專利名稱：制備共聚物-1的改進(jìn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明披露的主題大體上涉及用于聚合氨基酸的方法。更具體而言，本發(fā)明披露的主題涉及制備共聚物-1的方法。
背景技術(shù)：
共聚物-1 (copolymer-l)是多肽的復(fù)雜混合物(complex mixture),所述多肽是由對(duì)氨基酸，即谷氨酸、賴氨酸、丙氨酸和酪氨酸進(jìn)行聚合而制備的。共聚物-1也稱為乙酸格拉默(glatiramer acetate， GA),并且具有以下結(jié)構(gòu)式
(Glu， Ala, Lys, Tyr)x XCH3COOH(C5H9N04C3H7N02.C6H14N202.C9H N03),XC2H402
乙酸才各4立默是COPAXONE (Teva Pharmaceutical Industries Ltd., Israel)的活性成份，其包含合成多肽的乙酸鹽，所述合成多肽含有四種天然存在的氨基酸L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-酪氨酸和L-賴氨酸，這四種氨基酸所報(bào)道的平均摩爾分?jǐn)?shù)(molarfraction)分別為0.141、 0.427、 0.095和0.338。
乙酸格拉默用于治療復(fù)發(fā)-緩解型多發(fā)性硬化(relapsing-remitting formof multiple sclerosis, RRMS)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明披露的主題提供了制備共聚物-1的方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐(N-carboxyanhydrides, NCAs)的混合物與聚合引發(fā)劑接觸以引發(fā)N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐的混合物的聚合，從而形成受保護(hù)的共聚物-1，所述N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐包含丙氨酸、受保護(hù)的谷氨酸、受保護(hù)的賴氨酸，以及酪氨酸，其中受保護(hù)的谷氨酸含有芐基或甲氧基保護(hù)基，以及受保護(hù)的賴氨酸含有環(huán)酰亞胺(cyclic imide)或叔丁氧基羰基(Boc)保護(hù)基。然后可用一種或多種脫保護(hù)劑處理受保護(hù)的共聚物-1，和/或?qū)κ鼙Ｗo(hù)的共聚物-1進(jìn)行解聚。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括對(duì)受保護(hù)的谷氨酸和受保護(hù)的賴氨酸進(jìn)行脫保護(hù)，從而生成共聚物-l。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括在進(jìn)行N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐混合物
的聚合時(shí)，測(cè)量共聚物-1的分子量。在聚合進(jìn)行時(shí)測(cè)量分子量使得可以在共聚物-1已經(jīng)獲得期望的分子量時(shí)終止聚合反應(yīng)，或者在一些實(shí)施方案中，
終止解聚反應(yīng)(depolymerization reaction)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過一種或多種聯(lián)機(jī)方法(in-line method)、在線方法(on-line method)、離線方法(off-line method),以及所述方法的組合來確定分子量。在一個(gè)實(shí)施方案中，在聚合反應(yīng)進(jìn)行時(shí)可通過以下方式確定分子量使用紅外(IR)探針來測(cè)量反應(yīng)混合物中氨基曱酸酯部分基的量(通過氨基曱酸酯部分的 一種或多種特征性紅外吸收帶的強(qiáng)度確定)。然后可以使測(cè)量的氨基曱酸酯部分的量與模型(所述模型將分子量關(guān)聯(lián)為反應(yīng)混合物中存在的氨基曱酸酯部分的量的函數(shù))相關(guān)聯(lián)。在另一實(shí)施方案中，可在解聚反應(yīng)期間測(cè)量酰胺羰基部分的量?？梢允箿y(cè)量的酰胺羰基部分的量與模型(所述模型將分子量關(guān)聯(lián)為反應(yīng)混合物中存在的酰胺羰基部分的量的函數(shù))相關(guān)聯(lián)。
本發(fā)明披露的方法克服了可能與制備多肽如共聚物-1的現(xiàn)有技術(shù)方法相關(guān)的許多問題。更具體而言，本發(fā)明披露的方法能夠更有效，并且能夠合成具有期望分子量的共聚物-1。
在上文中已經(jīng)說明了本發(fā)明所披露主題的某些方面，這些方面可通過本發(fā)明披露的主題整體或部分地得到解決，并且隨著本申請(qǐng)說明書的展開以及當(dāng)與下文中最佳描述的實(shí)施例和附圖結(jié)合時(shí)，其它方面將會(huì)變得明顯。


由于已概括地描述了本發(fā)明披露的主題，現(xiàn)在參照附圖(附圖未必是按比例繪制的)，以及其中
圖1是描述用于制備共聚物-1的本發(fā)明所披露方法的代表性非限制實(shí)施方案，其中谷氨酸用曱氧基保護(hù)基保護(hù)，以及賴氨酸用Boc保護(hù)基保護(hù)；以及
圖2是描述用于制備共聚物-1的本發(fā)明所披露方法的代表性非限制實(shí)施方案，其中谷氨酸用千基保護(hù)基保護(hù)，以及賴氨酸用鄰苯二曱?；?phthaloyl)保護(hù)基保護(hù)。
具體實(shí)施例方式
以下參照附圖，更充分地描述本發(fā)明披露的主題，這些附圖顯示了本發(fā)明披露主題的一些實(shí)施方案，但并非所有的實(shí)施方案。受益于前述說明書和相關(guān)附圖所表現(xiàn)出的教導(dǎo)，本發(fā)明披露主題所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到對(duì)本申請(qǐng)列出的本發(fā)明披露主題進(jìn)行各種修改和其它實(shí)施方案。因此，應(yīng)該理解的是，本發(fā)明披露的主題并非局限于所披露的具體實(shí)施方案，并且修改和其它實(shí)施方案意圖包括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。盡管本申請(qǐng)使用了具體的術(shù)語(yǔ)，但是它們僅用于一般意義和描述性意義，并非出于限制的目的。
當(dāng)在本申請(qǐng)(包括權(quán)利要求書在內(nèi))使用術(shù)語(yǔ)"一個(gè)/種(a)"、"一個(gè)/種(an)"和"所述(the)"時(shí)，它們是指"一種或多種"或"一個(gè)或多個(gè)"。因此，例如當(dāng)提及"試樣"時(shí)，包括多個(gè)試樣，除非上下文中有明確的相反指示(例如，多個(gè)試樣)，等等。在本申請(qǐng)中引入所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)作為參考，所引用的程度就如同每篇出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)被明確和單獨(dú)地指示引入作為參考一樣。應(yīng)該理解的是，
盡管本申請(qǐng)參考許多專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)，這些參考并非構(gòu)成了對(duì)任何這些文件形成了本領(lǐng)域的公知常識(shí)的一部分的認(rèn)可。
在說明書全文中，當(dāng)將組合物描述為具有(having)、包括(including)或包含(comprising)各種具體組分時(shí)，或者當(dāng)將工藝或方法描述為具有、包括或包含特定步驟時(shí)，預(yù)期本發(fā)明披露主題的組合物還可基本上由所述組分組成，或者由所述組分組成，以及本發(fā)明披露主題的工藝或方法還可基本上由所述步驟組成，或者由所述步驟組成。此外，應(yīng)該理解的是，只要本發(fā)明披露的主題保持是可操作的，各步驟的順序或進(jìn)行某些操作的順序并非是重要的。而且，就本發(fā)明披露的主題而言，可同時(shí)進(jìn)行兩步或多步步驟或操作。
在 一 些實(shí)施方案中，本發(fā)明披露的主題提供了制備合成肽(syntheticpolypeptide)如共聚物-l的方法，其中對(duì)具有受保護(hù)的氨基酸和未保護(hù)的氨基酸的N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐(NCAs)的混合物進(jìn)行聚合，從而形成多肽。如本申請(qǐng)使用的"多肽"是指包含氨基酸殘基的聚合物，所述氨基酸殘基是通過酰胺鍵(通常稱為肽鍵)結(jié)合在一起的。肽鍵是由氨基酸C末端上的羰基與另一個(gè)氨基酸N末端上的氨基之間的鍵形成的。當(dāng)多個(gè)氨基酸使用這些肽鍵
7結(jié)合時(shí)，它們形成了多肽。
多肽可包括由相同氨基酸、不同氨基酸，或相同氨基酸或不同氨基酸的組合而形成的聚合物。多肽可以具有氨基酸的隨機(jī)排列，或氨基酸的有
序排列。在一些實(shí)施方案中，多肽可以是僅由L氨基酸或D氨基酸組成的聚合物，或由一些任意比例的L氨基酸和D氨基酸的組合組成的聚合物。更具體而言，在一些實(shí)施方案中術(shù)語(yǔ)"多肽混合物"是指氨基酸共聚物的混合物，所述氨基酸包含L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-酪氨酸和L-賴氨酸，或這四種氨基酸的類似物或衍生物。
如本申請(qǐng)使用的，術(shù)語(yǔ)"共聚物"、"氨基酸共聚物"或"氨基酸共聚物制劑，，是指由限定的多個(gè)不同氨基酸(通常為2-10個(gè)，例如2、 3、 4、 5、6、 7、 8、 9或10個(gè)不同氨基酸，以及在一些實(shí)施方案中，為3-6個(gè)，例如3、 4、 5或6個(gè)不同氨基酸)組成的多肽的異質(zhì)混合物(heterogenousmixture)。如本申請(qǐng)描述的，共聚物可由單獨(dú)氨基酸的聚合來制備。術(shù)語(yǔ)"氨基酸"不限于天然存在的氨基酸，但是可包括氨基酸衍生物和/或氨基酸類似物。例如，在包含酪氨酸氨基酸的氨基酸共聚物中，所述氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以是高酪氨酸(homotyrosine)。此外，在此定義中包括在兩個(gè)相鄰殘基之間具有 一 個(gè)或多個(gè)非肽鍵或擬肽鍵(peptidomimetic bond)的氨基酸共聚物。就所述混合物中各種多肽的分子量而言，共聚物可以是不均一的。本發(fā)明披露主題的具體共聚物包含多肽的混合物，所述多肽包含丙氨酸(A)、谷氨酸(E)、賴氨酸(K)和酪氨酸(Y)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述共聚物包含由氨基酸Y、 E、 A和K組成的多肽的混合物，并且也稱為共聚物-l(Cop l)或乙酸格拉默(GA)。
更具體而言，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明披露的主題提供了制備共聚物-1的方法，所述方法包括使具有下式的N-羧基環(huán)內(nèi)酸肝(NCAs)的混合物與聚合引發(fā)劑接觸以引發(fā)包含一種或多種氨基酸的NCAs的混合物的聚合，從而產(chǎn)生具有以下結(jié)構(gòu)的共聚物-1:NCAs的結(jié)構(gòu)式
其中R,包含一種或多種選自丙氨酸、受保護(hù)的谷氨酸、受保護(hù)的賴氨酸, 以及酪氨酸的氨基酸；
關(guān)
共聚物-1的結(jié)構(gòu)式 其中Ri如上文所定義，以及n為描述包含酰胺鍵的聚合物鏈的整數(shù)。 在隨后的步驟中，可從受保護(hù)的谷氨酸和受保護(hù)的賴氨酸中除去保護(hù) 基以產(chǎn)生共聚物-1。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明披露的方法可用于制備分子 量在約2 kDa至約40 kDa之間的共聚物-l。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明披 露的方法可用于制備具有分子量在約2 kDa至約25 kDa之間的共聚物-l; 在一些實(shí)施方案中，分子量在約4 kDa至約16 kDa之間；在一些實(shí)施方案 中，分子量在約4kDa至約9kDa之間；在一些實(shí)施方案中，分子量在約4 kDa至約8kDa之間；在一些實(shí)施方案中，分子量在約9 kDa至約12 kDa 之間；在一些實(shí)施方案中，分子量在約10kDa至約11 kDa之間；以及在一 些實(shí)施方案中，分子量在約10kDa至約12kDa之間。如本申請(qǐng)所使用的， 短語(yǔ)"分子量，，表示峰值平均分子量(peak average molecular weight, Mp)?？?通過以下方式測(cè)量共聚物-1的分子量例如，凝膠滲透色譜法(GPC)，使用 例如SUPEROSE 12頂或SUPERDEXTM柱，所述柱用蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品、聚曱 基丙烯酸曱酯(PMMA)標(biāo)準(zhǔn)品，或本領(lǐng)域已知并且可得到的其它適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn) 品校準(zhǔn)。也可通過本領(lǐng)域已知的其它計(jì)量法(metric)描述多肽的異質(zhì)混合物 如共聚物-1，所述的其它計(jì)量法包括但不限于重均分子量(weight average molecular weight, Mw)、 數(shù)均分子量(number average molecular weight, Mn)、 z-均分子量(z-average molecular weight, Mz)，以及所述多肽混合物的多分散 性(polydispersity)。
合適的聚合引發(fā)劑可包括例如44、親核試劑以及它們的組合。在一個(gè) 實(shí)施方案中，聚合引發(fā)劑可包括一種或多種胺、醇、水，以及上述物質(zhì)的
9組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合引發(fā)劑包含一種或多種仲胺。合適的仲胺 包括但不限于，二甲胺、二乙胺、二正丙胺、二異丙胺、N-乙基曱胺、二 正丁胺、二異丁胺、二仲丁胺、二叔丁胺、二戊胺、二正辛胺、二-(2-乙基 己基)-胺、二異壬胺、二烯丙胺、N-曱基苯胺、二苯胺、氮丙啶、吡咯、吡 咯烷、咪唑、巧l哚、哌啶、噤呤，以及上述物質(zhì)的組合。其它聚合引發(fā)劑
可包括叔丁醇鉀(K-tOBu)、 NaH、 KH、三乙胺(TEA)、四曱基旅咬、二環(huán)己 基胺、二環(huán)己基十一烷(dicyclohexylundecane, DCU)、 二異丙基氨基鋰、詐又 丁基鋰(t-BuLi),以及上述物質(zhì)的組合。
使聚合引發(fā)劑與N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐的混合物接觸，這使得氨基酸的延伸 和共聚物-1的合成開始。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)共聚物-1的分子量在期望 的范圍內(nèi)，如約10kDa至約12kDa時(shí)，可通過終止聚合反應(yīng)來控制共聚物 -1的分子量。
在一個(gè)實(shí)施方案中，制備共聚物-1的方法包括使NCAs的混合物與聚 合引發(fā)劑接觸，其中NCAs的混合物包括含有千基或曱氧基(OMe)保護(hù)基的 谷氨酸。在另一實(shí)施方案中，NCAs的混合物包括含有環(huán)酰亞胺衍生物或叔 丁氧基羰基(Boc)保護(hù)基的賴氨酸。適用于本發(fā)明披露方法的環(huán)酰亞胺衍生 物包括但不限于鄰苯二曱酰亞胺、N-四氯鄰苯二曱酰亞胺、4-硝基-N-鄰苯 二曱酰亞胺、N-二硫代琥珀酰亞胺(N-dithiasuccinimide)、 N-2,3-二苯基馬來 酰亞胺、N-2，5-二曱基吡咯、N-2，5-二(三異丙基曱硅烷氧基)吡咯、N-l,1,4,4-四曱基二甲硅烷基氮雜環(huán)戊烷加成物等等。在一些實(shí)施方案中，所述賴氨 酸保護(hù)基為鄰苯二曱酰亞胺。
更具體而言，在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過使具有以下結(jié)構(gòu)的N-羧基環(huán) 內(nèi)酸酐(NCAs)的混合物與聚合引發(fā)劑接觸以形成受保護(hù)的共聚物-1 ，從而 制備共聚物-1，
其中R,包含一種或多種選自丙氨酸、甲氧基-保護(hù)的谷氨酸、Boc-保護(hù) 的賴氨酸的氨基酸。現(xiàn)參照?qǐng)D1,提供了制備共聚物-1的示例性多步驟反應(yīng)方案。在步驟(a)中，使NCAs的混合物與聚合引發(fā)劑如二乙胺接觸，以形 成受保護(hù)的共聚物-1中間體l。在此實(shí)施例中，谷氨酸用曱氧基保護(hù)，以及 賴氨酸用Boc基保護(hù)。步驟(a)可在各種溶劑中進(jìn)行，所述溶劑包括但不限 于，例如四氫呋喃(THF)、 二氯曱烷(DCM)、 二氧雜環(huán)己烷、N-曱基吡咯烷 酮(NMP)、 二甲基曱酰胺(DMF)和乙腈(ACN)。
在步驟(b)中，用脫保護(hù)劑如NaOH處理中間體1，從而對(duì)曱氧基-保護(hù) 的谷氨酸進(jìn)行脫保護(hù)。然后可用酸如HBr將反應(yīng)混合物中和，以產(chǎn)生中間 體2。在步驟(c)中，用HBr/乙酸混合物處理中間體2以脫除賴氨酸的Boc 保護(hù)基，由此產(chǎn)生共聚物-1，其標(biāo)記為圖1中的中間體3。
然后可以使用已知方法(例如，凍干和/或透析(dialysis))純化和表征所形 成的共聚物-1，以產(chǎn)生共聚物-1的鹽。應(yīng)該意識(shí)的是，在一些實(shí)施方案中， 步驟(b)和步驟(c)的順序可以相反。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，可用HBr的 冰乙酸溶液處理中間體1,以脫除賴氨酸的Boc保護(hù)基，接著用堿如NaOH 處理所形成的共聚物-1中間體，以脫除谷氨酸的曱氧基保護(hù)基。
現(xiàn)參照?qǐng)D2，以分步方式闡明了制備共聚物-1的供選反應(yīng)方案。在此實(shí) 施方案中，谷氨酸用千基保護(hù)，以及賴氨酸用鄰苯二曱酰亞胺保護(hù)基保護(hù)。 在步驟(a)中，使NCAs的混合物與聚合引發(fā)劑如二乙胺接觸，以形成受保 護(hù)的共聚物-1中間體l。聚合步驟即圖2的步驟(a)，可在各種溶劑中進(jìn)行， 所述溶劑包括但不限于，例如THF、 DCM、 二氧雜環(huán)己烷、NMP、 DMF 和ACN。
現(xiàn)再次參照?qǐng)D2,在步驟(b)中，用脫保護(hù)劑如HBr的冰乙酸溶液處理 中間體l，以便從受保護(hù)的谷氨酸中除去千基保護(hù)基，從而形成中間體2。 在步驟(c)中，用從賴氨酸中除去鄰苯二曱酰亞胺保護(hù)基的脫保護(hù)劑處理中 間體2,以產(chǎn)生未保護(hù)的共聚物-1。可用于除去鄰苯二曱酰亞胺保護(hù)基的合 適脫保護(hù)劑包括但不限于，肼、苯基肼、曱胺、丁胺、氫氧化鈉、羥胺-曱 醇鈉和乙酸肼?？梢允褂靡阎椒?例如，凍干和/或透析)純化和表征所形 成的未保護(hù)的共聚物-1，以產(chǎn)生共聚物-1的鹽。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將高純度的酸用于制備共聚物-1的方法中。在一 個(gè)實(shí)施方案中，高純度的酸包含少于0.5%的游離囟素和少于1000 ppm的 金屬離子雜質(zhì)。
除去可能存在的任何保護(hù)基后，可進(jìn)一步純化共聚物-1。純化共聚物-1
ii的合適方法可以包括但不限于，透析，真空干燥(vacuum desiccation),凍干， 重結(jié)晶，回流，各種形式的色i普法，析出法(precipitation methods),升華法 (sublimation methods)， 過濾，力口成、萃取和炫體結(jié)晶(melt crystallization), 蒸發(fā)，固/液分離，離心，柱分離法，蒸鎦，共沸、萃取和蒸汽蒸餾，離子 交才灸法，月莫分離#支術(shù)，吸附分離方法(adsorption separation processes),才莫#以 移動(dòng)床色i普法(simulated moving bed chromatography), 固/液萃取和 >歷濾 (solid/liquid extraction and leaching), 液/液萃取禾口超臨界；危體萃取 (supercritical fluid extraction), 以及所述方法的纟且合。
在一個(gè)實(shí)施方案中， 一旦將聚合反應(yīng)淬滅，可使用色譜法如GPC純化 反應(yīng)的產(chǎn)物。GPC柱可用例如SUPERDEXTM((獲自GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway， New Jersey)或其等價(jià)物，和/或 SUPEROSETM(GE Healthcare)或其等價(jià)物填充。
在GPC分離方法中可利用本領(lǐng)域通常使用的任何流動(dòng)相，包括水性溶 劑和有機(jī)溶劑，以及它們的任何組合。在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，可將 共聚物-1溶于流動(dòng)相中，然后經(jīng)過校準(zhǔn)的填充GPC柱洗脫。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品、 PMMA標(biāo)準(zhǔn)品，或本領(lǐng)域已知并且可用的其它適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品可用于校準(zhǔn)GPC 柱。檢測(cè)器如紫外(UV)檢測(cè)器可用于確定共聚物-1何時(shí)洗脫經(jīng)過柱。收集 所洗脫的共聚物-1的級(jí)份，分子量可由洗脫時(shí)間確定。
可用于純化根據(jù)本發(fā)明披露方法的共聚物-1的其它純化方法包括但不 限于真空干燥；凍干；重結(jié)晶；萃取、回流；析出法；升華法；過濾；加 成、萃取和熔體結(jié)晶；蒸發(fā)；固/液分離；離心；柱分離法；沉降法 (sedimentation);蒸餾；共沸、萃取和蒸汽蒸餾；離子交換法；膜分離技術(shù)； 吸附分離方法；模擬移動(dòng)床色譜法；固/液萃取和瀝濾；液/液萃??；超臨界 流體萃??；毛細(xì)管電泳(CE)， 包括毛細(xì)管區(qū)帶電泳(capillary zone electrophresis, CZE)、毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)、毛細(xì)管等電聚焦(capillary isoelectric focusing, CIEF)、等速電泳(ITP)、電動(dòng)色譜法(EKC)、毛細(xì)管膠束 電動(dòng)色譜法(MECC或MEKC)、微乳電動(dòng)色譜法(MEEKC)、非水性毛細(xì)管電 泳(NACE)和毛細(xì)管電色譜法(CEC);凝膠電泳；透析；HPLC; RP-HPLC; 親合色譜法；氣相色譜法，包括氣-液色譜法、氣-固色譜法、分配色譜法 (partition chromatography)、吸附色譜法、薄層色譜法，和超臨界流體色譜法。 一般而言，上文剛剛披露的任何技術(shù)可單獨(dú)使用或聯(lián)用，并且以任何順序使用，以純化共聚物-1。
使聚合引發(fā)劑與N-羧基環(huán)內(nèi)酸肝混合物接觸，這引發(fā)了氨基酸的延伸， 由此開始共聚物-1的合成。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)共聚物-1的分子量在期
望的范圍內(nèi)，如約10kDa至約12kDa時(shí)，可通過終止聚合反應(yīng)來控制共聚 物-1的分子量。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明披露的制備共聚物-1的方法可包括 在進(jìn)行聚合反應(yīng)時(shí)測(cè)量共聚物產(chǎn)物的分子量。在所述實(shí)施方案中，在進(jìn)行 聚合反應(yīng)時(shí)測(cè)量分子量可以在共聚物-1已經(jīng)達(dá)到期望的分子量時(shí)使反應(yīng)停 止。以這種方式，可以制備具有期望分子量范圍的共聚物-1。因此，可以減 少或在一些情況下消除對(duì)額外步驟(如解聚以獲得期望的分子量)的需要。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過在進(jìn)行聚合反應(yīng)時(shí)移取等份試樣的共聚物 來確定分子量。然后可用已知方法確定共聚物的分子量，所述的已知方法 包括但不限于GPC和其它使用蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品、PMMA標(biāo)準(zhǔn)品或本領(lǐng)域已知 并且可用的其它適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品來校準(zhǔn)柱的色譜法、端基分析(end group analysis), 蒸汽相法(vapor phase methods)、 沸點(diǎn)升高法(elevation of boiling points method)、'沐點(diǎn)測(cè)定法(ebulliometry)、；參透壓、4吏用prinner畫stabin'滲透 4義(prinner-stabin osometer)、擴(kuò)散和梯度法(diffusion and gradient methods)、 光散射法、溶液粘度測(cè)定法(solution viscometry methods),紅外法(IR methods) 和X-射線法。
如本申請(qǐng)下文中進(jìn)一步討論的那樣，在一些實(shí)施方案中，可通過將聯(lián) 機(jī)儀器(in-line instrument)如紅外探針引入反應(yīng)混合物中來確定分子量。聯(lián)機(jī) 儀器可用于在進(jìn)行聚合反應(yīng)時(shí)原位確定共聚物-1的分子量。在進(jìn)行反應(yīng)時(shí) 測(cè)量共聚物-1的分子量，使得可以在共聚物-1已經(jīng)獲得期望的分子量時(shí)終 止反應(yīng)。因此，可以在不使用將多肽中間體斷裂為更小分子量片段的試劑 如HBr的情況下，獲得具有期望分子量的共聚物-l。
可通過許多本領(lǐng)域已知方法中的任何一種來終止聚合反應(yīng)。例如，在 一個(gè)實(shí)施方案中，可通過加入足夠量的水來淬滅聚合反應(yīng)，從而終止反應(yīng)。 在一些實(shí)施方案中，當(dāng)共聚物-1具有約2kDa至約40kDa之間的分子量時(shí)， 可以終止聚合反應(yīng)。聚合反應(yīng)可以在以下情況時(shí)終止，在另一實(shí)施方案中， 當(dāng)共聚物-1具有超過約3kDa的分子量時(shí)；在一些實(shí)施方案中，當(dāng)共聚物-1 具有超過約4 kDa的分子量時(shí)；在一些實(shí)施方案中，當(dāng)共聚物-1具有超過
13約5 kDa的分子量時(shí)；在一些實(shí)施方案中，當(dāng)共聚物-1具有超過約6 kDa 的分子量時(shí)；在一些實(shí)施方案中，當(dāng)共聚物-1具有超過約7 kDa的分子量 時(shí)；在一些實(shí)施方案中，當(dāng)共聚物-1具有超過約8 kDa的分子量時(shí)；在一 些實(shí)施方案中，當(dāng)共聚物-1具有超過約9 kDa的分子量時(shí)；以及在一些實(shí) 施方案中，當(dāng)共聚物-1具有超過約10kDa的分子量時(shí)。聚合反應(yīng)可以在以 下情況時(shí)終止，在另一實(shí)施方案中，當(dāng)共聚物-1具有少于約25kDa的分子 量時(shí)；在一些實(shí)施方案中，當(dāng)共聚物-1具有少于約20kDa的分子量時(shí)；在 一些實(shí)施方案中，當(dāng)共聚物-1具有少于約15kDa的分子量時(shí)；在一些實(shí)施 方案中，當(dāng)共聚物-1具有少于約14kDa的分子量時(shí)；在一些實(shí)施方案中， 當(dāng)共聚物-1具有少于約13kDa的分子量時(shí)；在一些實(shí)施方案中，當(dāng)共聚物 -1具有少于約12kDa的分子量時(shí)；以及在一些實(shí)施方案中，當(dāng)共聚物-1具 有少于約llkDa的分子量時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，共聚物-1的分子量在約 10kDa至約12kDa之間。
在一些實(shí)施方案中，可以在進(jìn)行聚合反應(yīng)時(shí)，通過使用聯(lián)機(jī)方法、在 線方法、離線方法，以及所述方法的組合來確定共聚物-1的分子量。如本 申請(qǐng)使用的，術(shù)語(yǔ)"聯(lián)機(jī)"是指在進(jìn)行聚合反應(yīng)時(shí)，通過將測(cè)量裝置或探 針直接引入反應(yīng)容器中來測(cè)量共聚物-1的分子量的方法。例如，在一個(gè)實(shí) 施方案中，在聚合反應(yīng)期間，可以通過將IR探針直接引入反應(yīng)容器中來測(cè) 量共聚物-1的分子量。在一個(gè)實(shí)施方案中，IR探針可以在聚合反應(yīng)期間測(cè) 量存在的氨基曱酸酯的量，例如通過特征性氨基曱酸酯IR吸收帶的強(qiáng)度確 定。通常地，氨基曱酸酯的量以及其IR吸收帶的強(qiáng)度應(yīng)該隨著聚合反應(yīng)的 進(jìn)展而降低。反應(yīng)混合物中氨基曱酸酯的量的降低應(yīng)該與共聚物-1的分子 量的增加成比例?？梢詫⑻卣餍园被鶗跛狨R吸收帶的強(qiáng)度的變化與模型 (所述模型將分子量描述為混合物中存在的氨基曱酸酯的量的函數(shù))相關(guān)聯(lián)。 利用該模型，可以在聚合反應(yīng)期間的任一點(diǎn)確定共聚物-1的分子量。
在其它實(shí)施方案中，可以在解聚期間使用IR探針測(cè)量存在的酰胺羰基 部分的特征性紅外吸收帶的強(qiáng)度，所述吸收帶的強(qiáng)度隨著分子量降低而增 力口。也可將酰胺羰基IR強(qiáng)度與模型(所述模型將分子量描述為混合物中存在 的酰胺羰基的量的函數(shù))相關(guān)聯(lián)。當(dāng)共聚物-1在期望的分子量范圍內(nèi)時(shí)，可 使用所測(cè)量的強(qiáng)度來停止聚合反應(yīng)或解聚反應(yīng)。測(cè)量混合物中氨基曱酸酯 部分和/或酰胺羰基部分的量(如濃度)的其它方法可以包括拉曼(Raman)、紫外、其它振動(dòng)技術(shù)以及類似的光譜分析技術(shù)。
作為確定反應(yīng)混合物中分子量的方法，除了測(cè)量混合物中存在的氨基 曱酸酯部分和/或酰胺羰基部分的量之外，可使用其它方法將反應(yīng)進(jìn)展與共 聚物的分子量相關(guān)聯(lián)。所述的其它方法包括但不限于，粘度測(cè)量法、濁度
測(cè)量法(turbidity measurements), C02測(cè)量法、密度和熱膨脹法(dilatormetry) 測(cè)量法、超聲測(cè)量法、熒光光譜法、量熱法等等。例如，在一個(gè)實(shí)施方案 中，可將聚合反應(yīng)期間生成的C02的量與共聚物-l的分子量相關(guān)聯(lián)。在聚 合反應(yīng)期間，當(dāng)消耗NCAs時(shí)，生成了 C02。在其它實(shí)施方案中，可將所測(cè) 量的共聚物-1的粘度和/或濁度與模型(所述模型將分子量描述為聚合物粘 度和/或濁度的函數(shù))相關(guān)聯(lián)。
在其它實(shí)施方案中，可通過"離線"方法確定共聚物-1的分子量。在 離線方法中，在進(jìn)行聚合反應(yīng)時(shí)從反應(yīng)容器中移取等份試樣的聚合反應(yīng)混 合物。在等份試樣中將反應(yīng)淬滅，然后可以使用各種方法，如使用由蛋白 質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品、PMMA標(biāo)準(zhǔn)品或本領(lǐng)域已知并且可用的其它適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品來^t準(zhǔn) 的GPC柱等等來確定分子量。在一個(gè)實(shí)施方案中，此離線方法還可以包括 在對(duì)分子量進(jìn)行離線確定的時(shí)期中在反應(yīng)器容器中使聚合反應(yīng)減慢。例如， 可通過使反應(yīng)容器冷卻至0。C至10。C之間的溫度來減慢反應(yīng)。
在另一實(shí)施方案中，可以在聚合反應(yīng)期間"在線"確定分子量。在此 實(shí)施方案中，反應(yīng)容器可包括通道(channel),可以使等份試樣的反應(yīng)混合物
反應(yīng)容器中。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)器可包括具有兩個(gè)或多個(gè)開 口的通道，所述開口能夠與反應(yīng)容器的內(nèi)部流體相通。所述開口可以包括 能夠阻止反應(yīng)混合物從通道中進(jìn)入(ingress)或流出(egress)的門(gate)或相似 的裝置，例如閥(valve)。在期望的時(shí)間，可以^使所述門或閥中的一個(gè)打開以 使得等份試樣的反應(yīng)混合物流入通道中。位于所述通道相對(duì)端的第二個(gè)門 或閥可以保持在關(guān)閉的位置。然后可分析試樣以確定反應(yīng)混合物的分子量。 然后通過打開第二個(gè)門或閥使等份試樣返回至反應(yīng)混合物中。在此實(shí)施方 案中，可以使用如上文所討論的涉及使用聯(lián)機(jī)技術(shù)確定分子量的那些技術(shù)， 包括但不限于IR、拉曼、紫外光譜分析。在一些實(shí)施方案中，也可從反應(yīng) 容器中永久除去等份試樣。
在一個(gè)供選的實(shí)施方案中，可通過以下方式制備NCA或NCAs的混合物使具有以下結(jié)構(gòu)的一種或多種氨基酸與光氣或光氣替代物(surrogate)反
其中R,如上文中所定義。合適的光氣替代物包括但不限于雙光氣、三光氣、 羰基二咪唑、碳酸二琥珀酰亞胺基酯(disuccinimidyl carbonate),以及上述物 質(zhì)的組合。
在一些實(shí)施方案中，可選擇性控制多肽中存在的D、 L立體異構(gòu)體的比 例。所形成的肽鍵的立體化學(xué)可被用于合成多肽的氨基酸的立體化學(xué)控制。 相反地，具有環(huán)結(jié)構(gòu)的活化的氨基酸能夠生成右旋(D)和左旋(L)立體異構(gòu)體 的混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽可包含約80%至約100%的L對(duì)映異 構(gòu)體，以及約0%至約20%的D對(duì)映異構(gòu)體。在另一實(shí)施方案中，多肽可包 含大于約75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%的L對(duì) 映異構(gòu)體。在另一實(shí)施方案中，多肽可含有少于約100%、 99%、 98%、 97%、 96%、 95°/。、 90%、 85%或80%的L對(duì)映異構(gòu)體。
在另一非限制性實(shí)施方案中，共聚物-1可包含合成多肽的乙酸鹽，所 述合成多肽含有四種天然存在的氨基酸L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-酪氨酸和 L-賴氨酸，這四種氨基酸的平均摩爾分?jǐn)?shù)分別為約0.141、 0.427、 0.095和 0.338。共聚物-1的分子量可以在約4,700至約11,000道爾頓之間。在一個(gè) 實(shí)施方案中，共聚物-1的化學(xué)式為L(zhǎng)-谷氨酸與L-丙氨酸、L-賴氨酸和L-酪 氨酸的聚合物乙酸鹽。其結(jié)構(gòu)式可表示為(Glu，Ala，Lys,Tyr)xXCH3COOH 或[(CsH9N04 C3H7N02 C6H14N202 C9H N03)xXC2H402。
在另一非限制性實(shí)施方案中，可將共聚物-1加到可藥用賦形劑中，并 且可將共聚物-1配制成含有約50 mg至約10 mg乙酸格拉默以及約100 mg 至約10 mg甘露醇的白色至灰白色滅菌凍千粉末。在另一實(shí)施方案中，可 將共聚物-1加到可藥用賦形劑中，并且可將共聚物-1配制成含有約20 mg 乙酸格拉默以及約40 mg甘露醇的白色至灰白色滅菌凍干粉末。在一個(gè)實(shí) 施方案中，可將共聚物-1與可藥用賦形劑一起提供于單次使用或多次使用 的小瓶中，并且可在用所提供的任何稀釋劑如滅菌注射用水稀釋后，使用 皮下給藥的方式給藥。
16實(shí)施例
以下實(shí)施例已經(jīng)包括在本發(fā)明中，從而對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供指 導(dǎo)，用于實(shí)踐本發(fā)明披露主題的代表性實(shí)施方案。鑒于本發(fā)明所披露的內(nèi) 容和本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般水平，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解的是，以下 實(shí)施例的目的僅為示例性的，并且可以在不偏離本發(fā)明披露主題的范圍的 情況下，使用多種變化、修改和變更。因此，以下所提供的實(shí)施例是為了 示例性的，而不是為了限制性的。
實(shí)施例1
使用曱氧基-保護(hù)的谷氨酸和Boc-保護(hù)的賴氨酸制備共聚物-l 步驟(a):現(xiàn)在參照方案1，在第一步中，將酪氨酸(3 g, 14.5 mmol, 1.0 當(dāng)量)、丙氨酸(8.3 g， 72.1 mmol， 5.0當(dāng)量)、Y-曱氧基谷氨酸(Glu(OMe))(5.8 g, 22.2 mmol， 1.5當(dāng)量)、s-N-Boc-賴氨酸(13.8 g, 51.5 mmol， 3.6當(dāng)量)的N-羧基 環(huán)內(nèi)酸酐的混合物在氮?dú)饬?低速)下裝入1.0-L帶夾套的燒瓶(jacketed flask) 中。所述燒瓶包括機(jī)械攪拌器和溫度探針。然后將583.3 mL二氧雜環(huán)己烷 加到燒瓶中。將反應(yīng)混合物攪拌30分鐘，然后使用移液管將116pL(1.1 mmol 0.08當(dāng)量)二乙胺(聚合引發(fā)劑)加到燒瓶中。在第一個(gè)小時(shí)的期間內(nèi)反應(yīng)混 合物變得粘稠并非常混濁。
方案l.NCAs的混合物的聚合以形成受保護(hù)的共聚物-1 約24小時(shí)后，將反應(yīng)混合物如下淬滅在劇烈攪拌下將混合物倒入含 有水(1.58L)的第二個(gè)燒瓶(3.0L)中。形成白色固體。沉淀經(jīng)真空過濾分離， 并用水(6 x 250 mL)洗滌，然后在真空干燥箱中干燥過夜至恒定的重量，獲 得中間體1。
步驟(b):現(xiàn)在參照方案2，在以下步驟中，通過用NaOH處理中間體 1將曱氧基保護(hù)基從受保護(hù)的谷氨酸中除去。在此步驟中，將1.8g中間體
24小時(shí) "聚合步漲"
Glu(OMe)-NCA Ala-NCA Lys(Boc》NCA Tyr-NCA
中間體-1 [Glu(OMe), Ala， Lys(Boc), Tyr], - NEt:1裝入250-mL燒瓶中。將1M氫氧化鈉水溶液加到燒瓶中，然后在4。C至 15。C的溫度攪拌24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，使用HBr水溶液將反應(yīng)混合物中和 至pH二7。對(duì)固體進(jìn)行過濾，然后在真空干燥箱中干燥，獲得中間體2([Glu, Ala, Lys(Boc), Tyr]x)。
NaOH的水溶液 Br— +H3N.
H2ti
肥2
Ri
o
OH
中間體-1x -HBr
n
中間體-2 [Glu, A1a Lys(Boc)， Tyr^ -xHBr
方案2.對(duì)曱氧基-保護(hù)的谷氨酸脫保護(hù)
步驟(c):現(xiàn)在參照方案3，在此步驟中，將22 g中間體2裝入具有機(jī) 械攪拌器的500-mL帶夾套的燒〗fe中。向其中加入177.2 mL33%HBr的水乙 酸溶液，然后在約20。C的溫度攪拌約20至30小時(shí)。將形成的反應(yīng)混合物 透析并凍干，獲得中間體3，其為白色至灰白色固體。
Br— +H3N
OH
33% HBr/AcOH
透析
AcO"H3N
OH
中間體-2 [Glu, Ala> Lys(Boc), Tyr]'
中間體-3 [Glu,城Lys， Tyr]". ;cCH3C02H
方案3.對(duì)Boc-保護(hù)的賴氨酸脫保護(hù)及對(duì)所形成的共聚物-l純化
實(shí)施例2
使用芐基-保護(hù)的谷氨酸和鄰苯二曱?；?保護(hù)的賴氨酸制備共聚物-1
現(xiàn)在參照方案4，在低速氮?dú)饬飨拢瑢⒗野彼?3 g, 14.5 mmol， 1.0當(dāng)量)、 丙氨酸(8.3 g， 72.1 mmol， 5.0當(dāng)量)、Y-芐基畫谷氨酸(Glu(OBn)) (5.8 g, 22.2 mmol, 1.5當(dāng)量)、s-N-鄰苯二曱?；?賴氨酸(Lys(phtha1))(13.8 g, 51.5 mmol, 3.6當(dāng)量)的N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐的混合物裝入1.0-L帶夾套的燒瓶中。所述燒瓶 包括機(jī)械攪拌器和溫度探針。然后將583.3 mL 二氧雜環(huán)己烷加到燒瓶中。 將反應(yīng)混合物攪拌30分鐘，然后使用移液管將116pL(1.1 mmol, 0.08當(dāng)量) 二乙胺(聚合引發(fā)劑)加到燒瓶中。在第 一 個(gè)小時(shí)的期間內(nèi)反應(yīng)混合物變得粘 稠并非?；鞚?。約24小時(shí)后，將反應(yīng)混合物如下淬滅在劇烈攪拌下將其倒入含有水(1.58 L)的另一個(gè)燒瓶(3.0 L)中。形成白色固體。沉淀經(jīng)真空過 濾分離，然后用水(6 x 250 mL)洗滌。將形成的產(chǎn)物在真空干燥箱中干燥過 夜至恒定的重量，獲得中間體l。
HN
二乙胺，二氧雜環(huán)己烷
24小時(shí) "聚合步驟"
Glu(OBn)-NCA Ala-NCA Lys(phthal)-NCA Tyr-NCA
方案4.形成共聚物-1的聚合步驟
中間體-1x - NEt2
現(xiàn)在參照方案5,將22 g中間體1裝入具有機(jī)械攪拌器的500-mL帶夾 套的燒瓶中。向此混合物中加入177.2 mL 33%的HBr的水乙酸溶液，然后 在約2(TC的溫度攪拌約20至30小時(shí)。將反應(yīng)如下淬滅將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn) 移至含有660 mL水的燒瓶(用機(jī)械攪拌器攪拌)中。將固體真空過濾，然后 用3x40水和3x40mL二異丙醚洗滌。將固體在真空干燥箱(在37。C)中干 燥，獲得中間體2，其為白色固體。
H2N
33% HBr/AcOH,
、
Glu上的Bn脫保護(hù)
解聚步驟
Br"H3N
'OH
中間體-, - NEt2
方案5.對(duì)千基-保護(hù)的谷氨酸脫保護(hù)
中間體-2 [Glu, Ala, Lys(Phthal), Tyr], - HBr
現(xiàn)在參照方案6，將1.8 g中間體2加到250-mL燒瓶中。向其中加入肼 溶液。將混合物攪拌15-24小時(shí)之間的一段時(shí)間。對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行過濾以 脫除任何微細(xì)的不可溶物質(zhì)，然后使濾液經(jīng)過超濾器(首先使用含有循環(huán)水 的1KD膜，直到觀測(cè)到滲透液中pH為8，然后用0.3%乙酸/水循環(huán)，至保 留液中pH為5.5-6.0)。然后將溶液凍干，獲得中間體3，其為白色至灰白色 固體。
19<formula>formula see original document page 20</formula>
方案6.對(duì)鄰苯二曱?；?保護(hù)的賴氨酸的保護(hù)及對(duì)共聚物-1的純化
受益于前述說明書和相關(guān)附圖中提出的教導(dǎo)，本發(fā)明披露主題所屬領(lǐng) 域的技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到對(duì)本申請(qǐng)列出的本發(fā)明披露主題的許多修改和其它 實(shí)施方案。因此，應(yīng)該理解的是，本發(fā)明披露的主題并非局限于所披露的 具體實(shí)施方案，以及修改和其它實(shí)施方案意圖包括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 制備共聚物-1的方法，所述方法包括(a)使具有下式的N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐的混合物與聚合引發(fā)劑反應(yīng)以引發(fā)N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐的混合物的聚合，從而形成受保護(hù)的共聚物-1；其中R1包含選自丙氨酸、受保護(hù)的谷氨酸、受保護(hù)的賴氨酸，以及酪氨酸中的一種或多種氨基酸；以及其中所述受保護(hù)的谷氨酸含有芐基或甲氧基保護(hù)基，以及所述受保護(hù)的賴氨酸含有環(huán)酰亞胺或叔丁氧基羰基保護(hù)基；(b)對(duì)受保護(hù)的谷氨酸進(jìn)行脫保護(hù)；(c)對(duì)受保護(hù)的賴氨酸進(jìn)行脫保護(hù)，從而形成共聚物-1。
2. 權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括d) 在進(jìn)行N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐的混合物聚合的期間，確定共聚物-l的分子 量至少一次；以及e) 當(dāng)共聚物-1的分子量具有預(yù)定值或在預(yù)定范圍內(nèi)時(shí)，終止對(duì)N-羧基 環(huán)內(nèi)酸酐的混合物的聚合。
3. 權(quán)利要求l的方法，其中所述聚合引發(fā)劑選自二乙胺、叔丁醇鉀、 NaH、 KH、三乙胺、四曱基哌啶、二環(huán)己基胺、二環(huán)己基十一烷、二異丙 基氨基鋰、叔丁基鋰，以及上述物質(zhì)的組合。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中對(duì)所述受保護(hù)的谷氨酸進(jìn)行脫保護(hù)是在對(duì) 所述受保護(hù)的賴氨酸脫進(jìn)行脫保護(hù)之前進(jìn)行的。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中通過用NaOH對(duì)所述受保護(hù)的共聚物-l進(jìn) 行處理來對(duì)所述受保護(hù)的谷氨酸進(jìn)行脫保護(hù)。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中通過用HBr的水乙酸溶液對(duì)所述受保護(hù)的 共聚物-1進(jìn)行處理來對(duì)所述受保護(hù)的賴氨酸進(jìn)行脫保護(hù)。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中所述環(huán)酰亞胺選自鄰苯二甲酰亞胺、N-四氯鄰苯二曱酰亞胺、4-硝基-N-鄰苯二甲酰亞胺、N-二硫代琥珀酰亞胺、N-2,3-二苯基馬來酰亞胺、N-2，5-二曱基吡咯、N-2，5-二(三異丙基曱硅烷氧基)p比咯 和N-1,1,4,4-四曱基二曱硅烷基氮雜環(huán)戊烷加成物。
8. 權(quán)利要求1的方法，其中所述共聚物-1包含摩爾比例分別為約 5-7:1-3:4-6:0.2-2.2的丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸和酪氨酸。
9. 權(quán)利要求l的方法，其中N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐的混合物如下制備使光 氣或光氣替代物與具有以下結(jié)構(gòu)的多種氨基酸反應(yīng)，其中R,包含選自丙氨酸、受保護(hù)的谷氨酸、受保護(hù)的賴氨酸，以及酪氨酸 中的一種或多種氨基酸；以及其中所述受保護(hù)的谷氨酸含有千基或曱氧基 保護(hù)基，以及所述受保護(hù)的賴氨酸含有環(huán)酰亞胺或叔丁氧基羰基保護(hù)基。
10. 由權(quán)利要求1的方法制備的共聚物-1。
11. 選擇性制備分子量在約2千道爾頓至約25千道爾頓之間的共聚物 -1的方法，所述方法包括(a)使具有下式的N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐的混合物與聚合引發(fā)劑反應(yīng)以引發(fā) N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐的混合物的聚合，從而形成受保護(hù)的共聚物-1;其中R!包含選自丙氨酸、受保護(hù)的谷氨酸、受保護(hù)的賴氨酸，以及酪 氨酸中的一種或多種氨基酸；以及其中所述受保護(hù)的谷氨酸含有千基或曱 氧基保護(hù)基，以及賴氨酸含有環(huán)酰亞胺或叔丁氧基羰基保護(hù)基；(b)在進(jìn)行N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐的混合物聚合的期間，測(cè)量所述共聚物-1的分子量至少一次；以及(c)當(dāng)從步驟(b)中測(cè)量的共聚物-l的分子量具有預(yù)定值或在預(yù)定范圍 內(nèi)時(shí)，終止對(duì)N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐的混合物的聚合，從而形成分子量在約2千 道爾頓至約25千道爾頓之間的共聚物-1。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中測(cè)量共聚物的分子量包括移取步驟(c) 的反應(yīng)產(chǎn)物的等份試樣，然后通過色譜法確定分子量。
13. 權(quán)利要求ll的方法，其中所述聚合物的分子量是原位測(cè)量的。
14. 權(quán)利要求11的方法，所述方法還包括從一種或多種所述受保護(hù)的 谷氨酸和所述受保護(hù)的賴氨酸中脫除保護(hù)基。
15. 權(quán)利要求11的方法，其中共聚物-1包含摩爾比例分別為約6:2:5:1 的丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸和酪氨酸。
16. 權(quán)利要求ll的方法，其中終止對(duì)N-羧基環(huán)內(nèi)酸酑的聚合包括當(dāng) 從步驟(b)中測(cè)量的分子量在約4千道爾頓至約16千道爾頓之間時(shí)，終止聚 合反應(yīng)。
17. 權(quán)利要求11的方法，其中所述聚合引發(fā)劑包含一種或多種仲胺， 所述仲胺選自二曱胺、二乙胺、二正丙胺、二異丙胺、N-乙基曱胺、二正 丁胺、二異丁胺、二仲丁胺、二叔丁胺、二戊胺、二正辛胺、二-(2-乙基己 基)-胺、二異壬胺、二烯丙胺、N-曱基苯胺、二苯胺、氮丙啶、吡咯、吡咯 烷、咪唑、巧l咮、哌咬、嘌呤，以及上述物質(zhì)的組合。
18. 權(quán)利要求11的方法，其中所述受保護(hù)的谷氨酸含有曱氧基保護(hù)基， 以及所述受保護(hù)的賴氨酸含有叔丁氧基羰基保護(hù)基。
19. 權(quán)利要求18的方法，所述方法還包括以下步驟d) 用堿對(duì)所述共聚物-1進(jìn)行處理，脫除谷氨酸的曱氧基保護(hù)基；以及e) 用HBr的水乙酸溶液對(duì)所述共聚物-1進(jìn)行處理，脫除賴氨酸的叔丁 氧基羰基保護(hù)基。
20. 權(quán)利要求11的方法，其中所述受保護(hù)的谷氨酸含有千基保護(hù)基， 以及所述受保護(hù)的賴氨酸含有鄰苯二曱酰亞胺保護(hù)基。
21. 權(quán)利要求20的方法，所述方法還包括以下步驟d) 對(duì)受保護(hù)的谷氨酸進(jìn)行脫保護(hù)；以及e) 對(duì)受保護(hù)的賴氨酸進(jìn)行脫保護(hù)。
22. 權(quán)利要求11的方法，所述方法還包括對(duì)所述共聚物-1進(jìn)行純化。
23. 權(quán)利要求11的方法，其中所述共聚物-1的分子量如下確定測(cè)量 氨基曱酸酯、酰胺羰基或其組合的紅外強(qiáng)度，然后將所測(cè)量的紅外強(qiáng)度與 將共聚物-1的分子量描述為所測(cè)量的紅外強(qiáng)度的函數(shù)的模型相關(guān)聯(lián)。
全文摘要
本發(fā)明披露的主題提供了制備共聚物-1的新方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，用聚合引發(fā)劑處理N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐(NCAs)的混合物以引發(fā)N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐的混合物的聚合，以及由此合成受保護(hù)的共聚物-1，所述N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐包含丙氨酸、受保護(hù)的谷氨酸、受保護(hù)的賴氨酸，以及酪氨酸，以及其中谷氨酸含有芐基或甲氧基保護(hù)基，賴氨酸含有環(huán)酰亞胺或Boc保護(hù)基。然后可用脫保護(hù)劑處理受保護(hù)的共聚物-1和/或使受保護(hù)的共聚物-1解聚，從而獲得具有期望分子量的共聚物-1。
文檔編號(hào)C07K14/00GK101511862SQ200780032880
公開日2009年8月19日 申請(qǐng)日期2007年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月5日
發(fā)明者帕特·奧利弗-謝弗, 科琳·鮑爾, 馬尼·S·艾耶 申請(qǐng)人:莫門塔制藥股份有限公司