專利名稱：：Fc融合蛋白的純化方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)純化領域。更具體說，本發(fā)明涉及通過蛋白A或蛋白G親和層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析和羥基磷灰石層析純化Fc-融合蛋白。
背景技術：
：蛋白質(zhì)作為通常稱為"生物制品"的藥物在商業(yè)上日益變得重要。其最大的挑戰(zhàn)之一是在商品化規(guī)模上開發(fā)具有成本效益和有效的蛋白質(zhì)純化方法。雖然現(xiàn)已有許多大規(guī)模純化蛋白質(zhì)的方法可采用，但粗制品，如細胞培養(yǎng)上清液不僅含有所需的產(chǎn)物也含有難以與所需產(chǎn)物分離的雜質(zhì)。如果用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，表達重組蛋白產(chǎn)物細胞的細胞培養(yǎng)上清液含有的雜質(zhì)可能較少，但是在純化過程中仍需要去除宿主細胞的蛋白質(zhì)(HCP)。另外，衛(wèi)生主管當局對人用蛋白質(zhì)的純度要求標準很高。許多純化方法包括需要采用可能危害給定蛋白質(zhì)生物學活性的低或高pH、高鹽濃度或其它極端條件。因此，對于任何蛋白質(zhì)而言，建立能夠充分純化同時保留該蛋白質(zhì)生物學活性的純化方法是一種挑戰(zhàn)。一些已知的層析系統(tǒng)已廣泛用于蛋白質(zhì)純化。用于分離蛋白質(zhì)的離子交換層析系統(tǒng)主要依據(jù)電荷的差異。離子交換層析時，假如周圍緩沖液提供的離子強度低，溶質(zhì)表面的帶電區(qū)通過被相反電荷所吸引而吸附于層析基質(zhì)。通常通過提高緩沖液的離子強度(即導電率)與溶質(zhì)競爭離子交換基質(zhì)的帶電位點來實現(xiàn)洗脫。改變pH因而改變?nèi)苜|(zhì)所帶電荷是另一種實現(xiàn)溶質(zhì)洗脫的方法。導電率或PH的這種改變可以是漸增(梯度洗脫)或分步(分步洗脫)的。陰離子交換劑可分類為弱或強交換劑。弱陰離子交換劑上的帶電基團是弱堿性基團，當處于高pH時因去質(zhì)子化而喪失了所帶電荷。DEAE-瓊脂糖是弱陰離子交換劑的一個例子，其氨基在低于約pH9時帶正電荷而在更高pH時逐漸喪失此電荷。例如，溴化甲基苯羥乙胺(DEAE)或二乙基-(2-羥基-丙基)氨基乙基(diethyl-(2-hydroxy-pr叩yl)aminoethyl，QAE)含抗衡離子氯離子。另一方面，強陰離子交換劑含強堿基團，在離子交換層析通常所用的整個pH范圍內(nèi)(pHl-14)都帶正電荷。Q-瓊脂糖(Q表示季胺)是強陰離子交換劑的一個例子。陽離子交換劑可分類為弱或強交換劑。強陽離子交換劑含強酸基團(如磺丙基)，在pH1-14時維持帶電，而弱陽離子交換劑含弱酸基團(如羧甲基)，隨pH降低到4或5以下逐漸失去電荷。例如，羧甲基(CM)和磺丙基(SP)含抗衡離子鈉離子。一種不同的層析樹脂是基于不溶性羥基磷酸鈣基質(zhì)稱為羥基磷灰石的樹脂。羥基磷灰石層析是一種利用可形成基質(zhì)和配體的不溶性羥基化磷酸鈣(Cas(P04)30H)2純化蛋白質(zhì)的方法。其功能基團包括成對帶正電的鈣離子(C-位點)和成簇帶負電的磷酸根基團(P-位點)。羥基磷灰石與蛋白質(zhì)之間的相互作用具有復雜的多重模式。在一種相互作方式中，蛋白質(zhì)上帶正電的氨基與(樹脂)帶負電的P-位點結合，蛋白質(zhì)的羧基則通過與(樹脂)C-位點配位絡合相互作用(Shepard等，2000)。晶體狀羥基磷灰石是首先用于層析的羥基磷灰石類型。在羥基磷灰石層析中進一步開發(fā)了陶瓷羥基磷灰石(CHA)層析。與晶體狀羥基磷灰石相比，陶瓷羥基磷灰石耐用性高，蛋白結合能力好，可在高流速和高壓情況下使用(Vola等，1993)。羥基磷灰石業(yè)已用于層析分離蛋白質(zhì)、核酸以及抗體。在羥基磷灰石層析中，通常要以低濃度的磷酸緩沖液平衡層析柱和加載樣品，然后用梯級濃度的磷酸鹽緩沖液洗脫吸附的蛋白質(zhì)(Giovannini等，2000)。還有另外一種純化蛋白質(zhì)的方法是基于感興趣蛋白質(zhì)與固定在層析樹脂上的另一種蛋白的親和力。這種固定配體(蛋白)的例子是對某些免疫球蛋白的Fc部分具有特異性的細菌的細胞壁蛋白質(zhì)蛋白A和蛋白G。雖然蛋白A和蛋白G二者對IgG抗體具有強親和力，但它們對其它類型的免疫球蛋白和其同種型親和力不同。蛋白A是由金黃色葡萄菌產(chǎn)生的一種43,000道爾頓的蛋白質(zhì)，含有4個與IgG的Fc區(qū)的結合位點。蛋白G由G屬鏈球菌產(chǎn)生，含有2個對IgG的Fc區(qū)的結合位點。這兩種蛋白質(zhì)的特性已得到廣泛鑒定，它們對各種類型的免疫球蛋白具有親和力。蛋白L是來源于消化鏈球菌屬的另一種細菌蛋白質(zhì)，能結合免疫球蛋白及其含有Ig輕鏈的片段(Akerstrom和Bjork,1989)。蛋白A、蛋白G和蛋白L親和層析已廣泛用于分離和純化免疫球蛋白。由于蛋白A和蛋白G的結合位點位于免疫球蛋白的Fc區(qū)，蛋白A和蛋白G親和層析也能純化所謂的Fc-融合蛋白。Fc-融合蛋白是含有與某種免疫球蛋白(常常是免疫球蛋白G,IgG)Fc區(qū)融合的蛋白質(zhì)效應器部分(如受體結合區(qū))的嵌合蛋白質(zhì)。Fc-融合蛋白可廣泛用作治療劑，因為它們具有Fc區(qū)所賦予的優(yōu)點，例如-能夠用蛋白A或蛋白G親和層析法純化，親和力視IgG同種型而不同。人的IgG,、IgG2和IgG4能與蛋白A強結合，所有的人IgG包括IgG:i能強結合蛋白G;-在循環(huán)系統(tǒng)中的半衰期延長，因為其Fc區(qū)結合于補救受體FcRn而保護其免遭溶酶體酶降解；-取決于此Fc融合蛋白的醫(yī)學應用，F(xiàn)c區(qū)的效應器功能可能是需要的。這類效應器功能包括通過與Fc受體(FqR)相互作用的抗體依賴細胞毒性(ADCC)、以及與補體組分lq(Clq)結合的補體依賴性細胞毒性(CDC)。IgG各亞型發(fā)揮不同水平的效應器功能。人IgG,和IgG:,具有強效ADCC和CDC作用，而人IgGs具有弱ADCC和CDC作用。人Ig"顯示弱ADCC作用而無CDC作用。根據(jù)Fc-融合蛋白所預期的治療應用，通過工程改造Fc區(qū)以提高或降低其分別與FcR、FqR和Clq結合的能力，可改善其血清半衰期和效應器功能。在ADCC中，抗體的Fc區(qū)結合于免疫效應細胞(如自然殺傷細胞和巨噬細胞)表面的Fc受體(FcyR)，而導致吞噬或溶解靶細胞。在CDC中，抗體通過在細胞表面觸發(fā)補體級聯(lián)反應而殺傷靶細胞。IgG各亞型發(fā)揮的效應器功能水平不同，按IgG^IgG2〈IgGi《IgG3順序遞增。人IgGt顯示有高度ADCC和CDC作用，最適合于對病原體和癌細胞的治療應用。在某些情況下，例如當消除靶細胞對機體不利時，可能需要去除或減少其效應器功能。相反，當抗體用于腫瘤治療時，提高效應器功能可增強其治療活性(Carter等，2006)。通過工程改造Fc區(qū)提高或降低其與FcYR或補體因子的結合，可實現(xiàn)對效應器功能的修飾。IgG與活化性FqR(FqRI、Fc7RIIa、FcyRnia和FcyRIIIb)和抑制性FcYR(FqRIIb)或補體1組分(Clq)的結合取決于位于絞鏈區(qū)和CH2結構域中的殘基。CH2結構域的兩個區(qū)域是FqR與補體Clq結合的關鍵區(qū)，在IgG2和Ig^中含有獨特的序列。例如，用IgG2的233-236位殘基取代人IgG,的相應殘基將大大降低IgG,的ADCC和CDC功能(Armour等，1999;和Shield等，2001)。已在IgG的CH2結構域中制作了許多突變，體外研究了它們對ADCC和CDC的影響(Shieid等，2001;Idusogie等'2001和2002;Steurer等，1995)。具體說，報導了E333位突變成丙氨酸提高了ADCC和CDC兩種功能(Idusogie等，2001和2002)。提高治療抗體的血清半衰期是改進其療效，使之循環(huán)水平更高，減少給藥頻率和減少劑量的另一種方法。這可通過提高Fc區(qū)與新生FcR(FcRn)的結合力而實現(xiàn)。FcRn表達在內(nèi)皮細胞表面上，以pH依賴方式結合IgG，能保護其免遭降解。業(yè)己證明位于CH2與CH3結構域之間介面上的好幾種突變延長了IgG的半衰期(Hinton等，2004和Vaccaro等，2005)。下表1概括了Fc區(qū)的一些已知突變(取自Invivogen'swebsite網(wǎng)站)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>在具有治療用途的某些已知Fc融合蛋白中，F(xiàn)c區(qū)與屬于腫瘤壞死因子受體(TNF-R)超家族的某些受體的胞外結構域相融合(Locksley等，2001，Bodmer等，2002,Bossen等，2006)。TNFR家族成員的標志是其胞外結構域存在富含半胱氨酸的偽重復序列，如Naismith和Sprangl998所述的那樣。兩種TNF受體p55(TNFR1)和p75TNFR(TNFR2)是TNF超家族這類成員的例子。依那西普(Etanercept，TNF-a的拮抗劑)是一種含有p75TNFR可溶性部分的Fc融合蛋白(如WO91/03553,WO94/06476)，它以商標名Enbrel⑧銷售，用于治療子宮內(nèi)膜異位、丙肝病毒感染、HIV感染、牛皮癬關節(jié)炎、牛皮癬，類風濕關節(jié)炎、哮喘、強直性脊椎炎、心力衰竭、移植物抗宿主疾病、肺纖維化、克羅恩病。來那西普(Lenercept)是一種含有人p55TNF受體胞外組分和人IgGFc部分的融合蛋白，預期可用于治療嚴重膿毒癥和多發(fā)性硬化癥。OX40也是TNFR超家族的成員。已制備了OX40-IgGl和OX40-HIG4mut融合蛋白用于治療炎癥和自身免疫疾病，如克羅恩病。BAFF-R(也稱為BR3)的Fc-融合蛋白，也稱作BR3-Fc，是屬于BAFF(TNF家族的B細胞激活因子)抑制劑系列的一種可溶性誘餌受體，正在開發(fā)用于自身免疫疾病如類風濕關節(jié)炎(RA)和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的潛在治療。BCMA是屬于TNFR超家族的另一種受體。業(yè)己報導了BCMA-Ig融合蛋白可抑制自身免疫疾病(Melchers，2006)。TNF-R超家族的另一種受體是TACI,這是一種跨膜活化劑和CAML-相互作用因子(vonBiilow和Bram,1997;US5,969,102,Gross等，2000)，其胞外結構域含有兩個富含半胱氨酸的偽重復序列。TACI能結合腫瘤壞死因子(TNF)配體家族的兩個成員，一類配體命名為BLyS、BAFF、neutrokine-a、TALL-1、zTNF4或THANK(Moore等.，1999)，另一類配體命名為APRIL,TNFR死亡配體-1或ZTNF2(Hahne等，JExpMed.l88:1185,1998)。對含有融合于IgGFc區(qū)的TACI受體可溶性形式的融合蛋白己有很好了解，命名為TACI-Fc(WO00/40716,WO02/094852)。TACI-Fc能抑制BLyS和APRIL與B-細胞結合(Xia等，2000)。正在開發(fā)用它來治療自身免疫疾病，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕關節(jié)炎(RA)和血液惡性腫瘤，以及治療多發(fā)性硬化癥(MS)。除此之外，正在開發(fā)用TACI-Fc治療多發(fā)性骨髓瘤(MM)(Novak等，2004;Moreau等，2004)禾口非-何杰金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)及瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥(WM)。對于Fc-融合蛋白，特別是含有TNFR超家族胞外部分的那些蛋白的治療應用，需要適合人給藥的足夠量的高純度蛋白質(zhì)。WO02/094852描述了部分純化TACI-Fc的方法，包括蛋白A層析然后用S-200分子大小排阻層析。WO03/059935公開了p75TNFR:Fc-融合蛋白的純化方法，采用羥基磷灰石層析與蛋白A親和層析相組合。然而，在WO03/059935描述的方法中，F(xiàn)c-融合蛋白不結合于羥基磷灰石而是含在羥基磷灰石柱的流出液中。除此之外，沒提到p75TNFR:Fc-融合蛋白純化時采用了離子交換層析。WO2005/044856公開了羥基磷灰石層析制備抗體中去除高分子量凝聚物的方法，也公開了采用蛋白A、陰離子交換層析和羥基磷灰石層析的純化方法。然而，首先，其描述的方法只用于抗體，其次，沒有公開在蛋白A親和層析與陰離子交換層析步驟之間釆用陽離子交換層析步驟。WO94/06476提出的純化重組可溶性TNF受體的假設方案以TNF或凝集素親和層析、陰離子或陽離子交換層析和反向高效液相層析(RP-HPLC)為基礎。此文件中沒提及羥基磷灰石層析可作為可溶性TNF受體的合適純化步驟。US2002/0115175描述了金屬蛋白酶如TNFa轉化酶的純化方法。TACE的理論等電點約為5.4，如利用英特網(wǎng)上的"等電點服務EMBLWWW入口"計算的那樣。TACE是一種蛋白酶，能切除膜結合(前-)TNFa的N-末端8個氨基酸，如此使細胞膜釋放并激活細胞因子TNFcc。US2002/0115175公開的TACE純化方法包括小麥胚凝集素瓊脂糖步驟。此文件也描述了TACE的Fc融合蛋白，但不是純化的。EP1561756公開了單用蛋白A或G為基礎的層析可能不足以分離去除蛋白質(zhì)中污染的DNA，為了純化蛋白質(zhì)，可采用其它步驟，如陰離子或陽離子交換層析、羥基磷灰石層析或它們的組合，但沒提出這些層析步驟的特定順序。此外，EP1561756涉及的蛋白質(zhì)是血細胞生成因子、細胞因子和抗體。EP1561756中沒提及Fc-融合蛋白。EP1614693描述了依據(jù)蛋白A親和層析、陰離子交換層析和陽離子交換層純化抗體的方法。此文件中，專門提到先后通過陰離子交換和陽離子交換層析，或通過陽離子交換層析然后疏水層析純化抗體。這種疏水層析可用任何其它類型層析，包括羥基磷灰石層析替代。在EP1614693中沒提及Fc-融合蛋白。Feng等，2005描述的抗體純化方法是基于最初用蛋白A的捕獲步驟，其后的精加工步驟可以是疏水相互作用層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析，或羥基磷灰石層析。然而，F(xiàn)eng等只描述了抗體純化而不是Fc-融合蛋白。此外，除最初的蛋白A親和步驟外，沒有提出系統(tǒng)性去除所有不良雜質(zhì)如宿主細胞蛋白質(zhì)(HCP)、凝聚物、DNA、污染病毒和脫落蛋白A的特定順序。因此，對于產(chǎn)生純度適合人給藥的Fc融合蛋白，仍沒有能滿足其充分純化所需的方法。發(fā)明概述本發(fā)明是基于Fc-融合蛋白純化方法的開發(fā)。因此，在第一方面，本發(fā)明涉及Fc-融合蛋白的純化方法，包括以下步驟a.使含有所述Fc-融合蛋白的液體進行蛋白A或蛋白G親和層析；b.使步驟(a)的洗脫物進行陽離子交換層析；C.使步驟(b)的洗脫物進行陰離子交換層析；和d.使步驟(c)的流出液進行羥基磷灰石層析，和收集洗脫物獲得純化的Fc-融合蛋白。此方法可用于純化等電點(pl)范圍在7.0-9.5之間的Fc-融合蛋白。此方法優(yōu)選用于純化治療性Fc-融合蛋白，即預期用于人給藥的Fc-融合蛋白。更優(yōu)選用于包含腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員的胞外部分(特別是配體結合部分和任選的抑制性胞外部分)的Fc-融合蛋白。已令人驚奇地證明了步驟(b)適合去除所謂的游離Fc，即未與整個治療分子(例如TNF家族成員的配體結合胞外部分)融合的免疫球蛋白重鏈結構域。在第二方面，本發(fā)明涉及純化Fc-融合蛋白，優(yōu)選治療性Fc-融合蛋白，更優(yōu)選包含腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員的胞外部分特別是配體結合胞外部分的Fc-融合蛋白，該純化的Fc-融合蛋白所含的游離Fc蛋白低于1%或0.5%或0.2%或0.1%。還顯示步驟(a)、(c)和(d)聯(lián)合顯著地除去無治療活性、對人給藥不需要的Fc-融合蛋白凝聚物。因此，第三方面，本發(fā)明涉及純化的Fc-融合蛋白組合物，優(yōu)選治療性Fc-融合蛋白，更優(yōu)選含有腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員的胞外部分特別是配體結合胞外部分的Fc-融合蛋白。該純化的Fc-融合蛋白所含F(xiàn)c-融合蛋白凝聚物低于1%或低于0.5%，和/或所含游離Fc蛋白低于0.5%或低于0.2%或低于0.1%。本發(fā)明另一方面涉及用陽離子交換層析去除Fc-融合蛋白制品中的游離Fc，所述Fc-融合蛋白制品優(yōu)選治療性Fc-融合蛋白制品，更優(yōu)選包含腫瘤壞死因子受體家族成員胞外部分或配體結合部分的Fc-融合蛋白，和任選其抑制性片段。本發(fā)明還有一方面涉及采用羥基磷灰石層析來去除Fc-融合蛋白制品中的凝聚物，所述Fc-融合蛋白制品優(yōu)選治療性Fc-融合蛋白制品，更優(yōu)選包含腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員的胞外部分的Fc-融合蛋白，或其配體結合片段。附圖的簡要說明圖1.顯示得自實施例2所述陽離子交換層析的逆流不同組分的非還原性銀染色SDS-PAGE。泳道l:分子量標記；泳道2:純化的TACE-Fc;泳道3:加載物；泳道4:洗滌液2;泳道5:洗脫物2;泳道6:洗滌液3;泳道7:洗脫物3;泳道8:洗滌液l;泳道9:洗脫物l;泳道10:純化的游離Fc。圖2.顯示實施例2所述的陽離子交換層析概貌。序列表的簡要說明SEQIDNO:1是TNFR超家族成員共同的半胱氨酸指紋序列(富含半胱氨酸的偽重復序列)；SEQIDN〇2是人TACI受體(如WO98/39361中所述)的全長序列；SEQIDN〇3是本發(fā)明人Fc序列(如WO02/094852中所述)的一個例子；SEQIDNO:4是本發(fā)明的優(yōu)選Fc-融合蛋白，其含有衍生自TACI胞外部分和人IgG,Fc部分(如WO02/094852中所述)的序列。SEQIDNO:5是編碼SEQIDNO:2(如WO02/094852中所述)多肽的聚核苷酸。SEQIDNO:6是編碼SEQIDNO:3(如W〇02/094852中所述)多肽的聚核苷酸。SEQIDNO:7是編碼SEQIDNO:4(如WO02/094852中所述)多肽的聚核苷酸。發(fā)明詳述本發(fā)明基于稱作TACI-Fc融合蛋白的示例性治療用Fc-融合蛋白純化方法的開發(fā)，所述方法產(chǎn)生適合人給藥的高純度TACI-Fc制品。因此本發(fā)明涉及Fc-融合蛋白的純化方法，包括以下步驟a.將包含所述Fc-融合蛋白的液體進行蛋白A或蛋白G親和層析；b.將步驟(a)的洗脫物進行陽離子交換層析；C.將步驟(b)的洗脫物進行陰離子交換層析；d.將步驟(c)的流出液進行羥基磷灰石層析，收集洗脫物以獲得純化的Fc-融合蛋白。在本發(fā)明的一實施方式中，此純化方法不包括凝集素親和層析步驟，特別是不包括小麥胚凝集素瓊脂糖步驟。本發(fā)明的方法可用于純化等電點范圍6.9-9.5的Fc-融合蛋白。蛋白質(zhì)的"等電點"或"pi"是該蛋白質(zhì)的純總電荷為零時的pH,即正電荷與負電荷數(shù)量相等時的pH?？砂凑找蚜己媒⒌募夹g，如等電聚焦技術，來測定任何給定蛋白質(zhì)的pl。要按本發(fā)明純化的Fc-融合蛋白的pI可以是，例如6.9、6.95、7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35、7.4、7.45、7.5、7.55、7.6、7.65、7.7、7.75、7.8、7.85、7.9、7.95、8.0、8.05、8.1、8.15、8.2、8.25、8.3、8.35、8.4、8.45、8.5、8.55、8.6、8.65、8.7、8.75、8.8、8.85、8.9、8.95、9.0、9.05、9.1、9.15、9.2、9.25、9.3、9.35、9.4、9.45、9.5。優(yōu)選地，要按本發(fā)明純化的Fc-融合蛋白的pi為8-9或8.0-9.0，更優(yōu)選為8.3-8.6。本發(fā)明方法優(yōu)選用于純化治療性Fc-融合蛋白，即預期用于治療或預防動物疾病或優(yōu)選用于治療人的Fc-融合蛋白。本發(fā)明方法更優(yōu)選用于純化含有腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員胞外部分的Fc-融合蛋白。該胞外部分優(yōu)選是各自受體胞外部分或結構域的配體結合片段?？砂幢景l(fā)明純化的優(yōu)選的Fc-融合蛋白能結合配體，抑制或阻斷配體的功能，例如受體激活功能。本說明書所用術語"Fc-融合蛋白"含義指包括蛋白質(zhì)，特別是含有從免疫球蛋白衍生的部分(本說明書稱作"Fc-部分")和從第二種非免疫球蛋白衍生的部分(本說明書稱作"治療性部分")的蛋白質(zhì)，不論是否預期用于治療疾病。本說明書所用術語"游離Fc"含義指擬按本發(fā)明方法純化的Fc-融合蛋白的任何部分，它衍生自Fc-融合蛋白的免疫球蛋白部分但不含有該Fc-融合蛋白顯著的治療性部分。因此，游離Fc可包括由IgG絞鏈區(qū)、CH2禾口CH3區(qū)組成的但不連接或結合于顯著的治療部分的二聚體，其對應于例如用木瓜蛋白酶切割產(chǎn)生的Fc-部分。游離的Fc組分中也可含衍生自Fc-部分的單體。已知道此種游離的Fc也可含有來自治療部分的一些氨基酸殘基，例如與該Fc部分融合的屬于治療部分的1-10個(如2、3、4、5、6、7、8或9個)氨基酸。此Fc-部分可衍生自人或動物的免疫球蛋白(lg)，優(yōu)選lgG。所述IgG可以是lgG^lgG2、IgG3或lgG^也優(yōu)選此Fc-部分衍生自免疫球蛋白(優(yōu)選IgG)的重鏈。更優(yōu)選此Fc-部分含有例如免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)部分。這種lg恒定區(qū)優(yōu)選包含至少一個選自絞鏈區(qū)、CH2區(qū)、CH3區(qū)的lg恒定區(qū)，或它們的任何組合。優(yōu)選此Fc-部分至少包含CH2和CH3區(qū)。更優(yōu)選此Fc-部分包含IgG絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)。本發(fā)明的Fc-融合蛋白可以是單體或二聚體。此Fc-融合蛋白也可以是"偽-二聚體"，包含二聚的Fc-部分(如由兩個二硫鍵連接的絞鏈-CH2-CH3結構組成的二聚體)，其中一個(單體)融合于治療部分。此Fc-融合蛋白可以是包含兩個不同治療部分的異質(zhì)二聚體，或包含一種治療部分兩個拷貝的同質(zhì)二聚體。按照本發(fā)明，也可修飾此Fc-部分以調(diào)節(jié)其效應器功能。例如，如果此Fc-部分衍生自IgG"可按照EU索引位置(Kabatetal,1991)引入以下Fc突變T250Q/M428LM252Y/S254T/T256E+H433K/N434FE233P/L234V/L235A/AG236+A327G/A330S/P331SE333A;K322A其它Fc突變可以是例如選自330、331、234或235的EU索引位置上的取代，或它們的組合。也可將位于CH2區(qū)中EU索引位置297的任何氨基酸取代引入本發(fā)明的Fc-部分中，以去除潛在的N-連接糖基附著位點。EU索引位置220處的半胱氨酸殘基也可用絲氨酸殘基取代以去除通常可與免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)形成二硫鍵的半胱氨酸殘基。按照本發(fā)明，優(yōu)選此Fc-部分包含SEQIDNO:3或由其組成，或由含SEQIDNO:6的聚核苷酸編碼。本發(fā)明的治療部分可以衍生自例如EPO、TPO、生長激素、干擾素-a、干擾素-(3、干擾素-y、PDGF-p、VEGF、IL-la、IL-1(3、IL-2、IL-4、IL-5、IL-8、IL-IO、IL-12、IL-18、IL-18結合蛋白、TGF-卩、TNF-a或TNF-J3。本發(fā)明的治療部分也可以衍生自受體，例如跨膜受體，優(yōu)選是或衍生自受體的胞外結構域，特別是某給定受體胞外部分或結構域的配體結合片段和任選的抑制片段。治療上感興趣受體的例子是CD2、CD3、CD4、CD8、CD1la、CD14、CD18、CD20、CD22、CD23、CD25、CD33、CD40、CD44、CD52、CD80、CD86、CD147、CD164、IL-2受體、IL-4受體、IL-6受體、IL-12受體、IL-18受體亞基(IL-18R-a、IL-18R-卩)、EGF受體、VEGF受體、整聯(lián)蛋白-a410(37、整聯(lián)蛋白VLA4、B2整聯(lián)蛋白、TRAIL受體1、2、3和4、RANK、RANK配體、上皮細胞粘附分子(EpCAM)、細胞間粘附分子-3(ICAM-3)、CTLA4(—種細胞毒性T淋巴細胞相關抗原)、Fc個l受體、HLA-DR10|3、HLA-DR抗原、L-選擇蛋白。高度優(yōu)選的是，本發(fā)明的治療部分衍生自屬于TNFR超家族的受體。此治療部分可以是或衍生自TNFR1(p55)、TNFR2(p75)、0X40、骨保護素(Osteoprotegerin)、CD27、CD30、CD40、RANK、DR3、Fas配體、TRAIL-Rl、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TAIL-R4、NGFR、AITR、BAFFR、BCMA、TACI的胞外結構域。按照本發(fā)明，衍生自TNFR超家族成員的治療部分包含該TNFR成員的全部或部分胞外結構域或由其組成，更優(yōu)選包含此TNFR成員的配體結合片段和任選的抑制性片段。下表5列出了本發(fā)明治療部分可從中衍生的TNFR超家族成員和它們各自配體的名單。本領域技術人員不難用例如簡單的體外試驗檢測給定受體的蛋白片段與各自配體之間的結合，來確定TNFR家族成員的"配體結合片段"。這類試驗可以是例如簡單的體外RIA-或ELISA夾心試驗，其中將一種蛋白質(zhì)如受體片段固定在載體(如ELISA平板)上并培育，然后用第二種蛋白如配體適當封閉載體上的蛋白結合位點。培育后，例如利用放射活性標記的配體檢測配體的結合情況，經(jīng)適當洗滌后在閃爍計數(shù)器中測定結合的放射活性。配體的結合也可用標記抗體測定，或用配體特異性第一抗體和抗第一抗體恒定區(qū)的標記第二抗體進行測定。根據(jù)所用標記如顏色反應，不難測定配體的結合?？捎眠m當?shù)募毎囼灆z測配體結合功能的阻斷或抑制。本發(fā)明的方法優(yōu)選用于純化包含選自表5所列TNFR超家庭成員所衍生的治療部分的Fc-融合蛋白。表5:TNFR超家族(根據(jù)Locksley等，2001和Bossen等，2006)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>在一優(yōu)選的實施方式中，F(xiàn)c-融合蛋白包含選自TNFR1、TNFR2胞外結構域，或其TNF結合片段和任選的抑制性片段的治療部分。在另一優(yōu)選實施方式中，F(xiàn)c-融合蛋白包含的治療部分選自BAFF-R、BCMA或TACI的胞外結構域，或其至少能結合Blys或APRIL之一的片段。例如在Hymowitz等，2006中描述了檢測與Blys或APRIL結合能力的試驗。TACI優(yōu)選人的TACI。SEQIDNO:2對應于全長人TACI受體(也見SwissProtentry014836)的氨基酸序列。更優(yōu)選此治療部分包含TACI的可溶性部分，優(yōu)選衍生自TACI的胞外結構域。此TACI-衍生的治療部分優(yōu)選包含SEQIDNO:2的至少氨基酸33-67，禾P/或SEQIDNO:2的氨基酸70-104。在一優(yōu)選實施方式中，按照本發(fā)明的治療部分所包括的TACI胞外域包含SEQIDNO:2的氨基酸1-166，或SEQIDNO:2的氨基酸30-166，或SEQIDNO:2的氨基酸30-119,或SEQIDNO:2的氨基酸30-110，或由它們組成。對于要用本發(fā)明方法純化的Fc-融合蛋白制品，優(yōu)選所有這些治療部分，將其與以上詳述的Fc-部分組合，特別是與含有SEQIDNO:3或由其組成的Fc-部分組合。待用本發(fā)明方法純化的Fc-融合蛋白高度優(yōu)選包含SEQIDNO:4或由其組成，或由SEQIDNO:7的聚核苷酸所編碼。因此，此Fc-融合蛋白高度優(yōu)選包含選自以下的多肽(a)SEQIDNO:2的氨基酸34-66;(b)SEQIDNO:2的氨基酸71-104;(c)SEQIDNO:2的氨基酸34-104;(d)SEQIDNO:2的氨基酸30-110;(e)SEQIDNO:3:(f)SEQIDNO:4:(g)能在高嚴謹條件下與SEQIDNO:5或6或7的互補物雜交的聚核苷酸編碼的多肽；(h)與(c)、(d)、(e)或(f)所述多肽具有至少80%或85%或90%或95%序列相同性的(c)、(d)、(e)或(f)之一所述的突變蛋白；其中所述多肽能結合至少Blys或APRIL之一種。在另一優(yōu)選實施方式中，此Fc-融合蛋白包含球蛋白的重鏈恒定區(qū)，更優(yōu)選人的恒定區(qū)。在本發(fā)明一實施方式中，所述免疫球蛋白是IgG"還優(yōu)選所述恒定區(qū)包含絞鏈區(qū)、CH2禾[JCH3區(qū)。在另一實施方式中，所述治療部分SEQIDNO:1的富含半胱氨酸的偽重復序列。按照本發(fā)明，先使含有Fc-融合蛋白的液體通過蛋白A或蛋白G親和層析柱。所述液體優(yōu)選細胞培養(yǎng)物，如溶解的細胞，更優(yōu)選細胞培養(yǎng)上清液。本說明書所用術語"細胞培養(yǎng)上清液"指培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)液，其含有細胞分泌的蛋白質(zhì)，此蛋白質(zhì)含有適當?shù)募毎盘枺此^的信號肽。優(yōu)選在無血清培養(yǎng)條件下培養(yǎng)此Fc-融合蛋白表達細胞。因此，細胞培養(yǎng)上清液優(yōu)選不含動物血清成分。此種細胞培養(yǎng)液最優(yōu)選是化學成分明確的培養(yǎng)液。親和層析所用的蛋白A可以是重組的。也可加以修飾以改進其性能(如可從GEHealthcare商品化購得的稱為MabSdectSuRe的樹脂)。在一優(yōu)選實施方式中，步驟(a)在含有用重組蛋白A修飾的交聯(lián)瓊脂糖樹脂上進行。以商品名MabSelectXtra(產(chǎn)自GEHealthcare)購得的層析柱是特別適合本方法步驟(a)的親和樹脂例子。蛋白A或蛋白G親和層析優(yōu)選用作捕獲步驟，從而用于純化Fc-融合蛋白，特別是去除宿主蛋白質(zhì)和Fc-融合蛋白的凝聚物，及濃縮Fc-融合蛋白制叩o本說明書所用術語"凝聚物"指蛋白凝聚物，它包括待純化Fc-融合蛋白中的多聚體(如二聚體、四聚體或更大的凝聚物)，可導致產(chǎn)生例如高分子量的凝聚物。此親和層析的另一優(yōu)點是可減少凝聚物水平2-4倍。采用蛋白A或蛋白G親和層析，宿主細胞蛋白質(zhì)水平可降低100-300倍。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方式中，在pH范圍2.8-4.5，優(yōu)選3.0-4.2，更優(yōu)選3.5、3.55、3.6、3.65、3.7、3.75、3.8、3.85、3.9、3.95、4.0、4.05、4.1或4,15時，進行步驟(a)的洗脫。步驟(a)的洗脫也可用梯度pH，優(yōu)選pH4.5-2.8的梯度進行。在另一優(yōu)選實施方式中，步驟(a)的洗脫用選自乙酸鈉或檸檬酸鈉的緩沖液進行。合適的緩沖液濃度選自例如選自50mM或100mM或150mM或200mM或250mM。按照本發(fā)明，將蛋白A或蛋白G層析后的洗脫物進行陽離子交換層析。陽離子交換層析可在任何合適的陽離子交換樹脂(如以上發(fā)明背景中所述的弱或強陽離子交換劑)上進行。優(yōu)選在強陽離子交換樹脂上進行步驟(b)。更優(yōu)選此陽離子交換材料含有以S(V基團修飾的交聯(lián)異丁烯酸酯。以商品名FractogdEMDS03—(產(chǎn)自Merck)購得的層析柱是特別適合本方法步驟(b)的陽離子交換樹脂的例子。優(yōu)選將蛋白A的洗脫物直接加載到該陽離子交換柱上。優(yōu)選在至少低于待純化Fc-融合蛋白pi—個單位的pH下進行此加載。還優(yōu)選在加載后，用導電率6-10mS/cm例如6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8或9.9mS/cm的緩沖液洗滌。更優(yōu)選此導電率的范圍為7.6-9.2，即8.4±0.8mS/cm。洗滌步驟宜在pH5.5-7.5、優(yōu)選6.0-7.0下進行。在另一優(yōu)選實施方式中，在pH范圍7.0-8.5，優(yōu)選在pH7.25或7.3或7.35或7.4或7.45或7.5或7.55或7.6或7.65或7.7或7.7或7.75或7.8或7.85或7.9或7.95或8.0或8.05或8.1或8.15或8.2或8.25或8.3或8.35或8.4或8.45或8.5下，洗脫陽離子交換層析柱。宜用導電率范圍在15-22mS/cm的緩沖液進行洗脫。例如，所述導電率可選自16、17、18、19、20、21或22mS/cm。優(yōu)選的洗脫緩沖液是磷酸鹽緩沖液。在一高度優(yōu)選實施方式中，步驟(b)還包括以下步驟b1.用pH6.0-7.0及導電率6-10mS/cm的緩沖液洗滌陽離子交換樹脂；和b2.用pH7.0-8.5及導電率15-22mS/cm的緩沖液洗脫該層析柱。步驟(bl)的優(yōu)選緩沖液是75-125mM的磷酸鈉緩沖液。在本發(fā)明框架中令人驚奇地發(fā)現(xiàn)步驟(b)能有效去除游離的Fc。因此，按照本發(fā)明，陽離子交換層析可優(yōu)選用于去除或降低游離Fc約5-15倍。本發(fā)明方法的步驟(b)的優(yōu)點是還能降低Fc-融合蛋白制品中的宿主細胞蛋白濃度，例如l-2倍，因而對清除宿主細胞蛋白(HCP)有顯著貢獻。按照本發(fā)明，使陽離子交換步驟后的洗脫物通過陰離子交換層析柱。陰離子交換層析可在任何合適的陰離子交換樹脂(如以上發(fā)明背景中所述的弱或強陰離子交換劑)上進行。優(yōu)選在強陰離子交換樹脂上進行步驟(c)。更優(yōu)選此陰離子交換樹脂含有帶N+(CH3)3基團修飾的聚苯乙烯/二乙烯基苯。以商品名Source30Q(產(chǎn)自GEHealthcare)購得的層析柱是特別適合本方法步驟(q的陰離子交換樹脂的例子。步驟(b)的洗脫物在加載到陰離子交換柱前宜用適當?shù)募虞d緩沖液先稀釋或透析。此陰離子交換柱也宜先用該加載緩沖液平衡。加載緩沖液的pH宜低于pI—個單位。合適的pH值范圍為6.0-8.5，優(yōu)選7.0-8.0，例如7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35、7.4、7.45、7.5、7.55、7,6、7.65、7.7、7.75、7.8、7.85、7.9、7.95或8.0。加載緩沖液的優(yōu)選導電率范圍為3.0-4.6mS/cm。合適的平衡/加載緩沖液可以是例如濃度范圍5-35mM、優(yōu)選20-30mM的磷酸鈉溶液。緩沖液的濃度可以是例如10、15、20、25、30mM。本發(fā)明的框架中，收集含感興趣Fc-融合蛋白的陰離子交換層析流出液(也稱為流穿液)。本發(fā)明方法的步驟(c)可進一步減少凝聚物3-5倍，減少宿主細胞蛋白質(zhì)30-70倍。按照本發(fā)明，將步驟(c)陰離子交換層析的流出液用羥基磷灰石層析柱進一步純化。本發(fā)明方法的步驟(d)可采用任何羥基磷灰石樹脂進行。在一優(yōu)選實施方式中，在陶瓷羥基磷灰石樹脂如I型或II型羥基磷灰石樹脂上進行步驟(d)。羥基磷灰石樹脂可以是任何粒度如20、40或80pm的顆粒。在一較為優(yōu)選的實施方式中，此種陶瓷羥基磷灰石樹脂為40pm粒度的顆粒。特別適合本方法步驟(d)的羥基磷灰石樹脂是以商品名CHTCeramicHydroxyapatiteI型(40jim)購得的層析柱。在一優(yōu)選實施方式中，將步驟(c)的流出液直接加載到羥基磷灰石樹脂上，即無須事先用合適的加載緩沖液稀釋或透析。加載宜在pH6.5-7.5，例如6.6、6.7、6.8、6.9、7.1、7.2、7.3或7.4，優(yōu)選7.0下進行。在另一優(yōu)選實施方式中，在2-10mM磷酸鈉存在下，優(yōu)選1.75-5.25mM，例如2、2,25、2.5、2,75、3、3.25、3.5、3.75、4、4.25、4,5、4.75、5mM，進行步驟(d)的洗脫。在還有一優(yōu)選實施方式中，在pH6.0-7.0范圍例如6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9下進行步驟(d)的洗脫。在另一優(yōu)選實施方式中，在0.4-1M氯化鉀存在下，優(yōu)選0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95M，最優(yōu)選0.6M，進行步驟(d)的洗脫。按照本發(fā)明，收集步驟(d)的洗脫物，其含有最終純化的Fc-融合蛋白制P叩o與本發(fā)明有關可使用的步驟(a)至(c)中所用層析樹脂的合適基質(zhì)材料即載體材料，可以是例如瓊脂糖((sepharose,superose)、葡聚糖(sephadex)、聚丙烯、異丁烯酸酯纖維素、聚苯乙烯/二乙烯基苯等。根據(jù)具體用途，樹脂材料可以各種交聯(lián)形式存在。所用層析柱中的樹脂體積、柱的長度和直徑，以及動態(tài)容量和流速，取決于幾種參數(shù)，例如擬處理液體的體積，要實施本發(fā)明方法的液體中蛋白質(zhì)的濃度等等。測定各步驟中的這些參數(shù)的方法是本領域普通技術人員熟知的。在本發(fā)明純化方法的一個優(yōu)選實施方式中，進行一步或多步超濾。超濾用于去除先前層析步驟所得洗脫物中的小有機分子和鹽，用大量緩沖液平衡Fc-融合蛋白，或濃縮Fc-融合蛋白到所需濃度。這種超濾可在孔徑能允許去除分子量低于5、10、15、20、25、30kDa或更大kDa的成分的超濾膜上進行。優(yōu)選在步驟(b)與(c)之間，和/或在步驟(d)后進行超濾。更優(yōu)選進行兩次超濾，一次在步驟(b)與(c)之間，一次在步驟(d)后。如果按本發(fā)明方法純化的蛋白是用于人給藥的，此方法中宜包括一步或多步病毒去除。較佳為在步驟(d)后進行病毒過濾去除步驟。更佳為病毒過濾去除步驟是納米過濾步驟，其中所用濾膜的標稱孔徑為20nm。本發(fā)明方法和具體步驟(a)、(c)、(d)與納米過濾聯(lián)用能有效去除病毒載量至總LRV(對數(shù)減少值)不高于約15-25。為了有利于貯存或運輸，例如，可在本發(fā)明純化步驟之前和/或之后凍融這種材料。按照本發(fā)明，可用真核表達系統(tǒng)，如酵母菌、昆蟲或哺乳動物細胞生產(chǎn)重組Fc-融合蛋白，以產(chǎn)生糖基化的Fc-融合蛋白。按照本發(fā)明，最優(yōu)選在哺乳動物細胞如動物細胞系或人細胞系中表達Fc-融合蛋白。中國侖鼠卵巢細胞(CHO)或小鼠骨髓瘤細胞系NSO是特別適合表達待純化Fc-融合蛋白的細胞系例子。也優(yōu)選用人細胞系，如人纖維肉瘤HT1080細胞系、人視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞系PERC6、或人胚腎細胞系293，或EP1230354中描述的恒定的羊水細胞系來生產(chǎn)Fc-融合蛋白。如果待純化的Fc-融合蛋白用哺乳動物細胞分泌表達，本發(fā)明純化方法的起始材料為細胞培養(yǎng)上清液，也稱為收獲液或粗制收獲液。如果用含動物血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，這種細胞培養(yǎng)上清液仍含有血清蛋白雜質(zhì)。宜在無血清條件下培養(yǎng)表達和分泌Fc-融合蛋白的細胞。也可用化學成分明確的培養(yǎng)液產(chǎn)生Fc-融合蛋白。此時，本發(fā)明純化方法的起始材料是主要含宿主細胞蛋白雜質(zhì)的無血清細胞培養(yǎng)上清液。例如，如果在此細胞培養(yǎng)液中加入生長因子如胰島素，純化過程中也將需要去除這些蛋白質(zhì)。為了產(chǎn)生可溶的分泌性Fc-融合蛋白使其釋放到細胞培養(yǎng)上清液中，可利用Fc-融合蛋白治療部分的天然信號肽，或優(yōu)選異源信號肽，即在所用的特定表達系統(tǒng)中有效的源自另一種分泌蛋白的信號肽，例如牛或人的生長激素信號肽，或免疫球蛋白信號肽。如上所述，待用本發(fā)明方法純化的優(yōu)選Fc-融合蛋白是具有衍生自人TACI(SEQIDNO:2)的治療部分、特別是具有衍生自其胞外結構域(SEQIDNO:2的氨基酸1-165)片段的融合蛋白。一種優(yōu)選的片段包含SEQIDNO:2的氨基酸30-110。在下文中，衍生自TACI胞外域的治療部分將稱為"可溶性TACI"或"sTACI"。一種優(yōu)選的Fc-部分包含SEQIDNO:3，其可產(chǎn)生SEQIDNO:4的Fc-融合蛋白，在下文中稱"TACI-Fc"。本說明書所用的術語TACI-Fc也包括TACI-Fc的突變蛋白。本說明書所用的術語"突變蛋白"指sTACI或TACI-Fc的同類物，其中sTACI或TACI-Fc的一個或多個氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基置換，或缺失，或在sTACI或TACI-Fc的原始序列中加入了一個或多個氨基酸殘基，與原始sTACI或TACI-Fc相比，不會顯著改變所得產(chǎn)物的活性?？捎靡阎暮铣杉夹g和/或定點誘變技術，或任何其它已知的適合技術，來制備這些突變蛋白。本發(fā)明的突變蛋白包括由能在嚴謹條件下與編碼SEQIDNO:2或4之一所示sTACI或TACI-Fc的DNA或RNA的互補物雜交的核酸(如DNA或RNA)編碼的蛋白質(zhì)。編碼TACI-Fc的DNA序列例子是SEQIDNO:7。術語"嚴謹條件"指雜交和隨后的洗滌條件，該領域普通技術人員常規(guī)稱作"嚴謹條件"。參見Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,同上，lnterscience，N.Y.,§§6.3和6.4(1987，1992)。非限制的嚴謹條件的例子包括在計算出的所述雜交Tm之下12-20°C的洗滌條件，例如用2xSSC和0.5%SDS洗滌5分鐘，用2xSSC和0.1%SDS洗滌15分鐘；用0.1xSSC和0.5%SDS于37。C洗滌30-60分鐘，然后用0.1xSSC和0.5%SDS于68°C洗滌30-60分鐘。本領域普通技術人員知道嚴謹條件也取決于DNA序列、寡核苷酸探針的長度(如10-40個堿基)或混合寡核苷酸探針的長度。如果采用混合探針，宜用氯化四甲銨代替SSC。參見Ausubel，同上。在另一實施方式中，任何此種突變蛋白至少有50%、至少有60%、至少有75%、至少有80%、至少有85%、至少有90%、或至少有95%的相同性或同源性。相同性反映通過序列比較確定的兩個或多個多肽序列之間或兩個或多個聚核苷酸序列之間的關系。一般說，相同性指兩條聚核苷酸或兩條多肽序列在所比較的序列長度上，核苷酸與核苷酸、或氨基酸與氨基酸精確相對應。對于并非精確對應的序列，可測定"相同性百分比％"。一般說，將要比較的兩條序列進行排列對比，得出兩個序列之間的最大相關性。這可能包括在一條或兩條序列中插入"空格"以提高排列對比程度?？蓽y定要比較的各序列全長的相同性百分比％(所謂總體序列對比)，這特別適合長度相同或非常相似，或較短而長度明確的序列(所謂局部序列對比)，更適合長度不相等的序列。比較兩條或多條序列相同性和同源性的方法是本領域熟知的。例如，可采用Wisconsin序列分析包9.1版(DevereuxJ等，1984)中的程序，例如BESTFIT和GAP程序，來測定兩條聚核苷酸之間的相同性。/。和兩條多肽序列之間的相同性％及同源性％。BESTFIT采用Smith和Waterman(1981)的"局部同源性"算法，尋找兩個序列之間相似性最佳的一個區(qū)域。其它測定序列之間相同性和/或相似性的程序是本領域知道的，例如通過www.ncbi.nlm.nih.gov的NCBI主頁進入得到BLAST(AltschulSF等，1990,AltschulSF等，1997)和FASTA(PearsonWR,1990)家族程序。任何這類突變蛋白最好具有充分復制的sTACI或TACI-Fc序列的氨基酸序列，從而具有與SEQIDNO:2或4基本相似的配體結合活性。例如，TACI的一種活性是能結合Blys或APRIL(Hymowitz等，2006)。只要這種突變蛋白具有基本的APRIL或Blys結合活性，即可視為具有與TACI基本相似的活性。因此，本領域技術人員通過常規(guī)實驗不難測定任何給定的突變蛋白是否具有與SEQIDNO:2或4蛋白基本相同的活性。本發(fā)明突變蛋白優(yōu)選的改變是稱為"保守性"取代的改變。sTACI或TACI-Fc的保守性氨基酸取代可包括具有充分相似理化性質(zhì)的一組氨基酸成員中的同義氨基酸取代，將保留該分子的生物學功能(Grantham，1974)。已清楚可在上述序列中進行氨基酸插入和缺失而不會改變它們的功能，特別是如果這種插入或缺失只涉及少數(shù)氨基酸，如30個以下、20個以下、或優(yōu)選10個以下，且不去除或取代對功能構型關鍵性的氨基酸，如半胱氨酸殘基。這種缺失和/或插入產(chǎn)生的蛋白和突變蛋白落入本發(fā)明范圍內(nèi)。保守性氨基酸分組優(yōu)選表2所列的那些。同義氨基酸分組更優(yōu)選表3所列的那些，同義氨基酸分組最優(yōu)選表4所列的那些。表2優(yōu)選的同義氨基酸組氨基酸同義組SerSer，Thr,Gly，AsnArgArg,Gln，Lys，Glu,HisLeulie,Phe,Tyr，Met,Val，LeuProGly,Ala,Thr'ProThrPro,Ser,Ala，Gly,His,Gln'ThrAlaGly,Thr，Pro,AlaValMet,Tyr,Phe,lie,l_eu，ValGlyAla,Thr，Pro,Ser'GlylieMet,Tyr,Phe，Val，l_eu,liePheTrp'Met,Tyr，lle，Val，Leu,PheTyrTrp，Met,Phe，lie,Val，Leu，TyrCysSer，Thr，CysHisGlu,Lys,Gln，Thr，Arg，HisGinGlu'l_ys,Asn，His,Thr'Arg,GinAsnGln，Asp,Ser，Asn匕ysGlu，Gin,His,Arg,LysAspGlu，Asn，AspGluAsp,Lys，Asn'Gln，His,Arg'GluMetPhe,lie,Val,Leu,MetTrpTrp表3更優(yōu)選的同義氨基酸組氨基酸同義組SerSerArgHis,Lys，ArgLeul_eu,lie,Phe，MetProAla,ProThrThrAlaPro,AlaValVal，Met,lieGlyGlylielie,Met'Phe，Val，LeuPheMet,Tyr,lie,L_eu，PheTyrPhe，TyrCysCys，SerHisHis,Gin,ArgGinGlu,Gin,HisAsnAsp,AsnLysLys，ArgAspAsp,AsnGluGlu，GinMetMet,Phe，lle，Val，LeuTrpTrp表4最優(yōu)選的同義氨基酸組<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>從按照本發(fā)明純化的Fc-融合蛋白可制備其功能衍生物。本說明書所用的"功能衍生物"覆蓋擬按本發(fā)明方法純化的Fc-融合蛋白的衍生物，用本領域已知的方法可從殘基的側鏈功能基團或N-或C-末端基團制備此衍生物，只要它們?nèi)詾樗帉W上可接受的，即它們的蛋白質(zhì)活性沒有破壞，仍基本上類似于上述未經(jīng)修飾的Fc-融合蛋白的活性，以及不會使含它們的組合物產(chǎn)生毒性，就都包括在本發(fā)明中。Fc-融合蛋白的功能衍生物可例如偶聯(lián)于聚合物以改善其蛋白性能，如穩(wěn)定性、半衰期、生物利用度、人體的耐受性或免疫原性。為實現(xiàn)此目的，可將TACI-Fc連接于例如聚乙二醇(PEG)。PEG化可用已知方法例如WO92/13095中描述的方法進行。例如，此種功能衍生物也可包括羧基的脂肪族酯，羧基與氨或伯胺或仲胺反應形成的酰胺，氨基酸殘基的游離氨基與酰基(如烷?；颦h(huán)碳芳酰基)形成的N-?；苌铮蛴坞x羥基(例如絲氨?；蛱K氨酰殘基的游離羥基)與?；纬傻腛-?；苌铩５谌矫?，本發(fā)明涉及用本發(fā)明純化方法純化的蛋白質(zhì)。在下文中，這種蛋白質(zhì)也稱為"純化的Fc-融合蛋白"。這種純化的Fc-融合蛋白較佳為高度純化的Fc-融合蛋白。例如，在每條泳道加載2mcg蛋白作非還原性SDS-PAGE凝膠電泳銀染色，以只存在一條帶來確定Fc-融合蛋白的高純度。也可利用在HPLC中洗脫物只有一個峰來確定純化的Fc-融合蛋白。從本發(fā)明純化方法獲得的Fc-融合蛋白制品可含有低于20%的雜質(zhì)，較佳為低于10%、5%、3%、2%或1%的雜質(zhì)，或可以純化至勻質(zhì)，即用上述銀染色SDS-PAGE或HPLC檢測沒有任何可檢測到的污染蛋白。純化的Fc-融合蛋白預期可用于治療，特別是給予病人。如果將純化的Fc-融合蛋白給予病人，宜全身給藥，較佳為皮下或肌肉內(nèi)，或局部給藥。根據(jù)純化Fc-融合蛋白的具體醫(yī)學用途，直腸內(nèi)或鞘膜內(nèi)給藥可能也是適合的。為此目的，在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方式中，可將純化的Fc-融合蛋白配制成藥物組合物，即與藥學上可接受的載體、賦形劑等一起配制。"藥學上可接受的"其定義意在包括不干擾活性成分生物學活性的有效性和對給藥宿主無毒的任何載體。例如，對于胃腸道外給藥，可將活性蛋白用載體如鹽水、葡聚糖溶液、血清白蛋白和林格液配制成注射用單位劑型。本發(fā)明藥物組合物的活性成分可經(jīng)各種途徑給予個體。給藥途徑包括皮內(nèi)、透皮(如緩釋制劑)肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下途徑，口服、顱內(nèi)、硬膜外、局部、直腸內(nèi)和鼻內(nèi)途徑。任何其它治療上有效的給藥途徑均可使用，例如通過上皮或內(nèi)皮組織吸收，或基因治療，其中給予病人編碼活性藥物的DNA分子(如通過載體)導致活性藥物在體內(nèi)表達和分泌。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可與其它生物學活性藥物組分，如藥學上可接受的表面活性劑、輔料、載體、稀釋劑等一起給予。對于胃腸道外(如靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi))給藥，可將活性蛋白質(zhì)與藥學上可接受的胃腸道外載體(如水、鹽水、葡萄糖溶液)和維持等滲性(如甘露醇)或化學穩(wěn)定性(如防腐劑和緩沖劑)的添加劑聯(lián)合配制成溶液、懸浮液、乳液或凍干粉末。通過常用技術將此制劑滅菌?；钚缘鞍椎闹委熡行Я靠赡苁窃S多變量的函數(shù)，這些變量包括Fc-融合蛋白的類型、Fc-融合蛋白對其配體的親和力、給藥途徑、病人的臨床狀況。如以上所述和特別參見上面的表5，"治療有效量"是Fc-融合蛋白給藥后導致對Fc-融合蛋白治療性部分的配體產(chǎn)生抑制作用的量。以單劑量或多劑量給予個體的劑量，將視各種因素而不同，包括Fc-融合蛋白的藥代動力學性質(zhì)、給藥途徑、病人狀況和特征(性別、年齡、體重、健康狀況、身體大小)、癥狀程度、同時進行的治療、治療頻率和需要的效果。調(diào)整和操縱已制定的劑量范圍屬于本領域技術人員的能力范圍，在個體上測定治療部分天然配體抑制作用的體內(nèi)外方法也是如此。純化Fc-融合蛋白的用量為每公斤體重0.001-100mg，或0.01-10mg，或(U-5mg，或1-3mg，或2mg。在其它優(yōu)選實施方式中，每日或每隔一日，或每周三次或每周一次給予純化的Fc-融合蛋白。每日劑量通常以可有效獲得所需結果的分劑量或持續(xù)釋放形式給予。可以與最初或先前給予個體的劑量相同的、較少的或較多的劑量進行第二次或隨后的給藥?？稍诩膊“l(fā)作期間或之前進行第二次或隨后的給藥。本發(fā)明還涉及用以上詳述的本發(fā)明方法獲得的包含腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員胞外部分的純化的Fc-融合蛋白組合物，其中，所述組合物包含的蛋白凝聚物少于2%、或少于1.5%、或少于1%、或少于0.7%、或少于0.6%、或優(yōu)選少于0.5%。本發(fā)明的組合物較佳為包含全長的完整Fc-融合蛋白，其N-或C-末端缺失不多于1或2個氨基酸，更優(yōu)選其N-或C-末端不缺失任何氨基酸。本發(fā)明還涉及用本發(fā)明方法獲得的包含腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員胞外部分的純化的Fc-融合蛋白組合物，其中，所述組合物包含的上述游離Fc少于1%、或少于0.8%、或少于0.5%。這種Fc-融合蛋白可以例如衍生自TNFR超家族成員0X40。這種OX40-功能蛋白，如OX40-IgG,和OX40-hIG4mut，可優(yōu)選用于治療和/或預防炎癥和自身免疫性疾病，如克羅恩病。此種包含治療部分的Fc-融合蛋白較佳為選自TNFR1、TNFR2的胞外結構域，或其TNF結合片段。在一優(yōu)選實施方式中，這種Fc-融合蛋白是依那西普(Etanercept)，一種含有p75TNFR的可溶性部分的Fc-融合蛋白(如WO91/03553,WO94/06476)。按照本發(fā)明純化的依那西普可用于例如治療和/或預防子宮內(nèi)膜移位癥、丙肝病毒感染、HIV感染、牛皮癬關節(jié)炎、牛皮癬，類風濕關節(jié)炎、哮喘、強直性脊椎炎、心力衰竭、移植物抗宿主疾病、肺纖維化、克羅恩病。來那西普(Lenercept)是一種含有人p55TNF受體胞外組分和人IgGFc部分的融合蛋白，預期可用于治療嚴重膿毒癥和多發(fā)性硬化癥。在另一優(yōu)選實施方式中，F(xiàn)c-融合蛋白包含選自BAFF-R、BCMA或TACI胞外結構域的治療部分，或其能與Blys或APRIL中至少一種結合的片段。按照本發(fā)明方法純化的衍生自BAFF-R的Fc-融合蛋白優(yōu)選用于治療和/或預防自身免疫性疾病，如類風濕關節(jié)炎(RA)和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)。按照本發(fā)明方法純化的BCMA-Ig融合蛋白優(yōu)選用于治療和/或預防自身免疫性疾病。衍生自TACI的Fc-融合蛋白(TACI-Fc)優(yōu)選包含選自以下的多肽a.SEQIDNO:2的氨基酸34-66;b.SEQIDNO:2的氮基酸71-104;c.SEQIDNO:2的氨基酸34-104;d.SEQIDNO:2的氨基酸30-110;e.SEQIDNO:3:f.SEQIDNO:4:g.能在高嚴謹條件下與SEQIDNO:5或6或7的互補物雜交的聚核苷酸編碼的多肽；h.與(c)、(d)、(e)或(f)所述多肽具有至少80%或85%或90%或95%序列相同性的(c)、(d)、(e)或(f)之一的突變蛋白；其中所述多肽能結合Blys或APRIL中至少一種。純化的TACI-Fc可優(yōu)選用于制備治療和/或預防多種疾病或病患的藥物。這類疾病或病患宜選自自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕關節(jié)炎(RA)，及治療多發(fā)性硬化癥(MS)。純化的TACI-Fc也可用于治療癌癥，例如血液惡性腫瘤如多發(fā)性骨髓瘤(MM)和/或非何杰金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)和瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥(WM)?，F(xiàn)已全面描述了本發(fā)明，本領域技術人員會理解，在廣泛的同等參數(shù)、濃度和條件范圍內(nèi)，不背離本發(fā)明的思路和范圍的范圍，也無須過多實驗，可以實施本發(fā)明的方法。本發(fā)明已結合具體實施方式加以描述，可以理解本發(fā)明能作進一步的修改。本申請旨在覆蓋基本上按照本發(fā)明的原理對本發(fā)明所作的任何更改、利用或適應性修改，包括背離本說明書公開的內(nèi)容，而這些更改、利用或適應性修改屬于本發(fā)明所屬領域已知或常規(guī)實踐原理范圍內(nèi)，以及如下所附權利要求闡述的可適應于上文所述的基本特征。本說明書引用的所有參考文獻，包括雜志中的文章或摘要，出版或未出版的美國或外國專利申請、已發(fā)布的美國或外國專利或任何其它參考文獻都整體納入本說明書作為參考，包括參考文獻中的所有數(shù)據(jù)、表格、附圖和文本。此外，本說明書引用的參考文獻中的參考文獻目錄也全部納入本說明書作參考。參考已知的方法步驟、常規(guī)方法的步驟、已知方法或常規(guī)方法，并不以任何方式承認在相關領域中公開、教導和提示了本發(fā)明的任何方面內(nèi)容、說明或實施方式。以上具體實施方式的描述完全揭示了本發(fā)明總的性質(zhì)，他人可通過應用本
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的知識(包括本說明書引用參考文獻的內(nèi)容)無須過多實驗和不背離本發(fā)明的總體概念而不難修飾和/或改編這些具體實施方式以供各種應用。因此，這些依據(jù)本說明書提供的教導和指引作出的適應性修改和修飾屬于所公開的實施方式等同物的范圍。也應理解，本說明書所用的措詞或術語是為了說明而非限制的目的，因此本說明書的術語或措詞可由本領域技術人員憑借本說明書提供的教導和指引，結合本領域普通技術人員的知識予以解釋。實施例:從無血清CHO細胞上清液中純化重組人TACI-Fc詞匯表BV:柱床體積CHO:中國侖鼠卵巢DSP:下游工藝EDTA:乙二胺四乙酸ELISA:酶聯(lián)免疫吸附試驗HAC:羥基磷灰石層析HCP:宿主蛋白HPLC:高效液相色譜id:效K:鉀kD:千道爾頓MES:2-嗎啉基乙磺酸Na:鈉NaAc:乙酸鈉n/d:未測定PA-SE-HPLC:蛋白A分子大小排阻高效液相色譜ppm:百萬分率RO:逆向滲透RT:室溫SDS-PAGE:十二烷基硫酸鈉聚丙酰胺凝膠電泳SE-HPLC:分子大小排阻高效液相色譜T。C:溫度TMAC:氯化四甲銨UV:紫外線WFI:注射用水WRO逆向滲透水實施例1:捕獲步驟蛋白A親和純化起始材料是在無血清條件下培養(yǎng)的表達TACI-Fc的CHO細胞克隆澄清收集液，冰凍貯存至使用。按以下方案在MabSelectXtra柱(GEHealthcare17-5269-03)上進行此捕獲步驟，此柱的床高17cm。所有操作在室溫下進行，除了加載溶液保持在15°C以下。記錄280nm的UV信號。微用至少3BV的0.1M乙酸+20%乙醇，以250cm/h的逆流速清潔此柱。停止流動1小時。用至少2BV的RO水，以250cm/h的逆流速洗滌此柱。f翁一用至少5BV的25mM磷酸鈉+150mM的NaCl液pH7.0(單位導電率和pH參數(shù)在特定范圍內(nèi)pH7.0士0.1，導電率18±2mS/cm)以450cm/h的向下流速平衡此柱?！贰ㄝd以350cm/h的流速加載保持在15°C以下的收集澄清液到此柱上，用Biacore試驗測定每ml填充樹脂的加載容量不高于15mg總TACI-Fc蛋白。用至少2BV的平衡緩沖液，以350cm/h流速洗滌此柱，然后用至少4BV的平衡緩沖液，以450cm/h流速洗漆此柱(直到UV信號回到基線)。碰用表1所示的不同洗脫緩沖液，以350cm/h流速洗脫此材料。當UV信號開始上升至洗脫至6.0士0.5BV時，收集洗脫組分。在pH4.1以下(如果需要，加入檸檬酸液調(diào)節(jié))室溫培育洗脫物1小時，然后加入32n/。NaOH液調(diào)節(jié)pH至5.0±0.1。體用至少3BV的50mMNa〇H+1MNaCI液，以450cm/h逆向流速再生此柱，停止流動15分鐘，然后用至少3BV的液體重新開始，流速450cm/h(直到UV信號返回到基線)。從此步驟起，用逆流方式操作此柱。用至少2BV的RO水，以450cm/h流速洗滌此柱。臂茲用至少3BV的清潔緩沖液，以250cm/h流速清潔此柱，停止流動培育此柱60分鐘。蔬游淑繊f用至少1BV的RO水以250cm/h流速，然后用至少3BV的平衡緩沖液以250cm/h流速，最后用至少2BV的RO水以250cm/h流速洗滌此柱。最后，在用3BV的20%乙醇以250cm/h流速洗滌后將柱儲存。結果表I:采用不同洗脫緩沖液的結果<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>結論澄清收集液中的TACI-Fc5被直接捕獲在MabSelectXtra柱上，當流速為350cm/h時每升充填樹脂的動態(tài)容量為15g總TACI-Fc5蛋白。優(yōu)化洗脫條件，尤其是pH，能最大回收產(chǎn)物同時顯著減少凝聚物水平。選擇0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH3.9)，使澄清收集液中的凝聚物水平從起初的約25-40%降低到約5-10%，未觀察到混濁。HCP水平通常為1500-2000卯m。用多克隆抗體ELISA測定HCP水平。制備了針對非轉染CHO細胞的澄清和濃縮細胞培養(yǎng)上清液中宿主細胞蛋白質(zhì)的抗體混合物。實施例2:陽離子交換層析將蛋白A捕獲步驟得到的洗脫物用適當?shù)募虞d緩沖液透析后用作陽離子交換層析的起始材料。此步采用床高10cm的FractogelEMDS(V柱(Merck1.16882.0010)。也可采用床高15cm的FractogelEMDS03—柱。后者的動態(tài)容量和流速可能需要改造，這屬于本領域技術人員的常規(guī)知識。所有操作在室溫下進行，流速恒定保持在150cm/h。記錄所有時間段的280nmUV信號。淑繊f用至少1BV的WRO(逆向滲透水)洗滌此柱。獰^然后，用至少3BV的0,5MNaOH+1.5MNaCI液以向上流動方式清潔此柱。/#然用至少4BV的WRQ以向下流動方式淋洗此柱。術用至少4BV的100mM檸檬酸鈉液(pH5.0)平衡此柱(或直到達到導電率為12±1mS/cm禾口pH5.0±0.1的目標)。》〃載用pH5.0(pH5.0土0.1，導電率12±1mS/cm)的后捕獲材料加載此柱，用SE-HPLC試驗測得每ml充填樹脂的容量不超過50mgTACI-Fc。淑繊f然后用至少5BV的lOOmM磷酸鈉液(pH6.5)洗滌此柱。扁用下表II-IV報告的不同緩沖液在不同條件下洗脫此柱。體稀茲用4BV的0.5MNaOH+1.5MNaCI液以向上流動方式再生和清潔此柱。然后停止流動30分鐘。纖用至少4BV的WRO淋洗此柱。錄存將此柱儲存在至少3BV的20%乙醇中。結果表II:洗脫液pH和導電率的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表III顯示了每ml樹脂的加載容量為10和32mgTACI-Fc且用導電率12-33mS/cm的磷酸緩沖液洗脫時TACI-Fc的回收率和HCP的清除率。從洗脫液UV開始上升起收集蛋白峰組分，共收集i0±0.5BV。表III:優(yōu)化洗脫液的pH和導電率對加載容量的作用加載液中的HCP水平201ppm。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表IV顯示采用50或100或150mM磷酸鈉液(pH6.5)的洗滌步驟對TACI-Fc回收和HCP清除效率的影響。表IV:洗滌步驟條件對層析柱效能的影響加載液中的HCP水平190ppm，凝聚物水平2.0%<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>第二次洗滌所用的緩沖液含lOOmM磷酸鈉，pH6.5，導電率8.4mS/cm。圖1顯示用表IV所示三步洗滌實驗條件清除游離Fc的實驗中得到的樣品的銀染色非還原性SDS-PAGE凝膠。圖2顯示用不同濃度磷酸鈉液洗滌實驗步驟的相互重疊色譜圖。用提高磷酸鈉濃度(從50mM提高到150mM)使洗滌步驟優(yōu)化于pH6.5。如圖1所見，150mM濃度的洗滌緩沖液(洗滌3，泳道6)導致TACI-Fc的丟失。50mM濃度的洗滌緩沖液(洗滌1，泳道8)產(chǎn)生了一個純TACI-Fc蛋白峰，然而洗脫物中含有微量游離Fc。用lOOmM磷酸鈉液(pH6.5)的洗滌步驟導致洗脫物主峰中的回收率為98%,洗滌液中只丟失了2%(圖2)。HCP清除了3.2倍。洗滌液和洗脫物組分的SDS-PAGE分析顯示，用100mM或以上濃度的緩沖液，此洗漆步驟洗滌液含游離Fc和一些完整的TACI-Fc蛋白(圖l，泳道4和6)。lOOmM或更高的濃度是完全去除洗脫物組分中游離Fc所必須的(圖l，泳道5和6)。結論開發(fā)了陽離子交換步驟作為捕獲步驟后的第二步純化步驟。捕獲的洗脫物pH低(5.0)，導電率低，可直接加到陽離子交換柱上。選擇加載容量為50mg/ml的FractogelEMDSQ3—樹脂。洗滌步驟中采用0.1M磷酸鈉液(pH6.5)能有效去除無生物學活性的降解產(chǎn)物游離Fc。優(yōu)化洗脫條件實現(xiàn)了HCP的最佳清除和TACI-Fc的高回收(179mM磷酸鈉液，pH8.0，導電率20.7mS/cm)。另外，當280nm吸光度開始升高時，用10BV的20mM磷酸鈉和180mMNaCl液(pH8.0)進行洗脫。實施例3:陰離子交換層析此純化步驟所用的起始材料是FractogelS03—(參見實施例2)陽離子交換步驟得到的洗脫物，用合適的加載緩沖液透析或稀釋。在10cm柱床高的SOURCE30Q層析柱(GEHealthcare17-1275-01)上進行此步陰離子交換層析。此步也可釆用柱床高15cm的SOURCE30Q層析柱。后者的動態(tài)容量和流速可能需要作適應性改變，這屬于本領域技術人員的常規(guī)知識。所有操作在室溫下進行，記錄280nmUV的信號。以150或200cm/h流速進行此步驟。纖先用至少1BV的RO水，以150cm/h流速淋洗此柱。獰茲然后用至少3BV的0.5MNaOH+1.5MNaCl清潔此柱。用至少3BV，優(yōu)選4-10BV的0.5M磷酸鈉液(pH7.5),以200cm/h流速洗滌此柱。情用至少5BV的10、15、20、25或30mM磷酸鈉液(pH7.5)平衡此柱。任選用3BV的0.5M磷酸鈉液(pH7.5)預平衡此柱、》/7載、^瀠浙M^敬桌蔬忠,^游7^C/-Fc蛋A將陽離子交換層析后所得材料稀釋到磷酸鈉濃度為10-30mM(pH7.5后)，加到此柱上，用SE-HPLC測定每ml充填樹脂的TACI-Fc容量不到50mg，用4±0.5BV平衡緩沖液洗滌，收集從UV開始升高到洗滌步驟結束時的流出液。砂清茲用至少3BV的0.5MNaOH+1.5MNaCI液，以150cm/h流速逆向流動方式(直到UV信號返回到基線)再生和清潔此柱。再生結束時，停止泵工作30分鐘。纖用至少3BV的RO水，以200cm/h流速洗滌此柱。錄存將此柱儲存于至少150cm/h流速的3BV20。/。乙醇(v/v)中。結果以下表V小結了用上述純化方法獲得的結果。表V:磷酸鈉加載液濃度的影響加載液的pH加載液中磷酸鈉的濃度(mM)加載液中TACI-Fc的濃度(mg/L)加載量(mg/ml)TACI-Fc回收率凝聚物HCP(ppm)7.5307733994%10.4%82.87.5256393990%6.9%50.47.5206514990%5.6%43.97.5154374688%3.4%45.07.510283n./d.82%2.8%26.3結論優(yōu)化了以流穿方式在Source30Q柱上的陰離子交換層析步驟，從而最大程度清除了HCP和凝聚物。用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)稀釋或透析加載的陽離子交換層析得到的洗脫物，得到了在產(chǎn)物回收率(90%)、HCP清除率(從約2000ppm降低至44ppm)和凝聚物清除(從約25%降低至5.6%)之間的最佳折衷結果。采用150-200cm/h流速時，每ml充填樹脂的TACI-Fc蛋白動態(tài)容量為50mg。實施例4:羥基磷灰石層析此純化步驟所用的起始材料是陰離子層析的流穿物(見實施例3)。釆用柱床高10cm的CHTI型陶瓷羥基磷灰石40微米(顆粒)柱(Biorad157-0040)。所有操作在室溫下進行，流速恒定保持在175cm/h。記錄280nmUV信號。所有溶液過濾除菌，儀器用前以氫氧化鈉液作清潔處理。此柱不用時儲存在0.5MNaOH溶液中。著娜淑繊fr,拔鵬，？用至少1BV的20mM磷酸鈉(pH7.5)緩沖液，然后用至少3BV的0.5M磷酸鈉pH7.5緩沖液洗滌此柱以降低其pH。憤用至少5BV的20mM磷酸鈉pH7.5緩沖液平衡此柱(或直到達到導電率3.0±0.3mS/cm和pH7.5±0.1的目標)?！窚p取SOURCE30Q層析柱的流出液加0.5M氯化鈣貯存液至氯化鈣終濃度O.lmM，加入85。/o的正磷酸液調(diào)節(jié)pH至7.0，以按SE-HPLC試驗測得每ml充填樹脂的TACI-Fc蛋白容量為NMT50mg的量加載于柱上。也可不用氯化鈣，將pH調(diào)節(jié)至7.0的SOURCE30Q流出液加載到羥基磷灰石柱上。纖與f用至少4BV的3、4或5mM磷酸鈉、10mMMES、O.lmMCaCl2pH6.5緩沖液洗滌此柱。在這些步驟中，也可采用不含氯化鈣的相同緩沖液。鎌采用不同BV(見表VI和VII)從UV升高開始，用5、4、3或2mM磷酸鈉(見表VI)、10mMMES、0.1mMCaCl2和0.6、0.7、0.8或0.9MKC1pH6.5緩沖液(見表vn)洗脫。也可采用不含氯化鈣的相同緩沖液洗脫。#凍依次用以下緩沖液淋洗此柱一至少1BV的20mM磷酸鈉pH7.5緩沖液；一至少3BV的0.5M磷酸鈉pH7.5緩沖液；禾口一至少1BV的20mM磷酸鈉pH7.5緩沖液。保存將柱保存在至少3BV的0.5MNaOH液中。結果表VI顯示洗脫緩沖液的磷酸鈉濃度(2-5mM)對去除凝聚物和產(chǎn)物回收的影響。合并洗脫峰組分，用SE-HPLC分析TACI-Fc濃度和凝聚物水平。表VI:洗脫緩沖液的磷酸鈉濃度的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>表VII顯示洗脫緩沖液的KC1濃度對凝聚物清楚和產(chǎn)物回收率的影響。研究了兩種磷酸鈉濃度2mM和3mM。合并洗脫峰組分用SE-HPLC分析TACI-Fc濃度和凝聚物水平。表VII:洗脫緩沖液氯化鉀濃度的效應<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>結論羥基磷灰石層析提供了降低TACI-Fc凝聚物水平的可靠有效方法。從陰離子交換層析純化的材料(見實施例3)開始時凝聚物水平約為5-8%,羥基磷灰石層析可使這些水平降低至0.8%以下而TACI-Fc回收率為85-90%。總結果我們開發(fā)的TACI-Fc四步純化方法產(chǎn)生了高純度的TACI-Fc(融合蛋白)，其中凝聚物水平總體降低到1%以下(0.2-0.8%，5次實驗)。HCP水平總體降低到約5-10ppm，游離Fc水平總體降低到0.5%以下(0.2禾口0.1%，兩次實驗)。參考文獻1.Akerstrom和Bjork，JBiolChem.1989Nov25;264(33):19740-6.2.AltschulS等，JMolBiol，215，403-410，19903.AltschulSF等，NucleicAcidsRes.,25:389-3402,19974.ArmourKL禁1999.缺乏Fay受體1結合和單核細胞觸發(fā)活性的重組人IgG分子(RecombinanthumanIgGmoleculeslackingFcgammareceptorIbindingandmonocytetriggeringactivities).EurJImmunol.29(8):2613-245.Black等，US2002/01151756.Bodmer等，T舊S27(1),19-247.Boschetti，E.，Jungbauer'Sep.Sci.&Tech.2No.15,Acad.Press(2000)538.Boschetti等，GeneticEngineeringVol.20，No.13，July,20009.Bossen等，J已C281(2),13964-1397110.B圓禾卩vonB(jlow，US5,969,102(1999)11.Bram等，WO98/3936112.CarterP丄，2006.強效抗體治療的設計(Potentantibodytherapeuticsbydesign).NatureReviewsImmunology.Advance在線發(fā)表(onlinepublication)13.DevereuxJ等，NucleicAcidsRes,12，387-395，198414.Feng等，Bioprocessing2005，1-715.Giovarmini,BiotechnologyandBioengineering73:522-529(2000)16.Grantham等，Science,Vol.185,pp.862-864(1974)17.Gross等，Nature404(27),995-99918.Gross等，WO00/4071619.HintonPR.等，2004.在靈長動物中有較長血清半衰期的工程改造IgG抗體(EngineeredhumanIgGantibodieswithlongerserumhalf-livesinprimates)JBiolChem.279(8):6213-620.Hymowitz等，JBC280(8)，7218-722721.IdusogieEE等，2000.—種與人IgGlFc嵌合的抗體(rituxan)的Clq纟吉合位點圖譜(MappingoftheClqbindingsiteonrituxan,achimericantibodyw他ahumanIgGlFc).JImmunol.164(8):4178-8422.IdusogieEE等，2001.工程改造抗體招募補體的活性增高(Engineeredantibodieswithincreasedactivitytorecruitcomplement).JImmunol.166(4):2571-523.Ishihara，EP161469324.Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.M.,Gottesman,K.S.禾卩Foeller,C.(1991),免疫學感興趣蛋白的序列(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest)第5版,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD25.Kochanek等，EP123035426.Locksley等，Cell104,487-501,200127.Melchers,Ann.Rheum.Dis2003,62,25-27.28.Moore等，Science285:260-329.Moreau等，Blood103(8)，3148-315730.Naismith和Sprang,TIBS23,74-79,199831.Novak等，Blood103(2)，689-69432.Rixon等，WO02/09485233.Pearson,MethodsEnzymol.1990;183:63-9834.Porath，丄Carlsson，I.Olsson禾口G.Belfrage，Nature(London)258598-599(1975)35.Porath和B.Olin,Biochemistry22，1621-1630(1983)36.Puren等，ProcNatlAcadSciUSA.1999Mar2;96(5):2256匿6137.Shepard，丄ofChromatography891:93-98(2000)38.ShieldsRL等，2001.人IgG1的FcyRI、FcyII、FcyRIII和FcRn結合位點高分辨率圖譜和對FcyR結合力增強的IgGl變體設計(HighresolutionmappingofthebindingsiteonhumanIgG1forFcgammaRl'FcgammaRll，F(xiàn)cgammaRlll,andFcRnanddesignofIgG1variantswithimprovedbindingtotheFcgammaR).JBiolChem.276(9):6591-604.39.Smith等，WO91/0355340.Smith等，WO94/0647641.Stanker，丄ImmunologicalMethods76:157-169(1985)(10mMto30mMsodiumphosphateelusiongradient)42.SteurerW.,1995.用小鼠CTLA4/Fc涂布離體胰島細胞同種異體移植物促進了移植物耐受(ExvivocoatingofisletcellallograftswithmurineCTLA4/Fcpromotesgrafttolerance).JImmunol.155(3):1165-7443.Sun等，WO2005/04485644.Takeda等，EP156175645.Tarditi,丄Chromatography599:13-20(1992)46.VaccaroC等，2005.工程改造的免疫球蛋白Fc區(qū)調(diào)節(jié)體內(nèi)抗體水平(EngineeringtheFcregionofimmunoglobulinGtomodulateinvivoantibodylevels).NatBiotechnol.23(10):1283-847.Vigers等，Nature.1997Mar13;386(6621):190-448.Vedantham等，WO03/5993549.Vola等，BioTechniques14:650-655(1993)50.vonBiJIow禾口Bram，Science228:138(1997)51.Xia等，J.Exp.Med.2000,137-143。權利要求1.一種純化等電點(pI)6.9-9.5的Fc-融合蛋白的方法，包括以下步驟a.將含有所述Fc-融合蛋白的液體進行蛋白A或蛋白G親和層析；b.將步驟(a)的洗脫物進行陽離子交換層析；c.將步驟(b)的洗脫物進行陰離子交換層析；和d.將步驟(c)的流出液進行羥基磷灰石層析，收集洗脫物獲得純化的Fc-融合蛋白。2.如權利要求l所述的方法，其中步驟(a)的洗脫在pH2.8-4.5范圍進行。3.如以上權利要求任何一項所述的方法，其中步驟(b)還包括bl.用pH6-7、導電率6-10mS/cm的緩沖液洗滌陽離子交換樹脂；禾口b2.用pH7.3-8.2、導電率15-22mS/cm的緩沖液洗脫該層析柱。4.如以上權利要求任何一項所述的方法，其中步驟(c)的平衡和加載用導電率3-4.6mS/cm、pH低于Fc-融合蛋白pl值一個單位的緩沖液進行。5.如以上權利要求任何一項所述的方法，其中步驟(d)的洗脫在3-10mM濃度磷酸鈉存在下進行。6.如以上權利要求任何一項所述的方法，其中步驟(d)的洗脫在0.4-lM濃度氯化鉀存在下進行。7.如以上權利要求任何一項所述的方法，其中步驟(d)的洗脫在pH6-7下進行。8.如以上權利要求任何一項所述的方法，其中步驟(a)在含有以重組蛋白A或蛋白G修飾的交聯(lián)瓊脂糖的樹脂上進行。9.如以上權利要求任何一項所述的方法，其中步驟(b)在強陽離子交換樹脂上進行。10.如權利要求9所述的方法，其中所述樹脂包括用S03—基團修飾的交聯(lián)異丁酸酯樹脂。11.如以上權利要求任何一項所述的方法，其中步驟(c)在強陰離子交換樹脂上進行。12.如權利要求11所述的方法，其中所述樹脂包括以N+(CH3)3.修飾的聚苯乙烯/二乙烯基苯樹脂。13.如以上權利要求任何一項所述的方法，其中步驟(d)在陶瓷羥基磷灰石樹脂上進行。14.如權利要求13所述的方法，其中所述陶瓷羥基磷灰石樹脂包含粒度40微米的顆粒。15.如以上任何一項權利要求所述的方法，所述方法還包括至少一步超濾步驟。16.如權利要求15所述的方法，其中所述超濾步驟在步驟(b)與(c)之間禾口/或步驟(d)之后進行。17.如以上任何一項權利要求所述的方法，所述方法還包括將Fc-融合蛋白配制到藥物組合物中。18.如以上任何一項權利要求所述的方法，其中所述Fc-融合蛋白的等電點(pl)在8-9之間。19.如權利要求18所述的方法，其中所述Fc-融合蛋白的等電點(pl)在8.3-8.6之間。20.如以上權利要求任何一項所述的方法，其中所述Fc-融合蛋白包含腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員的配體結合部分。21.如權利要求20所述的方法，其中所述配體結合部分選自TNFR1、TNFR2的胞外結構域，或其TNF結合片段。22.如權利要求20所述的方法，其中所述配體結合部分選自BAFF-R、BCMA或TACI的胞外結構域，或其能至少結合Blys或APRIL之一的片段。23.如權利要求22所述的方法，其中所述Fc-融合蛋白包括選自以下的多肽(a).SEQIDN0:2的氨基酸34-66;(b).SEQIDNO:2的氨基酸71-104;(c).SEQIDNO:2的氨基酸34-104;(d).SEQIDNO:2的氨基酸30-110;(e).SEQIDNO:3:(f).SEQIDNO:4:(g).能在高嚴謹條件下與SEQIDNO:5或6或7的互補物雜交的聚核苷酸編碼的多肽；(h).與(c)、(d)、(e)或(f)所述多肽具有至少80%或85%或90%或95%序列相同性的(c)、(d)、(e)或(f)之一所述的突變蛋白；其中所述多肽能結合至少Blys或APRIL之一種。24.如以上任何一項權利要求所述的方法，其中所述Fc-融合蛋白包括免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)。25.如權利要求24所述的方法，其中所述恒定區(qū)是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。26.如權利要求24或25所述的方法，其中所述免疫球蛋白是IgG,。27.如權利要求23-25任何一項所述的方法，其中所述恒定區(qū)包含絞鏈區(qū)、CH2禾卩CH3區(qū)。28.用以上任何一項權利要求所述方法獲得的純化Fc-融合蛋白組合物，其特征在于，所述Fc-融合蛋白包含選自以下的多肽(a).SEQIDNO:2的氨基酸34-66;(b).SEQIDNO:2的氨基酸71-104;(c).SEQIDNO:2的氨基酸34-104;(d).SEQIDNO:2的氨基酸30-110;(e).SEQIDNO:3:Cf).SEQIDNO:4:(g).能在高嚴謹條件下與SEQIDNO:5或6或7的互補物雜交的聚核苷酸編碼的多肽；(h).與(c)、(d)、(e)或(f)所述多肽具有至少80%或85%或90%或95%序列相同性的(c)、(d)、(e)或(f)之一所述的突變蛋白；其中所述多肽能結合至少Blys或APRIL之一種，禾口其中所述組合物含有的蛋白凝聚物少于1%或少于0.5%，和其中所述組合物含有的游離Fc蛋白少于1%或少于0.5%或少于0.1%。全文摘要本發(fā)明涉及等電點(pI)在6.9-9.5之間的Fc-融合蛋白的純化方法，包括蛋白A或蛋白G親和層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析和羥基磷灰石層析。文檔編號C07K1/36GK101541825SQ200780031919公開日2009年9月23日申請日期2007年8月27日優(yōu)先權日2006年8月28日發(fā)明者A·蘭姆普羅伊,A·翁-杜瓦爾申請人:阿雷斯貿(mào)易股份有限公司