合親和性和/或其他生物學性質(zhì)。

通過向編碼所述抗體的重或輕鏈的核酸中引入適當?shù)暮塑账岣淖儯蛲ㄟ^肽合成，可制備抗-IL-6抗體的氨基酸序列變體。示例性的修飾包括改變了所述抗體的重和/或輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的那些。特別優(yōu)選的是改變本發(fā)明抗體的重和/或輕鏈的可變區(qū)的一種或多種CDR的氨基酸序列的修飾。

示例性的修飾包括例如，抗-IL-6抗體的氨基酸序列之內(nèi)的殘基的缺失，和/或插入和/或取代。進行了缺失，插入和取代的任何組合以獲得最終的構(gòu)建體，只要最終的構(gòu)建體具有期望的性質(zhì)即可(例如，形成特異性結(jié)合IL-6抗原的抗體部分的能力)。氨基酸改變還可改變抗-IL-6抗體翻譯后的程序，例如改變糖基化位點的數(shù)量或位點。

引入氨基酸改變到本發(fā)明抗體的VH和VL區(qū)的示例性方法例示于下面的實施例2。根據(jù)該方法，NNK在特定位點引入，例如在VH或VL的CDR之內(nèi)，其中N可以是A，T，G或C，并且K是T或G。利用NNK，所有20個氨基酸和1個終止密碼子可在每個位點引入。

如Cunningham和Wells，Science 2441081-1085(1989)所述，鑒定優(yōu)選突變位點的抗-IL-6抗體可變重鏈區(qū)和可變輕鏈區(qū)的門某些殘基或區(qū)域的另一有用的方法稱為“丙氨酸掃描突變”。在此，靶殘基的殘基或基團被鑒定(例如，帶電殘基例如arg，asp，his，lys和glu)并被中性或帶負電氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或聚丙氨酸)取代。顯示出對于取代功能性敏感的這些氨基酸位點然后通過在或為取代位點引入進一步或其他變體而被改進。因此，雖然引入氨基酸序列改變的位點是預定的，突變性質(zhì)本身不需要預定。例如，為分析在給定位點的突變性能，在靶密碼子或區(qū)域進行丙氨酸掃描或隨機突變，并且為當與可變輕鏈或可變重鏈分別組合時的期望的活性篩選表達的VH變體和/或VL變體。

氨基酸序列插入包括長度范圍在一個殘基到包含一百或更多個殘基的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰基的抗-IL-6VH或抗-IL-6VL，或融合于細胞毒性多肽的抗-IL-6VH或抗-IL-6VL。

另一變體類型是氨基酸取代變體。這些變體具有在VH或VL分子的至少一個氨基酸殘基被不同的殘基取代。本發(fā)明的抗-IL-6抗體的VH和VL區(qū)取代突變的最感興趣位點包括超變區(qū)，但是FR改變也是預期的。

保守取代示于表1“優(yōu)選取代”的標題之下。如果所述取代導致生物學活性的改變，則可引入在表1中稱為“示例性取代”或參考氨基酸類別的下面進一步描述的更多實質(zhì)性的改變，并且篩選產(chǎn)品。
表1
本發(fā)明的抗-IL-6抗體的生物學性質(zhì)中的實質(zhì)修飾可通過選擇取代而完成，所述取代在它們對于保持(a)取代區(qū)域中的多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如，作為折疊或螺旋構(gòu)象，(b)在靶位點的分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈大小，的效果是顯著不同的。天然存在的殘基基于共同的側(cè)鏈性質(zhì)分為幾組 (1)疏水的正亮氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸； (2)中性親水的半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸； (3)酸性的天冬氨酸，谷氨酸； (4)堿性的天冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸； (5)影響鏈定位的殘基甘氨酸，脯氨酸；和 (6)芳香族的色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。

非保守取代將使得一種這些類中的成員替換為另一類。

不涉及保持抗-IL-6抗體的正確構(gòu)象的半胱氨酸殘基也可被取代，通常被絲氨酸，以提高分子的穩(wěn)定性和防止異常交聯(lián)。相反地，半胱氨酸鍵可添加到抗-IL-6抗體以提高其穩(wěn)定性(特別地其中抗-IL-6抗體是抗體片段例如Fv片段)。

取代變體的一種特別優(yōu)選類型涉及取代親本抗體的一種或多種超變區(qū)殘基。通常地，為進一步發(fā)展選擇的產(chǎn)生的變體將具有相對于產(chǎn)生它們的親本抗體提高的生物學性質(zhì)(例如，提高的對IL-6抗原的親和性)。為產(chǎn)生所述取代變體的示例性方法是利用噬菌體展示的親和性突變。簡短而言，幾種超變區(qū)位點(例如，6-7個位點)被突變以在每個位點產(chǎn)生所有可能的氨基取代。由此產(chǎn)生的抗體變體當與包裝在每個顆粒內(nèi)的M13的基因III產(chǎn)物融合時，從細絲狀噬菌體顆粒以單價形式展示。然后如本文所公開地為它們的生物學活性(例如，結(jié)合親和性)篩選噬菌體展示變體。為鑒定候選用于修飾的超變區(qū)區(qū)域位點，可進行丙氨酸掃描突變以鑒定對于抗原結(jié)合顯著起作用的超變區(qū)殘基。替代地，或另外地，分析抗原-抗體復合體的晶體結(jié)構(gòu)以鑒定抗體和抗原之間的接觸點是有益的。根據(jù)本文所述技術(shù)，所述接觸殘基和鄰近殘基是用于取代的候選物。一旦產(chǎn)生了所述變體，如本文所述地篩選該組變體并且在一種或多種相關(guān)測定中具有優(yōu)良性質(zhì)的抗體可為進一步發(fā)展而選擇。

本文所述的抗-IL-6抗體的另一類型的氨基酸變體改變了抗-IL-6抗體的原始糖基化模式。所述改變包括刪除一種或多種在抗-IL-6抗體中發(fā)現(xiàn)的碳水化合物部分，和/或添加一種或多種不存在于抗-IL-6抗體中的糖基化位點。

多肽的糖基化典型地是N-連接或O-連接的。N-連接指碳水化合物部分附著于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸，其中X是脯氨酸之外的任何氨基酸，是對于碳水化合物部分酶附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列。因此，這些三肽序列的每種在多肽中的存在產(chǎn)生了潛在的糖基化位點。O-連接的糖基化指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一種附著于羥氨酸，最常見為絲氨酸或蘇氨酸，然而5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸也可被使用。

糖基化位點添加到抗-IL-6抗體通常通過改變氨基酸序列使得它包含一種或多種上述三肽序列而完成(用于N-連接的糖基化位點)。所述改變還可通過向原始抗-IL-6抗體序列添加一種或多種絲氨酸或蘇氨酸殘基，或被其取代而產(chǎn)生(用于O-連接糖基化位點)。

在某些實施方式中，包括在本發(fā)明抗體中的VH區(qū)可包含與SEQ ID NOs19到32或38到43中的任一同一的氨基序列，除了1到20個氨基酸的取代之外。例如，VH可具有與SEQ ID NOs19到32或38到43同一的氨基酸序列，除了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個氨基酸取代之外。取代可在SEQ ID NOs19到32或38到43中發(fā)現(xiàn)的序列之內(nèi)的任何位點上。在某些實施方式中，取代在VH區(qū)的一種或多種CDR之內(nèi)。例如，取代可以在CDR1、CDR2和/或CDR3之內(nèi)。

同樣地，在某些實施方式中，包括在本發(fā)明抗體中的VL區(qū)可包含與SEQ ID NOs1到18或33到37中的任一同一的氨基序列，除了1到20個氨基酸取代之外。例如，VL可具有與SEQ ID NOs1到18或33到37同一的氨基酸序列，除了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個氨基酸取代之外。取代可以在SEQ ID NOs1到18或33到37中發(fā)現(xiàn)的序列之內(nèi)的任何位點上。在某些實施方式中，取代在VL區(qū)的一種或多種CDR之內(nèi)。例如，取代可以在CDR1、CDR2和/或CDR3之內(nèi)。

包含在一個或多個氨基酸殘基中不同于SEQ ID NOs19到32或38到43的VH區(qū)和/或在一個或多個氨基酸殘基中不同于SEQ IDNOs1到18或33到37的VL區(qū)的本發(fā)明的抗-IL-6抗體將優(yōu)選保持特異性結(jié)合IL-6抗原的能力。

本發(fā)明包括包含VH區(qū)的抗-IL-6抗體，其中所述VH包含表2所述的任一CDR1 表2示例性VH CDR1序列
本發(fā)明包括包含VH區(qū)的抗-IL-6抗體，其中所述VH包含與SEQ ID NOs51到55中任一個同一的氨基酸序列，除了一個或多個(例如，一，二，三，四，五，六或七個)來自SEQ ID NOs51到55的氨基酸被任何其他氨基酸取代之外。優(yōu)選包含變異的CDR1的抗-IL-6抗體將特異性結(jié)合IL-6抗原。

本發(fā)明還包括包含VH區(qū)的抗-IL-6抗體，其中所述VH包含表3所述任一的CDR2 表3示例性VH CDR2序列
本發(fā)明包括包含VH區(qū)的抗-IL-6抗體，其中所述VH包含變異的CDR2，所述變異的CDR2具有與SEQ ID NOs56到61或97中任一個同一的氨基酸序列，除了一個或多個(例如、一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五或十六個)來自SEQ ID NOs56到61或97的氨基酸被任何其他氨基酸取代之外。優(yōu)選包含變異的CDR2的抗-IL-6抗體將特異性結(jié)合IL-6抗原。

本發(fā)明還包括包含VH區(qū)的抗-IL-6抗體，其中所述VH包含表4所述任一CDR3 表4示例性VH CDR3序列
本發(fā)明包括包含VH區(qū)的抗-IL-6抗體，其中所述VH包含變異的CDR3，所述變異的CDR3具有與SEQ ID NOs62到73或98中任一個同一的氨基酸序列，除了一個或多個(例如，一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二個)來自SEQ ID NOs62到73或98的氨基酸被任何其他氨基酸取代。優(yōu)選包含變異的CDR3的抗-IL-6抗體將特異性結(jié)合IL-6抗原。

另外，本發(fā)明包括包含VL區(qū)的抗-IL-6抗體，其中所述VL包含表5所述的任一CDR1 表5示例性VL CDR1序列
本發(fā)明包括包含VL區(qū)的抗-IL-6抗體，其中所述VL包含變異的CDR1，所述變異的CDR1具有與SEQ ID NOs74到79中任一個同一的氨基酸序列，除了一個或多個(例如、一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二個)來自SEQ ID NOs74到79的氨基酸被任何其他氨基酸取代之外。優(yōu)選包含變體CDR1的抗-IL-6抗體將特異性結(jié)合IL-6抗原。

本發(fā)明還包括包含VL區(qū)的抗-IL-6抗體，其中所述VL包含表6所述的任一CDR2 表6示例性VL CDR2序列
本發(fā)明包括包含VL區(qū)的抗-IL-6抗體，其中所述VL包含變異的CDR2，所述變異的CDR2具有與SEQ ID NOs80到85中任一個同一的氨基酸序列，除了一個或多個(例如，一，二，三，四，五，六，或七個)來自SEQ ID NOs80到85的氨基酸被任何其他氨基酸取代之外。優(yōu)選包含變異的CDR2的抗-IL-6抗體將特異性結(jié)合IL-6抗原。

本發(fā)明還包括包含VL區(qū)的抗-IL-6抗體，其中所述VL區(qū)包含表7所述任一的CDR3 表7示例性VL CDR3序列
本發(fā)明包括包含VL區(qū)的抗-IL-6抗體，其中所述VL包含變異的CDR3，所述變異的CDR3具有與SEQ ID NOs86到89中任一個同一的氨基酸序列，除了一個或多個(例如，一，二，三，四，五，六，七，八或九個)來自SEQ ID NOS86到96的氨基酸被任何其他氨基酸取代之外。優(yōu)選包含變異的CDR3的抗-IL-6的抗體特異性結(jié)合IL-6抗原。

如實施例1所示，通過篩選人VHs文庫鑒定的第一代人可變重鏈區(qū)(VHs)互相共享顯著的序列同一性。人VHs之間的氨基序列同一性顯示于表10并且圖解于圖1。例如，鑒定的人VHs的CDR1s都共享氨基酸序列T-S-G-X1-X2-V-X3(SEQ ED NO99)。另外，鑒定的人VH的CDR2都共享氨基酸序列X1-X2-X3-W-D-D-D-X4-X5-Y-X6-P-S-L-X7-X8(SEQ ID NO100)。

由此，本發(fā)明包括包含可變重鏈CDR1(VH-CDR1)的單克隆抗體，所述可變重鏈CDR1具有氨基酸序列T-S-G-X1-X2-V-X3(SEQ IDNO99)，其中X1，X2和X3可以是任何氨基酸。例如，X1，X2和/或X3可以是異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，纈氨酸(V)，苯丙氨酸(P)，甲硫氨酸(M)，半胱氨酸(C)，丙氨酸(A)，甘氨酸(G)，脯氨酸(P)，蘇氨酸(T)，絲氨酸(S)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)，谷氨酰胺(Q)，天冬酰胺(N)，組氨酸(H)，谷氨酸(E)，天冬氨酸(D)，賴氨酸(W)，或精氨酸(R)。在一個示例性實施方式中，X1是甲硫氨酸(M)或纈氨酸(V)。在另一示例性實施方式中，X1是纈氨酸(V)。在另一示例性實施方式中，X2是半胱氨酸(C)，丙氨酸(A)，絲氨酸(S)或甘氨酸(G)。在另一示例性實施方式中，X3是絲氨酸(S)或甘氨酸(G)。優(yōu)選地，包含具有氨基酸序列T-S-G-X1-X2-V-X3(SEQ ID NO99)的VH-CDR1的本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合IL-6抗原。

本發(fā)明還包括包含可變重鏈CDR2(VH-CDR2)的單克隆抗體，所述可變重鏈CDR2具有氨基酸序列X1-X2-X3-W-D-D-D-X4-X5-Y-X6-P-S-L-X7-X8(SEQ ID NO100)，其中X1，X2，X3，X4，X5，X6，X7和X8可以是任何氨基酸。例如，X1，X2，X3，X4，X5，X6，X7和/或X8可以是異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，纈氨酸(V)，苯丙氨酸(P)，甲硫氨酸(M)，半胱氨酸(C)，丙氨酸(A)，甘氨酸(G)，脯氨酸(P)，蘇氨酸(T)，絲氨酸(S)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)，谷氨酰胺(Q)，天冬酰胺(N)，組氨酸(H)，谷氨酸(E)，天冬氨酸(D)，賴氨酸(W)，或精氨酸(R)。在一個示例性實施方式中，X1是亮氨酸(L)，苯丙氨酸(F)或纈氨酸(V)。在另一示例性實施方式中，X1是亮氨酸(L)。在另一示例性實施方式中，X2是異亮氨酸(I)或纈氨酸(V)。在另一示例性實施方式中，X2是異亮氨酸(I)。在另一示例性實施方式中，X3是酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F)。在另一示例性實施方式中，X4是賴氨酸(K)或精氨酸(R)。在另一示例性實施方式中，X5是精氨酸(R)，酪氨酸(Y)，或組氨酸(H)。在另一示例性實施方式中，X6是絲氨酸(S)或天冬酰胺(N)。在另一示例性實施方式中，其中X6是絲氨酸(S)。在另一示例性實施方式中，X7是精氨酸(R)，賴氨酸(K)，谷氨酸(E)或絲氨酸(S)。在另一示例性實施方式中，X7是賴氨酸(K)。在另一示例性實施方式中，X8是絲氨酸(S)或天冬酰胺(N)。優(yōu)選地，包含具有氨基酸序列X1-X2-X3-W-D-D-D-X4-X5-Y-X6-P-S-L-X7-X8(SEQ ID NO100)的VH-CDR2的本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合IL-6抗原。

本發(fā)明還包括包含VL區(qū)的抗-IL-6抗體，其中所述VL與SEQID NOs1到18或33到37中任一個同一，除了一個或多個來自SEQ IDNOs1到18或33到37的非CDR(例如，框架區(qū))氨基酸被任何其他氨基酸取代之外。本發(fā)明還包括包含VH區(qū)的抗-IL-6抗體，其中所述VH與SEQ ID NOs19到32或38到43中任一個同一，除了一個或多個來自SEQ ID NOs19到32或38到43的非CDR(例如，框架區(qū))氨基酸被任何其他氨基酸取代之外。優(yōu)選地，包含在VH和/或VK序列的框架區(qū)中一個或多個氨基酸改變的抗-IL-6抗體將特異性結(jié)合IL-6抗原。

本發(fā)明包括包含任何下面的組合的抗體 (1)本文所述的可變重鏈區(qū)(VH)，或包含本文所述一個或多個CDR的VH；和 (2)本文所述的可變輕鏈區(qū)(VL)或包含本文所述一個或多個CDR的VL。

例如，本發(fā)明包括包含任一下述VH區(qū)和VL區(qū)組合的抗-IL-6抗體H415(SEQ ID NO19)和L112(SEQ ID NO1)；H415(SEQ IDNO19)和L151(SEQ ID NO2)；H415(SEQ BD NO19)和L158(SEQ IDNO3)；H415(SEQ TD NO19)和L159(SEQ ID NO4)；H415(SEQ IDNO19)和L164(SEQ ID NO5)；H415(SEQ ID NO19)和L165(SEQ IDNO6)；H415(SEQ ID NO19)和L166(SEQ ID NO7)；H415(SEQ ID NO19)和L167(SEQ ID NO8)；H415(SEQ ID NO19)和L168(SEQ IDNO9)；H415(SEQ ID NO19)和L169(SEQ ID NO10)；H415(SEQ IDNO19)和L170(SEQ ID NO11)；H415(SEQ ID NO19)和L171(SEQ IDNO12)；H415(SEQ ID NO19)和L172(SEQ ID NO13)；H4T5(SEQ IDNO19)和L173(SEQ ID NO14)；H415(SEQ ID NO19)和L174(SEQ IDNO15)；H415(SEQ ID NO19)和L175(SEQ ID NO16)；H415(SEQ IDNO19)和L189(SEQ ID NO17)；H415(SEQ ID NO19)和L198(SEQ IDNO18)；H415(SEQ ID NO19)和L314(SEQ ID NO33)；H415(SEQ IDNO19)和L305(SEQ ID NO34)；H415(SEQ ID NO19)和L303(SEQ IDNO35)；H415(SEQ ID NO19)和L298(SEQ ID NO36)；或H415(SEQ IDNO19)和L321(SEQ ID NO37)。

本發(fā)明還包括包含任一下述VH區(qū)和VL區(qū)組合的抗-IL-6抗體H884(SEQ ID NO20)和L112(SEQ ID NO1)；H884(SEQ ID NO20)和L151(SEQ ID NO2)；H884(SEQ ID NO20)和L158(SEQ ID NO3)；H884(SEQ ID NO20)和L159(SEQ ID NO4)；H884(SEQ ID NO20)和L164(SEQ ID NO5)；H884(SEQ ID NO20)和L165(SEQ ID NO6)；H884(SEQ ID NO20)和L166(SEQ ID NO7)；H884(SEQ ID NO20)和L167(SEQ ID NO8)；H884(SEQ ID NO20)和L168(SEQ ID NO9)；H884(SEQ ID NO20)和L169(SEQ ID NO10)；H884(SEQ ID NO20)和L170(SEQ ID NO11)；H884(SEQ ID NO20)和L171(SEQ ID NO12)；H884(SEQ ID NO20)和L172(SEQ ID NO13)；H884(SEQ ID NO20)和L173(SEQ ID NO14)；H884(SEQ ID NO20)和L174(SEQ ID NO15)；H884(SEQ ID NO20)和L175(SEQ ID NO16)；H884(SEQ ID NO20)和L189(SEQ ID NO17)；H884(SEQ ID NO20)和L198(SEQ ID NO18)；H884(SEQ ED NO20)和L314(SEQ ID NO33)；H884(SEQ ID NO20)和L305(SEQ ID NO34)；H884(SEQ ID NO20)和L303(SEQ ID NO35)；H884(SEQ ID NO20)和L298(SEQ ID NO36)；或H884(SEQ ID NO20)和L321(SEQ ID NO37)。

本發(fā)明還包括包含任一下述VH區(qū)和VL區(qū)組合的抗-IL-6抗體H1077(SEQ ID NO21)和L112(SEQ ID NO1)；H1077(SEQ ID NO21)和L151(SEQ ID NO2)；H1077(SEQ ID NO21)和L158(SEQ ID NO3)；H1077(SEQ ID NO21)和L159(SEQ ID NO4)；H1077(SEQ ID NO21)和L164(SEQ ID NO5)；H1077(SEQ ID NO21)和L165(SEQ ID NO6)；H1077(SEQ ID NO21)和L166(SEQ ID NO7)；H1077(SEQ ID NO21)和L167(SEQ ID NO8)；H1077(SEQ ID NO21)和L168(SEQ ID NO9)；H1077(SEQ ID N O21)和L169(SEQ ID NO10)；H1077(SEQ ID NO21)和L170(SEQ ID NO11)；H1077(SEQ ID NO21)和L171(SEQ IDNO12)；H1077(SEQ ID NO21)和L172(SEQ ID NO13)；H1077(SEQ IDNO21)和L173(SEQ ID NO14)；H1077(SEQ ID NO21)和L174(SEQ IDNO15)；H1077(SEQ ID NO21)和L175(SEQ ID NO16)；H1077(SEQ IDNO21)和L189(SEQ ID NO17)；H1077(SEQ ID NO21)和L198(SEQ IDNO18)；H1077(SEQ ID NO21)和L314(SEQ ID NO33)；H1077(SEQ IDNO21)和L305(SEQ ID NO34)；H1077(SEQ ID NO21)和L303(SEQ IDNO35)；H1077(SEQ ID NO21)和L298(SEQ ID NO36)；或H1077(SEQID NO21)和L321(SEQ ID NO37)。

本發(fā)明還包括包含任一下述VH區(qū)和VL區(qū)組合的抗-IL-6抗體H1078(SEQ ID NO22)和L112(SEQ ID NO1)；H1078(SEQ ID NO22)和L151(SEQ ID NO2)；H1078(SEQ ID NO22)和L158(SEQ ID NO3)；H1078(SEQ ID NO22)和L159(SEQ ID NO4)；H1078(SEQ ID NO22)和L164(SEQ ID NO5)；H1078(SEQ ED NO22)和L165(SEQ ED NO6)；H1078(SEQ ED NO22)和L166(SEQ ED NO7)；H1078(SEQ ED NO22)和L167(SEQ ID NO8)；H1078(SEQ ED NO22)和L168(SEQ ED NO9)；H1078(SEQ ED NO22)和L169(SEQ ID NO10)；H1078(SEQ ID NO22)和L170(SEQ ID NO11)；H1078(SEQ ED NO22)和L171(SEQ EDNO12)；H1078(SEQ ED NO22)和L172(SEQ ID NO13)；H1078(SEQ IDNO22)和L173(SEQ ED NO14)；H1078(SEQ ID NO22)和L174(SEQ IDNO15)；H1078(SEQ ED NO22)和L175(SEQ ID NO16)；H1078(SEQED NO22)和L189(SEQ ED NO17)；H1078(SEQ ED NO22)和L198(SEQ ED NO18)；H1078(SEQ ED NO22)和L314(SEQ ED NO33)；H1078(SEQ ED NO22)和L305(SEQ ED NO34)；H1078(SEQ ID NO22)和L303(SEQ ID NO35)；H1078(SEQ ED NO22)和L298(SEQ EDNO36)；或H1078(SEQ ED NO22)和L321(SEQ ED NO37)。

本發(fā)明還包括包含任一下述VH區(qū)和VL區(qū)組合的抗-IL-6抗體H1079(SEQ ID NO23)和L112(SEQ ID NO1)；H1079(SEQ ID NO23)和L151(SEQ ID NO2)；H1079(SEQ ID NO23)和L158(SEQ ID NO3)；H1079(SEQ ID NO23)和L159(SEQ ID NO4)；H1079(SEQ ID NO23)和L164(SEQ ID NO5)；H1079(SEQ ID NO23)和L165(SEQ ID NO6)；H1079(SEQ ID NO23)和L166(SEQ ID NO7)；H1079(SEQ ID NO23)和L167(SEQ ID NO8)；H1079(SEQ ID NO23)和L168(SEQ ID NO9)；H1079(SEQ ID NO23)和L169(SEQ IDNO10)；H1079(SEQ ID NO23)和L170(SEQ ID NO11)；H1079(SEQ ID NO23)和L171(SEQ IDNO12)；H1079(SEQ ID NO23)和L172(SEQ ID NO13)；H1079(SEQ IDNO23)和L173(SEQ ID NO.14)；H1079(SEQ ID NO23)和L174(SEQ IDNO15)；H1079(SEQ ID NO23)和L175(SEQ ID NO16)；H1079(SEQ IDNO23)和L189(SEQ ID NO17)；H1079(SEQ ID NO23)和L198(SEQ IDNO18)；H1079(SEQ ID NO23)和L314(SEQ ID NO33)；H1079(SEQ IDNO23)和L305(SEQ ED NO34)；H1079(SEQ ID NO23)和L303(SEQ IDNO35)；H1079(SEQ ID NO23)和L298(SEQ ID NO36)；或H1079(SEQID NO23)和L321(SEQ ID NO37).
本發(fā)明還包括包含任一下述VH區(qū)和VL區(qū)組合的抗-IL-6抗體H1081(SEQ ID NO24)和L112(SEQ ID NO1)；H1081(SEQ ID NO24)和L151(SEQ ID NO2)；H1081(SEQ ID NO24)和L158(SEQ ID NO3)；H1081(SEQ ID NO24)和L159(SEQ ID NO4)；H1081(SEQ ID NO24)和L164(SEQ ID NO5)；H1081(SEQ ID NO24)和L165(SEQ ID NO6)；H1081(SEQ ID NO24)和L166(SEQ ID NO7)；H1081(SEQ ID NO24)和L167(SEQ ID NO8)；H1081(SEQ ID NO24)和L168(SEQ ID NO9)；H1081(SEQ ED NO24)和L169(SEQ ED NO10)；H1081(SEQ ID NO24)和L170(SEQ ID NO11)；H1081(SEQ ID NO24)和L171(SEQ IDNO12)；H1081(SEQ ID NO24)和L172(SEQ ID NO13)；H1081(SEQ IDNO24)和L173(SEQ ID NO14)；H1081(SEQ ID NO24)和L174(SEQ IDNO15)；H1081(SEQ ED NO24)和L175(SEQ ID NO16)；H1081(SEQ IDNO24)和L 189(SEQ ID NO17)；H1081(SEQ ID NO24)和L198(SEQ IDNO18)；H1081(SEQ ID NO24)和L314(SEQ ID NO33)；H1081(SEQ EDNO24)和L305(SEQ ID NO34)；H1081(SEQ ID NO24)和L303(SEQ IDNO35)；H1081(SEQ ID NO24)和L298(SEQ ID NO36)；或H1081(SEQID NO24)和L321(SEQ ID NO37)。

本發(fā)明還包括包含任何下述VH區(qū)和VL區(qū)組合的抗-IL-6抗體H1089(SEQ ID NO25)和L112(SEQ ID NO1)；H1089(SEQ ID NO25)和L151(SEQ ID NO2)；H1089(SEQ ID NO25)和L158(SEQ ID NO3)；H1089(SEQ ID NO25)和L159(SEQ ID NO4)；H1089(SEQ ID NO25)和L164(SEQ ID NO5)；H1089(SEQ ID NO25)和L165(SEQ ID NO6)；H1089(SEQ ID NO25)和L166(SEQ ID NO7)；H1089(SEQ ID NO25)和L167(SEQ ID NO8)；H1089(SEQ ID NO25)和L168(SEQ ID NO9)；H1089(SEQ ID NO25)和L169(SEQ ID NO10)；H1089(SEQ ID NO25)和L170(SEQ ID NO11)；H1089(SEQ ID NO25)和L171(SEQ IDNO12)；H1089(SEQ ID NO25)和L172(SEQ ID NO13)；H1089(SEQ IDNO25)和L173(SEQ ID NO14)；H1089(SEQ ID NO25)和L174(SEQ IDNO15)；H1089(SEQ ID NO25)和L175(SEQ ID NO16)；H1089(SEQ IDNO25)和L189(SEQ ID NO17)；H1089(SEQ ID NO25)和L198(SEQ IDNO18)；H1089(SEQ ID NO25)和L314(SEQ ID NO33)；H1089(SEQ IDNO25)和L305(SEQ ID NO34)；H1089(SEQ ID NO25)和L303(SEQ IDNO35)；H1089(SEQ ID NO25)和L298(SEQ ID NO36)；或H1089(SEQBD NO25)和L321(SEQ ID NO37)。

本發(fā)明還包括包含任何下述VH區(qū)和VL區(qū)組合的抗-IL-6抗體H1420(SEQ ID NO27)和L112(SEQ ID NO1)；H1420(SEQ ID NO27)和L151(SEQ ID NO2)；H1420(SEQ ID NO27)和L158(SEQ ID NO3)；H1420(SEQ ID NO27)和L159(SEQ ID NO4)；H1420(SEQ ID NO27)和L164(SEQ ID NO5)；H1420(SEQ ID NO27)和L165(SEQ ID NO6)；H1420(SEQ ID NO27)和L166(SEQ DD NO7)；H1420(SEQ ID NO27)和L167(SEQ ED NO8)；H1420(SEQ ID NO27)和L168(SEQ ID NO9)；H1420(SEQ ID NO27)和L169(SEQ ID NO10)；H1420(SEQ ID NO27)和L170(SEQ ID NO11)；H1420(SEQ ID NO27)和L171(SEQ IDNO12)；H1420(SEQ ID NO27)和L172(SEQ ID NO13)；H1420(SEQ IDNO27)和L173(SEQ ID NO14)；H1420(SEQ ID NO27)和L174(SEQ IDNO15)；H1420(SEQ ID NO27)和L175(SEQ ID NO16)；H1420(SEQ IDNO27)和L189(SEQ ID NO17)；H1420(SEQ ID NO27)和L198(SEQ IDNO18)；H1420(SEQ ID NO27)和L314(SEQ ID NO33)；H1420(SEQ IDNO27)和L305(SEQ ID NO34)；H1420(SEQ ID NO27)和L303(SEQ IDNO35)；H1420(SEQ ID NO27)和L298(SEQ ID NO36)；或H1420(SEQID NO27)和L321(SEQ ED NO37)。

本發(fā)明還包括包含任何下述VH區(qū)和VL區(qū)組合的抗-IL-6抗體H1515(SEQ ID NO29)和L112(SEQ ID NO1)；H1515(SEQ ID NO29)和L151(SEQ ID NO2)；H1515(SEQ ID NO29)和L158(SEQ ID NO3)；H1515(SEQ ID NO29)和L159(SEQ ID NO4)；H1515(SEQ ID NO29)和L164(SEQ ID NO5)；H1515(SEQ ID NO29)和L165(SEQ ID NO6)；H1515(SEQ ID NO29)和L166(SEQ ID NO7)；H1515(SEQ ID NO29)和L167(SEQ ID NO8)；H1515(SEQ ID NO29)和L168(SEQ ID NO9)；H1515(SEQ ID NO29)和L169(SEQ ID NO10)；H1515(SEQ ID NO29)和L170(SEQ ID NO11)；H1515(SEQ ID NO29)和L171(SEQ ID NO12)；H1515(SEQ ID NO29)和L172(SEQ ID NO13)；H1515(SEQ IDNO29)和L173(SEQ ID NO14)；H1515(SEQ ID NO29)和L174(SEQ IDNO15)；H1515(SEQ ID NO29)和L175(SEQ ID NO16)；H1515(SEQID NO29)和L189(SEQ ID NO17)；H1515(SEQ ID NO29)和L198(SEQID NO18)；H1515(SEQ ID NO29)和L314(SEQ ID NO33)；H1515(SEQID NO29)和L305(SEQ ID NO34)；H1515(SEQ ID NO29)和L303(SEQID NO35)；H1515(SEQ ID NO29)和L298(SEQ ID NO36)；或H1515(SEQ ID NO29)和L321(SEQ ID NO37)。

本發(fā)明還包括包含任何下述VH區(qū)和VL區(qū)組合的抗-IL-6抗體H1362(SEQ ID NO30)和L112(SEQ ID NO1)；H1362(SEQ ID NO30)和L151(SEQ ID NO2)；H1362(SEQ ID NO30)和L158(SEQ ID NO3)；H1362(SEQ ID NO30)和L159(SEQ ID NO4)；H1362(SEQ ID NO30)和L164(SEQ ID NO5)；H1362(SEQ ID NO30)和L165(SEQ ID NO6)；H1362(SEQ ID NO30)和L166(SEQ ID NO7)；H1362(SEQ ID NO30)和L167(SEQ ID NO8)；H1362(SEQ ID NO30)和L168(SEQ ID NO9)；H1362(SEQ ID NO30)和L169(SEQ ID NO10)；H1362(SEQ ID NO30)和L170(SEQ ID NO11)；H1362(SEQ ID NO30)和L171(SEQ IDNO12)；H1362(SEQ ID NO30)和L172(SEQ ID NO13)；H1362(SEQ IDNO30)和L173(SEQ ID NO14)；H1362(SEQ ID NO30)和L174(SEQ IDNO15)；H1362(SEQ ID NO30)和L175(SEQ ID NO16)；H1362(SEQ IDNO30)和L189(SEQ ID NO17)；H1362(SEQ ID NO30)和L198(SEQ IDNO18)；H1362(SEQ ID NO30)和L314(SEQ ID NO33)；H1362(SEQ IDNO30)和L305(SEQ ID NO34)；H1362(SEQ ID NO30)和L303(SEQ IDNO35)；H1362(SEQ ID NO30)和L298(SEQ ID NO36)；或H1362(SEQID NO30)和L321(SEQ ID NO37)。

本發(fā)明還包括包含任何下述VH區(qū)和VL區(qū)組合的抗-IL-6抗體H1437(SEQ ID NO31)和L112(SEQ ID NO1)；H1437(SEQ ID NO31)和L151(SEQ ID NO2)；H1437(SEQ ID NO31)和L158(SEQ ID NO3)；H1437(SEQ ID NO31)和L159(SEQ ID NO4)；H1437(SEQ ID NO31)和L164(SEQ ID NO5)；H1437(SEQ ID NO31)和L165(SEQ ID NO6)；H1437(SEQ ID NO31)和L166(SEQ ID NO7)；H1437(SEQ ID NO31)和L167(SEQ ED NO8)；H1437(SEQ ID NO31)和L168(SEQ ID NO9)；H1437(SEQ ID NO31)和L169(SEQ ID NO10)；H1437(SEQ ID NO31)和L170(SEQ ID NO11)；H1437(SEQ ID NO31)和L171(SEQ IDNO12)；H1437(SEQ ID NO31)和L172(SEQ ID NO13)；H1437(SEQ IDNO31)和L173(SEQ ID NO14)；H1437(SEQ ID NO31)和L174(SEQ IDNO15)；H1437(SEQ ID NO31)和L175(SEQ ID NO16)；H1437(SEQ IDNO31)和L189(SEQ ID NO17)；H1437(SEQ ID NO31)和L198(SEQ IDNO18)；H1437(SEQ ID NO31)和L314(SEQ ID NO33)；H1437(SEQ IDNO31)和L305(SEQ ID NO34)；H1437(SEQ ED NO31)和L303(SEQ IDNO35)；H1437(SEQ ID NO31)和L298(SEQ ID NO36)；或H1437(SEQID NO31)和L321(SEQ ID NO37)。

本發(fā)明還包括包含任何下述VH區(qū)和VL區(qū)組合的抗-IL-6抗體H1461(SEQ ID NO32)和L112(SEQ ID NO1)；H1461(SEQ ID NO32)和L151(SEQ ID NO2)；H1461(SEQ ID NO32)和L158(SEQ ID NO3)；H1461(SEQ ID NO32)和L159(SEQ ID NO4)；H1461(SEQ ID NO32)和L164(SEQ ID NO5)；H1461(SEQ ID NO32)和L165(SEQ ID NO6)；H1461(SEQ ID NO32)和L166(SEQ ID NO7)；H1461(SEQ ID NO32)和L167(SEQ ID NO8)；H1461(SEQ ID NO32)和L168(SEQ ID NO9)；H1461(SEQ ID NO32)和L169(SEQ ID NO10)；H1461(SEQ ID NO32)和L170(SEQ ID NO11)；H1461(SEQ ID NO32)和L171(SEQ IDNO12)；H1461(SEQ ID NO32)和L172(SEQ ID NO13)；H1461(SEQ IDNO32)和L173(SEQ ID NO14)；H1461(SEQ ID NO32)和L174(SEQ IDNO15)；H1461(SEQ ID NO32)和L175(SEQ ID NO16)；H1461(SEQ IDNO32)和L189(SEQ ID NO17)；H1461(SEQ ID NO32)和L198(SEQ IDNO18)；H1461(SEQ ID NO32)和L314(SEQ ID NO33)；H1461(SEQ IDNO32)和L305(SEQ ID NO34)；H1461(SEQ ID NO32)和L303(SEQ IDNO35)；H1461(SEQ ID NO32)和L298(SEQ ID NO36)；或H1461(SEQID NO32)和L321(SEQ ID NO37)。

本發(fā)明還包括包含任何下述VH區(qū)和VL區(qū)組合的抗-IL-6抗體H1519(SEQ ID NO38)和L112(SEQ ID NO1)；H1519(SEQ ID NO38)和L151(SEQ ID NO2)；H1519(SEQ ID NO38)和L158(SEQ ID NO3)；H1519(SEQ ID NO38)和L159(SEQ ID NO4)；H1519(SEQ ID NO38)和L164(SEQ ID NO5)；H1519(SEQ ID NO38)和L165(SEQ ID NO6)；H1519(SEQ ID NO38)和L166(SEQ ID NO7)；H1519(SEQ ID NO38)和L167(SEQ ID NO8)；H1519(SEQ ID NO38)和L168(SEQ ID NO9)；H1519(SEQ ID NO38)和L169(SEQ ID NO10)；H1519(SEQ ID NO38)和L170(SEQ ID NO11)；H1519(SEQ ID NO38)和L171(SEQ IDNO12)；H1519(SEQ ID NO38)和L172(SEQ ID NO13)；H1519(SEQ IDNO38)和L173(SEQ ID NO14)；H1519(SEQ ID NO38)和L174(SEQ IDNO15)；H1519(SEQ ID NO38)和L175(SEQ ID NO16)；H1519(SEQ IDNO38)和L189(SEQ ID NO17)；H1519(SEQ ID NO38)和L198(SEQ IDNO18)；H1519(SEQ ID NO38)和L314(SEQ ID NO33)；H1519(SEQ IDNO38)和L305(SEQ ID NO34)；H1519(SEQ ID NO38)和L303(SEQ IDNO35)；H1519(SEQ ID NO38)和L298(SEQ ID NO36)；或H1519(SEQID NO38)和L321(SEQ ID NO37)。

本發(fā)明還包括包含任何下述VH區(qū)和VL區(qū)組合的抗-IL-6抗體H1520(SEQ ID NO39)和L112(SEQ ID NO1)；H1520(SEQ ID NO39)和L151(SEQ ID NO2)；H1520(SEQ ID NO39)和L158(SEQ ID NO3)；H1520(SEQ ID NO39)和L159(SEQ ID NO4)；H1520(SEQ ID NO39)和L164(SEQ ID NO5)；H1520(SEQ ID NO39)和L165(SEQ ID NO6)；H1520(SEQ ID NO39)和L166(SEQ ID NO7)；H1520(SEQ ID NO39)和L167(SEQ ID NO8)；H1520(SEQ ID NO39)和L168(SEQ ID NO9)；H1520(SEQ ID NO39)和L169(SEQ ID NO10)；H1520(SEQ ID NO39)和L170(SEQ ID NO11)；H1520(SEQ ID NO39)和L171(SEQ IDNO12)；H1520(SEQ ID NO39)和L172(SEQ ID NO13)；H1520(SEQ IDNO39)和L173(SEQ ID NO14)；H1520(SEQ ID NO39)和L174(SEQ IDNO15)；H1520(SEQ ID NO39)和L175(SEQ ID NO16)；H1520(SEQ IDNO39)和L189(SEQ ID NO17)；H1520(SEQ ID NQ39)和L198(SEQ IDNO18)；H1520(SEQ ID NO39)和L314(SEQ ID NO33)；H1520(SEQ IDNO39)和L305(SEQ ID NO34)；H1520(SEQ ID NO39)和L303(SEQ IDNO35)；H1520(SEQ ID NO39)和L298(SEQ ID NO36)；或H1520(SEQID NO39)和L321(SEQ ED NO37)。

本發(fā)明還包括包含任何下述VH區(qū)和VL區(qū)組合的抗-IL-6抗體H1521(SEQ ID NO40)和L112(SEQ ID NO1)；H1521(SEQ ID NO40)和L151(SEQ ID NO2)；H1521(SEQ ID NO40)和L158(SEQ ID NO3)；H1521(SEQ ID NO40)和L159(SEQ ID NO4)；H1521(SEQ ID NO40)和L164(SEQ ID NO5)；H1521(SEQ ID NO40)和L165(SEQ ID NO6)；H1521(SEQ ID NO40)和L166(SEQ ID NO7)；H1521(SEQ ID NO40)和L167(SEQ ID NO8)；H1521(SEQ ID NO40)和L168(SEQ ID NO9)；H1521(SEQ ID NO40)和L169(SEQ ID NO10)；H1521(SEQ ID NO40)和L170(SEQ ID NO11)；H1521(SEQ ID NO40)和L171(SEQ TDNO12)；H1521(SEQ ID NO40)和L172(SEQ ID NO13)；H1521(SEQ IDNO40)和L173(SEQ ID NO14)；H1521(SEQ ID NO40)和L174(SEQ IDNO15)；H1521(SEQ ID NO40)和L175(SEQ ID NO16)；H1521(SEQ IDNO40)和L189(SEQ ID NO17)；H1521(SEQ ID NO40)和L198(SEQ IDNO18)；H1521(SEQ ID NO40)和L314(SEQ ID NO33)；H1521(SEQ IDNO40)和L305(SEQ ID NO34)；H1521(SEQ ID NO40)和L303(SEQ IDNO35)；H1521(SEQ ID NO40)和L298(SEQ ID NO36)；或H1521(SEQID NO40)和L321(SEQ ID NO37)。

本發(fā)明還包括包含任何下述VH區(qū)和VL區(qū)組合的抗-IL-6抗體H1522(SEQ ID NO41)和L112(SEQ ID NO1)；H1522(SEQ EDNO41)和L151(SEQ ID NO2)；H1522(SEQ ID NO41)和L158(SEQ IDNO3)；H1522(SEQ ID NO41)和L159(SEQ ID NO4)；H1522(SEQ IDNO41)和L164(SEQ ID NO5)；H1522(SEQ ID NO41)和L165(SEQ IDNO6)；H1522(SEQ ID NO41)和L166(SEQ ID NO7)；H1522(SEQ IDNO41)和L167(SEQ ID NO8)；H1522(SEQ ID NO41)和L168(SEQ IDNO9)；H1522(SEQ ID NO41)和L169(SEQ ID NO10)；H1522(SEQ IDNO41)和L170(SEQ ID NO11)；H1522(SEQ ID NO41)和L171(SEQ IDNO12)；H1522(SEQ ID NO41)和L172(SEQ ID NO13)；H1522(SEQ IDNO41)和L173(SEQ ID NO14)；H1522(SEQ ID NO41)和L174(SEQ IDNO15)；H1522(SEQ ID NO41)和L175(SEQ ID NO16)；H1522(SEQ IDNO41)和L189(SEQ ID NO17)；H1522(SEQ ID NO41)和L198(SEQ IDNO18)；H1522(SEQ ID NO41)和L314(SEQ ID NO33)；H1522(SEQ IDNO41)和L305(SEQ ID NO34)；H1522(SEQ ID NO41)和L303(SEQ IDNO35)；H1522(SEQ ID NO41)和L298(SEQ ID NO36)；或H1522(SEQID NO41)和L321(SEQ ID NO37)。

本發(fā)明還包括包含任何下述VH區(qū)和VL區(qū)組合的抗-IL-6抗體H1553(SEQ DD NO42)和L112(SEQ ID NO1)；H1553(SEQ IDNO42)和L151(SEQ ID NO2)；H1553(SEQ ID NO42)和L158(SEQ IDNO3)；H1553(SEQ ID NO42)和L159(SEQ ID NO4)；H1553(SEQ IDNO.42)和L164(SEQ ID NO5)；H1553(SEQ ID NO42)和L165(SEQ IDNO6)；H1553(SEQ ID NO42)和L166(SEQ ID NO7)；H1553(SEQ IDNO42)和L167(SEQ ID NO8)；H1553(SEQ ED NO42)和L168(SEQ IDNO9)；H1553(SEQ ID NO42)和L169(SEQ ID NO10)；H1553(SEQ IDNO42)和L170(SEQ ID NO11)；H1553(SEQ ID NO42)和L171(SEQ IDNO12)；H1553(SEQ ID NO42)和L172(SEQ ID NO13)；H1553(SEQ IDNO42)和L173(SEQ ID NO14)；H1553(SEQ ID NO42)和L174(SEQ IDNO15)；H1553(SEQ ED NO42)和L175(SEQ ID NO16)；H1553(SEQ IDNO42)和L189(SEQ ID NO17)；H1553(SEQ ID NO42)和L198(SEQ IDNO18)；H1553(SEQ ID NO42)和L314(SEQ ID NO33)；H1553(SEQ IDNO42)和L305(SEQ ID NO34)；H1553(SEQ ID NO42)和L303(SEQ IDNO35)；H1553(SEQ ID NO42)和L298(SEQ ID NO36)；或H1553(SEQID NO42)和L321(SEQ ID NO37)。

本發(fā)明還包括包含任何下述VH區(qū)和VL區(qū)組合的抗-IL-6抗體H1579(SEQ ID NO43)和L112(SEQ ID NO1)；H1579(SEQ ID NO43)和L151(SEQ ID NO2)；H1579(SEQ ID NO43)和L158(SEQ DD NO3)；H1579(SEQ ID NO43)和L159(SEQ ID NO4)；H1579(SEQ ID NO43)和L164(SEQ ED NO5)；H1579(SEQ ID NO43)和L165(SEQ ID NO6)；H1579(SEQ TD NO43)和L166(SEQ ID NO7)；H1579(SEQ ID NO43)和L167(SEQ ED NO8)；H1579(SEQ ID NO43)和L168(SEQ ID NO9)；H1579(SEQ ID NO43)和L169(SEQ ID NO10)；H1579(SEQ ID NO43)和L170(SEQ ID NO11)；H1579(SEQ ID NO43)和L171(SEQ IDNO12)；H1579(SEQ ID NO43)和L172(SEQ ID NO13)；H1579(SEQ IDNO43)和L173(SEQ ID NO14)；H1579(SEQ ID NO43)和L174(SEQ IDNO15)；H1579(SEQ ID NO43)和L175(SEQ ID NO16)；H1579(SEQ IDNO43)和L189(SEQ ID NO17)；H1579(SEQ ID NO43)和L198(SEQ IDNO18)；H1579(SEQ ID NO43)和L314(SEQ ID NO33)；H1579(SEQ IDNO43)和L305(SEQ ID NO34)；H1579(SEQ ID NO43)和L303(SEQ IDNO35)；H1579(SEQ ID NO43)和L298(SEQ ID NO36)；或H1579(SEQID NO43)和L321(SEQ ID NO37)。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解包含VH區(qū)和VL區(qū)組合的任何前述抗體可包括通常發(fā)現(xiàn)于抗體分子中的一個或多個另外的區(qū)域(或“結(jié)構(gòu)域”)，例如一個或多個恒定重鏈區(qū)(例如，CH1，CH2和/或CH3)，和/或恒定輕鏈區(qū)(CL)。優(yōu)選，如本文所述，包含VH區(qū)和VL區(qū)組合的抗體將特異性結(jié)合IL-6抗原。
核酸分子，載體和細胞
本發(fā)明包括編碼抗-IL-6抗體重鏈的核酸分子，所述抗-IL-6抗體重鏈包含任一本文所述VH區(qū)，包括VH區(qū)的任何氨基酸變體。本發(fā)明還包括編碼抗-IL-6抗體輕鏈的核酸分子，所述抗-IL-6抗體輕鏈包含任一本文所述VL區(qū)，包括VL區(qū)的任何氨基酸變體。在某些實施方式中，所述核酸分子編碼抗-IL-6抗體重鏈的部分或抗-IL-6抗體輕鏈的部分。例如，本發(fā)明包括編碼多肽的核酸分子，所述多肽包含本文所述抗-IL-6VH的一個或多個CDR，包括SEQ ID NOs51到73代表的任何CDR。本發(fā)明還包括編碼多肽的核酸分子，所述多肽包含本文所述的抗-IL-6VL的一個或多個CDR，包括SEQ ID NOs74到96代表的任何CDR。

本發(fā)明還包括編碼任何本文所述VH區(qū)的核酸分子，所述VH區(qū)包括SEQ ID NOs19到32和38到43代表的任何VH區(qū)。本發(fā)明包括編碼VH區(qū)的核酸分子，所述VH區(qū)具有與SEQ ID NOs19到32和38到43中的任一個至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列，其中包含所述VH區(qū)的抗體特異性結(jié)合IL-6。

本發(fā)明還包括編碼任何本文所述VL區(qū)的核酸分子，所述VL區(qū)包括SEQ ID NOs1到18和33到37代表的任何VL區(qū)。本發(fā)明包括編碼VL區(qū)的核酸分子，所述VL區(qū)具有與SEQ ID NOs1到18和33到37中的任一個至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列，其中包含所述VL區(qū)的抗體特異性結(jié)合IL-6。

本發(fā)明還包括包含任何本文所述的核酸分子的表達載體。示例性的載體包括質(zhì)粒，噬菌粒，粘粒，病毒和噬菌體核酸或能夠在原核或真核細胞中自主復制或被復制的其他核酸分子。在某些實施方式中，載體能夠在哺乳動物細胞中復制。典型的表達載體包含用于調(diào)節(jié)本發(fā)明的核酸分子的表達的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子，起始序列，和啟動子。載體還包含基因表達盒，所述基因表達盒包含至少一種獨立終止子序列，允許載體在真核生物和原核生物中的載體復制的序列，即穿梭載體，和用于原核和真核系統(tǒng)的選擇標記。載體優(yōu)選包含提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型特性例如賦予對抗生素例如氨比西林或新霉素的抗性的標記。

本發(fā)明的核酸分子可在一種或多種啟動子的控制之下。例如，核酸分子可在組成型啟動子或可誘導啟動子的控制之下。示例性的啟動子包括源于人巨細胞病毒的啟動子，金屬硫蛋白啟動子，SV-40早期啟動子，SV-40晚期啟動子，鼠乳房腫瘤病毒啟動子，勞氏肉瘤病毒啟動子，多角體蛋白啟動子，或顯示出對于在真核細胞中表達有效的其他啟動子。

本發(fā)明還包括包含本發(fā)明的核酸分子或載體的宿主細胞。術(shù)語“宿主細胞”表示本發(fā)明的核酸分子或載體引入其中的細胞或細胞群。本發(fā)明的宿主細胞優(yōu)選是真核細胞或細胞系，優(yōu)選植物，動物，脊椎動物，哺乳動物，嚙齒動物，小鼠，靈長類動物，或人細胞或細胞系。術(shù)語“宿主細胞群”表示本發(fā)明的核酸分子或載體可引入其中并在其中表達的培養(yǎng)的細胞群。任何支持從本發(fā)明的核酸分子或載體表達的宿主細胞是意圖的。雖然優(yōu)選宿主細胞群是單培養(yǎng)物，即群體中每個細胞是相同的細胞類型，混合細胞培養(yǎng)物也是預期的。本發(fā)明的宿主細胞可以是粘附的，即生長的宿主細胞粘附于固相基質(zhì)，或替代地，宿主細胞可以在懸浮液中。宿主細胞可以是源于原發(fā)性腫瘤的細胞，源于轉(zhuǎn)移性腫瘤的細胞，初級細胞，具有喪失的接觸抑制的細胞，轉(zhuǎn)化的初級細胞，永生化的初級細胞，可經(jīng)歷細胞凋亡的細胞，和源于其的細胞系。

本發(fā)明還包括產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的方法，該方法包含(i)培養(yǎng)表達編碼本發(fā)明的抗體的一種或多種核酸序列的宿主細胞，和(ii)從培養(yǎng)基中回收抗體。
藥物組合物
本發(fā)明的抗-IL-6抗體可引入適于給予受試者的藥物組合物中。典型地，藥物組合物包含本發(fā)明的抗體或抗體部分和藥學上可接受的載體。如本文所用，“藥學上可接受的載體”包括任何和所有的溶劑，分散介質(zhì)，包衣，抗細菌和抗真菌試劑，等滲和吸收延遲試劑，和生理學上兼容的類似物。藥學上可接受的載體可進一步包含少量的輔助物質(zhì)例如濕潤或乳化試劑，防腐劑或緩沖劑，其增強抗體或抗體部分的保存期限或有效性。

本發(fā)明的藥物組合物可以是多種形式。這包括例如，液體，半固體和固體劑量形式，例如液體溶液(例如，可注射和可輸注的溶液)，分散液或懸浮液，片劑，丸劑，粉劑，脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選形式依賴于給藥和治療應用意圖的模式。典型優(yōu)選的組合物是可注射或可輸注溶液的形式，例如類似于用于用其他抗體對人的被動免疫的組合物。給藥的優(yōu)選模式是腸胃外(例如，靜脈內(nèi)，皮下，腹膜內(nèi)，肌肉內(nèi))。在一個優(yōu)選的實施方式中，抗體通過靜脈內(nèi)輸注或注射給藥。在另一優(yōu)選的實施方式中，抗體通過肌肉內(nèi)或皮下注射給藥。

治療組合物典型地必須是無菌的和在制備和儲存條件下是穩(wěn)定的。組合物可制劑為溶液，微乳劑，分散液，脂質(zhì)體，或適合于高藥物濃度的其他規(guī)則結(jié)構(gòu)。根據(jù)需要，可通過在具有一種或多種上面列舉的成分的適當溶劑中引入需要量的活性化合物(即，抗體或抗體部分)，然后通過過濾滅菌，而制備無菌可注射溶液。通常，通過將活性化合物引入包含堿性分散培養(yǎng)基和來自上面列舉的需要的其他成分的無菌載體而制備分散液。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉劑的例子中，制備的優(yōu)選方法是制備無菌可注射溶液，制備的優(yōu)選方法是產(chǎn)生活性成分加上來自其先前無菌過濾溶液的另外的期望成分的粉末的真空干燥和冷凍干燥?？杀３秩芤旱倪m當?shù)牧鲃有?，例如，通過利用包衣例如卵磷脂，在分散液的例子中通過保持期望的顆粒大小，并且通過利用表面活性劑?？勺⑸浣M合物的延長吸收可通過在組合物中包括延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鹽和凝膠而產(chǎn)生。

本發(fā)明的抗-IL-6抗體可通過多種本領(lǐng)域已知的方法給予，盡管用于許多治療用途，優(yōu)選的給藥途徑/模式是靜脈內(nèi)注射或輸注。如本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將理解的，給藥途徑和/或模式將根據(jù)期望的結(jié)果而改變。在某些實施方式中，活性化合物可與將保護化合物免于快速釋放的載體一起制備，例如控釋制劑，包括植入體，經(jīng)皮貼片，和微膠囊化遞送系統(tǒng)。生物可降解，生物兼容的聚合物可被利用，例如乙烯乙烯基醋酸酯，聚酐，聚乙醇酸，膠原蛋白，聚原酸酯，和聚乳酸。制備所述制劑的許多方法是專利方法并且對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員是公知的。見例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

在某些實施方式中，本發(fā)明的抗-IL-6抗體可以是口服給藥，例如與惰性稀釋液或可吸收的食用載體一起。化合物(和其他成分，如果期望的話)還可包封在硬或軟的殼凝膠膠囊中，壓縮為片劑，或直接引入受試者的食物中。對于口服治療給藥，化合物可與賦形劑一起引入，并且以可消化片劑，口腔片劑，含片，膠囊，酏劑，懸浮液，糖漿，晶片等形式食用。為通過腸胃外給藥之外的方法給予本發(fā)明的化合物，用預防其失活的材料包被化合物或與化合物共給藥是必要的。

補充的活性化合物也可引入組合物中。在某些實施方式中，本發(fā)明的抗體或抗體部分與一種或多種另外的治療試劑共制劑和/或共給藥。在一些實施方式中，所述一種或多種另外的治療試劑是用于治療本文所述的疾病或病癥的試劑，特別是在名為“本發(fā)明的抗-IL-6抗體”的部分中所述的疾病或病癥。例如，本發(fā)明的抗-IL-6抗體可以與結(jié)合IL-6或其他靶標例如結(jié)合IL-6受體的抗體的一種或多種其他抗體共制劑和/或共給藥。

如本文所用的，術(shù)語“治療”指治療性治療，包括預防性措施，其中目標是預防或降低(減少)與疾病或病癥相關(guān)的不期望的生理學改變。有益或期望的臨床結(jié)果包括但不限于癥狀的緩解，疾病或病癥程度的減輕，疾病或病癥的穩(wěn)定化(即，疾病或病癥不惡化)，疾病或病癥進展的延遲或減慢，疾病或病癥的改善或減輕，和疾病或病癥的免除(部分或全部)，可檢測或不可檢測地。“治療”還可表示與當不接受治療時預期的存活相比延長的存活。需要治療的那些人包括已經(jīng)具有疾病或病癥的那些人以及具有疾病或病癥的傾向的那些人或疾病或病癥有待于預防的那些人。

本發(fā)明的藥物組合物可包括“治療有效量”或“預防有效量”的本發(fā)明的抗-IL-6抗體。“治療有效量”指足以獲得期望的治療結(jié)果的劑量和時期的有效數(shù)量?？贵w的治療有效量可根據(jù)因素例如個體的疾病狀態(tài)，年齡，性別和體重，以及抗體或抗體部分在個體中產(chǎn)生期望的應答的能力，而改變。而且，在治療有效量中抗體或抗體部分的毒性或有害效果被治療有益效果超過?！邦A防有效量”指足以獲得期望的預防結(jié)果的劑量和時期的有效數(shù)量。典型地，由于預防劑量在疾病之前或在疾病早期階段用于受試者，預防有效量將小于治療有效量。

可調(diào)整劑量方案以提供最佳期望的應答(例如，治療或預防應答)。例如，可給予單個大丸劑，可隨著時間給予幾個分開的劑量，或者可如治療環(huán)境的緊急所指示，適當?shù)亟档突蛱岣邉┝俊榻o藥的方便和劑量的均勻，將腸胃外組合物制劑為劑量單元形式是特別優(yōu)選的。本文所用的劑量單元形式指適于作為用于待治療的哺乳動物受試者的單元劑量的物理上分離的單元；每個單元包含為與需要的藥物載體聯(lián)合產(chǎn)生預期治療效果而計算出的預定量的活性化合物。本發(fā)明劑量單元形式的具體要求由以下因素規(guī)定并且直接依賴于以下因素(a)活性化合物的獨特性質(zhì)和要獲得的特定治療或預防效果，和(b)本領(lǐng)域為處理個體中的敏感性的混合所述活性化合物的固有限制。

本發(fā)明抗-IL-6抗體的一個示例性，非限制性范圍的治療或預防有效量是0.1-20mg/kg，更優(yōu)選1-10mg/kg。要足以劑量值可隨待緩解的病癥的類型和嚴重性而改變。需要進一步理解對于任何特定受試者，特定劑量方案硬根據(jù)個體需要和給予或減毒組合物給予的人的職業(yè)判斷而隨著時間調(diào)節(jié)，并且本文所述的劑量范圍僅僅是示例性的并且不意圖限制所請求的組合物的范圍或?qū)嵺`。
本發(fā)明的抗-IL-6抗體的治療用途
本發(fā)明的抗體可用于治療由IL-6的作用介導，與其相關(guān)，或由其引起的任何疾病或病癥。例如，本發(fā)明的抗體可用于治療產(chǎn)生于IL-6與IL-6受體結(jié)合的疾病或病癥。本發(fā)明的抗體可用于治療由細胞內(nèi)信號傳導事件引起的疾病或病癥，所述細胞內(nèi)信號傳導事件產(chǎn)生于，直接或間接地，IL-6與IL-6受體的結(jié)合。示例性的細胞內(nèi)IL-6信號傳導途徑圖示于圖11。本發(fā)明的抗體可用于治療由任何圖11所示的分子引起或與其相關(guān)的任何疾病或病癥，其活性被IL-6與IL-6受體的結(jié)合所影響。

因此，本發(fā)明包括用于治療由IL-6的作用介導，與其相關(guān)，或由其引起的疾病或病癥。本方法包含給予有此需要的患者本文所述的抗-IL-6抗體。表述“本文所述抗-IL-6抗體”意圖表示包含任何本文所述VH區(qū)和/或VL區(qū)的任何抗-IL-6抗體，以及包含任何本文所述VH區(qū)的變體和/或任何本文所述VL區(qū)的變體的任何抗-IL-6抗體“本文所述抗-IL-6抗體”還意圖表示包含本文所述的一個或多個VH CDRs(例如，CDR1，CDR2和/或CDR3)和/或一個或多個VL CDRs(例如，CDR1，CDR2和/或CDR3)的任何抗-IL-6抗體。優(yōu)選，所述抗體特異性結(jié)合IL-6抗原。

在一些實施方式中，待治療的疾病或病癥選自自身免疫疾病或病癥，與異?；虿贿m當?shù)难馨l(fā)生相關(guān)的疾病或病癥，癌癥，骨關(guān)節(jié)炎，特發(fā)性青少年關(guān)節(jié)炎，和纖維變性病癥。

在一個示例性實施方式中，本發(fā)明提供了用于治療自身免疫疾病或病癥的方法，其中該方法包含給予有此需要的患者本文所述的抗-IL-6抗體。可用本發(fā)明的抗-IL-6抗體治療的示例性的自身免疫疾病和病癥包括，例如，同種異體移植排斥，自身免疫甲狀腺疾病(例如，Graves′疾病和Hashimoto′s甲狀腺炎)，自身免疫性葡萄膜炎(autoimmuneuveoretinitis)，巨細胞動脈炎，炎性腸疾病(包括例如，Crohn′s疾病，潰瘍性結(jié)腸炎，局限性腸炎，肉芽腫性腸炎，末梢回腸炎，節(jié)段性回腸炎，和末端回腸炎)，胰島素依賴性糖尿病，多發(fā)性硬化癥，惡性貧血癥，牛皮癬，關(guān)節(jié)炎，類風濕性關(guān)節(jié)炎，肉狀瘤病，硬皮病，和全身性紅斑狼瘡。

本發(fā)明包括治療與異常或不適當?shù)难馨l(fā)生相關(guān)的疾病或病癥的方法，其中所述方法包含給予有此需要的患者本文公開的抗-IL-6抗體。可用本發(fā)明的抗-IL-6抗體治療的與異?；虿贿m當?shù)难馨l(fā)生相關(guān)的示例性的疾病和病癥包括例如，心血管疾病例如血管瘤，血管纖維瘤，血管畸形，動脈硬化癥，粘連性和水腫性硬化(synechia and edemicsclerosis)，和眼科疾病例如角膜移植后的新血管形成，新生血管性青光眼，糖尿病性視網(wǎng)膜病，晶體后纖維增生癥，和顆粒狀結(jié)膜炎。可被本發(fā)明的抗-IL-6抗體治療的與不適當?shù)难苌上嚓P(guān)的炎性疾病包括例如，關(guān)節(jié)炎，皮膚病學疾病例如牛皮癬，毛細管擴張，膿性肉芽瘤，脂溢性皮炎，靜脈潰瘍，痤瘡，紅斑痤瘡(rosacea)(酒糟鼻(cne rosacea)或紅斑(erythematosa))，疣(warts)(疣(verrucas))，濕疹，血管瘤，和淋巴管生成(lymphangiogenesis)。

本發(fā)明包括治療癌癥的方法，其中所述方法包含給予有此需要的患者本文所述的抗-IL-6抗體?？杀槐景l(fā)明的抗-IL-6抗體治療的示例性癌癥包括例如，產(chǎn)生于免疫細胞異常的癌癥，包括骨髓癌如多發(fā)性骨髓癌，和骨髓性白血病(CML)，以及淋巴細胞性白血病(CLL和ALL)和淋巴瘤，特別是非Hodgkin′s淋巴瘤(NHL)。本發(fā)明的抗體還可用于治療例如，腎癌，乳癌，前列腺癌，淋巴瘤，移植后淋巴瘤，和移植后淋巴增生性疾病(也稱為移植后淋巴增殖性病癥)。

可被本發(fā)明的抗-IL-6抗體治療的另外病癥包括例如，骨關(guān)節(jié)炎，特發(fā)性青少年關(guān)節(jié)炎，類風濕性關(guān)節(jié)炎，和纖維變性病癥(例如內(nèi)部和外部器官瘢痕形成)。

本發(fā)明還包括本發(fā)明的抗體用于制備治療本文所述的疾病或病癥的藥物中的用途。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易地理解本文所述的組合物，方法和用途的其他適當?shù)男揎椇驼{(diào)整是顯而易見的，并且可在不偏離本發(fā)明或其任何實施方式的范圍的前提下作出?，F(xiàn)在已經(jīng)詳細描述了本發(fā)明，參考下面實施例將更容易理解上述，所述實施例包括在此僅僅為了例示的目的，并且不意圖限制本發(fā)明。
實施例 實施例1 特異性結(jié)合IL-6的第一代人單克隆抗體
本實施例的目的是從稱為B-E8(也稱為Elsilimomab)的鼠IL-6抗體產(chǎn)生人抗-IL-6單克隆抗體。

利用基于牛痘病毒的抗體篩選平臺實施了篩選方法，以鑒定當與鼠B-E8抗體的VK或VH區(qū)配對時形成特異性結(jié)合IL-6的抗體的人VH和VK區(qū)。選擇的人VH和VK然后分別用于選擇特異性結(jié)合IL-6的人VK和VH?；谂６徊《镜暮Y選平臺的細節(jié)公開于例如，美國專利申請公開號2005/0196755中。從該篩選方法，利用鼠B-E8或人VH，鑒定了18種不同的人VK基因。確定了鑒定的人VK基因的核酸序列以及它們相應的氨基酸序列。鑒定的人VK基因的氨基酸序列示于下面的表8 表8鑒定的人VK區(qū)的氨基酸序列

下劃線序列分別代表CDR 1-3。

另外，利用鼠B-E8或人VK，鑒定了7種不同的人VH基因。確定了鑒定的人VH基因和它們相應的氨基酸序列。鑒定的人VH基因的氨基酸序列示于下面的表9 表9鑒定的人VH區(qū)的氨基酸序列
下劃線序列分別代表CDR 1-3。

如下表10所示，鑒定的人VH區(qū)的氨基酸序列互相顯示出顯著的序列同一性 表10在人VH中鑒定的氨基酸序列
鑒定的人VH區(qū)的比對描繪于圖1中。

所有鑒定的人VK與所有鑒定的人VH交叉配對。通過ELISA測試了產(chǎn)生于這些交叉配對的抗體的結(jié)合IL-6的能力。還測試了所述抗體在阻斷IL-6-誘導的細胞增殖或IL-6結(jié)合IL-6R的測定中的功能活性。

通過ELISA，基于J.of Immunology Methods 77(1985)305-319中所述的方法，測量了選擇的抗體對于IL-6的親和性。簡短而言，用用包被緩沖劑中的2μg/ml的mBE4捕獲抗體包被平板，每孔100μl。平板過夜培養(yǎng)。接下來，清洗平板3次并且輕敲干燥(tapped dry)。平板然后用每孔200μl的測定稀釋液或PBS中10％FBS封閉，并且培養(yǎng)2小時。當平板封閉時，通過預培養(yǎng)大約2ng/ml濃度的65μl的Ab與65μl的不同濃度的rhIL6(從5.12μg/ml到5ng/ml以1∶2連續(xù)稀釋，總共12種不同濃度，包括沒有IL-6的一種)在溶液中建立起競爭反應。反應在RT下進行3-4小時。因此，根據(jù)作為單體的IL-6，在競爭溶液中最終的rhIL6是從98.46、49.23、24.62、12.31、6.15、3.08、1.54、0.77、0.38、0.19、0.10和0nM。接下來，平板清洗三次并且輕敲干燥。向BE4包被平板中每孔添加100μl中的50ng/ml的重組人IL-6。平板培養(yǎng)1-2小時。平板清洗三次并且輕敲干燥。接下來，來自上述的100μl的mAb樣品添加到IL-6捕獲平板中。平板在RT下培養(yǎng)2小時(因此，在此點任何未結(jié)合的mAb將通過ELISA測量)。平板人然后清洗5次并且輕敲干燥。以1∶20,000稀釋液或1∶40,000稀釋液(根據(jù)組(lot))添加100μl的檢測Ab山羊抗-人IgG F(ab)′2-HRP(Jackson lab)，并且平板培養(yǎng)1-2小時。平板清洗7次并且輕敲干燥。接下來，顯象底物(試劑盒中每種試劑等份)被預混合并且在使用前允許暖和到室溫。然后向每孔中加入100μl的顯象劑。平板允許在黑暗中的抽屜中非密封地顯象15分鐘。最后，通過添加100μl的2N H2SO4到每孔中而終止顯象，并且平板在450nm-570nm的終點讀數(shù)。

阻斷測定如本文別處所述地進行。

從VH/VK交叉配對中，鑒定了33種第一代mAb。這些第一代mAb列于下表11 表11第一代人抗-IL-6抗體的概述 *mAb 88是嵌合B-E8對照抗體
如上表所示，獲得的所有第一代人抗-IL-6抗體顯示出對于IL-6一定程度的親和性和在阻斷測定中的功能活性。簡短而言，12.5ng/ml的生物素化人重組IL-6與抗-IL-6抗體一起在冰上在顯示的濃度下培養(yǎng)20分鐘。清洗之后，鏈霉親和素-PE被添加以顯示結(jié)合于細胞表面的IL-6。清洗之后，通過流式細胞術(shù)分析細胞。

某些示例性第一代mAb的阻斷IL-6結(jié)合U266細胞上的IL-6受體的能力描繪于圖2。

本實施例因此顯示了幾種生物學功能的人抗-IL-6單克隆抗體的生產(chǎn)。
實施例2 人抗-IL-6抗體的親和性改進
利用突變以進一步改進實施例1中鑒定的第一代人mAb的功能活性。特別是，基于PCR的突變被利用以引入在mAb416的VH(H1079)和VK(L198)的CDR3中的氨基酸改變。

為引入可變性，在VH和VK基因的特定位點引入序列NNK，其中N可以是A，T，G或C，并且K是T或G。利用NNK，在每個位點可引入所有的20個氨基酸和1個終止密碼子(在NNK序列中存在32種可能的組合4×4×2)。

在H1079和L198中所有的CDR3殘基被改變，一次一個殘基。輕鏈(VK)CDR3具有9個氨基酸，并且重鏈(VH)CDR3具有12個氨基酸。還利用本方法改變在H1079的CDR1和CDR2中選擇的殘基。

為產(chǎn)生突變，為PCR反應，將編碼用NNK取代的氨基酸并且擴增CDR3和框架區(qū)4的反義引物與在感興趣的鏈的框架區(qū)1中雜交的正義引物配對。每種PCR產(chǎn)物編碼全部VK或VH鏈并且具有一個氨基酸位點轉(zhuǎn)換為NNK。

PCR產(chǎn)物被克隆如入包含人γ1(對于VH突變體)或κ(對于VK突變體)的恒定區(qū)的哺乳動物表達載體中，由此產(chǎn)生全長重或輕鏈。

克隆置于96孔平板格式中，每孔1種克隆。質(zhì)粒DNA從每種克隆中被純化并且然后通過轉(zhuǎn)染入CHO細胞每種克隆與補充鏈一起表達(例如，突變的VK將與VH一起表達)。選擇并表征更高親和性結(jié)合物。這種方法的概述示于圖3。

當鑒定了更高親和性突變體時，對突變體進行測序，通過轉(zhuǎn)染入CHO細胞產(chǎn)生了獲得的mAb，并且然后在基于流式細胞術(shù)的IL-6阻斷測定中測試其特異性，親和性和功能。

通過本方法，獲得了下列H1079和L198變體 表12通過基于PCR的突變獲得的H1079變體
*氨基酸編號代表Kabat編號。
§方框中殘基是已相對于H1079序列改變了的殘基。
下劃線殘基分別代表CDR 1-3。
表13通過基于PCR的突變獲得的L198變體
*氨基酸編號代表Kabat編號。
§方框內(nèi)殘基是相對于L198序列已改變的殘基。
下劃線序列分別代表CDR 1-3。

利用表12所述的H1079變體與L198配對產(chǎn)生了下列抗體 表14通過將H1079變體與L198配對產(chǎn)生的mAb


測試單克隆抗體416，926，810，963，968和992與對照mAb88的阻斷IL-6結(jié)合IL-6R表達細胞的能力。簡短而言，以1nM的人重組IL-6與1μg/ml-0.1μg/ml-10ng/ml-0ng/ml抗-IL-6抗體在冰上培養(yǎng)30分鐘。FcR封閉的U266細胞(大約250,000細胞)然后被添加并且另外在冰上共培養(yǎng)30分鐘。清洗之后，純化的IL-6-特異的小鼠抗體(B-F6)被添加并且與細胞在冰上培養(yǎng)30分鐘。最后，APC-綴合多克隆山羊-抗-小鼠Fcγ被添加并且在冰上培養(yǎng)30分鐘。清洗之后，通過僅僅選擇(gating on)活細胞通過流式細胞術(shù)分析細胞。每種樣品開始于250,000細胞。所有的流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)建立于10,000活(PI-陰性)細胞的最小值之上。這些試驗的結(jié)果示于圖4。

利用表13所述的L198變體與H1079配對產(chǎn)生下列抗體 表15通過將L198變體與L1079配對產(chǎn)生的mAbs
H1079中的多種突變也通過上述方法制備。
表16通過基于PCR的突變獲得的H1079多種突變體
*氨基酸編號代表Kabat編號。
§方框內(nèi)殘基是相對于H1079序列已經(jīng)改變的殘基。
下劃線序列分別代表CDR 1-3。

另外，命名為H1553的變異的重鏈通過在H1079的CDR2中進行單個氨基酸改變(F52W)而產(chǎn)生。H1553具有下述氨基酸序列

而且，在H1553的CDR2中發(fā)現(xiàn)的氨基酸改變與在H1522中的四個CDR3氨基酸取代組合以產(chǎn)生H1579，其具有下述氨基酸序列

如下表17所示，通過組合VH和VK變體獲得下列mAb 表17通過組合VH和VK變體產(chǎn)生mAb
如表18所示，示例性mAbs對于IL-6的親和性通過IC50ELISA和Biacore確定。如上所述進行IC50ELISA。利用HBS-EP緩沖劑(Biacore AB)根據(jù)制造商說明進行通過Biacore的親和性分析。簡短而言，100μg/ml的山羊抗-人IgG(Sigma-Aldrich Co.)固定在CM5傳感器芯片的表面(Biacore AB)，對于每種IL-6mAb的親和性通過在Biacore 2000系統(tǒng)(Biacore AB)上以5μl/分鐘的流率注射15μl的5μg/ml的mAb然后以30μl/分鐘的流率注射100μl的40nM到1.25nM的人IL-6(StrathmannBiotec GmbH & Co.KG)而確定。
表18通過IC50ELISA和Biacore的mAb的親和性
單克隆抗體1259、1337、1338、1339和1340是IgG1κ。所有的恒定區(qū)是相同的。恒定區(qū)在表達質(zhì)粒中并且因此在mAb到mAb之間不改變。僅僅VH和VK區(qū)從文庫中選擇。

本實施例因此例示了通過基于PCR的突變獲得的包含變異的VH和VK鏈的幾種另外的人抗-IL-6單克隆抗體的產(chǎn)生。
實施例3 序列和載體 示例性的重和輕鏈序列
編碼鼠mAb B-E8的重和輕鏈的核苷酸序列描繪于表19 表19B-E8的重和輕鏈序列

人mAb926的重和輕鏈的氨基酸序列描繪于表20 表20mAb 926的重和輕鏈序列
人mAb1339的重和輕鏈的氨基酸序列描繪于表21 表21mAb 1339的重和輕鏈序列 表達MAB1339的重和輕鏈的雙基因載體的構(gòu)建 將重鏈H1579克隆入pCONG1中
H1579通過用BssHII和BstEII限制性酶消化可變區(qū)從原始表達載體亞克隆入HindIII/ApaI-切割pConGl。H1579.pConGl克隆被證實序列。
將輕鏈L298克隆入pCONK2
L298通過用ApaLl/XhoI消化可變區(qū)從原始表達載體亞克隆并連接入牛痘轉(zhuǎn)移載體VKE中以提供編碼對于接下來的雙基因克隆必要的限制性位點的兼容序列?？勺冃蛄斜籔CR擴增以在5’末端添加HindIII位點并在3’末端添加BsiWI位點。PCR產(chǎn)物被克隆入TOPO以促進在接下來的克隆反應中用HindIII和BsiWI的完全消化。L298TOPO被證實序列，用Hindlll/BsiWI消化并且連接入Hindlll/BsiWI-切割pConK2。L298.pConK2被證實序列。
雙基因載體的產(chǎn)生
利用H1579.pConGl消化24小時，重鏈表達盒被釋放為Notl/Pvul片段。用AviII消化L298.pConK2以防止親本克隆的再形成，并且利用Pvul和Notl消化，L298可變區(qū)盒被釋放。凝膠純化之后，重和輕鏈盒以1∶1的比例在14℃下的過夜連接反應中被連接。通過完整細胞PCR篩選集落中重和輕鏈同時插入的存在，通過測序確認陽性克隆。雙基因載體的圖譜描繪于圖9。雙基因載體的序列示于表22 表22mAb 1339雙基因載體的核苷酸序列 實施例4 表達MAB 1339的CHO細胞系的產(chǎn)生
CHO-K1HD，一種改造為在高密度懸浮培養(yǎng)物中生長的細胞系，用mAb1339雙基因載體(如上述實施例3所述)轉(zhuǎn)染。CHO-K1HD細胞保持在懸浮液中直至轉(zhuǎn)染時。轉(zhuǎn)染前一天，懸浮系被接種入存在血清的6-孔平板以允許細胞的粘附。

利用CHO-K1HD細胞隨后的傳代和從獨立的質(zhì)粒DNA制劑新近純化和消化的DNA，進行了四個獨立的轉(zhuǎn)染，每個分隔7天。每周，細胞接種入6-孔平板，一個平板2.5∶1的DNA∶lipofectamine比例，并且另一個為3.0∶1的比例。因此，在4周的進程中轉(zhuǎn)染了總共48個庫。觀察每個庫的生長和抗體產(chǎn)生水平；不是每個庫都在藥物篩選中存活。通過下述命名法表示庫mAb名稱/轉(zhuǎn)染編號，DNA∶lipofectamine比例，轉(zhuǎn)染孔字母，和盤的編號。(例子mAb 1339/12.5B2庫)。

利用3-天分泌測定測量生長率。數(shù)據(jù)以mAb滴度(μg/ml)和特定生產(chǎn)率(μg/百萬細胞/天)表示。通過ELISA確定抗體滴度和特異性。來自所有測試1339庫的分泌測定的結(jié)果示于表23。
表23轉(zhuǎn)染的CHO細胞的生產(chǎn)率

來自小規(guī)模分泌實驗的mAb產(chǎn)量描繪于圖10。
實施例5 抗體特異性和生物活性 抗體特異性
測試純化的mAb1339以確認對于IL-6的特異性。通過ELISA測試純化的mAb1339的與一組對照抗原的結(jié)合，包括人胰島素，人血清白蛋白，人血紅蛋白，和牛血清白蛋白。對于這些抗原沒有觀察到非特異性結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。

另外，通過ELISA測試了純化的mAb1339和對照mAb88與一組IL-6超家族成員的結(jié)合CNFT，制癌蛋白M，IL-1，和NNT-1。如圖5A和5B所示，在ELISA中mAb1339和mAb88都不結(jié)合任何這些細胞因子。
IL-6誘導的鼠和人細胞增殖的抑制
為評價人抗-IL-6mAb的生物學活性，評價了它們抑制IL-6誘導的鼠B9骨髓瘤細胞增殖(圖12)和IL-6誘導的人U266細胞增殖(圖13)的能力。鼠B9細胞系是人IL-6敏感的。

如圖12所示，mAb 926、1259、1337、1338、1339和1340都顯示出對于IL-6誘導的鼠骨髓瘤細胞增殖的劑量依賴的抑制效果。例如，在100ng/ml的mAb濃度，用mAb 926、1337、1338和1339觀察到的抑制水平非常接近于用鼠mAb B-E8觀察到的抑制水平。

如圖13所示，mAb 416、926和1339顯示出對于IL-6誘導的人骨髓瘤細胞增殖的劑量依賴的抑制效果。
IL-6與IL-6R之間的相互作用的抑制
為進一步評價人抗-IL-6mAbs的生物學活性，利用流式細胞術(shù)評價了它們抑制IL-6和IL-6受體之間的相互作用的能力。

利用標準方法實施流式細胞術(shù)。首先，實施在U266細胞上的Fc-受體阻斷。U266是一種生產(chǎn)IgE和IL-6的人漿細胞瘤系。U266細胞被收獲并旋轉(zhuǎn)沉淀(spun down)。細胞被計數(shù)并在流動緩沖劑中清洗兩次并且調(diào)整到大概120％測定需要的最終細胞數(shù)量，96孔平板的每孔計算150,000細胞。細胞以5×106細胞/ml重懸浮于FB中并且調(diào)整到0.1mg huIgG/ml。細胞被混合并在冰上培養(yǎng)20-30分鐘。接下來，添加15體積的FB，并且旋轉(zhuǎn)沉淀細胞。棄置上清液并且用20ml FB再清洗細胞兩次。細胞然后重懸浮到1.5×106細胞/ml的密度并且每孔添加100μl到預培養(yǎng)平板。接下來，重組人IL-6和抗-人IL-6mAb共培養(yǎng)。首先制備FB中的mAb和IL-6的所有必要稀釋液。接下來，在平板渦旋(plate vortex)上以中度功率混合平板30s之后，用50μl的IL-6(優(yōu)選最終為1nM)在冰上預培養(yǎng)50μl的mAb 30分鐘。對于每種mAb包括在不存在抗體的情況下不具有IL-6和具有IL-6的對照細胞。接下來，U266細胞與IL-6和抗-IL-6mAb共培養(yǎng)。在100μl的FB中的阻斷和清洗的細胞添加到來自上述的IL6/MAb混合物。最終培養(yǎng)體積是200μl。細胞在冰上培養(yǎng)30分鐘。培養(yǎng)之間的清洗步驟如下所述進行首先培養(yǎng)平板在設(shè)定為4℃的離心機上以250×g旋轉(zhuǎn)4分鐘。平板被小心地輕彈并且擦拭，而不使小球變位。接下來，通過以最大功率渦旋平板10s重懸浮細胞。添加220μl的FB并且平板被再次旋轉(zhuǎn)。這一清洗步驟再重復一次并且渦旋的細胞小球最后重懸浮在100μl的相應抗體稀釋液中。然后用小鼠抗-IL-6抗體B-F6培養(yǎng)這些細胞。100μl抗體(在FB中5μg/ml)被直接添加到來自上述的清洗的細胞小球中，其已經(jīng)通過簡短的渦旋而松弛，并且然后以中度功率再次小心地渦旋15s。細胞在冰上培養(yǎng)30分鐘并且清洗。接下來用APC偶聯(lián)的山羊抗-小鼠IgG1培養(yǎng)細胞。松弛的清洗的細胞小球重懸浮在100μl的標記抗體中(2.5μg別藻藍蛋白/ml)。細胞保持在黑暗中并且渦旋并且在冰上培養(yǎng)30分鐘。細胞被清洗并且重懸浮于200到400μl的FB中。然后進行通過流式細胞術(shù)的分析。首先，利用PI存料的150倍稀釋添加碘化丙錠(PI)。設(shè)置了通過觀察F1-3vs.FSC的基于排除PI的活門(live gate)。PI僅僅為接下來的細胞樣品而添加以避免具有PI的細胞的延長培養(yǎng)。

如圖6A和6B所示，在漸增濃度的IL-6而抗體濃度保持恒定在0.5μg/ml之下，mAb 926、1259、1337、1338、1339和1340都顯示出對于IL-6結(jié)合U266細胞上的IL-6受體的抑制性效果。用mAb1339觀察到顯著高水平的抑制。類似地，圖7A和7B顯示了在漸增濃度的mAb而IL-6濃度保持恒定在500ng/ml的情況下，mAb 242、416、926和1339對于IL-6結(jié)合U266細胞上的IL-6受體的抑制性效果。

當使用生物素化IL-6時，mAb的抑制性效果也被證實(數(shù)據(jù)未顯示)。

結(jié)果顯示mAb 242、416、926、1259、1337、1338、1339和1340能夠抑制IL-6和其受體之間的相互作用并且因此確認了這些mAb的生物學活性。

最后，利用mAb 416、926、1259、1337、1338、1339和1340以及對照mAb88，實施了圖4的實施例2所述的競爭測定。如圖8所示，所有測試的mAb顯示出對于重組人IL-6結(jié)合IL-6受體的劑量依賴的抑制性效果。
實施例6 MABS926和1339的MAB特異性
如上所述通過ELISA為mAbs 926和1339確定了鼠和大鼠IL-6之間的交叉反應性。用100ng/ml鼠或大鼠IL-6(R&D Systems)以100μl/孔包被孔。對于利用人單克隆抗體的實驗，IgG1κ(人骨髓瘤IgG1；Sigma-Aldrich Co.)mAb用作對照。為檢測mAb，兔抗-人IgG-HRP(Dako)以1/10,000的稀釋以100μl/孔添加。多克隆抗體(pAb)對照包括生物素化山羊抗-人IL-6(Peprotech)，生物素化山羊抗-鼠IL-6(Peprotech)，和生物素化山羊抗-人IL-2(Peprotech)。對于pAbs，鏈霉親和素-HRP(Prozyme)以100μl/孔添加用于檢測。抗體以12.5、25、50和100ng/ml的濃度應用。如圖14和15分別所示，mAbs926和1339通過ELISA沒有檢測包被的重組鼠或大鼠IL-6。
實施例7 天然人和猴IL-6的檢測
在活化的人單核細胞中分析mAbs 926和1339檢測天然人IL-6的能力。用脂多糖(LPS；20μg/ml；Sigma-Aldrich Co.)活化來自外周血單核細胞的單核細胞24小時以誘導IL-6胞漿內(nèi)的表達(數(shù)據(jù)未顯示)。在LPS處理結(jié)束之前用1μg/ml的布雷菲爾德菌素A(Brefeldin A)(Sigma-Aldrich Co.)處理細胞6小時以抑制IL-6運送到上清液。如前所述用0.8μg/ml的生物素化mAbs 88，1339，926，B-E8(抗-鼠-IL-6；Diaclone)，B-Z1(小鼠IgGl；Diaclone)，和人IgGlκ(Sigma-Aldrich Co.)通過流式細胞術(shù)分析活化的細胞。對于每種抗體進行三個獨立的實驗。代表性的實驗示于圖16，顯示出mAbS926和1339識別天然的胞漿內(nèi)IL-6。

另外，利用Diaclone高敏感性人IL-6ELISA試劑盒根據(jù)制造商說明通過ELISA確定mAbs 926和1339檢測來自人血清的天然人IL-6的能力。利用后一試劑盒，通過與包被在ELISA平板孔上的IL-6抗體的mAb競爭(5μg/ml)而確定人IL-6的檢測。在不存在競爭抗體的情況下添加包含IL-6的血清(Serum AB batch 5；Blood Center，Besancon，F(xiàn)rance)導致通過ELISA試劑盒的IL-6檢測。在競爭抗體存在下添加包含IL-6的血清導致ELISA檢測血清中IL-6的能力的下降。對照抗體包括B-E8(抗-鼠-IL-6；Diaclone)，B-Z1(小鼠IgG1；Diaclone)，和人IgG1κ(Sigma-Aldrich Co.)。如圖17所示，mAbs 926和1339檢測來自健康供體血清的天然IL-6。

利用U-Cytech猴IL-6ELISA試劑盒(U-Cytech biosciences)根據(jù)制造商說明通過ELISA確定mAb1339檢測來自獼猴血清(BPRC，TheNetherlands)的天然猴IL-6的能力。利用后一試劑盒，通過與包被在ELISA平板孔上的IL-6抗體的mAb競爭(5μg/ml)而確定猴IL-6的檢測。在不存在競爭抗體的情況下添加包含IL-6的血清導致通過ELISA試劑盒的IL-6檢測。在存在競爭抗體的情況下添加包含IL-6的血清導致ELISA試劑盒檢測血清中的IL-6的能力的降低。猴IgG1κ用作對照抗體。如圖18所示，mAb 1339檢測來自猴血清的天然IL-6。

現(xiàn)在已經(jīng)通過為清楚理解的目的的例示和實施例的方式完全詳細地描述了本發(fā)明，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，通過在寬泛和等同范圍的條件，制劑和其他參數(shù)之內(nèi)修飾或改變本發(fā)明并且不影響本發(fā)明的范圍或其任何特定實施方式而實施上述是顯而易見的，并且所述修飾或改變意圖包括在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。

說明書中提到的所有公開文獻，專利和專利申請對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員是指示性的，并且引入本文作為參考，如同每個獨立公開文獻，專利或?qū)＠暾埍惶貏e地和單獨地指明引入作為參考一樣。
序列表
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Asp Ser Ser
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65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Asn Thr Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu
100
<210>16
<211>107
<212>PRT
<213>智人
<400>16
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ile Asp Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Val Pro Thr Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Gly Thr Pro Leu
85 90 95
Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>17
<211>107
<212>PRT
<213>智人
<400>17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Met Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Gly Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ile Asn Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>18
<211>106
<212>PRT
<213>智人
<400>18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Phe Val Gly
1 5 10 15
Asp Gly Val Thr Met Thr Cys Trp Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asp Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr His Gln Arg Pro Gly Glu Ala Pro Glu Leu Leu Val
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Glu Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105
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<212>PRT
<213>智人
<400>19
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser
20 25 30
Gly Met Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Arg Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Tyr Asp Asp Tyr Leu Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
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<212>PRT
<213>智人
<400>20
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
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Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser
20 25 30
Gly Met Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
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Leu Arg Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
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100 105 110
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<213>智人
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100 105 110
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<212>PRT
<213>智人
<400>22
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Leu Lys Asn Arg Leu Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
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<212>PRT
<213>智人
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<212>PRT
<213>智人
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<212>PRT
<213>人工序列
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Phe Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly
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Ser Gly Ser Glu Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Gln His Gly His Ser Phe Pro Leu
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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20 25 30
Leu Asn Trp Tyr His Gln Arg Pro Gly Glu Ala Pro Glu Leu Leu Val
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Glu Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Gln Leu Gly His Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人L298變體
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<213>人工序列
<220>
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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<400>38
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<213>人工序列
<220>
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<400>39
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85 90 95
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100 105 110
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人H1521變體
<400>40
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
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115
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人H1522變體
<400>41
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Phe Ile Phe Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
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115
<210>42
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人H1553變體
<400>42
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
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35 40 45
Trp Leu Ala Phe Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
115
<210>43
<211>119
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人H1579變體
<400>43
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Phe Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Ala Asp Asp Tyr Leu Tyr Tyr Ser Phe Asp Thr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
115
<210>44
<211>490
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠mAb B-E8重鏈
<400>44
gtcgacccac gcgtccggac atggacaggc ttacttcttc attcctgctg ctgattgtcc 60
ctgcatatgt cttgtcccaa gttactctaa aagagtctgg ccctgggata ttgaagccct120
cacagaccct cagtctgact tgttctttct ctgggttttc actgagcact tctggtatgg180
gtgtaggctg gattcgtcag ccttcaggga agggtctgga gtggctggca cacatttggt240
gggatgatga taagtactat aacccatccc tgaagagcca gctcacaatc tccaaggata300
cctccagaaa ccaggtattc ctcaagatca ccagtgtgga cactgcagat actgccactt360
actactgtgc tcgatcctat gatgactatc tttactatgc tttggactac tggggtcaag420
gaacctcagt caccgtctcc tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc480
ctggatctgc 490
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tGactctcag tatcaacagt gtggaacctg aagatgttgg agtgtattac tgtcaaaatg360
gtcacagctt tccgctcacg ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa cgggctgatg420
ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat catgcgagat tcgaacatct 470
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210 215 220
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Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
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Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
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Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
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Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
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Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
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Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
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Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
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Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
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<223>人mAb 1339輕鏈
<400>49
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
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Phe Val Gly Asp Gly Val Thr Met Thr Cys Trp Ala Ser Gln Ser Ile
35 40 45
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Leu Leu Val Phe Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ile Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
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Leu Gln Pro Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Gln Asn Ala His Ser
100 105 110
Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr
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Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
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tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt420
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attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat540
ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 600
tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 660
aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc 720
acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 780
aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 840
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agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt1020
tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc1080
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ggttgatggt actggagaag gactgcgctg caaaacccgc accctggact gtgagcccaa2340
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ctccaacagt gacatgtatc tcagccctgt tgccatgttt cgggacccct tccgcagaga2460
tcccaacaag ctggtgttct gtgaagtttt caagtacaac cggaagcctg cagagaccaa2520
tttaaggcac tcgtgtaaac ggataatgga catggtgagc aaccagcacc cctggtttgg2580
aatggaacag gagtatactc tgatgggaac agatgggcac ccttttggtt ggccttccaa2640
tggctttcct gggccccaag gtccgtatta ctgtggtgtg ggcgcagaca aagcctatgg2700
cagggatatc gtggaggctc actaccgcgc ctgcttgtat gctggggtca agattacagg2760
aacaaatgct gaggtcatgc ctgcccagtg ggaactccaa ataggaccct gtgaaggaat2820
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tggggtaata gcaacctttg accccaagcc cattcctggg aactggaatg gtgcaggctg2940
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ggccatcgag aaactaagca agcggcaccg gtaccacatt cgagcctacg atcccaaggg3060
gggcctggac aatgcccgtg gtctgactgg gttccacgaa acgtccaaca tcaacgactt3120
ttctgctggt gtcgccaatc gcagtgccag catccgcatt ccccggactg tcggccagga3180
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aaactaatta gactttgagt gatcttgagc ctttcctagt tcatcccacc ccgccccaga3360
gagatctttg tgaaggaacc ttacttctgt ggtgtgacat aattggacaa actacctaca3420
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attctaattg tttgtgtatt ttagattcca acctatggaa ctgatgaatg ggagcagtgg3540
tggaatgcct ttaatgagga aaacctgttt tgctcagaag aaatgccatc tagtgatgat3600
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cccaaggact ttccttcaga attgctaagt tttttgagtc atgctgtgtt tagtaataga3720
actcttgctt gctttgctat ttacaccaca aaggaaaaag ctgcactgct atacaagaaa3780
attatggaaa aatattctgt aacctttata agtaggcata acagttataa tcataacata3840
ctgttttttc ttactccaca caggcataga gtgtctgcta ttaataacta tgctcaaaaa3900
ttgtgtacct ttagcttttt aatttgtaaa ggggttaata aggaatattt gatgtatagt3960
gccttgacta gagatcataa tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa4020
aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa4080
cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa4140
taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta4200
tcatgtctgg atctctagct tcgtgtcaag gacggtgact gcagtgaata ataaaatgtg4260
tgtttgtccg aaatacgcgt tttgagattt ctgtcgccga ctaaattcat gtcgcgcgat4320
agtggtgttt atcgccgata gagatggcga tattggaaaa atcgatattt gaaaatatgg4380
catattgaaa atgtcgccga tgtgagtttc tgtgtaactg atatcgccat ttttccaaaa4440
gtgatttttg ggcatacgcg atatctggcg atagcgctta tatcgtttac gggggatggc4500
gatagacgac tttggtgact tgggcgattc tgtgtgtcgc aaatatcgca gtttcgatat4560
aggtgacaga cgatatgagg ctatatcgcc gatagaggcg acatcaagct ggcacatggc4620
caatgcatat cgatctatac attgaatcaa tattggccat tagccatatt attcattggt4680
tatatagcat aaatcaatat tggctattgg ccattgcata cgttgtatcc atatcataat4740
atgtacattt atattggctc atgtccaaca ttaccgccat gttgacattg attattgact4800
agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc4860
gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg4920
acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa4980
tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca5040
agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac5100
atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc5160
atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga5220
tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg5280
gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta5340
cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc5400
catccacgct gttttgacct ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggccgg5460
gaacggtgca ttggaacgcg gattccccgt gccaagagtg acgtaagtac cgcctataga5520
gtctataggc ccaccccctt ggcttcttat gcatgctata ctgtttttgg cttggggtct5580
atacaccccc gcttcctcat gttataggtg atggtatagc ttagcctata ggtgtgggtt5640
attgaccatt attgaccact cccctattgg tgacgatact ttccattact aatccataac5700
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tgacacggac tctgtatttt tacaggatgg ggtctcattt attatttaca aattcacata5820
tacaacacca ccgtccccag tgcccgcagt ttttattaaa cataacgtgg gatctcacgc5880
gaatctcggg tacgtgttcc ggacatgggc tcttctccgg tagcggcgga gcttctacat5940
ccgagccctg ctcccatgcc tccagcgact catggtcgct cggcagctcc ttgctcctaa6000
cagtggaggc cagacttagg cacagcacga tgcccaccac caccagtgtg ccgcacaagg6060
ccgtggcggt agggtatgtg tctgaaaatg agctcgggga gcgggcttgc accgctgacg6120
catttggaag acttaaggca gcggcagaag aagatgcagg cagctgagtt gttgtgttct6180
gataagagtc agaggtaact cccgttgcgg tgctgttaac ggtggagggc agtgtagtct6240
gagcagtact cgttgctgcc gcgcgcgcca ccagacataa tagctgacag actaacagac6300
tgttcctttc catgggtctt ttctgcagtc accgtccttg acacgaagct taagccgcca6360
ccatgggatg gagctgtatc atcctcttct tggtagcaac agctacaggc gtgcactccg6420
acatccagat gacccagtct ccgtcctccc tgtctgcttt tgtgggagac ggagtcacca6480
tgacttgttg ggcaagtcag agtatcaacg actatttaaa ttggtatcac cagaggccag6540
gggaggcccc tgagctcctg gtctttgctg cctccaattt gcaaattgga gtcccgtcaa6600
ggttcagggg cagtggatct gagacgtatt tcactttaac tatcaacagt ctgcaacctg6660
aagatagtgg cacatacttc tgtcagaatg ctcactcttt cccgcttact ttcggcggag6720
ggaccaagct cgagatcaaa cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat6780
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tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc7020
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ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat7200
aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg7260
cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg gcggccgccg7320
atatttgaaa atatggcata ttgaaaatgt cgccgatgtg agtttctgtg taactgatat7380
cgccattttt ccaaaagtga tttttgggca tacgcgatat ctggcgatag cgcttatatc7440
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cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac7920
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agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg8160
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gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagacacc gggaccgatc8400
cagcctccgc ggccgggaac ggtgcattgg aacgcggatt ccccgtgcca agagtgacgt8460
aagtaccgcc tatagagtct ataggcccac ccccttggct tcttatgcat gctatactgt8520
ttttggcttg gggtctatac acccccgctt cctcatgtta taggtgatgg tatagcttag8580
cctataggtg tgggttattg accattattg accactcccc tattggtgac gatactttcc8640
attactaatc cataacatgg ctctttgcca caactctctt tattggctat atgccaatac8700
actgtccttc agagactgac acggactctg tatttttaca ggatggggtc tcatttatta8760
tttacaaatt cacatataca acaccaccgt ccccagtgcc cgcagttttt attaaacata8820
acgtgggatc tccacgcgaa tctcgggtac gtgttccgga catgggctct tctccggtag8880
cggcggagct tctacatccg agccctgctc ccatgcctcc agcgactcat ggtcgctcgg8940
cagctccttg ctcctaacag tggaggccag acttaggcac agcacgatgc ccaccaccac9000
cagtgtgccg cacaaggccg tggcggtagg gtatgtgtct gaaaatgagc tcggggagcg9060
ggcttgtacc gctgacgcat ttggaagact taaggcagcg gcagaagaag atgcaggcag9120
ctgagttgtt gtgttctgat aagagtcaga ggtaactccc gttgcggtgc tgttaacggt9180
ggagggcagt gtagtctgag cagtactcgt tgctgccgcg cgcgccacca gacataatag9240
ctgacagact aacagactgt tcctttccat gggtcttttc tgcagtcacc gtccttgaca9300
cgaagcttaa gccgccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc9360
tacaggcgcg cactcccaag tcactttgaa ggagtctggt cctacgctgg tgaaacccac9420
acagaccctc acgctgacct gcagcttctc tgggttctca ctcagcacta gtggagtggg9480
tgtgggctgg gtccgtcagc ccccaggaaa ggccctggag tggcttgcat tcatttggtg9540
ggatgatgat aagtactaca gcccgtctct ggagagcagg ctcaccatca ccaaggacac9600
ctccaaaaac caggtggtcc ttacaatgac caacatggac cctgtggaca cagccacata9660
ttactgtgca cgatccgctg atgactatct ttactattct tttgacacgt ggggccaggg9720
aaccctggtc accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc9780
ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt9840
ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt9900
cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc9960
cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa 10020
ggtggacaag agagttggtg agaggccagc acagggaggg agggtgtctg ctggaagcca 10080
ggctcagcgc tcctgcctgg acgcatcccg gctatgcagt cccagtccag ggcagcaagg 10140
caggccccgt ctgcctcttc acccggaggc ctctgcccgc cccactcatg ctcagggaga 10200
gggtcttctg gctttttccc caggctctgg gcaggcacag gctaggtgcc cctaacccag 10260
gccctgcaca caaaggggca ggtgctgggc tcagacctgc caagagccat atccgggagg 10320
accctgcccc tgacctaagc ccaccccaaa ggccaaactc tccactccct cagctcggac 10380
accttctctc ctcccagatt ccagtaactc ccaatcttct ctctgcagag cccaaatctt 10440
gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc caggtaagcc agcccaggcc tcgccctcca 10500
gctcaaggcg ggacaggtgc cctagagtag cctgcatcca gggacaggcc ccagccgggt 10560
gctgacacgt ccacctccat ctcttcctca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 10620
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 10680
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 10740
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 10800
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 10860
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 10920
ggtgggaccc gtggggtgcg agggccacat ggacagaggc cggctcggcc caccctctgc 10980
cctgagagtg accgctgtac caacctctgt ccctacaggg cagccccgag aaccacaggt 11040
gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct 11100
ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga 11160
gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctatag 11220
caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat 11280
gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaata 11340
ggaattcatt gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa 11400
acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact 11460
tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 11520
aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc11580
atgtctggat cctctacgcc ggacgcatcg tggccggcat caccggcgcc acaggtgcgg11640
ttgctggcgc ctatatcgcc gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc cacttcgggc11700
tcatgagcgc ttgtttcggc gtgggtatgg tggcaggccc cgtggccggg ggactgttgg11760
gcgccatctc cttgcatgca ccattccttg cggcggcggt gctcaacggc ctcaacctac11820
tactgggctg cttcctaatg caggagtcgc ataagggaga gcgtcgacct cgggccgcgt11880
tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa11940
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct12000
ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc12060
cttcgggaag cgtggc12076
<210>51
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VH CDR1
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Thr Ser Gly Met Cys Val Ser
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<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VH CDR1
<400>52
Thr Ser Gly Val Ala Val Gly
1 5
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<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VH CDR1
<400>53
Thr Ser Gly Val Ser Val Gly
1 5
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<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VH CDR1
<400>54
Thr Ser Gly Val Gly Val Gly
1 5
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<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VH CDR1
<400>55
Thr Ser Gly Val Ala Val Asn
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<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VH CDR2
<400>56
Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser
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<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VH CDR2
<400>57
Leu Ile Phe Trp Asp Asp Asp Lys His Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>58
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VH CDR2
<400>58
Leu Val Tyr Trp Asp Asp Asp Arg Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn
1 5 10 15
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<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VH CDR2
<400>59
Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Asn
1 5 10 15
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<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VH CDR2
<400>60
Phe Ile Phe Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Pro Ser Leu Glu Ser
1 5 10 15
<210>61
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VH CDR2
<400>61
Val Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Arg Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Ser Ser
1 5 10 15
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
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<400>62
Ser Tyr Asp Asp Tyr Leu Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VH CDR3
<400>63
Phe Tyr Asp Asp Tyr Leu Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VH CDR3
<400>64
Ser Ala Asp Asp Tyr Leu Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VH CDR3
<400>65
Ser Gly Asp Asp Tyr Leu Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VH CDR3
<400>66
Ser Tyr Asp Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Leu Asp Tyr
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
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<223>人VH CDR3
<400>67
Ser Tyr Asp Asp Tyr Leu Tyr Tyr Ser Leu Asp Tyr
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VH CDR3
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Ser Tyr Asp Asp Tyr Leu Tyr Tyr Ala Phe Asp Tyr
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
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<223>人VH CDR3
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Ser Tyr Asp Asp Tyr Leu Tyr Tyr Ala Leu Asp Thr
1 5 10
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VH CDR3
<400>70
Ser Ala Asp Asp Tyr Leu Tyr Tyr Ser Leu Asp Tyr
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
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<223>人VH CDR3
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Ser Ala Asp Asp Tyr Leu Tyr Tyr Ala Phe Asp Tyr
1 5 10
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VH CDR3
<400>72
Ser Ala Asp Asp Tyr Leu Tyr Tyr Ser Phe Asp Tyr
1 5 10
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VH CDR3
<400>73
Ser Ala Asp Asp Tyr Leu Tyr Tyr Ser Phe Asp Thr
1 5 10
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<212>PRT
<213>人工序列
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<223>人VL CDR1
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<212>PRT
<213>人工序列
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Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asn Phe Leu Ala
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<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
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<223>人VL CDR1
<400>76
Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
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<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
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<223>人VL CDR1
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Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ile Tyr Leu Asn
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<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
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<223>人VL CDR1
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Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Phe Leu Asn
1 5 10
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<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VL CDR1
<400>79
Trp Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asp Tyr Leu Asn
1 5 10
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<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
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<223>人VL CDR2
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1 5
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<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
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<223>人VL CDR2
<400>81
Lys Val Ser Ser Leu Arg Ser
1 5
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<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VL CDR2
<400>82
Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
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<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VL CDR2
<400>83
Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
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<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VL CDR2
<400>84
Ala Ser Ser Asn Leu Gln Ser
1 5
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<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VL CDR2
<400>85
Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ile
1 5
<210>86
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VL CDR3
<400>86
Gln Gln Tyr Ala Lys Ser Pro Ile Thr
1 5
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<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VL CDR3
<400>87
Gln Gln Thr Arg Arg Phe Pro Leu Thr
1 5
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<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VL CDR3
<400>88
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
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<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VL CDR3
<400>89
Gln Gln Thr Tyr Arg Asn Leu Phe Thr
1 5
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<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VL CDR3
<400>90
Gln Gln Thr Tyr Ser Thr Leu Gly Thr
1 5
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<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VL CDR3
<400>91
Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
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<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VL CDR3
<400>92
Gln Ser Gly His Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210>93
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VL CDR3
<400>93
Gln His Gly His Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210>94
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VL CDR3
<400>94
Gln Leu Gly His Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210>95
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VL CDR3
<400>95
Gln Asn Ala His Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210>96
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VL CDR3
<400>96
Gln Asn Gly Trp Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210>97
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VH CDR2
<400>97
Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Glu Thr
1 5 10 15
<210>98
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VH CDR3
<400>98
Ser His Asp Asp Tyr Leu Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210>99
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VH CDR1
<220>
<221>MISC_特征
<222>(4)..(4)
<223>Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221>MISC_特征
<222>(5)..(5)
<223>Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221>MISC_特征
<222>(7)..(7)
<223>Xaa可以是任何氨基酸
<400>99
Thr Ser Gly Xaa Xaa Val Xaa
1 5
<210>100
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人VH CDR2
<220>
<221>MISC_特征
<222>(1)..(1)
<223>Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221>MISC_特征
<222>(2)..(2)
<223>Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221>MISC_特征
<222>(3)..(3)
<223>Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221>MISC_特征
<222>(8)..(8)
<223>Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221>MISC_特征
<222>(9)..(9)
<223>Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221>MISC_特征
<222>(11)..(11)
<223>Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221>MISC_特征
<222>(15)..(15)
<223>Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221>MISC_特征
<222>(16)..(16)
<223>Xaa可以是任何氨基酸
<400>100
Xaa Xaa Xaa Trp Asp Asp Asp Xaa Xaa Tyr Xaa Pro Ser Leu Xaa Xaa
1 5 10 1權(quán)利要求
1.分離的單克隆抗體，其包含
(a)可變重鏈區(qū)(VH)，其包含
(i)包含選自下列的氨基酸序列的VH-CDR1SEQ ID NO51，SEQID NO52，SEQ ID NO53，SEQ ID NO54，SEQ ID NO55，以及除了1到5個氨基酸取代之外與SEQ ID NOs51-55中任一個同一的氨基酸序列；
(ii)包含選自下列的氨基酸序列的VH-CDR2SEQ ID NO56，SEQID NO57，SEQ ID NO58，SEQ ID NO59，SEQ ID NO60，SEQ ID NO61，SEQ ID NO97，以及除了1到5個氨基酸取代之外與SEQ ID NOs56到61或97中任一個同一的氨基酸序列；
(iii)包含選自下列的氨基酸序列的VH-CDR3SEQ ID NO62，SEQID NO63，SEQ ID NO64，SEQ ID NO65，SEQ ID NO66，SEQ ID NO67，SEQ ID NO68，SEQ ID NO69，SEQ ID NO70，SEQ ID NO71，SEQ IDNO72，SEQ ID NO73，SEQ ID NO98，以及除了1到5個氨基酸取代之外與SEQ ID NOs62到73或98中任一個同一的氨基酸序列；和
(b)可變輕鏈區(qū)(VL)，其包含
(i)包含選自下列的氨基酸序列的VL-CDR1SEQ ID NO74，SEQID NO75，SEQ ID NO76，SEQ ID NO77，SEQ ID NO78，SEQ IDNO79，以及除了1到5個氨基酸取代之外與SEQ ID NOs74-79中任一個同一的氨基酸序列；
(ii)包含選自下列的氨基酸序列的VL-CDR2SEQ ID NO80，SEQID NO81，SEQ ID NO82，SEQ ID NO83，SEQ ID NO84，SEQ IDNO85，以及除了1到5個氨基酸取代之外與SEQ ID NOs80-85中任一個同一的氨基酸序列；
(iii)包含選自下列的氨基酸序列的VL-CDR3SEQ ID NO86，SEQID NO87，SEQ ID NO88，SEQ ID NO89，SEQ ID NO90，SEQ ID NO91，SEQ ID NO92，SEQ ID NO93，SEQ ID NO94，SEQ ID NO95，SEQ IDNO96，以及除了1到5個氨基酸取代之外與SEQ ID NOs86-96中任一個同一的氨基酸序列；
其中所述抗體特異性結(jié)合IL-6抗原。
2.分離的人單克隆抗體，其包含具有氨基酸序列T-S-G-X1-X2-V-X3(SEQ ID NO99)的可變重鏈CDR1(VH-CDR1)，其中X1、X2和X3可以是任何氨基酸，并且其中所述抗體特異性結(jié)合IL-6抗原。
3.權(quán)利要求2的抗體，其中X1是甲硫氨酸(M)或纈氨酸(V)。
4.權(quán)利要求3的抗體，其中X1是纈氨酸(V)。
5.權(quán)利要求2的抗體，其中X2是半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、絲氨酸(S)或甘氨酸(G)。
6.權(quán)利要求2的抗體，其中X3是絲氨酸(S)或甘氨酸(G)。
7.分離的人單克隆抗體，其包含具有氨基酸序列X1-X2-X3-W-D-D-D-X4-X5-Y-X6-P-S-L-X7-X8(SEQ ID NO100)的可變重鏈CDR2(VH-CDR2)，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7或X8可以是任何氨基酸，并且其中所述抗體特異性結(jié)合IL-6抗原。
8.權(quán)利要求7的抗體，其中X1是亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)或纈氨酸(V)。
9.權(quán)利要求8的抗體，其中X1是亮氨酸(L)。
10.權(quán)利要求7的抗體，其中X2是異亮氨酸(I)或纈氨酸(V)。
11.權(quán)利要求10的抗體，其中X2是異亮氨酸(I)。
12.權(quán)利要求7的抗體，其中X3是酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F)。
13.權(quán)利要求7的抗體，其中X4是賴氨酸(K)或精氨酸(R)。
14.權(quán)利要求7的抗體，其中X5是精氨酸(R)、酪氨酸(Y)或組氨酸(H)。
15.權(quán)利要求7的抗體，其中X6是絲氨酸(S)或天冬酰胺(N)。
16.權(quán)利要求15的抗體，其中X6是絲氨酸(S)。
17.權(quán)利要求7的抗體，其中X7是精氨酸(R)、賴氨酸(K)、谷氨酸(E)或絲氨酸(S)。
18.權(quán)利要求17的抗體，其中X7是賴氨酸(K)。
19.權(quán)利要求7的抗體，其中X8是絲氨酸(S)或天冬酰胺(N)。
20.分離的核酸分子，其包含編碼可變重鏈CDR1(VH-CDDR1)的核苷酸序列，所述可變重鏈CDR1包含選自下列的氨基酸序列SEQ IDNO51，SEQ ID NO52，SEQ ID NO53，SEQ ID NO54，SEQ ID NO55，以及除了1到5個氨基酸取代之外與SEQ ID NOs51-55中任一個同一的氨基酸序列；
其中包含所述VH-CDR1的抗體分子特異性結(jié)合IL-6抗原。
21.分離的核酸分子，其包含編碼可變重鏈CDR2(VH-CDR2)的核苷酸序列，所述可變重鏈CDR2包含選自下列的氨基酸序列SEQ IDNO56，SEQ ID NO57，SEQ ID NO58，SEQ ID NO59，SEQ ED NO60，SEQ ID NO61，SEQ ID NO97，以及除了1到5個氨基酸取代之外與SEQID NOs56-61或97中任一個同一的氨基酸序列；
其中包含所述VH-CDR2的抗體分子特異性結(jié)合IL-6抗原。
22.分離的核酸分子，其包含編碼可變重鏈CDR3(VH-CDR3)的核苷酸序列，所述可變重鏈CDR3包含選自下列的氨基酸序列SEQ IDNO62，SEQ ID NO63，SEQ ID NO64，SEQ ID NO65，SEQ ED NO66，SEQ ID NO67，SEQ ID NO68，SEQ ID NO69，SEQ ID NO70，SEQ IDNO71，SEQ ID NO72，SEQ ID NO73，SEQ ID NO98，以及除了1到5個氨基酸取代之外與SEQ ID NOs62-73或98中任一個同一的氨基酸序列；
其中包含所述VH-CDR3的抗體分子特異性結(jié)合IL-6抗原。
23.分離的核酸分子，其包含編碼可變輕鏈CDR1(VL-CDR1)的核苷酸序列，所述可變輕鏈CDR1包含選自下列的氨基酸序列SEQ IDNO74，SEQ ID NO75，SEQ ID NO76，SEQ ID NO77，SEQ ID NO78，SEQ ID NO79，以及除了1到5個氨基酸取代之外與SEQ ID NOs74-79中任一個同一的氨基酸序列；
其中包含所述VL-CDR1的抗體分子特異性結(jié)合IL-6抗原。
24.分離的核酸分子，其包含編碼可變輕鏈CDR2(VL-CDR2)的核苷酸序列，所述可變輕鏈CDR2包含選自下列的氨基酸序列SEQ IDNO80，SEQ ID NO81，SEQ ID NO82，SEQ ID NO83，SEQ ID NO84，SEQ ID NO85，以及除了1到5個氨基酸取代之外與SEQ ID NOs80-85中任一個同一的氨基酸序列；
其中包含所述VL-CDR2的抗體分子特異性結(jié)合IL-6抗原。
25.分離的核酸分子，其包含編碼可變輕鏈CDR3(VL-CDR3)的核苷酸序列，所述可變輕鏈CDR3包含選自下列的氨基酸序列SEQ IDNO86，SEQ ID NO87，SEQ ID NO88，SEQ ID NO89，SEQ ID NO90，SEQ ID NO91，SEQ ID NO92，SEQ ID NO93，SEQ ID NO94，SEQ IDNO95，SEQ ID NO96，以及除了1到5個氨基酸取代之外與SEQ IDNOs86-96中任一個同一的氨基酸序列；
其中包含所述VL-CDR3的抗體分子特異性結(jié)合IL-6抗原。
26.分離的單克隆抗體，其包含
(a)包含選自下列的氨基酸序列的可變重鏈區(qū)(VH)
(1)H415(SEQ ID NO19)；
(2)H884(SEQ ID NO20)；
(3)H1077(SEQ ID NO21)；
(4)H1078(SEQ ID NO22)；
(5)H1079(SEQ ID NO23)；
(6)H1081(SEQ ID NO24)；
(7)H1089(SEQ ID NO25)；和
(8)與SEQ ID NOs19到25中任一個具有至少80％同一性的氨基酸序列；和
(b)可變輕鏈區(qū)(VL)，其包含選自下列的氨基酸序列
(9)L112(SEQ ID NO1)；
(10)L151(SEQ ID NO2)；
(11)L158(SEQ ID NO3)；
(12)L159(SEQ ID NO4)；
(13)L164(SEQ ID NO5)；
(14)L165(SEQ ID NO6)；
(15)L166(SEQ ID NO7)；
(16)L167(SEQ ID NO8)；
(17)L168(SEQ ID NO9)；
(18)L169(SEQ ED NO10)；
(19)L170(SEQ ID NO11)；
(20)L171(SEQ ID NO12)；
(21)L172(SEQ ID NO13)；
(22)L173(SEQ ID NO14)；
(23)L174(SEQ ID NO15)；
(24)L175(SEQ ID NO16)；
(25)L189(SEQ ID NO17)；
(26)L198(SEQ ID NO18)；和
(27)與SEQ ID NOs1到18中任一個具有至少80％同一性的氨基酸序列；并且
其中所述抗體特異性結(jié)合IL-6抗原。
27.權(quán)利要求26的抗體，其中所述VH包含H415(SEQ ID NO19)或與其具有至少80％同一性的氨基酸序列。
28.權(quán)利要求26的抗體，其中所述VH包含H884(SEQ ID NO20)或與其具有至少80％同一性的氨基酸序列。
29.權(quán)利要求26的抗體，其中所述VH包含H1077(SEQ ID NO21)或與其具有至少80％同一性的氨基酸序列。
30.權(quán)利要求26的抗體，其中所述VH包含H1078(SEQ ID NO22)或與其具有至少80％同一性的氨基酸序列。
31.權(quán)利要求26的抗體，其中所述VH包含H1079(SEQ ID NO23)或與其具有至少80％同一性的氨基酸序列。
32.權(quán)利要求26的抗體，其中所述VH包含H1081(SEQ ID NO24)或與其具有至少80％同一性的氨基酸序列。
33.權(quán)利要求26的抗體，其中所述VH包含H1089(SEQ ID NO25)或與其具有至少80％同一性的氨基酸序列。
34.權(quán)利要求26的抗體，其中所述VH包含H415(SEQ ID NO19)并且所述VL包含L112(SEQ ID NO1)。
35.權(quán)利要求26的抗體，其中所述VH包含H415(SEQ ID NO19)并且所述VL包含L165(SEQ ID NO6)。
36.權(quán)利要求26的抗體，其中所述VH包含H415(SEQ ID NO19)并且所述VL包含L172(SEQ ID NO13)。
37.權(quán)利要求26的抗體，其中所述VH包含H1079(SEQ ID NO23)并且所述VL包含L159(SEQ ID NO4)。
38.權(quán)利要求26的抗體，其中所述VH包含H415(SEQ ID NO19)并且所述VL包含L198(SEQ ID NO18)。
39.權(quán)利要求26的抗體，其中所述VH包含H1079(SEQ ID NO23)并且所述VL包含L198(SEQ ID NO18)。
40.權(quán)利要求26的抗體，其中所述VH包含H1081(SEQ ID NO24)并且所述VL包含L172(SEQ ID NO13)。
41.權(quán)利要求26的抗體，其中所述VH包含H1077(SEQ ID NO21)并且所述VL包含L158(SEQ ID NO3)。
42.權(quán)利要求26的抗體，其中所述VH包含H1078(SEQ ID NO22)并且所述VL包含L158(SEQ ID NO3)。
43.權(quán)利要求26的抗體，其中所述VH包含H1081(SEQ ID NO24)并且所述VL包含L159(SEQ ID NO4)。
44.權(quán)利要求26的抗體，其中所述VH是H1079的變體。
45.權(quán)利要求44的抗體，其中所述H1079的變體包含在H1079的CDR1、CDR2或CDR3中的一個或多個氨基酸差異。
46.權(quán)利要求45的抗體，其中所述H1079的變體包含在H1079的CDR3中的一個或多個氨基酸差異。
47.權(quán)利要求46的抗體，其中所述H1079的變體選自H1511(SEQID NO26)；H1420(SEQ ID NO27)；H1432(SEQ ID NO28)；H1515(SEQID NO29)；H1362(SEQ ID NO30)；H1437(SEQ ID NO31)；和H1461(SEQ ID NO32)。
48.權(quán)利要求46的抗體，其中所述H1079的變體選自H1519(SEQID NO38)；H1520(SEQ ID NO39)；H1521(SEQ ID NO40)；和H1522(SEQ ID NO41)。
49.權(quán)利要求26的抗體，其中所述VL是L198的變體。
50.權(quán)利要求49的抗體，其中所述L198的變體包含在L198的CDR1、CDR2或CDR3中的一個或多個氨基酸差異。
51.權(quán)利要求50的抗體，其中所述L198的變體包含在L198的CDR3中的一個或多個氨基酸差異。
52.權(quán)利要求51的抗體，其中所述L198的變體選自L314(SEQ IDNO33)；L305(SEQ ID NO34)；L303(SEQ ID NO35)；L298(SEQ IDNO36)；和L321(SEQ ID NO37)。
53.權(quán)利要求44的抗體，其中所述H 1079的變體是H1553(SEQ IDNO42)或H1579(SEQ ID NO43)。
54.分離的單克隆抗體，其包含
(a)可變重鏈區(qū)(VH)，其包含選自下列的氨基酸序列
(1)H1522(SEQ ID NO41)；
(2)H1553(SEQ ID NO42)；
(3)H1579(SEQ ID NO43)；和
(4)與SEQ ID NOs41到43中任一個具有至少80％同一性的氨基酸序列；和
(b)可變輕鏈區(qū)(VL)，其包含選自下列的氨基酸序列
(5)L198(SEQ ID NO18)；
(6)L305(SEQ ID NO34)；
(7)L314(SEQ ID NO33)；
(8)L298(SEQ ID NO36)；
(9)L321(SEQ ID NO37)；和
(10)與SEQ ID NOs18，33，34，36或37中的任一個具有至少80％同一性的氨基酸序列；并且
其中所述抗體特異性結(jié)合IL-6抗原。
55.權(quán)利要求54的抗體，其中所述VH包含H1522(SEQ ID NO41)或與其具有至少80％同一性的氨基酸序列。
56.權(quán)利要求54的抗體，其中所述VH包含H1553(SEQ ID NO42)或與其具有至少80％同一性的氨基酸序列。
57.權(quán)利要求54的抗體，其中所述VH包含H1579(SEQ ID NO43)或與其具有至少80％同一性的氨基酸序列。
58.權(quán)利要求54的抗體，其中所述VH包含H1522(SEQ ID NO41)并且所述VL包含L198(SEQ ID NO18)。
59.權(quán)利要求54的抗體，其中所述VH包含H1522(SEQ ID NO41)并且所述VL包含L305(SEQ ED NO34)。
60.權(quán)利要求54的抗體，其中所述VH包含H1522(SEQ ID NO41)并且所述VL包含L314(SEQ ID NO33)。
61.權(quán)利要求54的抗體，其中所述VH包含H1553(SEQ ID NO42)并且所述VL包含L198(SEQ ID NO18)。
62.權(quán)利要求54的抗體，其中所述VH包含H1579(SEQ ID NO43)并且所述VL包含L198(SEQ ID NO18)。
63.權(quán)利要求54的抗體，其中所述VH包含H1579(SEQ ID NO43)并且所述VL包含L305(SEQ ED NO34)。
64.權(quán)利要求54的抗體，其中所述VH包含H1579(SEQ ID NO43)并且所述VL包含L314(SEQ ID NO33)。
65.權(quán)利要求54的抗體，其中所述VH包含H 1579(SEQ ID NO43)并且所述VL包含L298(SEQ ID NO36)。
66.權(quán)利要求54的抗體，其中所述VH包含H1579(SEQ ED NO43)并且所述VL包含L321(SEQ ED NO37)。
67.分離的核酸分子，其包含編碼抗-IL-6抗體可變重鏈區(qū)(VH)的核苷酸序列，其中所述VH包含選自下列的氨基酸序列
(1)H415(SEQ ED NO19)；
(2)H884(SEQ ED NO20)；
(3)H1077(SEQ ED NO21)；
(4)H1078(SEQ ID NO22)；
(5)H1079(SEQ ED NO23)；
(6)H1081(SEQ ED NO24)；
(7)H1089(SEQ ED NO25)；和
(8)與SEQ ID NOs19到25中任一個具有至少80％同一性的氨基酸序列。
68.分離的核酸分子，其包含編碼抗-IL-6抗體可變輕鏈區(qū)(VL)的核苷酸序列，其中所述VL包含選自下列的氨基酸序列
(1)L112(SEQ ID NO1)；
(2)L151(SEQ ID NO2)；
(3)L158(SEQ ID NO3)；
(4)L159(SEQ ID NO4)；
(5)L164(SEQ ID NO5)；
(6)L165(SEQ ID NO6)；
(7)L166(SEQ ID NO7)；
(8)L167(SEQ ID NO8)；
(9)L168(SEQ ID NO9)；
(10)L169(SEQ ID NO10)；
(11)L170(SEQ IDNO11)；
(12)L171(SEQ ID NO12)；
(13)L172(SEQ ID NO13)；
(14)L173(SEQ ID NO14)；
(15)L174(SEQ ID NO15)；
(16)L175(SEQ ID NO16)；
(17)L189(SEQ ID NO17)；
(18)L198(SEQ ID NO18)；和
(19)與SEQ ID NOs1到18中任一個具有至少80％同一性的氨基酸序列。
69.分離的核酸分子，其包含編碼選自下列的抗-IL-6抗體可變重鏈區(qū)(VH)的互補決定區(qū)(CDR)的核苷酸序列
(1)H415(SEQ ID NO19)；
(2)H884(SEQ ID NO20)；
(3)H1077(SEQ ID NO21)；
(4)H1078(SEQ ID NO22)；
(5)H1079(SEQ ID NO23)；
(6)H1081(SEQ ID NO24)；和
(7)H1089(SEQ ID NO25)。
70.權(quán)利要求69的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼選自下列的抗-IL-6抗體可變重鏈區(qū)(VH)的CDR3
(1)H415(SEQ ID NO19)；
(2)H884(SEQ ID NO20)；
(3)H1077(SEQ ID NO21)；
(4)H1078(SEQ ID NO22)；
(5)H1079(SEQ ID NO23)；
(6)H1081(SEQ ID NO24)；和
(7)H1089(SEQ ID NO25)。
71.分離的核酸分子，其包含編碼選自下列的抗-IL-6抗體可變輕鏈區(qū)(VL)的互補決定區(qū)(CDR)的核苷酸序列
(1)L112(SEQ ID NO1)；
(2)L151(SEQ ID NO2)；
(3)L158(SEQ ID NO3)；
(4)L159(SEQ ID NO4)；
(5)L164(SEQ ID NO5)；
(6)L165(SEQ ID NO6)；
(7)L166(SEQ ID NO7)；
(8)L167(SEQ ID NO8)；
(9)L168(SEQ ID NO9)；
(10)L169(SEQ ID NO10)；
(11)L170(SEQ ID NO11)；
(12)L171(SEQ ID NO12)；
(13)L172(SEQ ID NO13)；
(14)L173(SEQ ID NO14)；
(15)L174(SEQ ID NO15)；
(16)L175(SEQ ID NO16)；
(17)L189(SEQ ID NO17)；和
(18)L198(SEQ ID NO18)。
72.權(quán)利要求71的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼選自下列的抗-IL-6抗體可變輕鏈區(qū)(VL)的CDR3
(1)L112(SEQ ID NO1)；
(2)L151(SEQ ID NO2)；
(3)L158(SEQ ID NO3)；
(4)L159(SEQ ID NO4)；
(5)L164(SEQ ID NO5)；
(6)L165(SEQ ID NO6)；
(7)L166(SEQ ID NO7)；
(8)L167(SEQ ID NO8)；
(9)L168(SEQ ID NO9)；
(10)L169(SEQ ID NO10)；
(11)L170(SEQ ID NO11)；
(12)L171(SEQ ID NO12)；
(13)L172(SEQ ID NO13)；
(14)L173(SEQ ID NO14)；
(15)L174(SEQ ID NO15)；
(16)L175(SEQ ID NO16)；
(17)L189(SEQ ID NO17)；和
(18)L198(SEQ ID NO18)。
73.包含權(quán)利要求67的核酸分子的表達載體。
74.包含權(quán)利要求68的核酸分子的表達載體。
75.包含權(quán)利要求69的核酸分子的表達載體。
76.包含權(quán)利要求71的核酸分子的表達載體。
77.包含權(quán)利要求73的表達載體的宿主細胞。
78.包含權(quán)利要求74的表達載體的宿主細胞。
79.包含權(quán)利要求75的表達載體的宿主細胞。
80.包含權(quán)利要求76的表達載體的宿主細胞。
81.治療炎性疾病的方法，所述方法包括給予有此需要的患者權(quán)利要求1-19或26-66任一項的抗體。
82.治療自身免疫疾病的方法，所述方法包括給予有此需要的患者權(quán)利要求1-19或26-66任一項的抗體。
83.權(quán)利要求82的方法，其中自身免疫疾病是類風濕性關(guān)節(jié)炎。
84.治療癌癥的方法，所述方法包括給予有此需要的患者權(quán)利要求1-19或26-66任一項的抗體。
85.權(quán)利要求84的方法，其中所述癌癥是多發(fā)性骨髓瘤。
86.權(quán)利要求84的方法，其中所述癌癥選自腎癌、乳癌、前列腺癌、淋巴瘤和移植后淋巴瘤。
87.治療特發(fā)性青少年關(guān)節(jié)炎的方法，所述方法包括給予有此需要的患者權(quán)利要求1-19或26-66任一項的抗體。
88.生產(chǎn)權(quán)利要求1-19或26-66任一項的分離的單克隆抗體的方法，所述方法包括(i)培養(yǎng)表達編碼所述抗體的一種或多種核酸序列的宿主細胞，和(ii)從培養(yǎng)基中回收所述抗體。
89.權(quán)利要求1-19或26-66任一項的分離的單克隆抗體在制備用于治療疾病或病癥的藥物中的用途，所述疾病或病癥選自自身免疫疾病或病癥、與異?；虿贿m當?shù)难馨l(fā)生相關(guān)的疾病或病癥、癌癥、骨關(guān)節(jié)炎、特發(fā)性青少年關(guān)節(jié)炎和纖維變性病癥。
90.藥物組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1-19或26-66任一項的分離的單克隆抗體和藥學上可接受的載體。
91.用作治療疾病或病癥的藥物的權(quán)利要求1-19或26-66任一項的分離的單克隆抗體，所述疾病或病癥選自自身免疫疾病或病癥、與異?；虿贿m當?shù)难馨l(fā)生相關(guān)的疾病或病癥、癌癥、骨關(guān)節(jié)炎、特發(fā)性青少年關(guān)節(jié)炎和纖維變性病癥。
92.權(quán)利要求1-19或26-66任一項的分離的單克隆抗體，其中所述抗體以80％或更高的抑制水平抑制IL-6-誘導的細胞增殖，例如鼠B9(ECACC)或人U266骨髓瘤細胞的增殖。
93.權(quán)利要求1-19或26-66任一項的分離的單克隆抗體，其中所述抗體特異性結(jié)合IL-6，以80％或更高的抑制水平抑制IL-6與其受體的結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明提供了特異性結(jié)合IL-6的新的單克隆抗體。本發(fā)明的抗體包含選自本文公開的任何VH區(qū)及其氨基酸變體的可變重鏈(VH)區(qū)，和/或選自本文公開的任何VL區(qū)及其氨基酸變體的可變輕鏈(VL)區(qū)。本發(fā)明還提供了治療與IL-6表達和/活性相關(guān)的疾病和病癥。
文檔編號C07K16/24GK101563365SQ200780028953
公開日2009年10月21日 申請日期2007年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月3日
發(fā)明者E·S·史密斯, W·王 申請人:疫苗檢測公司