專(zhuān)利名稱(chēng)：：具有抗鱗翅目活性的蘇云金芽孢桿菌毒素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及/人新的蘇云金芽孢桿菌(5acz7/wAw〃'"g/era^)基因獲得的天然存在的核酸和重組核酸，所述基因編碼以抗蟲(chóng)害殺蟲(chóng)活性為特征的殺蟲(chóng)多肽。本發(fā)明的組合物和方法使用所公開(kāi)核酸及其所編碼的殺蟲(chóng)多肽來(lái)控制植物疫害。
背景技術(shù)：
：蟲(chóng)害是世界農(nóng)作物損失的主要因素。例如，粘蟲(chóng)進(jìn)食、黑切根蟲(chóng)損害或歐洲玉米螟損害可以在經(jīng)濟(jì)上摧毀農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者。僅歐洲玉米螟攻擊田地和甜玉米帶來(lái)的蟲(chóng)害相關(guān)的農(nóng)作物損失就已在損害和控制開(kāi)銷(xiāo)上達(dá)到每年十億美元。傳統(tǒng)地，影響諸如黑切根蟲(chóng)群體的蟲(chóng)害群體的主要方法是應(yīng)用廣語(yǔ)化學(xué)殺昆蟲(chóng)劑。然而，消費(fèi)者與政府調(diào)節(jié)員一樣越來(lái)越關(guān)心與生產(chǎn)和使用合成的化學(xué)殺蟲(chóng)劑相關(guān)的環(huán)境危害。調(diào)節(jié)員出于這種關(guān)心已禁止或限制使用一些更為危險(xiǎn)的殺蟲(chóng)劑。因此，開(kāi)發(fā)替代殺蟲(chóng)劑具有實(shí)質(zhì)性利益。使用諸如真菌、細(xì)菌或其它昆蟲(chóng)物種的微生物劑對(duì)農(nóng)業(yè)上重要的蟲(chóng)害進(jìn)行生物學(xué)控制，這為合成的化學(xué)殺蟲(chóng)劑提供了對(duì)環(huán)境友好且具有商業(yè)吸引力的替代途徑。一般來(lái)講，使用生物殺蟲(chóng)劑造成污染和環(huán)境危害的風(fēng)險(xiǎn)較低，并且生物殺蟲(chóng)劑相對(duì)于傳統(tǒng)廣譜化學(xué)殺昆蟲(chóng)劑的性質(zhì)提供了更強(qiáng)的靶標(biāo)特異性。此外，生物殺蟲(chóng)劑的生產(chǎn)成本通常更低，并因而提高大量品種的農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)收益。已知芽孢桿菌屬的某些種的微生物具有抗廣譜蟲(chóng)害的殺蟲(chóng)活性，所述蟲(chóng)害包括鱗翅目(Z印zWoptera)、雙翅目(Dz>fera)、鞘翅目(Co/eoptera)、半翅目(//emz;p&ra)及其它。蘇云金芽孢桿菌(價(jià))和曱蟲(chóng)芽孢桿菌CBacz7/tw/^^7//ae)屬于迄今所發(fā)現(xiàn)的最為成功的生物控制劑。昆蟲(chóng)致病性還歸因于幼蟲(chóng)芽孢桿菌(及/WVM)、緩病芽孢桿菌(及/ew"'worZm力、J求形芽孑包斗干菌(A.1y//zae/-/cw1s)(Harwook，ed.，((1989)Bac〃/w(芽孢桿菌)(PlenumPress)，306)和蠟狀芽孢桿菌(5.(WO96/10083)菌林。雖然也已從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的芽孢桿菌分離出殺蟲(chóng)蛋白，但是殺蟲(chóng)活性看上去集中在伴孢晶體蛋白包涵體上。已分離并表征編碼這些殺蟲(chóng)蛋白的數(shù)種基因(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利第5,366,892號(hào)和第5,840,868號(hào))。微生物殺昆蟲(chóng)劑，特別是獲自芽孢桿窗菌抹的那些，作為化學(xué)疫害控制的替代品在農(nóng)業(yè)上起重要作用。近來(lái)，農(nóng)業(yè)科研工作者通過(guò)基因工程改造農(nóng)作物植物來(lái)產(chǎn)生來(lái)自芽孢桿菌的殺蟲(chóng)蛋白，已開(kāi)發(fā)出具有增強(qiáng)的昆蟲(chóng)抗性的農(nóng)作物植物。例如，玉米和棉花植物已被基因工程化以產(chǎn)生分離自?xún)r(jià)菌林的殺蟲(chóng)蛋白(參見(jiàn),例如，Aronson(2002)Ce〃Mo/.丄z/e59(3):417國(guó)425;Schnepfef"/.(1998)A^cro6/0/Mo/Bz'o/及ev.62(3):775-806)。這些基因工程農(nóng)作物現(xiàn)在廣泛用于北美農(nóng)業(yè)，并且向農(nóng)民提供了傳統(tǒng)昆蟲(chóng)控制方法的環(huán)境友好替代品。此外，已向美國(guó)農(nóng)民銷(xiāo)售經(jīng)基因工程改造而包含殺蟲(chóng)的Cry毒素的馬鈴薯。這些基因工程改造的抗昆蟲(chóng)的農(nóng)作物植物已被證明在商業(yè)上非常成功，但是它們僅提供對(duì)小范圍的商業(yè)上重要蟲(chóng)害的抗性。因此，仍需要具有更廣泛的抗蟲(chóng)害殺昆蟲(chóng)活性的新的份毒蛋白，例如對(duì)鱗翅目中更多品種的昆蟲(chóng)具有活性的毒素。此外，仍需要具有發(fā)明概述本發(fā)明提供影響蟲(chóng)害的組合物和方法。更具體地，本發(fā)明的實(shí)施方式涉及影響昆蟲(chóng)的方法，所述方法利用編碼殺昆蟲(chóng)肽的核苦酸序列，從而產(chǎn)生表達(dá)實(shí)施方式中的殺昆蟲(chóng)多肽的轉(zhuǎn)化的微生物和植物。這些害蟲(chóng)包括農(nóng)業(yè)上重要的害蟲(chóng)，諸如，例如，歐洲玉米螟，例如OwWmh"w^7a/z's。在一些實(shí)施方式中，該核苷酸序列編碼對(duì)屬于鱗翅目的至少一種昆蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)性的多肽。實(shí)施方式提供核酸及其片段和其變體，其編碼具有抗蟲(chóng)害殺蟲(chóng)活性的多肽(例如，編碼SEQIDNO:2的SEQIDNO:l)。實(shí)施方式的野生型(例如，天然存在的)核苷酸序列編碼新的殺昆蟲(chóng)肽，所述核苷酸序列獲得自A。實(shí)施方式還提供所公開(kāi)的編碼生物學(xué)活性(例如，殺昆蟲(chóng))多肽的核苷酸序列的片段及變體。實(shí)施方式還4是供分離的殺蟲(chóng)(例如，殺昆蟲(chóng))多肽，其由實(shí)施方式的天然存在的核酸或經(jīng)#~飾的(例如，突變的或經(jīng)」燥作的)核酸所編碼。在特定實(shí)例中，實(shí)施方式的殺蟲(chóng)蛋白包括全長(zhǎng)蛋白和多肽的片段，其產(chǎn)生自突變的核酸，所述核酸經(jīng)設(shè)計(jì)以將特定氨基酸序列引入實(shí)施方式的多肽。在特定實(shí)施方式中，所述多肽相對(duì)于其衍生自的天然存在的多肽具有增強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性。實(shí)施方式的核酸還可以用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的(例如，轉(zhuǎn)化的)單子葉或雙子葉植物，所述植物的特征在于基因組包含至少一個(gè)穩(wěn)定整合的核苷酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含實(shí)施方式的編碼序列，所述編碼序列與驅(qū)動(dòng)所編碼殺蟲(chóng)多肽表達(dá)的啟動(dòng)子可操作地連接。因此，還提供轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、植物及其種子。在特定實(shí)施方式中，可以使用經(jīng)優(yōu)化而在宿主植物中提高表達(dá)的核酸來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的才直物。例如，可以回譯(backtranslate)實(shí)施方式的一種殺蟲(chóng)多肽，從而產(chǎn)生包含為在特定宿主中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的核酸，所述特定宿主例如諸如玉米(ZMma")植物的農(nóng)作物植物。這種轉(zhuǎn)化的植物(例如，雙子葉或單子葉植物)表達(dá)編碼序列，從而導(dǎo)致產(chǎn)生殺蟲(chóng)多肽，并賦予所述植物增加的昆蟲(chóng)抗性。一些實(shí)施方式提供表達(dá)殺蟲(chóng)多肽的轉(zhuǎn)基因植物，所述殺蟲(chóng)多肽用于影響各種蟲(chóng)害的方法。實(shí)施方式還包括含有實(shí)施方式的殺昆蟲(chóng)多肽的殺蟲(chóng)或殺昆蟲(chóng)組合物，并且可以4壬選地包括另外的殺昆蟲(chóng)肽。實(shí)施方式包括將該組合物應(yīng)用于蟲(chóng)害環(huán)境，從而影響蟲(chóng)害。發(fā)明詳述本發(fā)明的實(shí)施方式涉及影響蟲(chóng)害、特別是植物疫害的組合物和方法。更為具體地，實(shí)施方式的分離的核酸及其片段和其變體包含編碼殺蟲(chóng)多肽(例如蛋白)的核苷酸序列。所公開(kāi)的殺蟲(chóng)蛋白對(duì)諸如但不限于鱗翅目蟲(chóng)害的蟲(chóng)害具有生物學(xué)活性(例如殺蟲(chóng)性)。目的蟲(chóng)害包括但不限于歐洲玉米螟，例如，歐洲玉米螟(0^7'm'am^//a/&);棉鈴蟲(chóng)，例^口，才帛鈴蟲(chóng)(^W/cover/(3普通4占心蟲(chóng)(commonstalkborer)，例^口,戶(hù)opfapemawe6Ws;灃占蟲(chóng),例3口，一星4'占蟲(chóng)(i^ewda/e/iawm》wwcto);西南玉米螟，例如，西南玉米螟(Z)/afraeagraw&o"〃a);黑切才艮蟲(chóng)，例如，黑切才艮蟲(chóng)(^gratoZpw7o");-火粘蟲(chóng)，例如，一火粘蟲(chóng)(S;o6/opfera/h/gYpgrtia);甜菜夜蛾，例如,甜菜夜蛾(5^ot/豐en3e;dg—;以及小菜蛾，例如，小菜蛾(/V她〃a;c;;/aste〃(3)。實(shí)施方式的組合物包含分離的核酸及其片段和其變體，'其編碼殺蟲(chóng)多肽、包含實(shí)施方式的核苷酸序列的表達(dá)盒、分離的殺蟲(chóng)蛋白和殺蟲(chóng)組合物。一些實(shí)施方式提供經(jīng)修飾的殺蟲(chóng)多肽，所述多肽的特征在于相對(duì)于相應(yīng)野生型蛋白的殺蟲(chóng)活性具有改良的抗鱗翅目殺昆蟲(chóng)活性。實(shí)施方式還提供用這些新的核酸轉(zhuǎn)化的植物和微生物，以及涉及將該核酸、殺蟲(chóng)組合物、轉(zhuǎn)化生物體及其產(chǎn)物用于影響蟲(chóng)害的方法。實(shí)施方式的核酸和核苷酸序列可以用于轉(zhuǎn)化任何生物體，從而產(chǎn)生所編碼的殺蟲(chóng)蛋白。所提供的方法涉及將該轉(zhuǎn)化生物體用于影響或控制植物疫害。實(shí)施方式的核酸和核芬酸序列還可以用于轉(zhuǎn)化諸如葉綠體的細(xì)胞器(McBrideWa/.(1995)WWec/wo/ogy13:362-365;和Kota(1999)7Voc,7Va/.^cadf7&496:1840-1845)。實(shí)施方式還涉及鑒定編碼生物學(xué)活性殺蟲(chóng)蛋白的天然存在的編碼序列片段和變體。實(shí)施方式的核苷酸序列直接用于影響疫害、特別是諸如鱗翅目疫害的蟲(chóng)害的方法。因此，實(shí)施方式提供影響蟲(chóng)害的新方法，所述方法不依賴(lài)傳統(tǒng)的合成的化學(xué)殺昆蟲(chóng)劑的使用。實(shí)施方式涉及發(fā)現(xiàn)天然存在的、可生物降解的殺蟲(chóng)劑以及編碼它們的基因。實(shí)施方式還提供同樣編碼生物學(xué)活性(例如，殺蟲(chóng))多肽的天然存在的編碼序列片段和變體。實(shí)施方式的核酸包括經(jīng)優(yōu)化用于特定生物體的細(xì)胞表達(dá)的核酸或核普酸序列，例如使用植物偏好密碼子，以具有增強(qiáng)殺蟲(chóng)活性的多肽氨基酸序列為基礎(chǔ)而回譯(即反向翻譯)的核酸序列。實(shí)施方式還提供突變，所述突變賦予實(shí)施方式的多肽改良的或改變的性質(zhì)。參見(jiàn)，例如，共同未決的2003年6月25日提交的美國(guó)申請(qǐng)第10/606,320號(hào)和2003年12月24日提交的第10〃46，914號(hào)。在隨后的描述中，廣泛使用了大量術(shù)語(yǔ)。為促進(jìn)對(duì)實(shí)施方式的理解，提供以下定義?？梢杂肧I可接受的形式表示單位、前綴和符號(hào)。除非另有所指，分別地，核酸以5，至3'方向從左向右書(shū)寫(xiě)；氨基酸序列以氨基至羧基方向從左向右書(shū)寫(xiě)。數(shù)字范圍包括限定該范圍的數(shù)字。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符號(hào)或IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的一字母符號(hào)來(lái)表示。同樣地，可以用通常接受的單字母碼表示核苷酸。參考說(shuō)明書(shū)整體更為充分地定義以上定義的術(shù)語(yǔ)。如本文所用，"核酸"包括涉及單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性質(zhì)的已知類(lèi)似物(例如，肽核酸)，所述類(lèi)似物以與天然存在的核苷酸類(lèi)似的方式與單鏈核酸雜交。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"編碼"或"所編碼的"用于特定核酸的上下文時(shí)，指該核酸包含指導(dǎo)該核苷酸序列翻譯成特定蛋白的必需信息。使用密碼子表示編碼蛋白的信息。編碼蛋白的核酸可以包含位于該核酸翻譯區(qū)內(nèi)的非翻譯序列(例如，內(nèi)含子)或者可以缺少這樣的居間非翻譯序列(例如，如同在cDNA中)。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所編碼的蛋白的"全長(zhǎng)序列"指具有天然(非合成)內(nèi)源序列的整個(gè)核酸序列或整個(gè)氨基酸序列。全長(zhǎng)多核苷酸編碼該特定蛋白的全長(zhǎng)、催化活性形式。如本文所用，用于核苷酸序列方向上下文的術(shù)語(yǔ)"反義"涉及二倍多核苷酸序列，所述多核苦酸序列以轉(zhuǎn)錄該反義鏈的方向與啟動(dòng)子可操作地連接。該反義鏈與內(nèi)源轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物充分互補(bǔ)，以致該內(nèi)源轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯通常受抑制。因而，將術(shù)語(yǔ)"反義"用于特定核苷酸序列的上下文時(shí)，該術(shù)語(yǔ)涉及該參考轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的互補(bǔ)鏈。本文可互換地使用術(shù)語(yǔ)"多肽"、"肽"和"蛋白"，以指氨基酸殘基的多聚物。該術(shù)語(yǔ)用于氨基酸多聚物，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類(lèi)似物。該術(shù)語(yǔ)還用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互換地使用術(shù)語(yǔ)"殘基"或"氨基酸殘基"或"氨基酸"，以指被并入蛋白、多肽或肽(統(tǒng)稱(chēng)"蛋白")的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知類(lèi)似物，所述類(lèi)似物可以以與天然存在的氨基酸相似的方式起作用?？梢詮谋疚墓_(kāi)的核酸或者使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)制備實(shí)施方式的多肽。例如，可以通過(guò)在適當(dāng)宿主細(xì)胞中表達(dá)實(shí)施方式的重組核酸，或可選擇地通過(guò)間接體內(nèi)(exv/vo)方法的組合，來(lái)制備實(shí)施方式的蛋白。如本文所用，可以互換地使用術(shù)語(yǔ)"分離的"和"純化的"，以涉及核酸或多肽或其生物學(xué)活性部分，其基本上或本質(zhì)上不含如在其天然存在的環(huán)境中所發(fā)現(xiàn)的通常伴隨或反應(yīng)于該核酸或多肽的組分。因而，用重組技術(shù)產(chǎn)生分離的或純化的核酸或多肽時(shí)，分離的或純化的核酸或多肽基本上不含其它細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者化學(xué)合成分離的或純化的核酸或多肽時(shí)，基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品。"分離的"核酸通常不含在該核酸所衍生自的生物體的基因組DNA中天然側(cè)翼于該核酸(即位于該核酸5，和3'端的序列)的序列(諸如，例如編碼蛋白的序列)。例如，在各種實(shí)施方式中，所分離的核酸可以包含少于約5kb，4kb，3kb,2kb，1kb，0.5kb或O.lkb的核苷酸序列，所述核苷酸序列在該核酸所衍生自的細(xì)胞的基因組DNA中天然側(cè)翼于該核酸。如本文所用，將術(shù)語(yǔ)"分離的"或"純化的"用于涉及實(shí)施方式的多肽時(shí)，指分離的蛋白基本上不含細(xì)胞物質(zhì)并且包含具有少于約30%,20%，10%或5%(干重計(jì))的污染蛋白的蛋白制備物。當(dāng)重組地產(chǎn)生實(shí)施方式的蛋白或其生物學(xué)活性部分時(shí)，培養(yǎng)基代表少于約30%,20%,10%或5%(干重計(jì))的化學(xué)前體或非目的蛋白化學(xué)品。貫穿申請(qǐng)文件，將詞語(yǔ)"包括(comprising)"或諸如"包括(comprises)"或"包括(comprising)"的變體理解成提示包含所稱(chēng)元素、整數(shù)或步驟，或者元素、整數(shù)或步驟的組，而非排除任何其它元素、整數(shù)或步驟，或者元素、整數(shù)或步驟的組。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"影響蟲(chóng)害"指對(duì)任何發(fā)育階段的昆蟲(chóng)進(jìn)食、生長(zhǎng)和/或行為的有影響的改變，包括但不限于殺滅昆蟲(chóng)、延遲生長(zhǎng)、阻礙生殖能力、拒食素活性等等。如本文所用，將術(shù)語(yǔ)"殺蟲(chóng)活性"和"殺昆蟲(chóng)活性"同義地使用以指生物體或物質(zhì)(諸如，例如蛋白)的活性，其測(cè)量可以通過(guò)但不限于害蟲(chóng)死亡率、害蟲(chóng)體重減少、害蟲(chóng)驅(qū)避性(repellency)以及進(jìn)食和暴露適當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間后害蟲(chóng)的其它行為和物理變化。因而，具有殺蟲(chóng)活性的生物體或物質(zhì)不利地影響至少一種可測(cè)量的害蟲(chóng)健康參數(shù)。例如，"殺蟲(chóng)蛋白"是自身顯示或與其它蛋白組合顯示殺蟲(chóng)活性的蛋白。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"殺蟲(chóng)有效量，，指存在于害蟲(chóng)環(huán)境的具有殺蟲(chóng)活性的物質(zhì)或生物體的量。對(duì)每一物質(zhì)或生物體而言，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定在特定環(huán)境中受影響的每一害蟲(chóng)的殺蟲(chóng)有效量。類(lèi)似地，當(dāng)害蟲(chóng)是昆蟲(chóng)時(shí)，"殺昆蟲(chóng)有效量"可以用于指"殺蟲(chóng)有效量"。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"重組工程化的"或"工程化的"指利用重組DNA技術(shù)引入(例如工程化)蛋白結(jié)構(gòu)的改變，這基于對(duì)蛋白作用機(jī)制的理解以及對(duì)被引入、被缺失或被取代的氨基酸的考慮。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"突變核普酸序列"或"突變"或"誘變的核苷酸序列"指經(jīng)誘變或改變而包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基(例如堿基對(duì))的核普酸序列，所述核苷酸殘基不存在于相應(yīng)的野生型序列中。這樣的誘變或改變由核酸殘基的一個(gè)或多個(gè)添加、缺失或取代或替換所組成。當(dāng)通過(guò)添加、移除或替換蛋白水解位點(diǎn)的氨基酸來(lái)制備突變時(shí)，這樣的添加、移除或替換可以在該蛋白水解位點(diǎn)基序內(nèi)或鄰近該基序，只要完成了突變的目的(即只要改變了該位點(diǎn)的蛋白水解)。突變體核苷酸序列可以編碼突變體殺昆蟲(chóng)毒素，所述毒素顯示改良的或降低的殺昆蟲(chóng)活性，或者可以編碼氨基酸序列，所述氨基酸序列賦予包含它的多肽改良的或降低的殺昆蟲(chóng)活性。如本文所用的，蛋白、多肽或氨基酸序列上下文的術(shù)語(yǔ)"突變體"或"突變"指經(jīng)突變或經(jīng)改造而包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列，所述氨基酸殘基不存在于相應(yīng)的野生型序列中。這樣的突變或改變由氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)添加、缺失或取代或替換所組成。突變體多肽顯示改良的或降低的殺昆蟲(chóng)活性，或者代表氨基酸序列，所述氨基酸序列賦予包含它的多肽改良的殺昆蟲(chóng)活性。因而，術(shù)語(yǔ)"突變體"或"突變"指突變體核香酸序列和所編碼的氨基酸之一或兩者。突變體可以單獨(dú)使用或者與其它突變體或與實(shí)施方式的其它突變體相容地任意組合使用。"突變體多肽"可以相反地顯示殺昆蟲(chóng)活性的降低。將超過(guò)一個(gè)突變添加至特定核酸或蛋白時(shí)，所述突變可以同時(shí)或順序添加；如果順序添加，突變可以以任何合適的次序添加。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"改良的殺昆蟲(chóng)活性"或"改良的殺蟲(chóng)活性"涉及實(shí)施方式的殺昆蟲(chóng)多肽，所述多肽相對(duì)于其相應(yīng)的野生型蛋白具有增強(qiáng)的殺昆蟲(chóng)活性，和/或涉及對(duì)更廣i普的昆蟲(chóng)有效的殺昆蟲(chóng)多肽，和/或涉及對(duì)不易受野生型蛋白毒性影響的昆蟲(chóng)具有特異性的殺昆蟲(chóng)多肽。改良的或增強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性的發(fā)現(xiàn)需要證明相對(duì)于野生型殺昆蟲(chóng)多肽的殺蟲(chóng)活性，對(duì)昆蟲(chóng)靶標(biāo)的殺蟲(chóng)活性提高至少10%，或者殺蟲(chóng)活性提高至少20%,25%，30%，35%,40%,45%，50%,60%,70%,100%,150%,200%或300%或更多，所述活性的確定是4h對(duì)同樣的昆蟲(chóng)。例如，提供改良的殺蟲(chóng)或殺昆蟲(chóng)活性，其中相對(duì)于受野生型價(jià)毒蛋白影響的昆蟲(chóng)的范圍，受該多肽影響的昆蟲(chóng)的范圍更寬或者更窄。當(dāng)需要多功能性時(shí)，可能需要較寬的影響范圍，而當(dāng)例如有益的昆蟲(chóng)另外有可能受該毒素的使用或存在所影響時(shí)，可能需要較窄的影響范圍。雖然實(shí)施方式不受任何特別的作用機(jī)制的限制，但是也可以通過(guò)改變多肽的一個(gè)或多個(gè)特性來(lái)提供改良的殺蟲(chóng)活性；例如，可以增加多肽在昆蟲(chóng)腸內(nèi)的穩(wěn)定性或壽命，所述增加相對(duì)于相應(yīng)野生型蛋白的穩(wěn)定性或壽命。本文所用術(shù)語(yǔ)"毒素"指表現(xiàn)殺蟲(chóng)活性或殺昆蟲(chóng)活性或改良的殺蟲(chóng)活性或改良的殺昆蟲(chóng)活性的多肽。"價(jià)"或"蘇云金芽孢桿菌，，毒素意在包括在A(yíng)的各種菌林中發(fā)現(xiàn)的較寬種類(lèi)的Cry毒素，其包括諸如例如CV少h,0;;2s或CV>ds的毒蛋白。術(shù)語(yǔ)"蛋白水解位點(diǎn)"或"切割位點(diǎn)"指氨基酸序列，其將敏感性賦予一類(lèi)蛋白酶或特別的蛋白酶，以致包含所述氨基酸序列的多肽被該類(lèi)蛋白酶或特別的蛋白酶所消化。據(jù)稱(chēng)，蛋白水解位點(diǎn)對(duì)識(shí)別該位點(diǎn)的一種或多種蛋白酶"敏感"。本領(lǐng)域理解，消化效率各不相同，并且消化效率的降低可以導(dǎo)致該多肽在昆蟲(chóng)腸內(nèi)穩(wěn)定性或壽命的增加。因而，蛋白水解位點(diǎn)可以將敏感性賦予不止一種蛋白酶或者不止一類(lèi)蛋白酶，但是各種蛋白酶對(duì)該位點(diǎn)的消化效率可以各不相同。蛋白水解位點(diǎn)包括，例如，胰蛋白酶位點(diǎn)、糜蛋白酶位點(diǎn)和彈性蛋白酶位點(diǎn)。研究已表明鱗翅目的昆蟲(chóng)腸蛋白酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶和彈'l"生蛋白酵。參見(jiàn)，，H口,Lenzefa/.(1991)^n/z.尸/^57'o/.16:201-212;和Hedegusefa/.(2003)^rc/j.7wecf5foc/zem.尸/^sz'o/.53:30-47。例如，已在verp"ww/gera幼蟲(chóng)的中腸內(nèi)發(fā)現(xiàn)約18種不同6令月iH白Sl(，^LGatehouseef(1997)/"■secfiWo/.丑/o/'27:929-944)。已研究了這些蛋白酶所偏好的蛋白水解底物位點(diǎn)。參見(jiàn)，i"列^(口Petersonefa/.(1995)/wse"5&c/zem.iWb/.5fo/.25:765-774。已努力理解份毒蛋白的作用機(jī)制并利用改良的性質(zhì)工程化毒素。已表明昆蟲(chóng)腸蛋白酶可以影響份Cry蛋白對(duì)該昆蟲(chóng)的影響。一些蛋白酶通過(guò)將Cry蛋白從"毒素原(protoxin)，，形式加工至毒性形式或"毒素"，來(lái)活化Cry蛋白。參見(jiàn)Oppert(1999)^r/z./me"所oc&m.P//;^.42:1-12;和CarrollWa/.(1997)J！/廚他6ra/e/to/w/ogy70:41-49。該毒蛋白的活化可以包括vt人所述蛋白移除N末端和C末端肽，并且還可以包括從內(nèi)部切割該蛋白。其它蛋白酶可以降解所述Cry蛋白。參見(jiàn)Oppert,如前。不同特異性的Cry毒素的氨基酸序列的比較揭示了5個(gè)高度保守的序列單元(block)。所述毒素在結(jié)構(gòu)上包含3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，從N末端到C末端為涉及孔形成的7個(gè)a螺旋的簇(稱(chēng)作"結(jié)構(gòu)域l")、涉及細(xì)胞結(jié)合的3個(gè)反平行p片層(稱(chēng)作"結(jié)構(gòu)域2")以及P三明治(稱(chēng)作"結(jié)構(gòu)域3")。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知這些結(jié)構(gòu)域的位置和性質(zhì)。參見(jiàn)，例如，Li"(1991)A^&re,305:815-821和MorseW(2001)S,n^we，9:409-417。涉及特定結(jié)構(gòu)域，例如涉及結(jié)構(gòu)域1時(shí)，應(yīng)理解關(guān)于特定序列的結(jié)構(gòu)域的確切終點(diǎn)并不是關(guān)鍵的，只要該序列或其部分包含提供歸因于該特定結(jié)構(gòu)域的至少一些功能的序列。因而，例如，當(dāng)提及"結(jié)構(gòu)域l"時(shí)，意在指特定序列包括7個(gè)a螺-走的簇，但所用序列或關(guān)于該簇的序列的確切終點(diǎn)并不關(guān)鍵。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這類(lèi)終點(diǎn)的確定以及對(duì)這類(lèi)功能的評(píng)價(jià)。為了嘗試更好地表征和改良價(jià)毒蛋白，研究了份細(xì)菌菌抹。發(fā)現(xiàn)從價(jià)菌抹培養(yǎng)物制備的晶體制備物具有抗歐洲玉米螟、黑切根蟲(chóng)、棉鈴蟲(chóng)和三化螟的殺蟲(chóng)活性(參見(jiàn)，例如實(shí)施例l和2)。嘗試鑒定來(lái)自所選菌抹的編碼晶體蛋白的核苦酸序列，從這些細(xì)菌菌抹分離實(shí)施方式的野生型(即天然存在的)核酸，將其克隆至表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌。依賴(lài)給定制備物的特性，認(rèn)識(shí)到殺蟲(chóng)活性的證明有時(shí)需要胰蛋白酶預(yù)處理以活化該殺蟲(chóng)蛋白。因而，應(yīng)理解一些殺蟲(chóng)蛋白的活化需要蛋白酶消化(例如，通過(guò)胰蛋白酶、糜蛋白酶等等)，而其它蛋白在無(wú)活化作用下便是生物活性的(例如，殺蟲(chóng)性)?？梢酝ㄟ^(guò)2003年6月25日提交的美國(guó)申請(qǐng)第10/606,320號(hào)和2003年12月24日提交的第10/746,914號(hào)所述的方法改造所述分子。此外，可以將核酸序列工程化，以編碼包含另外的突變的多肽，所述突變賦予相對(duì)于天然存在的多肽的殺蟲(chóng)活性的改良的或改變的殺蟲(chóng)活通常通過(guò)包括以下步驟的方法制備實(shí)施方式的突變體多肽獲得編碼Oy家族多肽的核酸序列；分析所述多肽的結(jié)構(gòu)，以鑒定特定"靶"位點(diǎn)的潛在基因序列的誘變，這基于對(duì)所述靶結(jié)構(gòu)域在毒素作用模式中的所提議功能的考慮；將一個(gè)或多個(gè)突變引入核酸序列以產(chǎn)生對(duì)所編碼多肽序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的所需改變；以及分析所產(chǎn)生多肽的殺蟲(chóng)活性。價(jià)殺昆蟲(chóng)毒素中的許多都是相關(guān)的，其氨基酸序列和三級(jí)結(jié)構(gòu)的相似程度各不相同，并且公知獲得份毒蛋白晶體結(jié)構(gòu)的方法。從文獻(xiàn)可獲得示例性的CVy3J和Oy35多肽兩者的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)解析。解析到的Oj^4基因結(jié)構(gòu)(Li&(1991)A^m/re353:815-821)提供了對(duì)該毒素結(jié)構(gòu)與功能間關(guān)系的深刻理解。組合考慮價(jià)毒素的已公開(kāi)的結(jié)構(gòu)分析和所報(bào)道的與特定結(jié)構(gòu)、基序等等相關(guān)的功能，說(shuō)明該毒素的特定區(qū)域與該蛋白的特定功能和特定作用模式的不連續(xù)步驟相關(guān)。例如，通常將分離自?xún)r(jià)的許多毒素描述為包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域涉及孔形成的7螺旋束、涉及受體結(jié)合的3片層結(jié)構(gòu)域和(3三明治基序(Li(1991)胸群353:815-821)。如美國(guó)專(zhuān)利第7,105,332號(hào)和2003年12月24日提交的未決美國(guó)申請(qǐng)第10/746,914號(hào)所報(bào)道，可以通過(guò)將位于該毒素結(jié)構(gòu)域1的a螺旋3和4之間的區(qū)域作為靶標(biāo)，來(lái)改良Cry蛋白的毒性。這一理論建立于關(guān)于殺昆蟲(chóng)毒素的知識(shí)體系，包括l)據(jù)報(bào)道CVy3J毒素結(jié)構(gòu)域1的a螺旋4和5插入內(nèi)襯易感昆蟲(chóng)中腸的細(xì)胞的脂雙分子層Gazitefa/.(1998)尸簡(jiǎn).淑/.^c^/.5W.USA95:12289-12294);2)發(fā)明人了解野生型蛋白氨基酸序列內(nèi)胰蛋白酶和糜蛋白酶切割位點(diǎn)的位置；3)觀(guān)察到在借助胰蛋白酶或糜蛋白酶處理的體外活化之后，野生型蛋白對(duì)某些昆蟲(chóng)更具活性；以及4)報(bào)道從3，端消化毒素導(dǎo)致了對(duì)昆蟲(chóng)毒性的降低?？梢灾苽湟幌盗型蛔?，并將其置于各種背景序列中，從而制備具有增強(qiáng)的或者改變的殺蟲(chóng)活性的新的多肽。參見(jiàn)，例如，如今已放棄的、2003年6月25日提交的美國(guó)申請(qǐng)第10/606,320號(hào)以及2003年12月24日提交的第10/746,914號(hào)。這些突變體包括但不限于在位于結(jié)構(gòu)域1的螺旋3和4之間的區(qū)域另外添加至少一個(gè)蛋白酶敏感的位點(diǎn)(例如胰蛋白酶切割位點(diǎn))；用不同蛋白酶敏感的位點(diǎn)替換野生型序列的原始蛋白酶敏感的位點(diǎn)；在特定位置添加多蛋白酶敏感位點(diǎn)；在一個(gè)或多個(gè)蛋白酶敏感的位點(diǎn)附近添加氨基酸殘基，從而改變所述多肽的折疊并因而增強(qiáng)在該一個(gè)或多個(gè)蛋白酶敏感的位點(diǎn)處的多肽消化；和添加突變以保護(hù)該多肽免受使毒性降低的降解性消化(例如，制備一系列突變，其中用纈氨酸替換野生型氨基酸以保護(hù)所述多肽免于消化)。可以單獨(dú)或以任意組合使用突變，從而提供實(shí)施方式的多肽。實(shí)施方式以這種方式提供包含各種突變的序列，所述突變諸如，例如包含位于所編碼多肽結(jié)構(gòu)域1的a螺旋3和4之間的另外的或可選擇的蛋白酶壽丈感位點(diǎn)的突變。另外的或可選擇的蛋白酶敏感位點(diǎn)的突變可以對(duì)諸如絲氨酸蛋白酶的數(shù)種蛋白酶或者諸如彈性蛋白酶的酶敏感，所述絲氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶和糜蛋白酶。因而，另外的或者可選擇的蛋白酶敏感位點(diǎn)的突變可以經(jīng)設(shè)計(jì)以致該位點(diǎn)被蛋白酶類(lèi)容易地識(shí)別和/或切割，所述蛋白酶諸如哺乳動(dòng)物蛋白酶或昆蟲(chóng)蛋白酶。還可以將蛋白酶敏感的位點(diǎn)設(shè)計(jì)為被已知產(chǎn)生于生物體的特定種類(lèi)的酶或特定酶切割，所述酶諸如，例如棉鈴蟲(chóng)//e/z'o^'szea產(chǎn)生的糜蛋白酶(Lenzd(1991)Jrc/z.尸/z;as7'o/.16:201-212)。突變還可以賦予對(duì)蛋白水解消化的抗性，例如對(duì)糜蛋白酶在所述肽的C末端的消化的抗性。所編碼多肽的氨基酸序列存在另外的和/或可選擇的蛋白酶敏感位點(diǎn)，這可以提高實(shí)施方式的核酸編碼的多肽的殺蟲(chóng)活性和/或殺蟲(chóng)特異性。因此，實(shí)施方式的核苷酸序列可以被重組工程化或者被操作以產(chǎn)生具有改良的或改變的殺蟲(chóng)活性和/或特異性的多肽，所述改良或改變相對(duì)于未經(jīng)修飾的野生型毒蛋白。另外，本文公開(kāi)的突變可以被置于其它核苦酸序列或與其它核苷酸序列聯(lián)用，從而提供改良的性質(zhì)。例如，昆蟲(chóng)糜蛋白酶容易切割的蛋白酶敏感位點(diǎn)可以被置于Oj背景序列，以提供針對(duì)該序列的改良的毒性，所述昆蟲(chóng)糜蛋白酶例如在花邊粘蟲(chóng)(berthaarmyworm)或棉鈴蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)的糜蛋白酶(HegedusWa/.(2003)Ac/z./騰"所oc/e附.戶(hù)—W.53:30-47;和Lenza/.(1991)Ac/z./騰"所oc/2綴尸—/o/.16:201-212)。實(shí)施方式以這種方式提供具有改良性質(zhì)的毒性多肽。例如，突變的Oy核苷酸序列可以包含另外的突變體，所述突變體包含將第二胰蛋白酶敏感的氨基酸序列(除開(kāi)天然存在的胰蛋白酶位點(diǎn))引入所編碼多肽的另外的密碼子。實(shí)施方式的可選擇的添加突變體包含另外的密碼子，所述密碼子經(jīng)設(shè)計(jì)以將至少一個(gè)另外的不同的蛋白酶敏感的位點(diǎn)引入該多肽，例如，緊靠天然存在的胰蛋白酶位點(diǎn)5，或3'的糜蛋白酶敏感的位點(diǎn)。可選擇地，可以制備取代突變體，其中石皮壞編碼天然存在的蛋白酶敏感位點(diǎn)的核酸的至少一個(gè)密碼子，并且將可選擇的密碼子引入核酸序列，從而提供不同的(例如取代的)蛋白酶敏感的位點(diǎn)。還可以將替換突變體添加至CV少序列，其中破壞所編碼多肽中存在的天然存在的胰蛋白酶切割位點(diǎn)，并且將糜蛋白酶或彈性蛋白酶切割位點(diǎn)引入它的位置。認(rèn)識(shí)到可以使用編碼蛋白水解位點(diǎn)或推定的蛋白水解位點(diǎn)(例如諸如NGSR、RR或LKM的序列)氨基酸序列的任何核苷酸序列，并且用于將這些切割位點(diǎn)中的任何位點(diǎn)引入變體多肽的密碼子的確切身份可以根據(jù)用途而不同，所述用途即在特定植物物種中的表達(dá)。還認(rèn)識(shí)到所公開(kāi)突變中的任何突變可以被引入實(shí)施方式的任一多核苷酸序列，所述序列包含提供天然胰蛋白酶切割位點(diǎn)的氨基酸殘基的密碼子，所述切割位點(diǎn)是修飾的靶標(biāo)。因此，可以修飾全長(zhǎng)毒豪或其片段的變體，以包含另外的或可選擇的切割位點(diǎn)，并且這些實(shí)施方式意在為本文公開(kāi)的實(shí)施方式的范圍所包括。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，只要所編碼多肽保留殺蟲(chóng)活性，任何有用的突變可以被添加至實(shí)施方式的序列。因而，也可以突變序列，以致所編碼多肽對(duì)糜蛋白酶的蛋白水解消化具有抗性?？梢砸匀魏谓M合在特定位置添加超過(guò)一個(gè)的識(shí)別位點(diǎn)，并且可以向所述毒素添加或從所述毒素移除多識(shí)別位點(diǎn)。因而，另外的突變可以包括3個(gè)、4個(gè)或更多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。將認(rèn)識(shí)到可以在任一合適的多核苷酸序列中工程化多突變；因此，可以^f奮飾全長(zhǎng)序列或其片段，以包^^另外的或可選擇的切割位點(diǎn)以及對(duì)蛋白水解消化具有抗性。如此，實(shí)施方式提供包含突變的CV少毒素，所述突變改善殺蟲(chóng)活性，實(shí)施方式還提供改良的組合物以及使用其它Bt毒素影響害蟲(chóng)的方法。突變可以保護(hù)該多肽免于蛋白酶降解，所述保護(hù)例如是通過(guò)從不同區(qū)域移除諸如推定的絲氨酸蛋白酶位點(diǎn)和彈性蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的推定的蛋白水解位點(diǎn)?？梢砸瞥蚋脑爝@些推定位點(diǎn)的一些或全部，以致原始位點(diǎn)位置的蛋白水解被降低?？梢酝ㄟ^(guò)比較突變體多肽和野生型毒素或者通過(guò)比較氨基酸序列各不相同的突變體毒素，來(lái)評(píng)價(jià)蛋白水解的變化。蛋白水解位點(diǎn)和推定的蛋白水解位點(diǎn)包括但不限于以下序列RR,胰蛋白酶切割位點(diǎn)；LKM,糜蛋白酶位點(diǎn)；和NGSR，胰蛋白酶位點(diǎn)。只要所述多肽的殺蟲(chóng)活性被提高，可以通過(guò)添加或缺失任意數(shù)目和種類(lèi)的氛基酸殘基來(lái)改造這些位點(diǎn)。因而，相對(duì)于天然序列或背景序列，由包含突變的核苷酸序列編碼的多肽將包含至少一個(gè)氨基酸改變或添加，或者2，3，4,5，6,7，8,9，10，11，12,13，14,15,16,17，18，19,20,21,22,23,24，25，26，27,28,29,30，32，35，38,40,45，4750,60，70，80，90,100，110，120，130，140,150，160，170，180，190，200，210，220，230，240,250,260，270或280或更多個(gè)氨基酸改變或添加。如本領(lǐng)域所知，還可以通過(guò)截短天然或全長(zhǎng)序列來(lái)提高多肽的殺蟲(chóng)活性。實(shí)施方式的組合物包括核酸及其片段和其變體，其編碼殺蟲(chóng)多肽。特別地，實(shí)施方式提供分離的核酸分子，所述核酸分子包含編碼SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列，或者包含編碼所述氨基酸序列的核苷酸序列，例如SEQIDNO:l所示的核香酸序列，及其片段和其變體。另外受到關(guān)注的是編碼實(shí)施方式的殺蟲(chóng)蛋白的優(yōu)化核芬酸序列。如本文所用，短語(yǔ)"優(yōu)化核苷酸序列"指為在特定生物體表達(dá)而優(yōu)化的核酸，所述特定生物體例如是植物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知方法制備用于任何目的生物體的優(yōu)化核香酸序列。參見(jiàn)，例如，如今已放棄的、2003年6月25日提交的美國(guó)申請(qǐng)第10/606,320號(hào)以及2003年12月24日4是交的第10/746,914號(hào)，它們描述了編碼所公開(kāi)殺蟲(chóng)蛋白的優(yōu)化核苷酸序列。在本實(shí)施例中，所述核苷酸序列的制備是通過(guò)反向翻譯蛋白的氨基酸序列，并改變核苷酸序列以致包含玉米偏好密碼子但仍編碼相同的氨基酸序列。該方法的更多細(xì)節(jié)描述于MurrayWa/.(1989)M/c/e/c^c/^s17:477-498。優(yōu)化核苷酸序列可用于提高殺蟲(chóng)蛋白在植物中的表達(dá)，所述植物例如禾本科(Gramineae)(Poaceae)單子葉植物，例如玉米(maize或corn)植物。實(shí)施方式還提供分離的殺蟲(chóng)(例如殺昆蟲(chóng))多肽，其由實(shí)施方式的天然存在的或修飾的核酸所編碼。更為具體地，實(shí)施方式提供包括SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽，以及本文所述核酸編碼的多肽，本文所述核酸例如SEQIDNO:l所示的核酸，及其片萃殳和其變體。在特定實(shí)施方式中，實(shí)施方式的殺蟲(chóng)蛋白提供全長(zhǎng)殺昆蟲(chóng)多肽、全長(zhǎng)殺昆蟲(chóng)多肽的片段以及由突變核酸產(chǎn)生的變體多肽，所述突變核酸經(jīng)設(shè)計(jì)將特定氨基酸序列引入實(shí)施方式的多肽。在特定實(shí)施方式中，被引入所述多肽的氨基酸序列包括提供諸如蛋白酶的酶的切割位點(diǎn)的序列。本領(lǐng)域已知份毒素的殺蟲(chóng)活性通常通過(guò)各種蛋白酶在昆蟲(chóng)腸內(nèi)對(duì)所述肽的切割^t活化。因?yàn)殡脑诶ハx(chóng)腸內(nèi)不總是以全效切割，所以全長(zhǎng)毒素的片段相對(duì)于全長(zhǎng)毒素自身可以具有增強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性。因而，實(shí)施方式的多肽中的一些包括全長(zhǎng)殺昆蟲(chóng)多肽的片段，并且多肽片段、變異體和突變中的一些將相對(duì)于其衍生自的天然存在的殺昆蟲(chóng)多肽的活性，具有增強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性，特別是如果天然存在的殺昆蟲(chóng)多肽在篩選活性前未用蛋白酶進(jìn)行體外活化。因而，本申請(qǐng)包括所述序列的截短形式或片段?？梢詫⑼蛔冎萌氚ㄋ霰唤囟潭嚯牡娜我槐尘靶蛄校灰龆嚯谋Ａ魵⑾x(chóng)活性。使用本領(lǐng)域已知的分析或本文他處描述的分析，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地比較兩種或更多種蛋白的殺蟲(chóng)活性。將理解實(shí)施方式的多肽可以通過(guò)表達(dá)本文所公開(kāi)的核酸或通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)而產(chǎn)生。認(rèn)識(shí)到所述殺蟲(chóng)蛋白可以是寡聚的并且會(huì)在分子量、殘基數(shù)目、組分多肽、抗特定害蟲(chóng)活性以及其它特性上各不相同。然而，通過(guò)本文所述方法，可以分離并表征對(duì)各種害蟲(chóng)有活性的蛋白。實(shí)施方式的殺蟲(chóng)蛋白可以與其它價(jià)毒素或其它殺昆蟲(chóng)蛋白組合使用，從而提高靶昆蟲(chóng)范圍。此外，實(shí)施方式的殺蟲(chóng)蛋白與其它份毒素或不同性質(zhì)的其它殺昆蟲(chóng)劑包括蛋白酶抑制劑(絲氨酸和半胱氨酸類(lèi)型)、a淀粉酶以及過(guò)氧化物酶。實(shí)施方式還包括核苷酸及其編碼的氨基酸序列和多肽的片段和變體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"片段"指實(shí)施方式的多核香酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以編碼蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相應(yīng)全長(zhǎng)蛋白的生物學(xué)活性，并因而具有殺蟲(chóng)活性。因而，已知實(shí)施方式的多核苦酸和氨基酸序列中的一些可以正確地稱(chēng)為片段和突變體。應(yīng)理解如術(shù)語(yǔ)"片段"用于提及實(shí)施方式的核酸序列時(shí)，該術(shù)語(yǔ)還包括可用作雜交探針的序列。這類(lèi)核普酸序列通常不編碼保留生物學(xué)活性的片段蛋白。因而，核香酸序列的片段的范圍可以從至少約20個(gè)核苷酸，約50個(gè)核香酸，約IOO個(gè)核香酸到編碼實(shí)施方式的蛋白的全長(zhǎng)核香酸序列。編碼實(shí)施方式的殺蟲(chóng)蛋白生物學(xué)活性部分的實(shí)施方式的核普酸序列片段將編碼至少15，25,30，50,100,200，300，400,500,600，700，800900，l，OOO,I，IOO或1,200個(gè)連續(xù)的氨基酸，或者編碼多達(dá)實(shí)施方式的殺蟲(chóng)多肽中存在的全部數(shù)量的氨基酸(例如SEQIDN0:2的670個(gè)氨基酸)。因而，應(yīng)理解實(shí)施方式還包括多肽，所述多肽是實(shí)施方式的示例性殺蟲(chóng)蛋白的片段并且具有至少長(zhǎng)15，25,30,50,100,200，300,400,500，600，700，800,900，l，OOO，1,100或1,200個(gè)連續(xù)氨基酸或者多達(dá)實(shí)施方式的殺蟲(chóng)多肽中存在的全部數(shù)量的氨基酸?？梢杂米麟s交探針或PCR引物的實(shí)施方式的核苷酸序列片段通常不需要編碼殺蟲(chóng)蛋白的生物學(xué)活性部分。因而，實(shí)施方式的核酸片段可以編碼殺蟲(chóng)蛋白的生物學(xué)活性部分，或者它可以是能夠用作使用本文所公開(kāi)方法的雜交探針或PCR引物的片段。殺蟲(chóng)蛋白的生物學(xué)活性部分的制備可以通過(guò)分離實(shí)施方式的核苷酸序列中的一種的一部分，表達(dá)殺蟲(chóng)蛋白的所編碼部分(例如通過(guò)體外重組表達(dá))，和分析所述殺蟲(chóng)蛋白所編碼部分的活性。作為實(shí)施方式核香酸序列片段的核酸包括至少16,20，50，75，100,150，200，250，300，350，400，450,500，600，700，800,1,000,1,200，1,400，1,600，1,800或2，000個(gè)核苷酸，或者多達(dá)本文^^開(kāi)的核苷酸序列中所存在數(shù)量的核苷酸(例如SEQIDNO:l的2013個(gè)核芬酸)。特定實(shí)施方式涉及衍生自(例如產(chǎn)生自)實(shí)施方式的第一核酸的片段，其中所述片段編碼以殺蟲(chóng)活性為特征的截短的毒素。實(shí)施方式的多核苷酸片段所編碼的截短的多肽的特征在于等價(jià)或改良的殺蟲(chóng)活性，所述等價(jià)或改良是相對(duì)于該片段衍生自的第一核酸所編碼的相應(yīng)全長(zhǎng)多肽的活性。所涉及的是實(shí)施方式的該核酸片段可以在天然或相應(yīng)全長(zhǎng)編碼序列的3，端被截短。核酸片段還可以在天然或相應(yīng)全長(zhǎng)編碼序列的5'和3，端均被截短。本文所用術(shù)語(yǔ)"變體"指基本上相似的序列。對(duì)于核苷酸序列，保守變體包括由于遺傳密碼子筒并性而編碼實(shí)施方式的殺蟲(chóng)多肽中的一種的氨基酸序列的那些序列。諸如這些的天然存在的等位基因變體可以使用公知的分子生物學(xué)技術(shù)鑒定，所述技術(shù)諸如，例如本文所列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和雜交技術(shù)。變體核苷酸序列還包括合成衍生的核苷酸序列，諸如使用例如位點(diǎn)定向誘變而產(chǎn)生的仍編碼實(shí)施方式的殺蟲(chóng)蛋白的那些，諸如突變體毒素。一般來(lái)講，實(shí)施方式的特定核苷酸序列的變體將與該特定核苷酸序列具有至少約70%，75%,80°/。，85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%，92%，93%，94%,95%，96%，97°/。，98%，99%或更高的序列一致性,一致性的確定是通過(guò)本文他處所述的序列比對(duì)程序，所述程序使用默認(rèn)參數(shù)。實(shí)施方式的核苷酸序列變體與該序列的差異可以少至1-15個(gè)核苷酸、少至1-10個(gè)(例如6-10個(gè))，少至5個(gè)，少至4,3，2或甚至1個(gè)核普酸。可以通過(guò)比較變體核苷酸序列所編碼多肽和該參考核苷酸序列所編碼多肽的序列一致性百分比。因而，例如，公開(kāi)了編碼與SEQIDNO:2的多肽具有給定序列一致性百分比的多肽的分離的核酸?？梢允褂帽疚乃幩鲂蛄斜葘?duì)程序計(jì)算任兩個(gè)多肽之間的序列一致性百分比，所述程序使用默認(rèn)參數(shù)。如果通過(guò)比較實(shí)施方式的任意給定對(duì)多核苦酸所編碼的兩個(gè)多肽所享有的序列一致性百分比，來(lái)評(píng)價(jià)所述任意給定對(duì)，那么該兩個(gè)所編碼多肽之間的序列一致性百分比為至少約40%,45%,50%,55%,60%，65%,70%,—般至少約75%,80%，85%,至少約90%，91%，92%，93%,94%,95%,96%，97%,或者至少約98%，99%或更高的序列一致性。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"變體蛋白"包括衍生自天然蛋白的多肽，所述衍生是通過(guò)缺失(所謂的截短)天然蛋白N末端和/或C末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸或?qū)⒁粋€(gè)或多個(gè)氨基酸添加至所述天然蛋白的N末端和/或C末端；在天然蛋白的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸；或者在天然蛋白的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸。因而，術(shù)語(yǔ)"變體蛋白"包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天熱蛋白生物學(xué)活性，即具有殺蟲(chóng)活性的足夠數(shù)目的連續(xù)氨基酸殘基。這樣的殺蟲(chóng)活性相對(duì)天然蛋白可以是不同的或者是改良的，或者它可以是不變的，只要保留了殺蟲(chóng)活性。實(shí)施方式包括的變體蛋白具有生物學(xué)活性，即它們繼續(xù)具有天然蛋白的所需的生物學(xué)活性，所述活性即本文所述的殺蟲(chóng)活性。所述變體可以得自例如基因多態(tài)性或人類(lèi)的操作。實(shí)施方式的天然殺蟲(chóng)蛋白的生物學(xué)活性變體將與天然蛋白氨基酸序列具有至少約60%,65%,70%,75%,80%,85%,86%,87%，88%,89%,9()o/o，91%，92%，93%,94%95%，96%,97%,98%,99°/?；蚋叩男蛄幸恢滦?，一致性的確定是通過(guò)本文他處描述的序列比對(duì)程序，所述程序使用默認(rèn)參數(shù)。實(shí)施方式的蛋白的生物學(xué)活性變體與該蛋白的差異可以少至1-15個(gè)氨基酸殘基、少至1-10個(gè)(例如6-10個(gè))，少至5個(gè)，少至4,3,2或甚至1個(gè)氨基酸殘基。實(shí)施方式還包括轉(zhuǎn)化的微生物，所述轉(zhuǎn)化使用至少一種實(shí)施方式的核酸、包含所述核酸的表達(dá)盒或者包含所述表達(dá)盒的載體。在一些實(shí)施方式中，所述微生物是依靠植物增殖的微生物。本發(fā)明的實(shí)施方式涉及封裝的殺蟲(chóng)蛋白，所述蛋白包括能夠表達(dá)至少一種實(shí)施方式的殺蟲(chóng)蛋白的轉(zhuǎn)化的微生物。實(shí)施方式提供殺蟲(chóng)組合物，包括實(shí)施方式的轉(zhuǎn)化的微生物。在該實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)化的微生物通常以殺蟲(chóng)有效量與適當(dāng)?shù)妮d體共同存在于所述殺蟲(chóng)組合物中。實(shí)施方式還包括殺蟲(chóng)組合物，所述組合物包括殺昆蟲(chóng)有效量的實(shí)施方式的分離的蛋白，以及適當(dāng)?shù)妮d體，所述的封裝的殺蟲(chóng)蛋白組合。實(shí)施方式還提供使用實(shí)施方式的殺蟲(chóng)蛋白與至少一種其它的或"第二"殺蟲(chóng)蛋白的組合，來(lái)增加昆蟲(chóng)靶范圍的方法?？梢詫⒈绢I(lǐng)域已知的任意殺蟲(chóng)蛋白用于實(shí)施方式的方法。所述殺蟲(chóng)蛋白包括但不限于價(jià)毒素、蛋白酶抑制劑、a淀粉酶以及過(guò)氧化物酶。23實(shí)施方式還包括轉(zhuǎn)化的植物或轉(zhuǎn)基因植物，其包含至少一種實(shí)施方式的核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，使用核苷酸構(gòu)建體穩(wěn)定地構(gòu)建植物，所述構(gòu)建體包含與在植物細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子可操作地連接的至少一種實(shí)施方式的核苷酸序列。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化的植物"和"轉(zhuǎn)基因植物"表示基因組內(nèi)包含異源多核苷酸的植物。一般來(lái)說(shuō)，所述異源多核苷酸在轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)化的植物的基因組內(nèi)穩(wěn)定地整合，以致將所述多核苷酸傳遞給后代。可以將所述異源多核苷酸單獨(dú)地或作為重組表達(dá)盒的一部分整合進(jìn)基因組。應(yīng)理解如本文所用，術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)基因的"包括基因型已通過(guò)異源核酸的存在而被改變的任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或者植物，包括最初如此改變的那些轉(zhuǎn)基因，以及通過(guò)有性雜交或無(wú)性繁殖從所述最初的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的那些。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)基因的"不包括借助常規(guī)植物育種方法或者借助天然發(fā)生的事件對(duì)基因組(染色體或染色體外)的改變，所述天然發(fā)生的事件諸如隨機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或者自發(fā)突變。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"植物"包括整體植物、植物器官(例如葉、莖、根等等)、種子、植物細(xì)胞及其子代。轉(zhuǎn)基因植物的部分屬于實(shí)施方式的范圍，包括，例如，源于轉(zhuǎn)基因植物或其子代并因而至少部分由轉(zhuǎn)基因細(xì)胞組成的植物細(xì)胞、原生質(zhì)體、組織、愈傷組織、胚胎以及花、莖、果實(shí)、葉以及根，所述轉(zhuǎn)基因植物先用實(shí)施方式的DNA分子轉(zhuǎn)化。如本文所用，術(shù)語(yǔ)植物包括植物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、可以再生出植物的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物團(tuán)塊和植物細(xì)胞，其為完整的植物或者植物的部分，諸如胚胎，花粉，胚珠，種子，葉，花，枝，果實(shí)，果仁，穗，穗軸，殼，秸稈，根，根尖，花藥等等?？梢杂糜趯?shí)施方式的方法的植物種類(lèi)通常與適于轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物種類(lèi)一樣寬泛，包括單子葉植物和雙子葉植物兩者。所述植物包括例^口馬鈴薯(^So/awwmfw6eraswm)和玉米(Ze(3majAs)。雖然實(shí)施方式不依賴(lài)特定生物學(xué)機(jī)制來(lái)增加植物對(duì)植物害蟲(chóng)的抗式的殺蟲(chóng)蛋白以及提高所述植物對(duì)植物害蟲(chóng)的抗性。實(shí)施方式的植物可以用于農(nóng)業(yè)上影響蟲(chóng)害的方法。某些實(shí)施方式提供轉(zhuǎn)化的農(nóng)作物植物，諸如例如玉米植物，其可以用于影響該植物的蟲(chóng)害的方法，所述蟲(chóng)害諸如例如歐洲玉米螟。"受試植物或植物細(xì)胞"是對(duì)目的基因的諸如轉(zhuǎn)化的遺傳改造已經(jīng)生效的植物或植物細(xì)胞，或者是傳自如此改造的植物或細(xì)胞并且包含所述改造的植物或植物細(xì)胞。"對(duì)照"或"對(duì)照植物"或"對(duì)照植物細(xì)胞"提供用于測(cè)量受試植物或植物細(xì)胞表型改變的參考點(diǎn)。對(duì)照植物或才直物細(xì)胞可以包括，例如O)野生型植物或細(xì)胞，即與遺傳改造起始材料具有相同基因型的植物或細(xì)胞，所述遺傳改造產(chǎn)生受試植物或細(xì)胞；(b)與所述起始材料具有相同基因型但已用空構(gòu)建體(即用對(duì)目的性狀無(wú)已知效果的構(gòu)建體，諸如包含標(biāo)志物基因的構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞；(c)是受試植物或植物細(xì)胞的非轉(zhuǎn)化分離子的植物或植物細(xì)胞；(d)與所述受試植物或植物細(xì)胞在遺傳上一致但未暴露于會(huì)誘導(dǎo)目的基因表達(dá)的條件或刺激物的植物或植物細(xì)胞；或(e)受試植物或植物細(xì)胞自身，其處于目的基因不被表達(dá)的條件下。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易地認(rèn)同，諸如位點(diǎn)特異性誘變和隨機(jī)誘變、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法和蛋白工程化技術(shù)的分子生物學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)步提供了廣泛的適當(dāng)?shù)墓ぞ吆筒僮鞑襟E，以用于改造或者工程化農(nóng)業(yè)上感興趣的蛋白的氨基酸序列和潛在的基因序列。因而，實(shí)施方式的蛋白可以以各種方式被改造，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于所述操作的方法為本領(lǐng)域所公知。例如，可以通過(guò)將突變引入合成核酸(例如DNA分子)制備殺蟲(chóng)蛋白的氨基酸序列變體。用于i秀變和核酸改變的方法為本領(lǐng)域所^知。例如，可以使用寡核苷酸介導(dǎo)的位點(diǎn)定向誘變技術(shù)，引入經(jīng)設(shè)計(jì)的改變。參見(jiàn)，例如Kunkel(1985)iVoc.A^/.82:488-492;Kunkeletal.(1987)MeAoA五"z;wo/.154:367-382;美國(guó)專(zhuān)利第4,873,192號(hào)；WalkerandGaastra,eds.(1983)rec/zm々wesz'wMo/ecw/arWo/ogy(分子生物學(xué)技術(shù))(MacMillanPublishingCompany,NewYork),以及本文所引用的文獻(xiàn)?？梢孕揎棇?shí)施方式的突變的核芬酸序列，從而改變約1,2，3,4,5,6，8，10，12或更多個(gè)存在于所編碼多肽一級(jí)序列的氨基酸?？蛇x擇地，可以引入更多的對(duì)天然序列的改變，以致所編碼蛋白可以具有至少約1%或2%,或者約3%,4%，5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%，12%,或者約13%，14%，15%,16%,17%，18%,19%，或20%,21%，22%,23%，24%或25%,30%，35%，或40%或更多的相對(duì)于^f應(yīng)的野生型蛋白而改變或者另外修飾的密碼子。以同樣的方式，所編碼蛋白可以具有至少約1%或2%，或者約3%，4%，5%,6%，7°/。，8%，9%,10。/。，11%,12%,或者約13%，14%，15%,16%，17%，18%，19%，或20%，21%，22%，23%，24%,或25°/。，30%,35%，或40%或更多的相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型蛋白而添加的密碼子。應(yīng)理解，實(shí)施方式的突變的核苷酸序列意在包括具有殺蟲(chóng)活性的生物學(xué)功能的、等同的肽，所述殺蟲(chóng)活性諸如改良的殺蟲(chóng)活性，其通過(guò)抗秋粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)的拒食素性質(zhì)來(lái)確定。所述序列的出現(xiàn)可以是因?yàn)槊艽a子冗余性和功能性等同，已知其天然地存在在核酸序列和如此編碼的蛋白內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到氨基酸添加和/或取代通?；诎被醾?cè)鏈取代基的相對(duì)相似性，例如，所述取代基的疏水性、電荷、大小等等。具有各種前述所考慮性質(zhì)的示例性氨基酸取代基團(tuán)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，并且包括精氨酸與賴(lài)氨酸；谷氨酸和天門(mén)冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。關(guān)于不影響目的蛋白生物學(xué)活性的適當(dāng)氨基酸取代的指南可以在Dayhoff(1978)^Wowo/iVo&z'"nSe《wewceaw<i5VrM"M尸e(蛋白序歹寸和結(jié)構(gòu)圖集)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C)(通過(guò)引用并入本文)的模型中找到。可以進(jìn)行諸如將一個(gè)氨基酸換作具有相似性質(zhì)的另一個(gè)氨基酸的保守性取代。形式兩者。同樣地，實(shí)施方式的蛋白包括天然存在的蛋白及其變體(例如截短的多肽)和其經(jīng)修飾的(例如突變體)形式。所述變體將繼續(xù)具有所需殺蟲(chóng)活性。顯然，將在編碼所述變體的核普酸序列中產(chǎn)生的突變絕不能使所述序列不符合讀框，并且所述突變通常不會(huì)產(chǎn)生能夠產(chǎn)生mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)。參見(jiàn)，歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)/>開(kāi)文本第75,444號(hào)。本文所包括的蛋白序列的缺失、插入和取代不應(yīng)對(duì)所述蛋白的性質(zhì)產(chǎn)生劇烈改變。然而，當(dāng)在進(jìn)行取代、缺失或插入前，難以預(yù)測(cè)其確切效果時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解所述效果將通過(guò)諸如昆蟲(chóng)進(jìn)食分析的常規(guī)篩選分析來(lái)評(píng)價(jià)。參見(jiàn),例如，通過(guò)引用并入本文的Marronedo/.(1985)五cow.五幽mo/.78:290-293和CzaplaandLang(1990)/￡，.五"to,/.83:2480-2485。變體核香酸序列和蛋白還包括衍生自諸如DNA重排的誘變和重組方法的序列和蛋白。利用該方法，可以操作一個(gè)或多個(gè)不同的編碼序列，從而產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的新的殺蟲(chóng)蛋白。如此，可以從相關(guān)序列多核苷酸群產(chǎn)生重組多核苷酸文庫(kù)，所述相關(guān)序列多核苷酸包含具有基本的序列一致性的序列區(qū)域，并且可以在體內(nèi)或體外被同源重組。例如，4吏用該方法，可以在實(shí)施方式的核苷酸序列和其它已知的0_y核苷酸序列的對(duì)應(yīng)部分之間重組全長(zhǎng)編碼序列、編碼目的結(jié)構(gòu)域的序列基序或者實(shí)施方式的核苷酸序列的任意片段，從而獲得新基因，所述新基因編碼具有改良的目的性質(zhì)的蛋白。受到關(guān)注的性質(zhì)包括但不限于每單位殺蟲(chóng)蛋白的殺蟲(chóng)活性、蛋白穩(wěn)定性、對(duì)非靶物種、特別是對(duì)人類(lèi)、家畜以及表達(dá)實(shí)施方式的殺蟲(chóng)多肽的植物和微生物的毒性。實(shí)施方式不受特定重排策略的限制，除開(kāi)所述重排策略涉及至少一種實(shí)施方式的核苷酸序列或其部分。重排可以?xún)H涉及本文所7>開(kāi)的核香酸序列，或者可以另外涉及重排本領(lǐng)域已知的其它核苷酸序列。DNA重排策略為本領(lǐng)域所已知。參見(jiàn)，例如，Stemmer(1994)iVoc.A^f/.^cad5b/.UiSJ91:10747-10751;Stemmer(1994)370:389-391;CrameriWfl/.(1997)iVafwre所ofec/2.15:436-438;Mooreefa/.(1997)/Afo/.5zo/.272:336-347;Zhangef(1997)尸賜.淑/.USA94:4504-4509;Crameri"a/.(1998)淑訓(xùn)391:288-291;以及美國(guó)專(zhuān)利第5,605,793號(hào)和第5，837,458號(hào)。還可以將實(shí)施方式的核苷酸序列用于從其它生物體分離相應(yīng)的序列，所述其它生物體特別是其它細(xì)菌，更為特別地是其它芽孢桿菌菌27林。如此，可以使用諸如PCR、雜交等等的方法來(lái)鑒定這些序列，所述鑒定基于其與本文所述序列的序列同源性。基于其與本文所述完整序列或其片段的序列一致性而選擇的序列也為實(shí)施方式所包括。這些序列包括作為所公開(kāi)序列同源物的序列。術(shù)語(yǔ)"同源物"指衍生自共同祖先基因并且因物種形成而在不同物種中所發(fā)現(xiàn)的基因。對(duì)于在不同物種中發(fā)現(xiàn)的基因，如果其核苷酸序列和/或其所編碼的蛋白序列如本文他處所定義而享有基本的序列一致性，則被認(rèn)為是同源物。同源物的功能在物種間常常高度保守。在PCR方法中，可以設(shè)計(jì)用于PCR反應(yīng)的寡核苷酸引物，以/人提取自任何目的生物體的cDNA或基因組DNA擴(kuò)增相應(yīng)的DNA序列。設(shè)計(jì)PCR引物和PCR克隆的方法通常為本領(lǐng)域已知，并且^^開(kāi)于Sambrookefo/.(1989)A/o/ecw/arC7ow/"gvJ丄"6ona^or少A/awwa/(分子克隆實(shí)'瞼室手冊(cè))(2ded"ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork),下文稱(chēng)"Sambrook"。另參見(jiàn)Innisa/.,eds.(1990)尸Ci/Votoco/s:^Gw/c/etoAfeAo<isawJ^/^//c^z'omj(PCR才喿"f乍步驟方法及應(yīng)用指南)(AcademicPress,NewYork);InnisandGelfand,eds.(1995)戶(hù)C及^ra&g7^(PCR策略)(AcademicPress,NewYork);以及InnisandGelfand,eds.(1999)尸C7M4o^sM畫(huà)/(PCR方法手冊(cè))(AcademicPress,NewYork)。PCR的已知方法包括^旦不P艮于如下方法，所述方法使用成對(duì)引物、巢式引物、單特異性引物、簡(jiǎn)并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯(cuò)配引物等等。在雜交技術(shù)中，將已知核苷酸序列的全部或部分用作與其它相應(yīng)核苷酸序列選擇性雜交的探針，所述其它相應(yīng)核苷酸序列存在于來(lái)自所選生物體的已克隆基因組DNA片段或cDNA片段群(即基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù))。所述雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核香酸，并且可以用諸如32P的可檢測(cè)基團(tuán)或其它可檢測(cè)標(biāo)志物來(lái)標(biāo)記。因而，例如，可以通過(guò)標(biāo)記基于實(shí)施方式序列的合成寡核苷酸制備雜交探針。制備雜交探針和構(gòu)建cDNA及基因組文庫(kù)的方法通常為本領(lǐng)域已知，并且公開(kāi)于Sambrook。例如，可以將本文公開(kāi)的完整序列或者其一個(gè)或多個(gè)部分用作能夠與對(duì)應(yīng)序列和信使RNA特異性雜交的探針。為在各種條件下完成特異性雜交，所述探針包含獨(dú)特于實(shí)施方式序列并且通常長(zhǎng)至少約10或20個(gè)核苷酸的序列。可以^吏用所述探針，以通過(guò)PCR/人所選生物體擴(kuò)增相應(yīng)的O少序列?？梢允褂迷摷夹g(shù)，以從所需生物體分離其它編碼序列，或?qū)⒃摷夹g(shù)用作診斷分析，以確定生物體是否存在編碼序列。雜交技術(shù)包括雜交篩選所接種的DNA文庫(kù)(噬菌斑或菌落；參見(jiàn)，例如，Sambrook)?？梢栽趪?yán)緊條件下進(jìn)行所述序列的雜交。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)緊條件"或"嚴(yán)緊雜交條件"表示如下條件，即在該條件下，相對(duì)于與其它序列雜交，探針將以可檢測(cè)的更大程度(例如，背景的至少2倍、5倍或IO倍)與其靶序列雜交。嚴(yán)緊條件是序列依賴(lài)性的并且在不同環(huán)境中有所不同。通過(guò)控制雜交嚴(yán)緊性和/或控制清洗條件，可以鑒定與所述探針100%互補(bǔ)的靶序列(同源探針?lè)??？蛇x擇地，可以調(diào)節(jié)嚴(yán)緊條件，以允許一些序列錯(cuò)配，以便檢測(cè)較低的相似度(異源探針?lè)?。通常，探針長(zhǎng)度少于約1000或500個(gè)核苷酸。通常，嚴(yán)緊條件是如下的條件，即在該條件中，鹽濃度為pH7.0至8.3下，少于約1.5MNa離子，通常約0.01M至1.0MNa離子濃度(或其它鹽)，并且溫度為用于短探針(例如10到50個(gè)核苷酸)的至少約30°C，和用于長(zhǎng)探針(例如大于50個(gè)核香酸)的至少約60°C。還可以通過(guò)添加諸如曱酰胺的去穩(wěn)定劑來(lái)實(shí)現(xiàn)嚴(yán)緊條件。示例性的低嚴(yán)緊條件包括37。C下使用30%至35%的曱酰胺緩沖液、1MNaCl、1%SDS(十二烷基硫酸鈉)雜交，50。C至55。C下在lx至2xSSC(20xSSC=3.0MNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中清洗。示例性的中度嚴(yán)緊條件包括37。C下在40%至45%曱酰胺、l.OMNaCl、1。/。SDS中雜交，55。C至60。C下在0.5x至lxSSC中清洗。示例性的高嚴(yán)緊條件包括37。C下在50%曱酰胺、1MNaCl、"/oSDS中雜交，60°C至65。C下在O.lxSSC中最后清洗至少約20分鐘。任選地，清洗緩沖液可以包含約0.1%至約1。/。SDS。雜交持續(xù)時(shí)間通常少于約24小時(shí)，通常為約4小時(shí)至約12小時(shí)。特異性通常依賴(lài)雜交后的清洗，關(guān)鍵因素在于最后清洗溶液的離子強(qiáng)度和溫度。DNA-DNA雜合體的Tm(熱力學(xué)熔點(diǎn))可以近似自MeinkothandWahl(1984)顛/.腸c/ze附.138:267-284的公式Tm=81.5°C+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(%曱酰胺)-500/L;其中M是一價(jià)陽(yáng)離子的克分子濃度，。/。GC是DNA中鳥(niǎo)苷和胞嘧啶核苦酸的百分?jǐn)?shù)，"。/o曱酰胺"是雜交溶液的曱酰胺百分?jǐn)?shù)，而L是雜合體的堿基對(duì)長(zhǎng)度。Tm是(確定的離子強(qiáng)度和pH下)50%的互補(bǔ)靶序列與完全匹配的探針雜交時(shí)的溫度。通常將清洗至少進(jìn)行至達(dá)到平衡，并且達(dá)到低的雜交背景水平，諸如進(jìn)行2小時(shí)、l小時(shí)或30分鐘。每1。/。的錯(cuò)配對(duì)應(yīng)使Tm降低約1。C;因而，可以調(diào)節(jié)Tm、雜交和/或清洗條件，從而與所需一致性的序列雜交。例如，如果需要^90%一致性的序列，可以將Tm降低10。C。通常，將嚴(yán)緊條件選擇為比確定離子強(qiáng)度和pH下的特異序列及其互補(bǔ)序列的TJ氐約5。C。然而，在非常嚴(yán)緊的條件下，可以在比所述Tm低1。C、2。C、3。C或4。C下進(jìn)行雜交和/或清洗；在中度嚴(yán)緊條件下，可以在比所述Tm低6°C、7°C、8°C、9。C或10°C下進(jìn)行雜交和/或清洗；在低嚴(yán)緊條件下，可以在比所述Tm低ll。C、12°C、13°C、14°C、15。C或20。C下進(jìn)行雜交和/或清洗。使用所述公式、雜交和清洗組合物，以及所需Tm，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，實(shí)質(zhì)上描述了雜交和/或清洗溶液嚴(yán)緊性的變化。如果所需程度的錯(cuò)配導(dǎo)致低于45。C(水溶液)或32。C(曱酰胺溶液)的Tm，那么可以提高SSC濃度以致能夠使用更高的溫度。對(duì)核酸雜交的一般性指南參見(jiàn)Tijssen(1993)Za6ora/o7-_yrec/zm々MesB/oc/iem/s^yMo/ecw/orWo/ogy—場(chǎng)6nW/zaf/owiVwc/e/c/Vo6as(生化及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)一核酸探針的雜交)，PartI，Chapter2(Elsevier,NewYork);k乂及Ausubela/.，eds.(1995)Ci^rewfiVo/oco/sAfo/ecw/ar(分子生物學(xué)最新實(shí)驗(yàn)指南)，Chapter2(GreenePublishingandWiley-lnterscience，NewYork)。另見(jiàn)Sambrook。因而，實(shí)施方式包4舌分離的序列，所述分離的序列編碼實(shí)施方式的07蛋白并且在嚴(yán)緊條件下與本文公開(kāi)的CVj序列或與其片段雜交。用以下術(shù)語(yǔ)描述兩個(gè)或更多個(gè)核酸或多核普酸之間的序列關(guān)系(a)"參考序列，，，(b)"比較窗口(comparisonwindow)",(c)"序列一致性，，，(d)"序列一致性百分比"和(e)"基本一致性"。(a)如本文所用，"參考序列"是用作序列比較基礎(chǔ)的確定的序列。參考序列可以是指定序列的子集或整體；例如，作為全長(zhǎng)cDNA或基因序列的片段，或完整的cDNA或基因序列。(b)如本文所用，"比較窗口"涉及多核苷酸序列的連續(xù)且指定的片段，其中比較窗口的多核苷酸序列可以包括相比于參考序列(其不包含添加或缺失)的添加或缺失(即間隔)，以對(duì)兩個(gè)序列進(jìn)行最適比對(duì)。通常，比較窗口長(zhǎng)至少20個(gè)連續(xù)核苷酸，并且4壬選地可以長(zhǎng)30，40,50,100或更長(zhǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，為避免由多核苷酸序列包含間隔而造成的與參考序列的高相似性，通常引入間隔罰分，并將其從匹配數(shù)中減去。用于比較序列的比對(duì)方法為本領(lǐng)域已知。因而，可以使用數(shù)學(xué)算法完成對(duì)任意兩序列之間序列一致性百分比的確定。所述數(shù)學(xué)算法的非限制性實(shí)例為Myers和Miller(1988)CAB/OS4:11-17的算法；Smith"a/.(1981)Jdv.Ma仇2:482的局部比對(duì)算法；Needleman和Wunsch(1970)乂Mo/.48:443-453的全局比對(duì)算法；Pearson和Lipman(1988)Ato/.」cad5W.85:2444-2448的局部搜索比對(duì)方法；如Karlin和Altschul(1993)/Voc.AW/.Jc^/.USA90:5873-5877所改進(jìn)的Karlin和Altschul(19卯)尸亂胸/.^cad5W.USA872264的算法?？梢岳眠@些數(shù)學(xué)算法的計(jì)算機(jī)工具，以比較序列，從而確定序列一致性。所述工具包括但不限于，PC/基因程序的CLUSTAL(可獲得自Intelligenetics，MountainView,California);ALIGN程序(2.0版)以及GCGWisconsin遺傳學(xué)軟件包(第IO版)的GAP,BESTFIT，BLAST,FASTA和TFASTA(可獲得自AccelrysInc.,9685ScrantonRoad,SanDiego,California,USA)?？梢允褂媚J(rèn)參數(shù)利用這些程序進(jìn)行比對(duì)。CLUSTAL程序詳述于Higgins"a/.(1988)73:237-244(1988);HigginsWa/.(1989)C蘊(yùn)OS5:151-153;CorpetWa/.(1988)M/c/ezc爿c/A16:10881-卯；HuangWa/.(1992)C45/OS18:155-65;以及Pearsone/a/.(1994)Me仇Mo/.所o/.24:307-331。ALIGN程序基于上述Myers和Miller(1988)的算法。使用ALIGN程序比較氨基酸序列時(shí)，可以采用PAM120權(quán)重殘基表、12的間隔長(zhǎng)度罰分以及4的間隔罰分。Altschulwa/.(1990)Mo/.所o/.215:403的BLAST程序基于上述Karlin和Altschul(1990)的算法?？梢允褂肂LASTN程序、分值=100、字長(zhǎng)=12來(lái)進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，從而獲得與編碼實(shí)施方式的蛋白的核苷酸序列同源的核芬酸序列?？梢允褂肂LASTX程序、分值=50、字長(zhǎng)=3來(lái)進(jìn)行BLAST蛋白搜索，從而獲得與實(shí)施方式的蛋白或多肽同源的氨基酸序列?？梢匀鏏ltschulWa/.(1997)A^c/ez'cJc/A25:3389所述，使用(BLAST2.0的)間隔BLAST來(lái)獲得以比較為目的的間隔比對(duì)。可選擇地，可以使用(BLAST2.0的)PSI-BLAST來(lái)進(jìn)行檢測(cè)分子間遠(yuǎn)源關(guān)系的迭代搜索。參見(jiàn)上述Altschul"a/.。使用BLAST、間隔BLAST、PSI-BLAST時(shí)，可以使用各自程序(例如，用于核普酸序列的BLASTN、用于蛋白的BLASTX)的默認(rèn)參數(shù)。參見(jiàn)萬(wàn)維網(wǎng)www.ncbi.hlm.nih.gov下的國(guó)立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站。還可以通過(guò)4企查進(jìn)行手工比對(duì)。除非另有說(shuō)明，本文提供的序列一致性/相似性值表示使用GAP第10版所獲得的值，其使用下列參數(shù)用于核苷酸序列的％—致性和%相似性，其使用50的GAP權(quán)重和3的長(zhǎng)度權(quán)重，以及nwsgapdna.cmp評(píng)分矩陣；用于氨基酸序列的％—致性和％相似性，其使用8的GAP權(quán)重和2的長(zhǎng)度權(quán)重，以及BLOSUM62評(píng)分矩陣；或者其任意等價(jià)程序。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"等價(jià)程序"指任意序列比較程序，其為所討論的任意兩個(gè)序列而生成比對(duì)，所述比對(duì)具有與GAP第10版所生成的相應(yīng)比對(duì)相同的核苷酸或氨基酸殘基匹配和相同的序列一致性百分比。GAP使用上述Needleman和Wunsch(1970)的算法，以尋找最大化匹配數(shù)且最小化間隔數(shù)的對(duì)兩條完整序列的比對(duì)。GAP考慮了所有可能的比對(duì)和間隔位置，并生成具有最大匹配堿基數(shù)和最少間隔的比對(duì)。它允許提供匹配堿基單元的間隔生成罰分和間隔延伸罰分。對(duì)于其插入的每一間隔，GAP必須利用匹配的間隔生成罰分?jǐn)?shù)。如果選擇大于0的間隔延伸罰分，則對(duì)于每一插入的間隔，GAP必須另外利用間隔長(zhǎng)度乘間隔延伸罰分。對(duì)于蛋白序列，GCGWisconsin遺傳學(xué)軟件包(第IO版)的默認(rèn)間隔生成罰分值和間隔延伸罰分值分別是8和2。對(duì)于核苷酸序列，該默認(rèn)間隔生成罰分是50，而默認(rèn)間隔延伸罰分是3。間隔生成罰分和間隔延伸罰分可以表示為選自0至200的整數(shù)。因而，例如，間隔生成罰分和間隔延伸罰分可以是O,1，2,3,4，5，6,7,8，9，10,15,20，25，30,35，40，45，50,55,60,65或更大。GAP代表最佳比對(duì)家族中的一個(gè)成員。該家族可能有許多成員，但其他成員的質(zhì)量都不如GAP。GAP顯示比對(duì)的4個(gè)^f介值數(shù)字品質(zhì)(Quality)、比率(Ratio)、一致性和相似性。品質(zhì)是為了比對(duì)序列而最大化的度量。比率是品質(zhì)除以較短片段中堿基的數(shù)目。一致性百分比是實(shí)際匹配的符號(hào)的百分比。相似性百分比是相似符號(hào)的百分比。忽略跨越間隔的符號(hào)。當(dāng)符號(hào)對(duì)的評(píng)分矩陣值大于或等于0.50(相似性閾值)時(shí)，對(duì)相似性進(jìn)行評(píng)分。GCGWisconsin遺傳學(xué)軟件包第10版所用的得分矩陣是BLOSUM62(參見(jiàn)HenikoffandHenikoff(1989)尸rac.AAaf/.爿c^/.Scz'.C/SJ89:10915)。(c)如本文所用，兩條核酸或多肽序列上下文中的"序列一致性"或"一致性"指當(dāng)在指定的比較窗口內(nèi)比對(duì)最大對(duì)應(yīng)性時(shí)，兩條序列中相同的殘基。對(duì)于蛋白，當(dāng)使用序列一致性百分比時(shí)，應(yīng)認(rèn)識(shí)到不一致的殘基位置經(jīng)常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸殘基被用于取代具有相似化學(xué)性質(zhì)(如電荷或疏水性)的其他氨基酸殘基，并因此不改變?cè)摲肿拥墓δ苄再|(zhì)。當(dāng)序列在保守取代方面不同時(shí)，可上調(diào)序列一致性百分比，以校正取代的保守特性。由這類(lèi)保守性取代而不同的序列被認(rèn)為具有"序列相似性"或"相似性"。進(jìn)行這種調(diào)整的手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。通常，這涉及將保守性取代評(píng)分為部分而不是完全的錯(cuò)配，從而提高序列一致性百分比。因此，例如，如果將一致的氨基酸的得分給定為1,而將非保守性取代的得分給定為0，則將保守性取代的得分給定為0至1。如在程序PC/GENE(Intelligenetics，MountainView,California)中所執(zhí)行的，計(jì)算保守性取代得分。(d)如本文所用，"序列一致性百分比"表示通過(guò)相對(duì)于比較窗口而比較兩條最適比對(duì)的序列而確定的值，其中，為了最適比對(duì)兩條序列，比較窗口中多核香酸序列的部分與參考序列(其不包含添加或缺失)相比，可以包含添加或缺失(即間隔)。百分比通過(guò)以下計(jì)算確定兩條序列中一致的核酸堿基或氨基酸殘基均存在的位置的數(shù)目，從而得出匹配位置的數(shù)目，用比較窗口中位置總數(shù)除匹配位置的數(shù)目，并且將結(jié)果乘以100，從而得出序列一致性百分比。(e)(i)術(shù)語(yǔ)多核苷酸序列的"基本一致性"表示多核苷酸包含利用使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的所述比對(duì)程序之一時(shí)，與參考序列具有至少70%、80%、90%或95%或更高的序列一致性的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到可以適當(dāng)?shù)卣{(diào)整這些值，以確定兩個(gè)核苷酸序列所編碼蛋白的相應(yīng)的一致性，所述確定考慮了密碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、讀框定位(readingframepositioning)等等。用于這些目的的氨基酸序列基本一致性通常表示具有至少60%、70°/。、80%、90%或95%的序列一致性或更高的序列一致性。如果兩個(gè)分子在嚴(yán)緊條件下相互雜交，也說(shuō)明核苷酸序列基本一致。通常，在確定的離子強(qiáng)度和pH下，選擇嚴(yán)緊條件，使其比特定序列的Tm低約5°C。然而，嚴(yán)緊條件包括比Tm低約1°C至20。C范圍的溫度，這取決于如本文另外所定性的所需嚴(yán)緊度。如果嚴(yán)緊條件下不相互雜交的核酸所編碼的多肽是基本一致的，所述核酸則仍是基本一致的。這可以出現(xiàn)在，例如，當(dāng)使用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡(jiǎn)并性而產(chǎn)生的核酸拷貝時(shí)。如果第一核酸編碼的多肽與第二核酸編碼的多肽具有免疫交叉反應(yīng)性，那么說(shuō)明兩個(gè)核酸序列基本一致。(e)(ii)肽上下文的術(shù)語(yǔ)"基本一致性"表示在指定的比較窗口，肽包含與參考序列具有至少70%、80%、85%、卯％、95°/?；蚋咝蛄幸恢滦缘男蛄?。使用上述Needleman和Wunsch(1970)的全局比對(duì)算法，能進(jìn)行用于這些目的的最適比對(duì)。一個(gè)肽與針對(duì)另一肽制備的抗體具有免疫反應(yīng)性，說(shuō)明兩個(gè)肽序列基本一致。因而，肽與另一肽基本一致，例如，其中該兩個(gè)肽僅因保守取代而不同。"基本相似的"肽共有如上所述的序列，除不一致的殘基位置可以因保守氨基酸改變而不同。術(shù)語(yǔ)"核苷酸構(gòu)建體"在本文的使用并非意在將實(shí)施方式限于包含DNA的核苷酸構(gòu)建體。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，核苷酸構(gòu)建體、特別是由核糖核苷酸以及核糖核苦酸和脫氧核糖核苷酸的組合所構(gòu)成的多核苷酸和寡核苷酸也可以用于本文所公開(kāi)的方法。實(shí)施方式的核苷酸構(gòu)建體、核酸和核苷酸序列另外包括所述構(gòu)建體、分子和序列的所有互補(bǔ)形式。此外，實(shí)施方式的核苷酸構(gòu)建體、核芬酸分子和核苷酸序列包括能用于實(shí)施方式的轉(zhuǎn)化植物方法的所有核苷酸構(gòu)建體、分子和序列，包括但不限于由脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及其組合所構(gòu)成的那些。所述脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成類(lèi)似物兩者。實(shí)施方式的核香酸構(gòu)建體、核酸和核苷酸序列還包括核苷酸構(gòu)建體的所有形式，包括但不限于單鏈形式、雙鏈形式、發(fā)夾、莖環(huán)結(jié)構(gòu)等等。另一實(shí)施方式涉及轉(zhuǎn)化的生物體，諸如選自植物和昆蟲(chóng)細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、桿狀病毒、原生動(dòng)物、線(xiàn)蟲(chóng)和藻的生物體。轉(zhuǎn)化的生物體包含實(shí)施方式的DNA分子、包含所述DNA分子的表達(dá)盒或包含所述表達(dá)盒的載體，其可以穩(wěn)定地整合進(jìn)所轉(zhuǎn)化生物體的基因組。在DNA構(gòu)建體中提供實(shí)施方式的序列，所述構(gòu)建體用于在目的生物體中表達(dá)。所述構(gòu)建體包括與實(shí)施方式的序列可操作連接的5，和3，調(diào)節(jié)性序列。本文所用術(shù)語(yǔ)"可操作連接"表示啟動(dòng)子和另一序列之間的功能性連接，其中所述啟動(dòng)子序列起始并介導(dǎo)對(duì)應(yīng)于所述另一序列的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。通常，可操作連接表示被連接的核酸序列是鄰接的，并且當(dāng)需要連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)時(shí)，是鄰接且在相同讀框內(nèi)的。所述構(gòu)建體可以另外包含至少一個(gè)被共轉(zhuǎn)化進(jìn)生物體的另外的基因?？蛇x擇地，可以在多DNA構(gòu)建體上提供另外的一個(gè)或多個(gè)基因。所述DNA構(gòu)建體具有多個(gè)用于插入Oy毒蛋白序列的限制性位點(diǎn)，所述毒蛋白序列將位于調(diào)節(jié)性區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)之下。所述DNA構(gòu)建體可以另外包含可選擇的標(biāo)志物基因。按5，到3，的轉(zhuǎn)錄方向，DNA構(gòu)建體包含轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(即啟動(dòng)子)、實(shí)施方式的DNA序列以及在用作宿主的生物體內(nèi)具有功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)(即終止區(qū))。轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(即啟動(dòng)子)相對(duì)于宿主生物體和/或?qū)嵤┓绞降男蛄?，可以是同源的、?lèi)似物的、外源的或異源的。另外，所述啟動(dòng)子可以是天然序列或者可選擇地是合成序列。本文所用術(shù)語(yǔ)"外源的"表示在導(dǎo)入啟動(dòng)子的同源生物體內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子。當(dāng)所述啟動(dòng)子相對(duì)于實(shí)施方式的序列是"外源的"或"異源的"時(shí)，意在表明該啟動(dòng)子不是實(shí)施方式中可操作連接的序列的同源的或天然存在的啟動(dòng)子。如本文所用，嵌合基因包含與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)可操作連接的編碼序列，所述轉(zhuǎn)錄起始區(qū)對(duì)于所述編碼序列是異源的。當(dāng)啟動(dòng)子是同源或天然的序列時(shí)，可操作連接的序列的表達(dá)改造自野生型表達(dá)，這導(dǎo)致表型的改變。終止區(qū)可以與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)是同源的，可以與可操作連接的目的DNA序列是同源的，可以與植物宿主是同源的，或者可以得自另一來(lái)源(即，相對(duì)于啟動(dòng)子、目的序列、植物宿主或其任一組合是外源的或異源的)。可以從根癌農(nóng)桿菌(A/wme/ac/ew)Ti質(zhì)粒獲得方便的終止區(qū)，諸如章魚(yú)堿合酶和胭脂堿合酶終止區(qū)。另見(jiàn)Guerineau"a/.(1991)Mo/.262:141-144;Proudfoot(1991)Ce〃64:671-674;Sanfacon"a/.(1991)Ge,Dev.5:141-149;Mogen"a/.(1990)尸/a"fCe〃2:1261-1272;MunroeWa/.(19卯)G騰91:151-158;Ballasaa/.(1989)7Vwc/e/c4"<isi&s.17:7891-7903;和Joshiefa/.(1987)7Vwc/ezc15:9627-9639。適當(dāng)時(shí)可以?xún)?yōu)化核酸以提高在宿主生物體中的表達(dá)。因而，如果宿主生物體是植物，可以使用植物偏好密碼子來(lái)合成合成的核酸，從而改良表達(dá)。參見(jiàn)，例如，CampbellandGowri(1990)尸/awf尸/ywo/.92:1-11,對(duì)宿主偏好密碼子使用的討論。例如，雖然在單子葉植物和雙子葉植物物種中均可以表達(dá)實(shí)施方式的核酸序列，但是可以修飾序列，以解決單子葉植物或雙子葉植物特異的密碼子偏好和GC含量偏好，這是因?yàn)檫@些偏好已經(jīng)表現(xiàn)出了差異(Murray"(1989)A^c/e/c^c/Aias.17:477-498)。因而，特定氨基酸的玉米偏好密碼子可以衍生自玉米的已知基因序列。28條玉米植物基因的玉米密碼子使用列于上文Murray"a/.的表4。本領(lǐng)域可以獲得合成植物偏好基因的方法。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利第5,380,831號(hào)和第5,436,391號(hào)，和MurrayW"/.(1989)7Vwc/e/c^c/A7仏17:477-498，其通過(guò)引用并入本文。已知另外的序列修飾來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞宿主的基因表達(dá)。這些包括清除序列，所述序列編碼假的多聚腺苷化信號(hào)、外顯子-內(nèi)含子剪接位點(diǎn)信號(hào)、轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)和可能不利于基因表達(dá)的其它良好表征的序列?？梢詫⑿蛄械腉C含量調(diào)節(jié)至給定細(xì)胞宿主的平均水平，其參考在該宿主細(xì)胞表達(dá)的已知基因而計(jì)算。本文所用術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"指包含載體且支持該表達(dá)載體復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是諸如大腸桿菌的原核細(xì)胞，或者是諸如酵母、昆蟲(chóng)、兩棲類(lèi)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞、或者單子葉植物或雙子葉植物細(xì)胞的真核細(xì)胞。單子葉植物宿主細(xì)胞的實(shí)例是玉米宿主細(xì)胞。如果可能，則^f務(wù)飾序列以避免預(yù)期的發(fā)夾mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。表達(dá)盒可以另外包含5，前導(dǎo)序列。所述前導(dǎo)序列能發(fā)揮增強(qiáng)翻譯的作用。翻譯前導(dǎo)序列為本領(lǐng)域已知并且包括小核糖核酸病毒前導(dǎo)序列，例如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎5'非編碼區(qū))(Elroy-SteinWa/.(1989)A^/.^c"d5W.園86:6126-6130);馬鈴薯Y病毒前導(dǎo)序列，例如TEV前導(dǎo)序列(煙草蝕刻病毒)(Gallie"a/.(1995)165(2):233-238)，MDMV前導(dǎo)序列(玉米矮小花葉病毒)，人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP)(Macejak"a/.(1991)Atowe353:90-94);苜?；ㄈ~病毒外殼蛋白mRNA(AMVRNA斗)的非翻譯前導(dǎo)序列(Jobling"a/.(l987)325:622-625);煙草花葉病毒前導(dǎo)序列(TMV)(GallieWa/.(1989)inMo/ecw/w所o/ogyo/iA^4(RNA的分子生物學(xué))，ed.Cech(Liss，NewYork),pp.237-256);以及玉米萎黃斑點(diǎn)病毒前導(dǎo)序歹'(MCMV)(Lommela/.(1991)Wra/ogy81:382-385)。另見(jiàn)Della-Cioppa"a/.(1987)尸/a^尸w'o/.84:965-968。在制備表達(dá)盒時(shí)，可以操作各種DNA片段以提供合適方向的和適當(dāng)時(shí)合適讀框的DNA序列。為達(dá)到這一目的，可以采用接頭或連接子來(lái)連接DNA片段，或者可以涉及其它操作來(lái)提供方便的限制性位點(diǎn)、移除多余DNA、移除限制性位點(diǎn)等等。為了這一目的，可以涉及體外誘變，引物修復(fù)，限制性，退火，再取代，例如轉(zhuǎn)換(transition)和顛換(transversion)。在實(shí)踐實(shí)施方式時(shí)可以使用大量啟動(dòng)子?？梢曰谒杞Y(jié)果選擇啟動(dòng)子?？梢允购怂崤c組成型、組織偏好型、誘導(dǎo)型或用于在宿主生物體中表達(dá)的其它啟動(dòng)子組合。用于植物宿主細(xì)胞的合適的組成型啟動(dòng)子包括，例如，Rsyn7啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子和WO99/43838及美國(guó)專(zhuān)利第6，072，050號(hào)所7>開(kāi)的其它組成型啟動(dòng)子；核心CaMV35S啟動(dòng)子(OdellM(1985)胸騰313:810-812);水稻肌動(dòng)蛋白(McElroy"a/.(1990)尸/滅CW/2:163-171);泛素(Christensenaa/.(1989)戶(hù)/a"fMo/.腸/.12:619-632andChristensenaa/.(1992)尸/"WMo/.5/o/.18:675-689);pEMU(Last"a/.(1991)2Tz匿柳/.Ge威81:581-588);MAS(Velten^a/.(1984)3:2723畫(huà)2730);ALS啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利第5,659,026號(hào))等等。其它組成型啟動(dòng)子包括，例如，公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利第5,608,149號(hào)；第5,608,144號(hào)；第5,604,121號(hào)；第5,569,597號(hào)；第5,466,785號(hào)；第5,399,680號(hào)；第5,268,463號(hào)；第5,608,142號(hào)；和第6,177,611號(hào)的那些。從誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)基因可以是有益的，這取決于所需結(jié)果。對(duì)于調(diào)節(jié)實(shí)施方式的核普酸序列在植物中的表達(dá)，傷口誘導(dǎo)型(wound-inducible)啟動(dòng)子有特別的好處。所述傷口誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以對(duì)昆蟲(chóng)取食造成的損傷產(chǎn)生反應(yīng)，并且包括馬鈴薯蛋白酶抑制劑(pinII)基因(Ryan(1990)^肌觸尸一，仇28:425-449;D腿"(1996)胸訓(xùn)14:494-498);wunl和wun2,美國(guó)專(zhuān)利第5,428,148號(hào)；winl禾口win2(Stanforda/.(1989)A/o/.Ge".215:200-208);systemin(McGurl"a/.(1992)5We"ce225:1570-1573);WIP1(Rohmeiera/.(1993)戶(hù)/"wfAfo/.B/o/.22:783-792;Eckelkamp"a/.(1993)323:73-76);MPI基因(CorderokWa/.(1994)尸/a"f/6(2):141-150);等等，其通過(guò)引用并入本文。此外，可以在實(shí)施方式的方法和核苷酸構(gòu)建體中采用病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。所述病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括來(lái)自致病相關(guān)蛋白(PR蛋白)的那些，其在受病原體感染后被誘導(dǎo)；例如，PR蛋白、SAR蛋白、p-l，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等等。參見(jiàn)，例如，RedolfiWa/.(1983)7V^A./P/aW尸w/zo/.89:245-254;Uknes"(1992)尸/""fCW/4:645-656;和VanLoon(1985)P/a"fMo/.腸/.4:111-116。另見(jiàn)WO99/43819，其通過(guò)引用并入本文。在病原體感染部位或在該部位附近局部表達(dá)的啟動(dòng)子引人注目。參見(jiàn)，侈J^口MarineauW/(1987)尸/awfAfo/.5z'o/.9:335-342;Mattonw(1989)iWo/ecw/ar尸/a^-A/z'cra6e/w&rac"ora(才直物-樣i生物的分子水平的相互作用)2:325-331;Somsisch"(1986)尸rac.淑/.JcW.83:2427-2430;SomsischWa/.(1988)Mo/.Gew.G^wW.2:93-98;和Yang(1996)尸rac.A^/.Jcad5W.93:14972-14977。另見(jiàn)ChenWa/.(1996)P/a"f10:955-966;Zhang"(1994)戶(hù)roc.A^/.Jcad5W.91:2507-2511;Warner&a/.(1993)P/a"fJ!3:191-201;Siebertz"a/.(1989)/V"mCe〃1:961-968;美國(guó)專(zhuān)利第5,750,386號(hào)(線(xiàn)蟲(chóng)誘導(dǎo)型)；并且這些參考文獻(xiàn)為本文所引用。玉米PRms基因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子特別引人注目，其表達(dá)受病原體串珠鐮刀菌CFw^Wwm附om7z/orwe)諸導(dǎo)(參見(jiàn)，例如，Cordero&a/.(1992)尸—W.Mo/.尸』尸a仇41:189-200)?？梢允褂没瘜W(xué)品調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，通過(guò)應(yīng)用外源化學(xué)調(diào)節(jié)物來(lái)調(diào)節(jié)基因在植物中的表達(dá)。依目的而定，啟動(dòng)子可以是化學(xué)品誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其中化學(xué)品的應(yīng)用誘導(dǎo)基因表達(dá)，或者化學(xué)品阻遏啟動(dòng)子，其中化學(xué)品的應(yīng)用阻遏基因表達(dá)?；瘜W(xué)品誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為本領(lǐng)域已知，并且包括，但不限于，玉米In2-2啟動(dòng)子，其為苯磺酰胺除草劑安全劑所激活，玉米GST啟動(dòng)子，其為用作萌前型除草劑的疏水親電子化合物所激活，以及煙草PR-la啟動(dòng)子，其為水楊酸所激活。其它所關(guān)注的化學(xué)品調(diào)節(jié)啟動(dòng)子包括類(lèi)固醇反應(yīng)性啟動(dòng)子(參見(jiàn)，例如，SchenaWa/.(1991)尸rac.淑/.爿caaf.5W.園88:10421-10425和McNellis"a/.(1998)尸/""f14(2):247-257中的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)以及四環(huán)素誘導(dǎo)型和四環(huán)素阻遏型啟動(dòng)子(參見(jiàn)，例如，Gatz"a/.(1991)Mo/.Ge".227:229-237和美國(guó)專(zhuān)利第5,814,618號(hào)和第5,789,156號(hào))，其通過(guò)引用并入本文。39可以利用組織偏好啟動(dòng)子將增強(qiáng)的殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)靶定在特定植物組織內(nèi)。組織偏好啟動(dòng)子包括以下所討論的那些，YamamotoWa/.(1997)尸/a"f/12(2)255-265;Kawamata"a/.(1997)尸/贈(zèng)CW/尸—。/38(7):792-803;Hansenefa/.(1997)Mo/.Ge"Ge""254(3):337-343;Russell"a/.(1997)T腦，m.c6(2):157-168;Rinehart"a/.(1996)尸/a"f^/zj^/o/.112(3):1331-1341;VanCamp<a/.(1996)尸/a"f戶(hù)/^w'o/.112(2):525國(guó)535;Canevascini"a/.(1996)P/a"f尸/y^'o/.U2(2):513-524;Yamamoto(1994)P/a"fCW/尸/^w'o/.35(5):773-778;Lam(1994)/Vo6/.Ce〃"zj^a20:181-196;Orozco"a/.(1993)尸/a"fiWo/5/o/.23(6):1129-1138;Matsuoka"(1993)尸rac淑/.爿c"d5W.園90(20):9586畫(huà)9590;和Guevara-Garcia"/.(1993)尸/awf乂4(3):495-505。如有必要，可以為弱表達(dá)^^飾這些啟動(dòng)子。葉偏好啟動(dòng)子為本領(lǐng)域已知。參見(jiàn)，例如，Yamamoto"a/.(1997)尸/a"f乂12(2):255-265;Kwon"a/.(1994)尸/a"f尸/ywo/.105:357-67;Yamamoto"a/.(1994)P/a"fCe//尸/y^z'o/.35(5):773-778;Gotorea/.(1993)尸/a"f/3:509-18;Orozcow(1993)P/a"fMo/.5zo/.23(6):1129-1138;和MatsuokaWa/.(1993)尸亂淑/.^<^.,90(20):9586-9590。根偏好或根特異性啟動(dòng)子是已知的，并且可以選自可由文獻(xiàn)獲得的許多啟動(dòng)子，或者從各種可相容物種重新分離。參見(jiàn)，例如，Hire"a/.(1992)P/"^tWo/.所o/.20(2):207-218(大豆才艮特異性谷氨酰胺合成酶基因)；KellerandBaumgartner(1991)尸taCW/3(10):1051畫(huà)1061(法國(guó)菜豆GRP1.8基因的根特異性控制元件)；Sanger"a/.(1990)尸/a"fMo/.5/o/.14(3):433-443(根癌農(nóng)桿菌甘露堿合酶(MAS)基因的根特異性啟動(dòng)子)；和MiaoWa/.(1991)尸/爐Ce〃3(1):11-22(編碼胞質(zhì)谷氨酰胺合成酶(GS)的全長(zhǎng)cDNA克隆，其在大豆根和根瘤中表達(dá))。另見(jiàn)BoguszWa/.(1990)戶(hù)/a^Ce〃2(7):633-641,其中描述了分離自血色素基因的兩種根特異性啟動(dòng)子，所述基因來(lái)自固氮的非豆科糙葉山黃麻(尸ara57om'aa"(ierso"〃)和相關(guān)的非固氮的非豆^牛山黃麻(7>ematome"tosa)。使這些基因的啟動(dòng)子與卩-葡糖苷酸酶報(bào)告基因相連，并被導(dǎo)入非豆牙牛煙草(7\^0//<3""to6acwm)和豆牙牛百月永才艮(jLofz^cor"/cw/afw力兩者，并且在兩例中均保留了根特異性啟動(dòng)子活性。Leach和Aoyagi(1991)描述了4也們對(duì)發(fā)才艮農(nóng)桿菌G4gra6acfen'w/wr/z/zoge"es)的高表達(dá)79(1):69-76)。他們的結(jié)論是增強(qiáng)子和組織偏好DNA決定子在這些啟動(dòng)子中分離。TeerieM/.(1989)使用與lacZ的基因融合，來(lái)表明編碼章魚(yú)堿合酶的農(nóng)桿菌T-DNA基因在根尖表皮尤其活躍，并且TR2，基因在完整植物中是根特異性的，且因葉組織受傷而被刺激，這是與殺昆蟲(chóng)或殺幼蟲(chóng)基因聯(lián)用所尤其需要的特征組合(參見(jiàn)五MBO/8(2):343-350)。與"^//(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II)融合的TR1，基因表現(xiàn)類(lèi)似的特征。另外的才艮偏好啟動(dòng)子包括V伍NOD-GRP3基因啟動(dòng)子(Kuster"(1995)尸teM/.廳.29(4):759-772);以及ro舊啟動(dòng)子(Capana(1994)編.脂.25(4):681國(guó)691。另見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,837,876;5,750,386;5,633,363;5,459,252;5,401,836;5,110,732;和5,023,179。"種子偏好"啟動(dòng)子包括"種子特異性"啟動(dòng)子(在種子發(fā)育中具有活性的那些啟動(dòng)子，諸如種子貯藏蛋白的啟動(dòng)子)和"種子萌發(fā)"啟動(dòng)子(在種子萌發(fā)中具有活性的那些啟動(dòng)子)兩者。參見(jiàn)Thompson"a/.(1989)所o五^《戸10:108，其通過(guò)引用并入本文。所述種子偏好啟動(dòng)子包括，但不限于，Ciml(細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)的信息)；cZ19Bl(玉米19kDa玉米蛋白)；以及milps(肌-肌醇-l-磷酸合酶)(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第6,225,529號(hào)，其通過(guò)引用并入本文)。y玉米蛋白和Glob-l是胚乳特異性啟動(dòng)子。對(duì)于雙子葉植物，種子特異性啟動(dòng)子包括但不限于，豆p-菜豆蛋白、napin、卩-伴球蛋白(卩-conglycinin)、大豆凝集素、十字花科蛋白(cmciferin)等等。對(duì)于單子葉植物，種子特異性啟動(dòng)子包括但不限于玉米15kDa玉米蛋白、22kDa玉米蛋白、27kDa玉米蛋白、g-玉米蛋白、waxy、shrunken1、shrunken2、^求蛋白1等等。另見(jiàn)WO00/12733,其中公開(kāi)了來(lái)自和基因的種子偏好啟動(dòng)子；其通過(guò)引用并入本文。具有特定組織"偏好"表達(dá)的啟動(dòng)子在該組織的表達(dá)的程度比在至少一種其它植物組織中的表達(dá)程度高。一些組織偏好的啟動(dòng)子表現(xiàn)幾乎專(zhuān)門(mén)在特定組織中表達(dá)。當(dāng)需要低水平表達(dá)時(shí)，可以使用弱啟動(dòng)子。通常，如本文所用的術(shù)語(yǔ)"弱啟動(dòng)子"指驅(qū)動(dòng)編碼序列低水平表達(dá)的啟動(dòng)子。低水平表達(dá)意指約1/1000轉(zhuǎn)錄本至約1/100,000轉(zhuǎn)錄本至約1/500,000轉(zhuǎn)錄本的水平?？蛇x擇地，應(yīng)i人識(shí)到術(shù)語(yǔ)"弱啟動(dòng)子，，還包括f義在少數(shù)細(xì)胞而不在其它細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)表達(dá)從而造成總的低水平表達(dá)的啟動(dòng)子。當(dāng)啟動(dòng)子以不可接受的高水平驅(qū)動(dòng)表達(dá)時(shí)，可以缺失或修飾該啟動(dòng)子序列的部分從而降低表達(dá)水平。所述弱組成型啟動(dòng)子包括，例如Rsyn7啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子(WO99/43838和美國(guó)專(zhuān)利第6,072,050號(hào))、35SCaMV核心啟動(dòng)子等等。其它的組成型啟動(dòng)子包括，例如，公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,608,149;5,608,144;5,604,121;5,569,597;5，466，785;5,399,680;5,268,463;5，608，142;和6,177,611的那些；其通過(guò)引用并入本文。通常，表達(dá)盒會(huì)包括用于選擇所轉(zhuǎn)化細(xì)胞的可選擇標(biāo)志物基因。利用可選擇標(biāo)志物基因選擇所轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織。標(biāo)志物基因包括編碼抗生素抗性的基因，諸如編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NEO)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)的那些，以及賦予除草劑化合物抗性的基因，所述化合物諸如草銨膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。適當(dāng)?shù)目蛇x擇標(biāo)志物基因的另外實(shí)例包括但不限于，編碼對(duì)以下物質(zhì)的抗性的基因，所述物質(zhì)為氯霉素(HerreraEstrella"a/.(1983)五M丑O/2:987-992);曱氨蝶呤(HerreraEstrellaWa/.(1983)A^wre3W:209-213;和MeijerW(1991)P/a"fAfo/.所o/.M:807-820);鏈霉素(JonesWa/.(1987)^Mo/.270:86-91);4士，見(jiàn)霉素(Bretagne-Sagnard"a/.(1996)r腦，m'c紐5:131-137);博來(lái)霉素(Hille"a/.(1990)尸taMo/.廳.7:171-176);石黃胺藥物(GuerineauW(1990)尸/贈(zèng)Mo/.所o/.":127畫(huà)136);溴苯腈(Stalker"(1988)5We認(rèn)242:419-423);草甘膦(Shaw^a/.(1986)5We"ce233:478-481;和美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)10/004,357和10/427,692);草銨膦(DeBlock"(1987)￡M56>>/6:2513-2518)。通常參見(jiàn)，Yarranton(1992)Cwr.3:506-511;Christophersonda/.(1992)戶(hù)rac.淑/.Jcad<Sc/.OS^89:6314-6318;Yao"a/.(1992)Ce〃71:63-72;Reznikoff(1992)Mo/.Mz'cra^W.6:2419-2422;BarkleyWa/.(1980)in■，腦，pp.177-220;Huda/.(1987)Ce〃48:555-566;Brownaa/.(1987)CW/49:603-612;Figge"a/.(1988)Ce//52:713-722;Deuschle"(1989)尸rac.腺/.JcadSc/.86:5400-5404;Fuerstwa/.(1989)/Voc.TVa"Jcad5""..86:2549-2553;DeuschleWa/.(1990)5We固248:480-483;Gossen(1993)Ph.D.Thesis,UniversityofHeidelberg(海德堡大學(xué)博士論文)；Reines"a/.(1993)A^/.Jcad90:1917-1921;LabowWa/.(1990)Afo/.Ce〃.A/o/.10:3343-3356;Zambrettia/.(1992)iVa"JcadSc/.CAS^(89:3952-3956;Baima/.(1991)iVoc.A^af/.JcadSc/.(75^488:5072-5076;Wyborski"a/.(1991)M/c/ez.cL19:4647-4653;Hillenand-Wissman(1989)7b//c<sAfo/.Sfn/c.5/o/.10:143-162;Degenkolba/.(1991)J""m/cro6.C7zewo^e;t35:1591-1595;KleinschnidtWa/.(1988)5/oc/^w/W727:1094-1104;Bonin(1993)Ph.D.Thesis,UniversityofHeidelberg(海德堡大學(xué)博士論文)；Gossena/.(1992)iVoc.JVaf/.Jcfl^.89:5547-5551;Olivaa/.(1992)爿wf/m/cro6.^gew^sC/zemo^zer.36:913-919;HlavkaWa/.(1985)/fawt/Z)00A:o/五x/en'mewto//T^rmaco/o^(實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)手冊(cè))，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin);和Gill"a/.(1988)淑歸334:721-724。所述公開(kāi)通過(guò)引用并入本文。以上所列可選擇標(biāo)志物基因并非意在限制。實(shí)施方式可以使用任一可選擇標(biāo)志物基因。實(shí)施方式的方法涉及將多肽或多核苷酸導(dǎo)入植物。"導(dǎo)入"意在表示向植物呈遞多核香酸或多肽，以致該序列進(jìn)入所述植物的細(xì)胞內(nèi)部。實(shí)施方式的方法不依賴(lài)將多核苷酸或多肽導(dǎo)入植物的特定的方法，只要所述多核苷酸或多肽進(jìn)入所述植物的至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部。將多核苷酸或多肽導(dǎo)入植物的方法為本領(lǐng)域已知，包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法和病毒介導(dǎo)的方法。"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化"意在表示導(dǎo)入植物的核苷酸構(gòu)建體整合進(jìn)植物基因組，并且能夠遺傳給其子代。"瞬時(shí)轉(zhuǎn)化"意在表示多核苷酸被導(dǎo)入植物但不整合進(jìn)植物基因組，或者多肽被導(dǎo)入植物。轉(zhuǎn)化操作步驟和將核香酸序列導(dǎo)入植物的操作步驟可以因作為轉(zhuǎn)化耙標(biāo)的植物或植物細(xì)胞的類(lèi)型(即單子葉植物或雙子葉植物)而不同。將核苷酸序列導(dǎo)入植物細(xì)胞繼而插入該植物基因組的適當(dāng)方法包^舌顯孩i;;主射(CrosswayWa/.(1986)5z'o^c/zm々we;y4:320-334)，電穿孑L(Riggs"a/.(1986)尸rac.A^af/.4ca"Sc/.f/5^83:5602-5606),農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(美國(guó)專(zhuān)利第5,563,055號(hào)和第5,981,840號(hào))，直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski"a/.(1984)￡MSO/3:2717-2722)，和彈道顆粒加速(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，945，050;5,879,918;5,886,244;和5,932,782;Tomesda/.(1995)in/VawfCe〃，7!s^we,af"d(9rg"wCw/^rezF"w/ame"to/M^/2oA(植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)基礎(chǔ)方法)，ed.GamborgandPhillips(Springer畫(huà)Verlag,Berlin);和McCabeefa/.(1988)6:923-926);和Led轉(zhuǎn)化(WO00/28058)。對(duì)于馬鈴薯轉(zhuǎn)化，參見(jiàn)Tua/.(1998)尸/贈(zèng)Mo/簡(jiǎn)/orB油gy37:829-838和Chong"a/.(2000)rra附ge"/c/esearc/9:71-78。另外的轉(zhuǎn)化方法可以在以下文獻(xiàn)中4戈至'J，^Weissingerefa/.(1988)及ev.Ge"e/.22:421-477;Sanfordda/.(1987)尸aWcw/她5Wewce<3"<irec/2m/0gy5:27-37(洋蔥)；ChristouWa/.(1988)尸/"wf戶(hù)/^w'o/.87:671-674(大豆)；McCabeW(1988)5z'o/Tec/i"oZogy6:923-926(大豆)；FinerandMcMullen(1991)附raCW/Dev.27P:175-182(大豆)；Singh"a/.(1998)7T^orJ/p/.G騰/.96:319-324(大豆)；Datta"a/.(1990)B/ofec;mo/ogy8:736-740(水稻)；KleinWa/.(1988)iVa".爿cadScz'.t/SJ85:4305-4309(玉米)；Klein"a/.(1988)所o&c/z"o/ogy6:559-563(玉米);美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,240,855;5,322,783和5,324,646;KleinWa/.(1988)尸/贈(zèng)尸—。/.91:440-444(玉米);Fromm"a/.(1990)5z,他c/z"o/，8:833-839(玉米);Hooykaas-VanSlogterenWa/.(1984)淑匿fZo油"」311:763-764;美國(guó)專(zhuān)利第5,736,369號(hào)(谷類(lèi))；Bytebier"a/.(1987)iVoc.淑/.5W.84:5345-5349(百合科)；DeWeta/.(1985)inTTze五xpen7we"to/iVfam^w/a"o"o/(9vw/e7!ww&s(胚；朱纟且織的實(shí)馬全才喿訐乍)，ed.Chapmana/.(Longman,NewYork),pp.197-209(花4分)；KaepplerWa/.(1990)尸/a"fCe〃iepw^9:415-418和Kaepplerda/.(1992)TTzew:如/.Ge"".84:560-566(whisker介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化);D'Halluinaa/.(1992)Ce〃4:1495-1505(電穿孔)；LiWa/.(1993)尸/aw/Ce〃12:250-255和ChristouandFord(1995)o/Boto";;75:407-413(水稻》Osjoda"<ar/.(1996)胸匿5/她c/z"o/ogy14:745-750(玉米，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌)；以上所有均通過(guò)引用并入本文。在具體實(shí)施方式中，可以使用各種瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法向植物提供實(shí)施方式的序列。所述瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，將Oy毒素蛋白或其變體和其片段直接導(dǎo)入植物，或者將CV7毒素轉(zhuǎn)錄本導(dǎo)入所述植物。所述方法包括，例如，顯微注射或顆粒轟擊。參見(jiàn)，例如，Crossway"a/.(1986)Mo/G饑C.202:179-185;NomuraWa/.(1986)尸』5W.44.:53-58;Heplera/.(1994)iVoc.Ato/.Jcad91:2176-2180和Hush""/.(1994)7T^Jbw"a/o/CW/5Wewce107:775-784，以上所有均通過(guò)引用并入本文?？蛇x擇地，使用本領(lǐng)域已知技術(shù)能將Oj毒素的多核苷酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)化進(jìn)植物。所述技術(shù)包括病毒載體系統(tǒng)以及對(duì)多核苦酸的沉淀以致阻止DNA隨后的釋放。因而，可以發(fā)生從顆粒結(jié)合的DNA的轉(zhuǎn)錄，但是它被釋放而整合進(jìn)基因組的頻率大大降低。所述方法包括使用聚乙亞胺包被的顆粒(PEI;Sigma#P3143)。本領(lǐng)域已知在植物基因組特定位置耙向插入多核芬酸的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)在所需基因組位置插入多核香酸。參見(jiàn)，例如，W099/25821、W099/25854、WO99/25840、W099/25855和W099/25853,以上所有均通過(guò)引用并入本文。簡(jiǎn)言之，實(shí)施方式的多核普酸可以包含在轉(zhuǎn)移盒內(nèi)，所述轉(zhuǎn)移盒側(cè)翼連接兩個(gè)非一致的重組位點(diǎn)。將該轉(zhuǎn)移盒導(dǎo)入植物，于靶位點(diǎn)穩(wěn)定整合進(jìn)其基因組，所述耙位點(diǎn)側(cè)翼連接對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)移盒位點(diǎn)的兩個(gè)非一致的重組位點(diǎn)。提供合適的重組酶，轉(zhuǎn)移盒于靶位點(diǎn)被整合。因而，目的多核苷酸于植物基因組中特定的染色體位置被整合。依照常規(guī)方式，可以使已被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生長(zhǎng)成植物。參見(jiàn)，例如，McCormickWa/.(1986)尸/a"/CW/7e/orfe5:81-84。隨后可以l吏這些植物生長(zhǎng)，并且用相同的轉(zhuǎn)化品系或不同品系授粉，鑒定具有所需表型特征的組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)的所得雜合體?？梢陨L(zhǎng)兩代或更多代，從而保證所需表型特征的表達(dá)保持穩(wěn)定并被遺傳，隨后收獲種子，以確保已經(jīng)實(shí)現(xiàn)所需表型特征的表達(dá)?？梢酝ㄟ^(guò)使植物與病毒或病毒核酸接觸，向植物提供實(shí)施方式的核苦酸序列。通常，所述方法涉及在病毒DNA或RNA分子內(nèi)并入目的核苷酸構(gòu)建體。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可以最初將實(shí)施方式的重組蛋白作為病毒聚合蛋白的部分來(lái)合成，隨后可以通過(guò)體內(nèi)或體外的蛋白水解來(lái)處理所述聚合蛋白，從而產(chǎn)生所需殺蟲(chóng)蛋白。還應(yīng)認(rèn)識(shí)到包含實(shí)施方式殺蟲(chóng)蛋白的氨基酸序列的至少一部分的這種病毒聚合蛋白可以具有所需的殺蟲(chóng)活性。實(shí)施方式包括所述病毒聚合蛋白以及編碼它們的核苷酸序列。向植物提供核苷酸構(gòu)建體并在植物中產(chǎn)生所編碼蛋白的方法為本領(lǐng)域已知，其涉及病毒DNA或RNA分子。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，889，191;5,889,190;5，866，785;5,589,367;和5,316,931;其通過(guò)引用并入本文。實(shí)施方式還涉及實(shí)施方式的所轉(zhuǎn)化植物的植物繁殖材料，包括但不限于種子，塊莖，球莖，鱗莖，葉，和根與芽的插條。實(shí)施方式可以用于轉(zhuǎn)化任意植物物種，包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物。所關(guān)注植物的實(shí)例包括但不限于玉米(Ze"wa")、蕓苔屬(5nxss/ca)的種(^口油菜(5.""/iw)、蕪菁(及napa)、芥菜(及乂imcea)),特別是可用作籽油來(lái)源的那些蕓苔屬的種、苜蓿(Me&c"go^m'wO、水vw/ga^)、粟(^口《良尾草(尸ewm'"fwmg/awcw附)、黍(尸am'cwmAm7/acewm)、谷子(5Wor/(2z'to/z'ca)、穆子(E7e,'wecorac朋a))、向曰蔡(//^//""/^awwwws)、鄉(xiāng)工花(CV/Y/z(3musf/wcfonTA)、'J、麥(7)-"/cMmaes"vt/m)、大豆花生/y;/ogae")、才帛(海島才帛(Go^j^/wmZ(ar6acfe"je)、陸地才帛(Gos^//,/n'n^,))、甘菩(&owoea6"to加)、木菩(Mam720fescw/e齒)、咖啡(Co,aspp.)、挪子(Cocaswwc(/^ra)、菠蘿(v4wawascowasw力、甜桔(C7/msspp.)、可可(77zeo6rawacacao)、茶(Ca,〃/aWwe"^)、香蕉(Mwraspp.)、絝梨(戶(hù)eraeaamen'cawa)、無(wú)花果(F/cwsca57'ca)、番石才留(/^/ii/w/wgi/q/(3va)、芒果(^Mawgi/^n2iwd/ca)、才敢才覽(0/eaewra戸ea)、木瓜(Ca〃'capapa戸)、腰果(Jw"C(3Wm附occ/cfe"a/e)、堅(jiān)果甘蔗(&cc/zaramspp.)、燕麥、大麥、蔬菜、觀(guān)賞植物以及針葉樹(shù)。蔬菜包括番癡(Z;yco/e^s/co"ejcw/e"fww)、萬(wàn)苣(Z<a""cas加'va)、菜豆(/Vz(Xseo/wvw/gan》、利馬豆/Zwem&)、至宛豆(Z^f/y^wsspp.)、以及黃瓜屬(Cwcwm、)的成員如黃瓜(Cs""vm)、羅馬甜瓜(C.cawto/w/em》以及甜瓜(Cwe/o)。觀(guān)賞植物包括杜鵑花(//zoabcfewdrawspp.)、八仙花(Macrap/^〃a/y^rawgea)、木植(歷6/sctwmsasa"e"w\y)、玫瑰(io^spp.)、郁金香(7W^aspp.)、水仙花C/Van^^wsspp.)、矮牽牛(戶(hù)efww/a/2y6Wda)、康乃馨(Z)/aw^zwscoT^op/^〃tAS)、《星《星木(五w//or6/apw/c/2e/r/wa)以及菊花?？捎糜趯?shí)踐實(shí)施方式的針葉樹(shù)包括例如松，諸J(?；鹁?〉(尸/wws、濕地CPz'wtwe〃/o"7)、西黃(尸/wm/owfiferasa)、，繁;+^(尸/wmscowfoWa)k乂及輻射+^(尸/wz^narJ/flfa);花-真+>(尸sewdo^swgame"27'es/z〕；力口拿大纟失杉(7iMgaca"adew/51);白云斗多(P/ceag/awca);纟工片》(5"e《wo/asewperv/rem1);真冷沖》,諸^口名艮冷才》(J6/esaw^)z7/"和香脂冷杉04W^^/samea);以及雪松，諸如西方紅色雪松(7T^/a/7//cato)和阿4i,斤力口黃才白(C/^maecjv/aniwooM:a&"5^)。實(shí)施方式的植物包括農(nóng)作物(例如玉米、苜蓿、向日葵、蕓莒屬、大豆、棉、紅花、花生、高粱、小麥、粟、煙草等)，諸如玉米和大豆植物。草畔草包括但不限于一年生早熟禾CPofla""w);—年生黑麥草(丄o/Zwmmw/nyorw附)；力口拿大早14禾(尸o"compre^a);^卩氏羊茅(■FeWwcan/6ra);纟田弱H"股穎(jgms"sfe鼎/力；匍旬蓊股穎(^4gms"s/a/wWn's);麥;^t、草(^grop少ro"d&sgWorw附)；扁穩(wěn)》Jc草(^4gro/5;yro"cr^/afw附)；石更羊茅(Fe虛ca/owgzyb〃a);草地早熟禾(尸oa/rateww力；野茅g/omenaffa);多年生,繁、麥草(丄o/z'wmperewwe);秀，羊茅(Festwcan/6ra);小糠草(々mst^a/6a);粗莖早熟禾(尸oafn'v/a/;羊茅(Festwcoov/—;47無(wú)芒雀麥(Sra/wws,"erw&);高羊茅(Fe虛ca"rw"W"acea);梯牧草(尸/z/ewwpra/erae);絨毛剪股穎(々raWscam'wa);檢茅(i^cc/we〃/aW加""；藍(lán)莖水草(々rapjra"，z窗/);狗牙草(Cy"odo"spp.);圣奧古斯丁草(》"oto//zrww；結(jié)縷草(Zo戸'"spp.);巴哈雀稗o//'Mra/(ies);《良尾草(尸ewm、efwmc/awiies/www);海濱雀-皁(戶(hù)as/x/wmvag7.w"^/m);格蘭馬草(5owte/owagna"7&);7K牛草(5wc/z/oedacf_y/o/dy);#J^t、才各蘭馬草(Sowfe/ow"cwr^pew^/"/a).所關(guān)注的植物包括提供所關(guān)注的種子的谷類(lèi)植物、含油種子植物以及豆科植物。所關(guān)注的種子包括谷類(lèi)種子，如玉米、小麥、大麥、水稻、高粱、黑麥、黍等。含油種子植物包括棉、大豆、紅花、向日葵、蕓苔屬、玉米、苜蓿、棕櫚、椰子、亞麻、蓖麻、橄欖等。豆科植物包括菜豆和豌豆。菜豆包括瓜爾豆、刺槐豆、胡蘆巴、大豆、青刀豆、豇豆、綠豆、利馬豆、蠶豆、小扁豆、鷹嘴豆等。在某些實(shí)施方式中，實(shí)施方式的核酸序列可以與任意組合的目的多核香酸序列堆疊，從而產(chǎn)生具有所需表型的植物。例如，實(shí)施方式的多核苷酸可以與編碼具有殺蟲(chóng)和/或殺昆蟲(chóng)活性的多肽的其它任何多核苷酸堆疊，所述多肽諸如其它價(jià)毒素蛋白(描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,366,892;5，747，450;5,736,514;5，723，756;5,593,881;和GeiserWa/.(1986)C騰48:109)、pentin(描述于美國(guó)專(zhuān)利第5,981,722號(hào))等等。生成的組合還可以包含多拷貝的任一目的多核苷酸。也可以將實(shí)施方式的多核苷酸與其它任一基因或基因的組合相堆疊，從而產(chǎn)生具有各種所需性狀組合的植物，其包括但不限于動(dòng)物取食所需的性狀，諸如高油基因(例如，美國(guó)專(zhuān)利第6,232,529號(hào))；平衡型氨基酸(例如，hordothionins(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,990,389;5,885,801;5，885，802;和5,703,049);大麥高賴(lài)氨酸(WilliamsonWa/.(1987)/165:99-106;和WO98/20122)和高曱硫氨酸蛋白(Pedersen"a/.(1986)/所o/.C7亂261:6279;Kiriharaa/.(1988)G潔71:359;和Musumura"a/.(1989)尸/a"fMo/.編.12:123));增強(qiáng)的消化性(例如,修飾的貯藏蛋白(2001年11月7日提交的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)10/053,410);和硫氧還蛋白(2001年12月3日提交的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)10/005,429)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。還可以將實(shí)施方式的多核苷酸與疾病或除草劑抗性所需的性狀相堆疊(例如，煙曲霉毒素去毒基因(美國(guó)專(zhuān)利第5,792,931號(hào))；無(wú)毒性和疾病抗性基因(JonesWa/.(1994)5We匿266:789;Martinefa/.(1993)Sc!'e"ce262:1432;和Mindrinos"a/.(1994)Ce〃78:1089);導(dǎo)致除草劑抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突變體，諸如S4和/或Hra突變；谷氨酰胺合酶抑制劑，諸如草銨膦或basta(例如，bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因和GAT基因，如美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)10/004,357;和10/427,692所公開(kāi))；以及與加工或加工產(chǎn)物所需的性狀相堆疊，諸如高油(例如，美國(guó)專(zhuān)利第6,232,529號(hào))；修飾的油(例如，脂肪酸去飽和酶基因(美國(guó)專(zhuān)利第5，952，544號(hào)；WO94/11516));修飾的淀粉(例如，ADPG焦磷酸化酶(AGPase),淀粉合酶(SS)，淀粉支化酶(SBE)和淀粉去支化酶(SDBE));以及多聚物或生物塑料(例如，美國(guó)專(zhuān)利第5.602,321號(hào)；卩-酮硫解酶，聚羥基丁酯合酶，和乙酰乙酰基-CoA還原酶(SchubertWa/.(1988)JBa"eWo/.170:5837-5847)促進(jìn)聚羥基鏈烷酸酯(PHA)的表達(dá))，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。也可以將實(shí)施方式的多核苷酸與提供農(nóng)藝學(xué)性狀或轉(zhuǎn)化技術(shù)性狀的多核芬酸組合，所述農(nóng)藝學(xué)性狀諸如雄性不育(例如，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5.583,210號(hào))、莖強(qiáng)度、開(kāi)花時(shí)間，所述轉(zhuǎn)化技術(shù)性狀諸如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)或基因打耙(例如，WO99/61619;WO00/17364;WO99/25821),其^>開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文?？梢酝ㄟ^(guò)包括但不限于雜交育種植物或遺傳轉(zhuǎn)化的任何方法來(lái)產(chǎn)生這些堆疊的組合物，所述雜交育種植物通過(guò)任何常規(guī)方法或丁(^&083@方法。如果通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化植物來(lái)堆疊性狀，那么可以在任意時(shí)間以^f壬意順序組合目的多核苷酸序列。例如，可以將包含一種或多種所需性狀的轉(zhuǎn)基因植物用作靶標(biāo)，從而通過(guò)隨后的轉(zhuǎn)化導(dǎo)入其它性狀。可以使用轉(zhuǎn)化盒的任意組合所提供的目的多核苷酸，以共轉(zhuǎn)化操作步驟同時(shí)導(dǎo)入所述性狀。例如，如果要導(dǎo)入兩條序列，那么所述兩中?？梢越柚嗤膯?dòng)子或借助不同的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)序列的表達(dá)。在某些情況下，需要導(dǎo)入抑制目的多核苷酸表達(dá)的轉(zhuǎn)化盒?？梢詫⑵渑c其它抑制盒或過(guò)表達(dá)盒的任意組合相組合，從而在植物中生成所需的性狀組合。還認(rèn)識(shí)到可以使用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，將多核苷酸序列在所需基因組位置堆疊。參見(jiàn)，例如，W099/25821,W099/25854，WO99/25840,W099/25855和W099/25853，所有這些都通過(guò)引用并入本文。可以將實(shí)施方式的組合物用于保護(hù)植物、種子和各種方式的植物產(chǎn)物。例如，組合物能用于下述方法，該方法涉及將有效量的殺蟲(chóng)組合物通過(guò)操作置于害蟲(chóng)環(huán)境，所述操作選自噴灑(spraying)、撒粉(dusting)、撒播(broadcasting)或種子包被。在將植物繁殖材料(果實(shí)、塊莖、鱗莖、球莖、谷物、種子)、尤其是種子作為商品銷(xiāo)售時(shí)，通常用保護(hù)劑包被將其處理，所述保護(hù)劑包被包括除草劑、殺昆蟲(chóng)劑、殺真菌劑、殺細(xì)菌劑、殺線(xiàn)蟲(chóng)劑、殺軟體動(dòng)物劑，或這些制備物中的幾種的混合物，如有需要，以及用另外的載體、表面活性劑或者通常用于制劑領(lǐng)域的促應(yīng)用佐劑處理，從而提供對(duì)細(xì)菌、真菌或動(dòng)物害蟲(chóng)造成的損害的保護(hù)。為了處理種子，可以通過(guò)用液體制劑浸漬塊根或谷物，或者通過(guò)用組合的濕性或干性制劑將其包被，來(lái)將保護(hù)劑包被用于種子。另外，在特殊情況下，應(yīng)用于植物的其它方法是可行的，例如針對(duì)芽或果實(shí)的處理?？梢杂梅N子保護(hù)劑包被處理實(shí)施方式的植物種子，所述植物種子包含編碼實(shí)施方式的殺蟲(chóng)蛋白的核苷酸序列，并且所述種子保護(hù)劑包被包含種子處理化合物，諸如，例如，克菌丹、萎銹靈、福美雙、methalaxyl、安定磷和通常用于種子處理的其它化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，包含實(shí)施方式的殺蟲(chóng)組合物的種子保護(hù)劑包被單獨(dú)使用，或與通常用于種子處理的種子保護(hù)劑包被中的一種組合使用。認(rèn)識(shí)到可以使用編碼殺蟲(chóng)蛋白的基因來(lái)轉(zhuǎn)化昆蟲(chóng)致病生物體。所述生物體包括桿狀病毒、真菌、原生動(dòng)物、細(xì)菌和線(xiàn)蟲(chóng)。可以通過(guò)合適的載體將編碼實(shí)施方式的殺蟲(chóng)蛋白的基因?qū)胛⑸锼拗鳎瑢⑺鏊拗鲬?yīng)用于環(huán)境、或者植物或動(dòng)物。在將核酸插入細(xì)胞的上下文中的術(shù)語(yǔ)"導(dǎo)入的"指"轉(zhuǎn)染"或"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)"，并且包括涉及將核酸并入真核或原核細(xì)胞，其中可以將核酸整合進(jìn)細(xì)胞基因組(例如，染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線(xiàn)粒體DNA)，轉(zhuǎn)變成自主復(fù)制子，或瞬時(shí)表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)?？梢赃x擇已知占據(jù)一種或多種目的作物"植物圈"(葉面、葉圍、根際和/或根面)的微生物宿主。選擇這些微生物，使其能夠在特定環(huán)境中與野生型微生物成功竟?fàn)帲贡磉_(dá)殺蟲(chóng)蛋白的基因穩(wěn)定地維持和表達(dá)，以及令人滿(mǎn)意地，提高對(duì)環(huán)境降解和失活殺蟲(chóng)劑的防護(hù)。所述微生物包括細(xì)菌、藻類(lèi)和真菌。特別引人注目關(guān)注的微生物諸如是細(xì)菌，例如，布i單孢菌屬(尸"wdomomw),歐文氏菌屬(^fiHWm'a)，沙雷氏菌屬(&rra"a)，克雷伯菌屬C^/e^/e//"),黃單胞菌屬(Xa"Aomowaw)，鏈霉菌屬(iS^-e/^om少ce力，才艮瘤菌屬(i/z/zoZ^'wm)，纟工，支單月包菌屬(i/20(io/wewdo附o"(351)，農(nóng)^干菌屬(^4grofeacfen'ww)，醋4干菌屬(y4cefo6a"er),乳酉吏才干菌屬(丄a"o6(2cz7/M力，節(jié)纟田菌屬(JW/raZ)a"er)，固氮菌屬(Jzoto6acfer)，明串珠菌屬(丄ewcowoWoc)和產(chǎn)堿桿菌屬04/^//^"^);是真菌，特別地是酵母，例如酵母屬OS^cc/wrawyce"，隱玉求菌屬(07/tococcM)，克魯維斯酵母屬(A7w7veraw少c^s)，擲抱酵母屬(iS/orafto/o，c&s)，紅酵母屬(i/2odotorw/fl)和黑酵母屬(^^eo^wWz'wn)。特別關(guān)注的是植物圈細(xì)菌物種，諸如丁香4艮單月包菌(尸sewfio附o"cwsyn."gwg)，熒光，支單月包菌(尸sewdow70"ow/7womsce"力，粘質(zhì)沙雷氏菌((Serra""worcejce"力，木醋酸菌(Jcefoft""erx_y//"wm)，農(nóng)才干菌屬(爿gro6acten'")，J求形纟工有支單月包菌(//2odo/weMfito附o"ass//zera/A)，實(shí)予油菜黃單月包菌wo"osc"mpes^"")，苜蓿才艮瘤菌(i/n'zo6z'wm附e//。^),真養(yǎng)產(chǎn)威軒菌(^/c"/z'ge"ase"加//z—,木質(zhì)棍狀桿菌(C7(3v/6acferxy/0和維涅蘭德固氮菌(^zoto6a"erv/"/awc^)和才直物圈酵母物種，諸如深紅酵母(i/zotfotonz/an^ra),粘紅酵母(及.g/w"m》，海濱紅酵母(凡，才登紅酵母(及.flwraw,/aca),淺白隱J求菌(O;;ptococc^a/6zWw"，流散隱J求酵母(C.(i(^Me"s)，羅倫隱5求菌(C/awewh7),3文3鬼酵母(nSacc/zaramycesrase/)，S.prefor/em7's，酉良酒酵母(5".ce^Ww'ae)，玫瑰色擲孢酵母(Spora6o/ow;;cM香氣擲孢酵母(51.odorws)，A7w^yveramyces和出芽4豆梗霉(/1wreo6as7W/i/附po〃w/a""。特別關(guān)注的是色素性微生物?？梢允褂矛F(xiàn)有的許多方式，在允許穩(wěn)定地維持和表達(dá)基因的條件下，將表達(dá)殺蟲(chóng)蛋白的基因?qū)胛⑸锼拗?。例如，能?gòu)建表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包括目的核香酸構(gòu)建體以及與宿主生物體中的序列同源的核香酸序列和/或在該宿主中具有功能的復(fù)制系統(tǒng)，所述核苷酸構(gòu)建體與用于表達(dá)該核苷酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)性信號(hào)可操作連接，借助所述核苷酸序列，發(fā)生整合，借助所述復(fù)制系統(tǒng)，發(fā)生整合或穩(wěn)定的維持。轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)性信號(hào)包括但不限于，啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、操作基因、活化子(activator)、增強(qiáng)子、其它調(diào)節(jié)性元件、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、終止信號(hào)等等。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利第5,039,523號(hào)和第4,853,331號(hào)；EPO0480762A2;Sambrook"a/.(1992)Mo/ecw/arC7om'"g:丄a6orato^yAfawi/a/(分子克隆實(shí)-險(xiǎn)室手冊(cè))，ed.Maniatisefa/.(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork),下稱(chēng)"SambrookII";Davisefa/.，eds.(1980"dwmce(i5a"e"'a/GW2e"cs(高級(jí)細(xì)菌遺傳學(xué))(ColdSpringHarborLaboratoryPress),ColdSpringHarbor,NewYork;并且所述參考文獻(xiàn)為本文所引用。合適的宿主細(xì)胞可以包括原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，其通常限于不產(chǎn)生對(duì)諸如哺乳動(dòng)物的高等生物體有毒性的物質(zhì)的那些細(xì)胞，其中處理含殺蟲(chóng)蛋白的細(xì)胞，從而在將受處理細(xì)胞應(yīng)用于具有一種或多種靶害蟲(chóng)的環(huán)境時(shí)，延長(zhǎng)殺蟲(chóng)蛋白在所述細(xì)胞中的活性。然而，能使用產(chǎn)生對(duì)高等生物體具有毒性的物質(zhì)的生物體，其中所述毒素不穩(wěn)定或者應(yīng)用水平足夠低，以致避免對(duì)哺乳動(dòng)物宿主存在毒性的任何可能。作為宿主，特別關(guān)注的是原核細(xì)胞和低等真核細(xì)胞，諸如真菌。示例性的原核細(xì)胞(革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌)包括腸桿菌科(五"&ra6a"en,aceae)，諸^口埃希氏菌屬(Esc/en.c/zz'a),歐文氏菌屬，志賀氏菌屬(5T"'ge〃a)，沙門(mén)氏菌屬(Sa/wo"e〃a)和變形桿菌屬(尸ra/e^);芽胞桿菌科CSa"7/aceae);才艮瘤菌科(i/n'zo6/aceae),諸如才艮瘤菌屬(及/z/zo6/wm);螺菌科(5^W//aceae)，諸如發(fā)光菌，酵單胞菌屬(Zymow70"(xy),沙雷氏菌屬，氣單胞菌屬Ueramowos),弧菌屬(W6Wo)，脫硫弧菌屬CDe^/ybW6Wo),螺旋菌屬(5^zW〃ww);乳桿菌科(丄a"o6ac/〃aceae);，i單月包菌-牛(/^ewcfowowa(iaceae)諸^口々i單月包菌屬和醋桿菌；固氮菌^牛(^4zc^o6a"eraceae)和硝匕斥干菌牙牛(7V"ra6a"eraceae)。真核細(xì)胞有真菌，諸如藻狀菌綱(尸/^cow7ce&"和子嚢菌綱G^com少cW^),其包括酵母，諸如酵母屬和裂殖酵母屬(6"c/n.myacc/2"rawyc—;以及擔(dān)子菌(Axs7Wom少ceto)酵母,諸如紅酵母屬，短梗霉屬04weokmW/wm)，擲孢酵母屬等。在為產(chǎn)生殺蟲(chóng)蛋白而選擇宿主細(xì)胞方面特別關(guān)注的特征包括將殺蟲(chóng)蛋白基因?qū)胨拗鞯谋憬荨⒈磉_(dá)系統(tǒng)的可獲得性、表達(dá)的效率、蛋白在宿主中的穩(wěn)定性以及輔助遺傳能力的存在。用作殺蟲(chóng)劑微膠嚢的所關(guān)注的特征包括對(duì)于殺蟲(chóng)劑的保護(hù)性特性，諸如厚的細(xì)胞壁、色素沉著和胞內(nèi)包裝或包涵體形成；葉親和性；哺乳動(dòng)物毒性的缺乏；對(duì)昆蟲(chóng)食入的吸引；殺死和固定且不損害毒蛋白的便捷；等等。其它考慮包括制劑和處理的便捷，經(jīng)濟(jì)，儲(chǔ)藏穩(wěn)定性等等。特別關(guān)注的宿主生物體包括酵母，諸如紅酵母(i^odotonJawp.)，次豆梗審(Ji^eo6os7'(iiwAW酵母(5"acc/zan9附少c&ss/p.)(諸:fe口，酉良酒酵母)，擲孢酵母(5^ora6o/owyc&s^;.);葉面生物體，諸如假單胞菌(尸;ewdomoww)(諸如綠膿假單胞菌(Paewgz'"asa),熒光假單胞菌)，歐文氏菌(五nvz'm'as/p.)以及黃質(zhì)菌CF/avo6(3"en'wms/p.);以及其它此類(lèi)生物體，包括價(jià)、大腸桿菌、枯草芽胞桿菌C6ac/〃wm/^7/力等等。編碼實(shí)施方式的殺蟲(chóng)蛋白的基因能導(dǎo)入依靠植物倍增的微生物(附生植物)，從而將殺蟲(chóng)蛋白遞送至潛在的靶害蟲(chóng)。附生植物，例如，可以是革蘭氏陽(yáng)性菌或革蘭氏陽(yáng)性菌。才艮定殖(root-colonizing)的細(xì)菌，例如，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知方法分離自所關(guān)注的植物。具體地，定殖根的蠟狀芽胞桿菌(^^7/wcwetw)菌抹可以分離自植物根(參見(jiàn)，例如，HandelsmanW(1991)v4/p/.￡"v/ra".M/cra6/o/.56:713-718)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，將編碼實(shí)施方式的殺蟲(chóng)蛋白的基因?qū)敫ㄖ车南灎钛堪麠U菌。借助電轉(zhuǎn)化能將編碼殺蟲(chóng)蛋白的基因?qū)?，例如，根定殖的芽孢桿菌。具體地，編碼殺蟲(chóng)蛋白的基因能克隆至穿梭載體，例如，pHT3101(LereciusWa/.(1989)F五MSMz'cra&o/.60:211-218)。包含特定殺蟲(chóng)蛋白基因的編碼序列的穿梭載體pHT3101，例如，借助電穿孔能轉(zhuǎn)化至根定殖的芽孢桿菌(LereciusWa/.(1989)i^MSMz'cra&o/.60:211-218)?？梢栽O(shè)計(jì)表達(dá)系統(tǒng)，以致，例如將殺蟲(chóng)蛋白分泌至諸如大腸桿菌的革蘭氏陰性菌的胞質(zhì)外。使殺蟲(chóng)蛋白分泌的優(yōu)點(diǎn)在于(l)避免所表達(dá)殺蟲(chóng)蛋白的潛在細(xì)胞毒性作用；以及(2)改善殺蟲(chóng)蛋白的純化效率，包括但不限于，提高每體積細(xì)胞肉湯的蛋白復(fù)性和純化效率，縮短每單位蛋白復(fù)性和純化的時(shí)間和/或減少其成本?？梢灾苽浯竽c桿菌分泌的殺蟲(chóng)蛋白，例如，通過(guò)將合適的大腸桿菌信號(hào)肽融合至殺蟲(chóng)蛋白的氨基端末端。可以在大腸桿菌已知分泌的蛋白中發(fā)現(xiàn)大腸桿菌識(shí)別的信號(hào)肽，例如OmpA蛋白(Ghrayeb"a/.(1984)/,3:2437-2442)。OmpA是大腸桿菌外膜的主要蛋白，它的信號(hào)肽因而浮皮認(rèn)為在轉(zhuǎn)位過(guò)程中有效。另外，加工前，OmpA信號(hào)肽不需要被修飾，例如脂蛋白信號(hào)肽的其它信號(hào)肽可能如此(Duffaudefa/.(1987)A/e^.五"z少mo/.153:492)。實(shí)施方式的殺蟲(chóng)蛋白在細(xì)菌宿主中能發(fā)酵，加工所得細(xì)菌并將其以與將5,菌株用作殺昆蟲(chóng)噴霧劑的相同方式用作微生物噴霧劑。在芽孢桿菌分泌一種或多種殺蟲(chóng)蛋白的情況下，使用本領(lǐng)域已知方法去除或突變分泌信號(hào)。所述突變和/或缺失阻止在發(fā)酵過(guò)程中將一種或多種殺蟲(chóng)蛋白分泌至生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在細(xì)胞內(nèi)保留殺蟲(chóng)蛋白，隨后加工所述細(xì)胞以產(chǎn)生封裝的殺蟲(chóng)蛋白。為該目的可以使用任意合適的微生物。假單胞菌已被用于將價(jià)毒素表達(dá)為封裝的蛋白，加工所得細(xì)胞，并將其作為殺昆蟲(chóng)劑噴灑(Gaertnerera/.(1993),i":A/va"ced五wgz'"eered(高級(jí)工考呈化殺蟲(chóng)劑)，ed.Kim)。可選擇地，通過(guò)將異源基因?qū)爰?xì)胞宿主來(lái)產(chǎn)生殺蟲(chóng)蛋白。異源基因的表達(dá)直接或間接地導(dǎo)致殺蟲(chóng)劑的胞內(nèi)產(chǎn)生和維持。隨后將細(xì)胞應(yīng)用于具有一種或多種靶害蟲(chóng)的環(huán)境時(shí)，在延長(zhǎng)細(xì)胞所產(chǎn)生毒素活性的條件下處理這些細(xì)胞。所得產(chǎn)物保留毒蛋白的毒性。隨后可以根據(jù)常規(guī)技術(shù)配制這些天然封裝的殺蟲(chóng)蛋白，以將其應(yīng)用于具有耙害蟲(chóng)的環(huán)境，例如土i裏、水和才直物的葉子。參見(jiàn)，例如EPA0192319，所述參考文獻(xiàn)為本文所引用。在實(shí)施方式中，可接受的載體能將轉(zhuǎn)化的微生物(其包括整個(gè)生物體、細(xì)胞、一種或多種孢子、一種或多種殺蟲(chóng)蛋白、一種或多種殺蟲(chóng)組分、一種或多種影響害蟲(chóng)的組分、一種或多種突變體、活細(xì)胞或死細(xì)胞和細(xì)胞組分，包括活細(xì)胞和死細(xì)胞和細(xì)胞組分的混合物，并且包括破損的細(xì)胞和細(xì)胞組分)或分離的殺蟲(chóng)蛋白配制成一種或多種殺蟲(chóng)組合物，所述殺蟲(chóng)組合物，例如是懸浮液、溶液、乳劑、粉劑、可分散顆粒或小球、可濕性粉劑和可乳化濃縮物、煙霧劑或噴霧劑、浸漬顆粒、佐劑、可包被糊劑、膠體，以及另外用例如多聚物物質(zhì)封裝?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)手段制備所述配制的組合物，所述手段諸如干燥、凍干、均質(zhì)化、萃取、過(guò)濾、離心、沉降或濃縮包含所述多肽的細(xì)胞培養(yǎng)物?？梢酝ㄟ^(guò)添加表面活性劑、惰性載體、防腐劑、濕潤(rùn)劑、取食刺激劑、引誘劑、封裝劑、黏合劑、乳化劑、染料、UV保護(hù)劑、緩沖液、流平劑或肥料、微營(yíng)養(yǎng)供體或者影響植物生長(zhǎng)的其它制備物，來(lái)獲得以上公開(kāi)的所述組合物?？梢詫⒁环N或多種農(nóng)用化學(xué)品與通常用于制劑領(lǐng)域的載體、表面活性劑或佐劑或者其它組分組合，以促進(jìn)為特定靶害蟲(chóng)的產(chǎn)物處理和應(yīng)用。適當(dāng)?shù)妮d體和佐劑可以是固體的或液體的，并且對(duì)應(yīng)于通常用于制劑技術(shù)的物質(zhì)，例如，天然的或再生的礦物質(zhì)、溶劑、分散劑、潤(rùn)濕劑、增粘劑、黏合劑或肥料。實(shí)施方式的活性成分通常以組合物形式應(yīng)用，并且可以應(yīng)用于4寺處理的作物區(qū)域、植物或種子。例如，可以在制備糧倉(cāng)或筒倉(cāng)等時(shí)，或者在糧倉(cāng)或筒倉(cāng)等儲(chǔ)藏時(shí)，將實(shí)施方式的組合物應(yīng)用于谷物?？梢耘c其它化合物同時(shí)或連續(xù)應(yīng)用實(shí)施方式的組合物。應(yīng)用實(shí)施方式的活性成分或?qū)嵤┓绞降霓r(nóng)用化學(xué)品組合物的方法包括但不限于葉敷、種子包被和土壤施用，所述活性成分或農(nóng)用化學(xué)品組合物包含實(shí)施方式的細(xì)菌菌抹產(chǎn)生的至少一種殺蟲(chóng)蛋白。應(yīng)用的數(shù)量和速率取決于對(duì)應(yīng)教蟲(chóng)群襲的強(qiáng)度。合適的表面活性劑包括但不限于陰離子化合物，諸如，例如金屬羧酸鹽；長(zhǎng)鏈脂肪酸羧酸鹽；N-?；“彼猁}；磷酸和脂肪醇乙氧基化物的一元或二元酯或者所述酯的鹽；脂肋醇硫酸鹽，諸如十二烷基硫酸鈉、十八烷基硫酸鈉或十六烷基硫酸鈉；乙氧基脂肪醇硫酸鹽；乙氧基烷基苯酚硫酸鹽；木質(zhì)素磺酸鹽；石油磺酸鹽；烷基芳基磺酸鹽，諸如烷基-苯磺酸鹽或低級(jí)烷基萘磺酸鹽，例如，丁基-萘磺酸鹽；磺化萘-曱醛縮合物的鹽；磺化苯酚-曱醛縮合物的鹽；更為復(fù)雜的磺酸鹽，諸如，酰胺石黃酸鹽，例如油酸和N-曱基牛膽堿的磺化縮合產(chǎn)物；或二烷基磺基琥珀酸鹽，例如二辛基琥珀酸酯的磺酸鈉。非離子試劑包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或脂肪-烷基或烯基取代的苯酚與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物、多元醇醚的脂肪酯，例如，山梨聚糖脂肪酸酯，所述酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，例如，聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷、炔二醇諸如2，4,7,9-四乙基-5-癸炔-4，7-二醇，或乙氧基炔二醇的嵌段共聚物。陽(yáng)離子表面活性劑的實(shí)例包括，例如，脂肪族一元胺、二元胺或多聚胺的諸如醋酸鹽、環(huán)烷酸鹽或油酸鹽；或者含氧胺，諸如聚氧乙烯烷基胺的胺氧化物；通過(guò)縮合羧酸和二元或多聚胺制備的酰胺鍵合的胺；或者季銨鹽。惰性材料的實(shí)例包括但不限于無(wú)機(jī)礦物質(zhì)諸如高嶺土、頁(yè)硅酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽或者植物材料諸如軟木、粉狀玉米穗軸、花生殼、稻殼和胡才兆殼。實(shí)施方式的組合物能是用于直接應(yīng)用或作為初始組合物濃縮物的適當(dāng)形式，所述濃縮物在應(yīng)用前需要用適量的水或其它稀釋劑稀釋。殺蟲(chóng)劑濃度依特定制劑的性質(zhì)而變化，具體地，依它是濃縮物還是要直接使用而變化。所述組合物包含1%至98%的固體或液體惰性載體，以及0°/。至50%或0.1%至50%的表面活性劑。以商品標(biāo)簽上的比率施用所述組合物，例如干燥形式時(shí)每英畝約0.01lb-5.0lb，液體形式時(shí)每英畝約0.01pts,10pts.。在另一實(shí)施方式中，配制前能處理實(shí)施方式的組合物和轉(zhuǎn)化的微生物及殺蟲(chóng)蛋白，從而在將其應(yīng)用至靶害蟲(chóng)的環(huán)境時(shí)，延長(zhǎng)殺蟲(chóng)活性，只要預(yù)處理對(duì)殺蟲(chóng)活性沒(méi)有害處。可以通過(guò)化學(xué)和/或物理手段進(jìn)行所述處理，只要所述處理不有害地影響一種或多種組合物的性質(zhì)?；瘜W(xué)試劑的實(shí)例包括但不限于卣化劑；諸如曱醛和戊二醛的醛；抗感染劑，諸如氯化卡烷氨；醇，諸如異丙醇和乙醇；以及組織學(xué)固定劑，諸如布安固定劑(Bouin，sfixative)和海利氏固定劑(Helly，sfixative)(參見(jiàn)，例如Humason(1967)顛應(yīng)/77扁e7fec/2m々腦(動(dòng)物組織技術(shù))(W.H.FreemanandCo.)。在其它實(shí)施方式中，可以有利地用例如胰蛋白酶的蛋白酶處理Oy毒素多肽，>夂人而在將實(shí)施方式的殺蟲(chóng)蛋白組合物應(yīng)用至靶害蟲(chóng)環(huán)境之前活化所述蛋白。本領(lǐng)域公知通過(guò)絲氨酸蛋白酶活化毒素原的方法。參見(jiàn)，例如，Cooksey(1968)所oc/z亂J.6:445-454和CarrollandEllar(1989)所oc/zem.乂261:99-105，通過(guò)引用將其教導(dǎo)并入本文。例如，適當(dāng)?shù)幕罨僮鞑襟E包括但不限于將待活化多肽，例如純化的新的CV_y多肽(例如，具有如SEQIDNO:2所述的氨基酸序列)，與胰蛋白酶在20nMNaHCO3，pH8中，以蛋白/胰蛋白酶重量比1/100相組合，并且將所述樣品在36C消化3小時(shí)?？梢栽诤οx(chóng)開(kāi)始出現(xiàn)或在害蟲(chóng)出現(xiàn)前，將組合物(包含實(shí)施方式的所轉(zhuǎn)化微生物和殺蟲(chóng)蛋白)作為保護(hù)措施應(yīng)用于昆蟲(chóng)害蟲(chóng)環(huán)境，所述應(yīng)用通過(guò)例如，噴灑、霧化、粉化、散布、包被或傾倒、引入土壤或引至土壤表面、引入灌溉水，其通過(guò)種子處理或通常的應(yīng)用或粉化。例如，可以將實(shí)施方式的殺蟲(chóng)蛋白和/或轉(zhuǎn)化的微生物與谷物混合，從而保護(hù)儲(chǔ)藏期的谷物。通常重要的是在植物生長(zhǎng)早期獲得對(duì)害蟲(chóng)的良好控制，因?yàn)榇藭r(shí)植物可以受到最為嚴(yán)重的損害。如認(rèn)為有必要，實(shí)施方式的組合物可以方4更地包含另一殺昆蟲(chóng)劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，在種植時(shí)，將組合物直接應(yīng)用至土壤，所述應(yīng)用是以載體和芽孢桿菌菌抹或?qū)嵤┓绞剿D(zhuǎn)化微生物的死細(xì)胞的組合的顆粒形式。另一實(shí)施方式是組合物的顆粒形式，所述組合物包含農(nóng)用化學(xué)品，諸如，例如，除草劑、殺昆蟲(chóng)劑、肥料、惰性載體和芽孢桿菌菌抹或?qū)嵤┓绞降乃D(zhuǎn)化纟效生物的死細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，不是所有化合物對(duì)全部害蟲(chóng)都具有同樣效果。實(shí)施方式的化合物顯示抗昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的活性，所述害蟲(chóng)可以包括經(jīng)濟(jì)上重要的農(nóng)藝學(xué)害蟲(chóng)、林業(yè)害蟲(chóng)、溫室害蟲(chóng)、苗圃害蟲(chóng)、觀(guān)賞品害蟲(chóng)、食物和纖維害蟲(chóng)、公眾和動(dòng)物健康害蟲(chóng)、家用和商用建筑害蟲(chóng)、家用品害蟲(chóng)和儲(chǔ)物害蟲(chóng)。昆蟲(chóng)害蟲(chóng)包括選自鞘翅目、雙翅目、膜翅目(Hymenoptera)、鱗翅目、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、纓翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等、特別是鱗翅目的昆蟲(chóng)。鱗翅目的幼蟲(chóng)包括但不限于夜蛾科(Noctuidae)的粘蟲(chóng)、切根蟲(chóng)、尺蠖和heliothine:秋粘蟲(chóng)0S/odo,ra如妳eWaJESmith,fallarmyworm);甜菜夜蛾(6".ex/gwaHtibner，beetarmyworm);斜纟丈夜蛾(S./"wraFabhcius,tobaccocutworm，clustercaterpillar);搭帶夜蛾(M函eWraco"化wratoWalker，berthaarmyworm);甘藍(lán)夜蛾6raww'caeLinnaeus,cabbagemoth);黑切才艮蟲(chóng)(jgro"sz]pw7owHufnagel,blackcutworm);西部切才艮蟲(chóng)(AowAogom'aMorrison,westerncutworm);茅貞沖立夜蛾(Ast/6fe;ra"eaFabricius,granulatecutworm),木沖帛蟲(chóng)argz.〃aceaHtibner，cottonleafworm);粉纟丈夜蛾(JWc/zo//,'am'Htibner，cabbagelooper);大豆夜械(尸化m^/o//,'"/wc/z/dmsWalker,soybeanlooper);黎豆夜域(Jw"carw'agemma^z/^Htibner，velvetbeancaterpillar);苜蓿綠夜蛾(/fy/ewasc"6raFabricius,greencloverworm);煙芽夜蛾(i7e//0^^v/mscmsFabricius,tobaccobudworm);—星粘蟲(chóng)(尸化w^/e"'aHaworth,armyworm);粗皮夜蛾(^^/e"51BarnesandMcdunnough，roughskinnedcutworm);暗緣地老虎(五wxo"mewon'aHarris,darksidedcutworm);i矣及金^岡4占z'wsw/tm"Boisduval，spinybollworm);翠纟丈金鋼鉆(五.W"e〃aFabricius,spottedbollworm);美洲才帛鈴蟲(chóng)(/fe/Zcove^paoTTm-genatHiibner，Americanbollworm);谷實(shí)夜蛾(/Z！zeaBoddie,cornearworm或cottonbollworm);纟丈蝶毛蟲(chóng)(Me/a"c/znafHarris,zebracaterpillar);斥甘才離夜蛾(五g/ra(々/ow_yges)c訓(xùn)'a//51Grote，citruscutworm);螟蛾科(Pyralidae)的鉆孑L蟲(chóng)、鞘蛾、結(jié)網(wǎng)毛蟲(chóng)、J求果蛾以及斑蛾歐洲玉米螟(0^n'm'flm^z7a/^Htibner，Europeancornborer);臍檢螟(」附少e/0^fnmste〃aWalker,navalorangeworm);地中海4分斑螟04w"gaWaA^e/m'e〃"Zeller，Mediterraneanflourmoth);干果斑螟(CWrac滅e〃aWalker,almondmoth);二化螟(C7n7osw//mwa/z、Walker，ricestemborer);斑禾草螺(C./a他〃ws,sorghumborer);米斌(Corcyracep/w/om'caStainton,ricemoth);玉米才艮結(jié)網(wǎng)毛蟲(chóng)(CVam6wsca/Zgiwos^/wjClemens,cornrootwebworm);藍(lán)草結(jié)網(wǎng)毛蟲(chóng)(C.化^re〃M;Zincken，bluegrasswebworm);稻縱巻葉野螟(C"a//wf/ocroc^wed/"a/^Guenee，riceleafroller);葡萄巻口十蟲(chóng)(Z)e雄z'a/wwera/z、Hiibner,grapeleaffolder);甜瓜野螺(Z)z'<3p/2"m'a/2"/z'"a^j！Linnaeus,melonworm);泡菜蟲(chóng)mY油/^Stoll，pickleworm);西南玉米螺(Z)/a加eorgrawd/ose〃aDyar,southwesterncornborer);小蔗螟(Z).^"/^"/&Fabricius，surgarcaneborer);墨西哥水牙舀螺CEbretwza/q/h'm.Dyar,Mexicanriceborer);火因草斗分螺(五//zes"ae/她〃flHiibner,tobacco(cacao)moth);錯(cuò)螺(GW/en'a膨〃o"e〃aLinnaeus,greaterwaxmoth);寶予螺(/Zerpefogra附附fl[//carwi"http://*Walker,sodwebworm);向曰蔡斑螺(Z/owoecwo^2e/ecte〃wmHulst,sunflowermoth);南美玉米苗斑螟(￡70附0/7"—j//g"ose〃iwZeller，lessercornstalkborer);小蠟螟(^c/zra/aFabricius,lesserwaxmoth);草地螺(丄oxos^egeWc"'ca/z\yLinnaeus,beetwebworm);茶樹(shù)螺(Ot/zaganW/sWalker,teatreewebmoth);豆野螟(Man/cates/Wa/z'sGeyer,beanpodborer);印度谷螟(P/od/az'w妙/nmcfe〃aHiibner,Indianmealmoth);三化螺(5Wc"http://zag"/wceWw/osWalker,yellowstemborer);溫室螟(C/^e"n^/ga/hGuenee，celeryleaftier);以及巻蛾科(Tortricidae)的巻葉蟲(chóng)、辨蟲(chóng)、種實(shí)蟲(chóng)以及果實(shí)蟲(chóng)黑頭巻葉蛾04c/eWsg/overa"aWalsingham,Westernblackheadedbudworm);黑頭長(zhǎng)翅巻蛾(Avan'awaFernald,Easternblackheadedbudworm);果樹(shù)黃巻械(argyro—/"Walker，fruittreeleafroller);歐洲巻葉蛾(AmsawaLinnaeus,Europeanleafroller);以及其他的黃巻蛾屬04rc/n)w)物種沖帛褐帶巻蛾(^oxo//z戸orawaFischervonR6sslerstamm，summerfruittortrixmoth);條纟丈向日葵螟(CW^/Zs./z哪&sWalsingham,bandedsunflowermoth);棒小巻蛾(C>^/aa2爭(zhēng)/vea""Walsingham，filbertworm);蘋(píng)果蠹蛾(C.pomowe〃aLinnaeus,codingmoth);雜色巻葉械(iV,"otoy7ave^maClemens,variegatedleafroller);荷蘭石竹小巻蛾(尸.地/to"aWalsingham,omnivorousleafroller);歐洲葡萄小巻葉蛾(丄o6ew'a6Cra"oDenis&Schiffermiiller,Europeangrapevinemoth);蘋(píng)白小巻蛾(浙/owo^roce〃朋aDenis&Schiffermiiller，eyespottedbudmoth);萄果實(shí)蟲(chóng)主蟲(chóng)(五"(iop^3vz."a"aClemens，grapeberrymoth);女貞纟田巻蛾(五w/oecz7/a歸6一e〃"Hlibner，vinemoth);巴西蘋(píng)果巻葉蛾(5o"agoto5^/z/6n.co/aMeyrick,Brazilianappleleafroller);梨小食心、蟲(chóng)(Grap/2o/〃awo/eWaBusck，orientalfruitmoth);向日蔡芽蛾OSWe/wa/2e/z'a"A朋aRiley,sunflowerbudmoth);條巻斌(」z-g7ratoew/(2spp.);尾蟲(chóng)夾蝶(C72o〃'加wewmspp.)。鱗翅目的所選其它農(nóng)藝害蟲(chóng)包括但不限于秋星尺蠖(J/jo//n7a;o膨ton'aHarris,fallcankerworm);桃枝麥械(Jwam.a"weafe〃aZeller，peachtwigborer);犀額蛾(Jmioto"贈(zèng)onVJ.E.Smith,orangestripedoakworm);樸香(v4w^eraeaj!er—Guerin畫(huà)Meneville，ChineseOakSilkmoth);家蠶(5ow6少;cmon'Linnaeus,Silkworm);沖帛潛蛾(5wcc"/afn'xBusck，cottonleafperforator);苜蓿黃蝶(Co/Zosewo^e膨Boisduval，alfalfacaterpillar);胡^^黃蝶(Z)atowa/w^g^r/zwaGrote&Robinson,walnutcaterpillar);落葉松毛蟲(chóng)(Z)ew^-o/z'附i^s/Z)zWciwTschetwerikov,Siberiansilkmoth);白尺獲CE"womossw657'gwon'aHtibner，elmspanworm);菩提尺蠖(五ayw"^Harris,lindenlooper);黃毒蛾(J5wproc"sc/，o^r/zoeaLinnaeus,browntailmoth);黑4以蛉蛾(i/am'w'"a"wen.cawaGuerin-Meneville，grapeleafskeletonizer);范圍毛蟲(chóng)飛蛾(Z/e附z7ewcao//WaeCockrell，rangecaterpillar);美國(guó)白蛾(i/j^ha欣/acwweflDrury，fallwebworm);番癡蠹械(Kez/en'a/_yco/em'ce〃aWalsingham,tomatopinworm);二尾蟲(chóng)夾蝶(ZamW/wa力ce〃an'"y^ce〃an'aHulst，Easternhemlocklooper);西部鐵杉尺蠖(丄./^ce〃an.G/wgw6nMaHulst,Westernhemlocklooper);湘卩毒蛾(丄ewccw2a■^//"■sLinnaeus,satinmoth);舞毒蛾(丄，aw^7'aifeparLinnaeus,gypsymoth);番癡天蛾(M(3"dwca拜'"《wewacw/atoHaworth，fivespottedhawkmoth,tomatohornworm);煙草天(Af.sextoHaworth,tomatohornworm,tobaccohornworm);冬尺峻(Clpen9;似era6r,afaLinnaeus,wintermoth);春尺蠖(尸a/e"cr""vematoPeck,springcankerworm);大鳳蟲(chóng)萊(Pa/7〃/ocrw//zo"fesCramer,giantswallowtail，orangedog);力口州才朱蟲(chóng)(/V^ygamWoca/zybrw'caPackard,Californiaoakworm);才計(jì)才慈;昝葉域(/7^〃ocw/W/s"Yre〃"Stainton，citrusleafminer);Jil幕潛pt蛾(/Vy/Z/owo/^cfe/"Z/awcarfife//"Fabricius，spottedtentiformleafminer);大菜粉蝶CP/e"'56mssz'caeLinnaeus,largewhitebutterfly);小菜粉蝶(i3.ropaeLinnaeus,smallwhitebutterfly);暗脈菜粉蝶(P.Linnaeus,greenveinedwhitebutterfly);洋薊習(xí)習(xí)蛾(/Va妙"/zVacar血zW"外/aRiley，artichokeplumemoth);菱斑餓(/7*〃a砂/oste〃"Linnaeus，diamondbackmoth);坤帛纟工鈴蟲(chóng)(戶(hù)e"z'wo//zon3gass3^/e〃flSaunders，pinkbollworm);南方菜械(尸o油'a/roto<i/ceBoisduval&Leconte,Southerncabbageworm);雜食尺蠖Wc^esGuenee，omnivorouslooper);康辛嫌(^Sc/2/zwracowc/ww<3J.E.Smith,redhumpedcaterpillar);麥蛾0S/,o/rogcrOlivier,Angoumoisgrainmoth);松異帶械(7Tia歸e啤oea/";yocaw戸Schifferaiuller，.pineprocessionarycaterpillar);結(jié)網(wǎng)衣域(77weo/a6^e〃zW/aHummel,webbingclothesmoth);番癡斑潛蟲(chóng)邑(7Waafoo/wtoMeyrick,tomatoleafminer);蘋(píng)果巢斌(1^7owomewfa/acfe〃aLinnaeus，erminemoth);i/e/Zo^n'sst/6y7e:raGuenee;天幕毛蟲(chóng)(Afo/acaso附flspp);以及毒蛾(Ogy/aspp)。鞘翅目的幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)包括長(zhǎng)角象鼻蟲(chóng)科(Anthribidae)、豆象科(Bmchidae)以及象曱科(Curculionidae)的象鼻蟲(chóng)(包括但不限于棉鈴象曱(Jw決owo附wjBoheman，bollweevil);稻水象曱(ZijJor/wp/^Ay0，0//n7twKuschel，ricewaterweevil);谷象(57fo//n7t/sgrawaWwsLinnaeus，granaryweevil);米象(S.o，aeLinnaeus,riceweevil);三葉草葉象(外/7era/w"c加flFabricius,cloverleafweevil);向日葵莖象曱(Cy/zWrac0/7^msa^y/e"i^LeConte，sunflowerstemweevil);紅色種子象曱(5>w'cn9">a/w/msLeConte,redsunflowerseedweevil);灰色種子象曱soniz^ASLeConte，graysunflowerseedweevil);玉米象甲(5^/7ewop/zon^附azW/sChittenden,maizebillbug);葉曱一牛(Chrysomelidae)的跳甲、黃瓜葉甲、根蟲(chóng)、葉曱、馬鈴薯葉曱以及潛葉蟲(chóng)(包括但不限于牙牛羅4立多州馬鈴薯曱蟲(chóng)(Z^ep""ofl"fitdecew〃we"toSay,Coloradopotatobeetle);玉米才艮螢葉甲(Z)/a6rodcavz>g7/eravz>gz/eraLeConte,westerncornrootworm);巴氏才艮葉曱(Z).Zar6en'Smith&Lawrence,northerncomrootworm》黃瓜十一星葉甲(Z).w"fifec/w/wwc加"/owaWBarber,southerncornrootworm);玉米浪匕曱(C7zaefoc"e/wa;/w/z'c<ar/"Melsheimer，cornfleabeetle);十字花牙+淑匕甲(戶(hù)/^//0&"(3cra"/eraeGoeze，cornfleabeetle);葡萄肖葉曱(Co/a，i6rw"weaFabricius,grapecolaspis);黑角負(fù)泥蟲(chóng)(Ow/emame/a"o/w51Linnaeus,cerealleafbeetle);向日葵葉曱(Zjvgogramwaexc/amaf/omSFabricius,sunflowerbeetle));瓢蟲(chóng)科(Coccinellidae)的曱蟲(chóng)(包括但不限于墨西哥豆瓢蟲(chóng)(五尸//"^""van'ves"sMulsant,Mexicanbeanbeetle);蜣,科(Scarabaeidae)的金龜子和其他的曱蟲(chóng)(包括但不限于日本金龜子(尸o;z7/^力/om'ca7Vewmaw，Japanesebeetle);北方圓頭犀金龜(C少c/0cep/n2/aArrow,northernmaskedchafer，whitegrub);南方圓頭犀金龜(C./wmacw/afaOlivier,southernmaskedchafer,whitegrub);歐;州金龜(//n.zo^ogMsRazoumowsky，Europeanchafer);蜂螬(尸/y^/0//2agacn'm'toBurmeister，whitegrub);胡蘿卜曱蟲(chóng)(///gyriwg/66osmDeGeer，carrotbeetle));皮蠹科(Dermestidae)的地毯圓皮蠹；叩曱科(Elateridae)的線(xiàn)蟲(chóng)偽金針蟲(chóng)(E/eocfesspp.)、金針蟲(chóng)(Me/a"o^yspp.)、單葉叩甲(Cowodemyspp.)、Ziwom'twspp.、雄尾叩曱(々r/她5spp.)、CVem'ceraspp.、^eo/wspp.;小蠹科(Scolytidae)的小蠹蟲(chóng)以及擬步甲科(Tenebrionidae)的曱蟲(chóng)。雙翅目的成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)包括諸如玉米斑潛葉蠅(jgramj^a;^rvz.co簡(jiǎn)'sLoew,cornblotchleafminer)的潛葉錄；蟲(chóng)丈(包括但不限于高粱癭蚊(Co"ton'm'"sorg/n'co/ofCoquillett，sorghummidge);黑森癭蚊(Ma_yWo/atfe^w"orSay，Hessianfly);麥紅吸漿蟲(chóng)(幼o(hù)卻/o57's附ose〃awaGehin，wheatmidge);蔡花庫(kù)予蟲(chóng)丈(A^0/aw/0pfen2附wr(/^/(^z'awaFelt，sunflowerseedmidge));果實(shí)蠅(實(shí)蠅科(T印hritidae))，瑞典稈蠅(Osc/"e〃a/nYLinnaeus,fritflies);蛆(包括但不限于灰地種蠅(De/^//她raMeigen，seedcornmaggot);麥種蟲(chóng)龜(Z).coarctotoFallen,wheatbulbfly);以及其它i也種蟲(chóng)黽(Z)e/Zas/^.)，美洲詳f蟲(chóng)黽(Aferow少zaa附er/c""aFitch，wheatstemmaggot);舍蟲(chóng)乾(Mwxcat/函eWc"Linnaeus,houseflies);夏廁蟲(chóng)是(7^"m'acaw/c"/aniLinnaeus),小舍蟲(chóng)乾(F.々膨n2feStein,lesserhouseflies);厭螫蟲(chóng)雖(5V蘭o平ca/c"m"sLinnaeus,stableflies));-火家錄、角蟲(chóng)菱、麗蟲(chóng)菱、金錄(c7w3Asom3/aspp.);i^犬錄(P/zonm.(3spp.);以及其他的苔蘚蠅害蟲(chóng)，馬蠅，虻(r^amwspp.);胃蠅，胃蠅(GaWrop/n7^spp.);狂繩(6tomsspp.);牛皮錄，皮繩(外pocfermaspp.);斑虻，斑虻(C7z，o/wspp.);纟帛羊虱蟲(chóng)是(Me/op/wgwov/wwsLinnaeus，keds);以及其他的短角亞目(5rac/y^cera)，蚊子，伊—蚊(Jeafesspp.);按蚊(Jwo//ze/wspp.);庫(kù)蟲(chóng)丈(Cw/exspp.);黑蟲(chóng)電，原蟲(chóng)內(nèi)(/Vayz-mw"wmspp.);蟲(chóng)內(nèi)0S!7nw/z'wmspp.);咬蠓、白蛉、尖目艮蕈蚊和其"f也長(zhǎng)角亞目(A^mafocem)。半翅目和同翅目的成蟲(chóng)和若蟲(chóng)包括昆蟲(chóng)，諸如但不限于球蟲(chóng)牙科(Adelgidae)的球辨、盲蝽科(Miridae)的盲蝽、蟬科(Cicadidae)的蟬、葉蟬科(Cicadellidae)的葉蟬、小綠葉蟬CEm/oascaspp.);菱飛虱科(Cixiidae)、蛾蠟蟬科(Flatidae)、蠟蟬總科(Fulgoroidea)、圓飛虱科(Issidae)以及稻虱科(Delphacidae)的飛虱；角蟬科(Membracidae)的角蟬；木虱科(Psyllidae)的木虱；粉虱科(Aleyrodidae)的粉虱；蚜科(Aphididae)的坊蟲(chóng)；根瘤奸科(Phylloxeridae)的根瘤蚜；粉蚧科(Pseudococcidae)的粉蟲(chóng)介；鏈介殼蟲(chóng)科(Asterolecanidae)、軟介殼蟲(chóng)科(Coccidae)、洋紅蟲(chóng)介-牛(Dactylopiidae)、盾介殼蟲(chóng)科(Diaspididae)、絨蟲(chóng)介科(Eriococcidae)、旌介殼蟲(chóng)科(Ortheziidae)、刺葵介殼蟲(chóng)科(Phoenicococcidae)以及碩介殼蟲(chóng)科(Margarodidae)的介殼蟲(chóng)；網(wǎng)棒科(Tingidae)的網(wǎng)砵；蝽-牛(Pentatomidae)的九香蟲(chóng)；長(zhǎng)蝽-牛(Lygaeidae)的麥長(zhǎng)蝽，長(zhǎng)椿(祝/xmyspp.);以及其他的蝽類(lèi)(seedbugs),沫蟬科(Cercopidae)的沫蟬、緣蝽科(Coreidae)的南瓜緣蝽、以及紅蝽科(Pyrrhocoridae)的《火恙蟎和棉蝽。同翅目中農(nóng)藝上重要的成員還包括但不限于豌豆辨(jc,f/^—ow一,Harris,peaaphid);雖工豆蟲(chóng)牙(^4//2/51cr"cc/voraKoch，cowpeaaphid);黑豆蟲(chóng)牙(Ay^6dfeScopoli，blackbeanaphid);棉蟲(chóng)牙(j.gos\y_y/"Glover,cottonaphid，melonaphid);玉米才艮蟲(chóng)牙(Aw"zWrad/c/jForbes,cornrootaphid);蘋(píng)果黃蟲(chóng)牙(Ap畫(huà)z.DeGeer,appleaphid);繡線(xiàn)菊蟲(chóng)牙(j.sj9/raeco/aPatch,spireaaphid);溝無(wú)網(wǎng)蟲(chóng)牙(Jw/acoW/2wmso/tmz'Kaltenbach,foxgloveaphid);草莓釘蟲(chóng)牙(C7w^o一/zo"_/h3ga^/b///Cockerell,strawberryaphid);麥只又尾蟲(chóng)牙(DiuraphisnoxiaKurdjumov/Mordvilko，Russianwheataphid);玫瑰蘋(píng)果蟲(chóng)牙(D;Asap/^//aw^g7.we"Paaserini,rosyappleaphid);蘋(píng)果纟帛蟲(chóng)牙(五rz'asowa/aw/gerwmHausmann,woollyappleaphid);甘藍(lán)蟲(chóng)牙C8rev/co，e6ra肌.caeLinnaeus,cabbageaphid);,匕4分大尾蟲(chóng)牙(外"/o/&n^/n/m'Geoffroy，mealyplumaphid);蘿卜蟲(chóng)牙(jL—er戸'm/Kaltenbach，turnipaphid);麥無(wú)網(wǎng)長(zhǎng)管蟲(chóng)牙(A/^opo/op/z/ww(^>r/2o<iw2Walker,cerealaphid);大,戈長(zhǎng)管蟲(chóng)牙(Afocrasz)/zi/mewp>/zo-6z'aeThomas,potatoaphid);》因沖兆蟲(chóng)牙(j^"zwspem'caeSulzer,peach-potatoaphid，greenpeachaphid);萬(wàn)苣蟲(chóng)牙(iVaso"ov/aW6/，.gWMosley,lettuceaphid);癭纟帛蟲(chóng)牙(尸em//z/giwspp.，rootaphids和gallaphids);玉米蟲(chóng)牙(及/o/a/ow)/m附wazWziFitch,cornleafaphid);禾谷纟益管蟲(chóng)牙(及.Linnaeus,birdcherry-oataphid);麥二叉蟲(chóng)牙((Sc/n'z(3p/^graw/"wmRondani,greenbug);黃色甘蔗蟲(chóng)牙(5^/za/7av"Forbes,yellowsugarcaneaphid);麥長(zhǎng)管蟲(chóng)牙(幼06/owavew"eFabricius,Englishgrainaphid);苜蓿斑蟲(chóng)牙(772en'oa//n'smacw/atoBuckton，spottedalfalfaaphid);黑色4甘橘蟲(chóng)牙(7bjco/&raawraw"z'BoyerdeFonscolombe，blackcitrusaphid)以及褐色桔蟲(chóng)牙(r.c〃n.c/<i(3Kirkaldy,browncitrusaphid);王求蟲(chóng)牙(/Ue/g^spp.，adelgids);長(zhǎng)山核4兆才艮瘤蟲(chóng)牙(P/z_y〃oxeracfeva逾fn'xPergande，pecanphylloxera);甘薯粉虱C6ew/s/ato6ac/Gennadius，tobaccowhitefly,sweetpotatowhitefly);4艮葉4分H(5.arge油yb/〃Bellows&Perring，silverleafwhitefly);甜桔粉H(Z)/a/ewn9^"Yn.Ashmead，citruswhitefly);煙粉虱(7Wa/ewn3(iasaZmo7owews,bandedwingedwhitefly)以及;顯室白4分虱(71.va/onar/or"附Westwood,greenhousewhitefly);馬鈴薯小綠葉蟬(五mpowca/ateHarris,potatoleafhopper);灰飛虱(￡"0<^///^"0:Wn,afe〃船F(xiàn)allen,smallerbrownplanthopper);紫菀葉蜂(M"cro/e他s《i/"(i〃7/wea加Forbes,asterleafhopper);黑尾葉蟬(iVe//20她/jccz'w"cej:wUhler，greenleafhopper);二條黑尾葉蟬(Wm'^op/"twStal,riceleafhopper);褐飛虱(M/a/arv齒/wgmsStal,brownplanthopper);玉米飛虱(尸eregn'wwsmaz'必Ashmead,cornplanthopper);白背飛虱(5"og她〃a/wr"y^raHorvath,white-backedplanthopper);稻飛虱(5bgvaf/ocZ&son'z/co/aMuir,ricedelphacid);蘋(píng)果白葉蟬(7y/Wocy6a/oman'aMcAtee，whiteappleleafhopper);葡萄葉蟬(五，/zroweowraspp.,grapeleafhoppers);十七年蟬(M，'c/ca<iasepfewcfec/附Linnaeus,periodicalcicada);吹纟帛蟲(chóng)介(/ce;7w/wc/z,'Maskell，cottonycushionscale);梨園盾蟲(chóng)介(^wadra—Wo^s/erm'c/osmComstock，SanJosescale);甜桔警纟丈粉蟲(chóng)介(尸/"wococcz^Risso，citrusmealybug);粉蜍的種(尸^wdococcwspp.)(其他的粉蟲(chóng)介系群)；梨木虱(Caco/w少〃"/>Wco/"Foerster,pearpsylla);神木氛(TWozaAshmead，persimmonpsylla)。半翅目中農(nóng)藝上重要的物種包括但不限于稻綠蝽(jcms^7mmZn7"reSay,greenstinkbug);南瓜緣棒(Jwasa^-/WjDeGeer，squashbug);麥長(zhǎng)蝽(5/z'^w51/e"co/fe/^s/ewco/&n^Say,chinchbug);方翅網(wǎng)棒(Co/^/mcagossjvp/z-Fabricius，cottonlacebug);番癡蜂(C,鄉(xiāng)e/"swo(ieWaDistant,tomatobug);沖帛棒(Z^5^en7wsw^we〃iwHerrich陽(yáng)Schaffer，cottonstainer);4曷臭棒(五wsc/ni^Asservt^Say,brownstinkbug);—斑臭棒(五.var/oAar/wjPalisotdeBeauvois，one-spottedstinkbug);長(zhǎng)棒(Graptostethusspp.)(果實(shí)漆系群(complexofseedbugs));^"葉才艮棒(丄e/^og/o^wscorcw/twSay,leaf-footedpineseedbug);美國(guó)牧草盲棒(Z^gt/s/z'"eo/"W^PalisotdeBeauvois,tarnishedplantbug);豆莢草盲棒(丄.//邵er附Knight,Westerntarnishedplantbug);牧草盲棒(丄./rafe肌iLinnaeus,commonmeadowbug);長(zhǎng)毛草盲棒(丄.rwgw/—wm\sPoppius，Europeantarnishedplantbug);長(zhǎng)綠盲棒(Z^gocon,j/^"http://""■sLinnaeus,commongreencapsid);7Jc稻稻綠蜂vzW<iw/aLinnaeus,southerngreenstinkbug);稻棒((9e6"/wspwgwaxFabricius,ricestinkbug);哭角長(zhǎng)棒(OMCope/fi^s^s"'afwsDallas,largemilkweedbug);沖帛盲蝽(i^eM^a^omojce/^sen'afw51Reuter,cottonfleahopper)。65半翅目中包括的害蟲(chóng)包括草莓椿(Ca/ocoW^worv^g/cwsGm6lin,strawberrybug);CVf/zopsLinnaeus;蘋(píng)盲棒(尸/ew.ocon^n/g/co〃/i1Fallen,applecapsid);番癡椿(Cywo/e/^ywocfestwsDistant,tomatobug);》因草小盲蝽(Cywope/^swotof^Distant,suckfly);白扭王盲蜂你朋agom'cws"/Zo^wc/齒sReuter，whitemarkedfleahopper);急莢棒(Z)Za/7/wocon\sc/z/on'om'sSay,honeylocustplantbug);洋蔥棒(丄aZ)opzW/co/(3a〃/z'Knight,onionplantbug);才帛盲椿(i^ei^atomosce/^sen'atoReuter,cottonfleahopper);苜蓿褐盲棒(^4cfe/p/zocon'sSay,rapidplantbug);四線(xiàn)盲棒(尸oe"7oca/w"s//weatoFabricius，four-linedplantbug);擬麥長(zhǎng)棒(jV戸eWcaeSchilling,falsechinchbug);茶黃薊馬(Tyyw'附Howard,falsechinchbug);稻青椿(7VezaraWr油/aLinnaeus,Southerngreenstinkbug);扁盾棒(五町ga他r負(fù)子蝽(5/ostom"/7Waes/;.);獵棒(iedwv"(iae以及臭棒螨(Acari)(螨(mites))目的成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)包括小麥巻葉螨(Jew/atos/c//e〃aKeifer，wheatcurlmite);褐色小麥竭(jPe/ra6/a/aferaMiiller，brownwheatmite);葉螨^KTetranychidae)的蛛錄和恙蟎，歐洲葉蟎(尸awo"yc/zM51w/附/Koch,Europeanredmite);二斑葉蟎(7^ra"yc/mswWcaeKoch，twospottedspidermite);邁葉蟲(chóng)禹(r.mcdam'e//McGregor,McDanielmite);朱砂葉螨(T"."'朋a6an'簡(jiǎn)sBoisduval,carminespidermite);土耳其斯i旦葉蟲(chóng)禹(71.fwrA:e""w/Ugarov&Nikolski，strawberryspidermite);纟田須蟎科(Tenuipalpidae)的扁平螨，葡萄短須螨(5revz》a/;ws/evWw'McGregor,citrusflatmite);癭螨-牛(Eriophyidae)的銹螨和芽癭螨以及其他的食葉螨和對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物健康重要的螨，即蜻科(Epidermoptidae)中的銹螨，蠕形螨科(Demodicidae)中的毛嚢蟲(chóng)，食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨，硬蜱科(Ixodidae)的扁虱，黑腳硬蜱(/xocfes5ra/w/an'sSay,deertick);全環(huán)硬蜱(/./o/o，/twNeumann,Australianparalysistick);美國(guó)狗壁虱(Z)evwacewforvan'<36///sSay,Americandogtick);美濟(jì)l壁SL(/lw26(yomm"amer/ca"wmLinnaeus,lonestartick);以及癢蟲(chóng)禹科(Psoroptidae)、蒲竭科(Pyemotidae)和濟(jì)竭科(Sarcoptidae)的癢螨和齊螨。纓尾目(Thysanura)中的蟲(chóng)害包括西洋衣魚(yú)(丄epz、ma^cc/jon'""Linnaeus,silverfish);'卜；)i衣魚(yú)(J77ermo6/ac/ow&st/caPackard,firebrat)。其他的節(jié)肢害蟲(chóng)包括蜘蛛目(Araneae)中的蜘蛛，如棕色隱遞蜘蛛(Zomyce/^srec/wsaGertsch&Mulaik,brownreclusespider);和黑寡婦錄口珠(丄a^Wecto/wa"araFabricius，blackwidowspider);和蟲(chóng)由挺目(Scutigeromorpha)中的蜈松,如蟲(chóng)由蟲(chóng)延(5"cw"geraco/eo/^ratoLinnaeus,housecentipede)?？梢栽诎l(fā)育早期，例如，如幼蟲(chóng)或其它未成熟形式，測(cè)試實(shí)施方式的組合物對(duì)蟲(chóng)害的殺蟲(chóng)活性?？梢栽谕耆诎禇l件下，于約20。C至約30。C，在約30%至約70°/。的相對(duì)濕度中培養(yǎng)昆蟲(chóng)。可以如CzaplaandLang(1990)J￡"fowo/.83(6):2480-2485所述進(jìn)行生物分析。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知培養(yǎng)昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)和進(jìn)行生物分析的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知各種生物分析技術(shù)。通常的程序包括向封口容器中的々欠食來(lái)源添加實(shí)驗(yàn)化合物或生物體。可以通過(guò)但不限于取食和暴露適當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間后的死亡率變化、體重減少、吸引、驅(qū)性和其它行為和物理變化，來(lái)測(cè)量殺蟲(chóng)活性?？梢詫?duì)幼蟲(chóng)期或成蟲(chóng)期的任何取食蟲(chóng)害使用本文所述的生物分析。通過(guò)說(shuō)明而非限制的方式陳述下列實(shí)施例。實(shí)施例實(shí)施例1:測(cè)試蘇云金芽孢桿菌毒素對(duì)所選昆蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性的生物分析進(jìn)行生物分析以評(píng)價(jià)如SEQIDNO:2所述的Bt殺昆蟲(chóng)毒素肽對(duì)歐洲玉米螟(0^n'm'awj^Z/a/^)、棉鈴蟲(chóng)(//e//cov^pazea)、黑切才艮蟲(chóng)^"/o")和-火津占蟲(chóng)(SpoJo/^erfl/rwgz》enia)的作用。3于包含殺昆蟲(chóng)蛋白的人工飲食進(jìn)行取食分析。使用鱗翅目特異性人工飲食來(lái)局部應(yīng)用殺昆蟲(chóng)蛋白。以每容器每25pl樣品0.3ng的比例應(yīng)用毒素，并將其干燥。該蛋白包含在pH10的lOmM碳酸鹽緩沖液中。每一容器放置一個(gè)新生幼蟲(chóng)，以隨意取食5天。如果有諸如萎縮和或死亡的幼蟲(chóng)反應(yīng)，則結(jié)果為陽(yáng)性。如果幼蟲(chóng)與食用僅應(yīng)用上述緩沖液的飲食的陰性對(duì)照相似，則結(jié)果為陰性。表1:SEQIDNO:2的取食生物分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>實(shí)施例2:用于測(cè)試蘇云金芽孢桿菌毒素對(duì)三化螟的殺蟲(chóng)活性的生物分析新生昆蟲(chóng)的制備從稻田(ARSMandya和Tattaguppe農(nóng)場(chǎng))采集三化螟(S"'o;/wga/wceWw/osWalker)成蟲(chóng)，并用稻類(lèi)植物飼養(yǎng)。在所述條件下存活3-4天的成蟲(chóng)在葉片上產(chǎn)下大量卵。隨葉的部分小心分割卯團(tuán)，分開(kāi)存放于密封的塑料陪替氏培養(yǎng)亞以室溫醉化。賻化后立即將新生蟲(chóng)用于建立生物分析。莖片段的制備利用實(shí)施方式的Bt毒素制備轉(zhuǎn)基因水稻植物。本領(lǐng)域已知諸如Hieiaa/.(PlantJournal1994,6(2),271-282)所述操作步驟的水稻轉(zhuǎn)化方法。從基部切割約55-60天齡的每一價(jià)水稻植物(每一植物為一事件)的分蘗，將其制成等大(約2cm)的5個(gè)片段。將全部片段置于陪替氏培養(yǎng)皿中的無(wú)菌濾紙盤(pán)上，并用蒸餾水潤(rùn)濕。類(lèi)似地，供養(yǎng)非Bt對(duì)照以比較。兩天后，向該螟提供來(lái)自各自事件的2-3個(gè)片段。生物分析在每板中，用小刷小心釋放5只新生三化螟/事件。用塑料膜將板密封，從而防止幼蟲(chóng)逃走。將全部板放入盤(pán)中，將其置入更大的含水食槽，室溫條件下保存。每天小心打開(kāi)全部板并再次密封，以提供新鮮空氣并且(如果有的話(huà))除去過(guò)多的凝結(jié)物，直至最后一次觀(guān)察。觀(guān)察5天后對(duì)幼蟲(chóng)死亡率和生長(zhǎng)進(jìn)行觀(guān)察。起初，在每一板中，4企查在全部莖片段表面上的任何已死幼蟲(chóng)。隨后，分葉片層地(一葉鞘一葉鞘地)縱向切開(kāi)莖片段，觀(guān)察組織內(nèi)是否存在死的或活的幼蟲(chóng)。存活的幼蟲(chóng)仍留在管內(nèi)，而死亡的幼蟲(chóng)則又黑又扁。-脫覺(jué)上比較存活幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)和非Bt對(duì)照的生長(zhǎng)。如表2結(jié)果所見(jiàn)，如SEQIDNO:2所示的Bt殺昆蟲(chóng)毒素肽對(duì)三化螟有活性。表2:來(lái)自18個(gè)事件的三化螟生物分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>實(shí)施例3:確定LC5o和EC5o進(jìn)行生物分析以確定如SEQIDNO:2所述的殺昆蟲(chóng)毒素肽對(duì)歐洲玉米螟(C^n'm'aww6z7a/f力、沖帛鈴蟲(chóng)(T/e/z'cove/7azea)和黑切才艮蟲(chóng)(」gra"s^w7o")和^火粘蟲(chóng)(iS/ot/o;ferayh/g^e/Y/a)的LC50和EC5o。，十包含殺昆蟲(chóng)蛋白的人工々大食進(jìn)行取食分析。殺昆蟲(chóng)蛋白用pH10的10mM碳酸鹽緩沖液和昆蟲(chóng)飲食稀釋?zhuān)赃_(dá)到10000，1000，100，10和1ng/cm2的毒素終濃度。每一容器放置一個(gè)新生幼蟲(chóng)，以隨意取食5天。在每一劑量下，一式八份進(jìn)行每一生物分析，將所述生物分析重復(fù)三次。通過(guò)死亡率將結(jié)果示作LC5。和/或通過(guò)稱(chēng)量每一毒素濃度下的存活幼蟲(chóng)將其示作EC50。實(shí)施例4:通過(guò)粒子轟擊和再生轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)化玉米用含有毒素核苷酸序列(例如，SEQIDNO:l)的DNA分子轟擊來(lái)自溫室供體^:物的未成熟玉米胚，所述毒素核苷酸序列與泛素啟動(dòng)子和可選才奪的標(biāo)志物基因PAT(WohllebenWa/.(1988)70:25-37)可操作連接，其賦予對(duì)雙丙氨磷除草劑的抗性?？蛇x擇地，在單獨(dú)的DNA分子上提供可選擇標(biāo)志物基因。如下進(jìn)行轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)基配方如下。耙組織的制備給穗去皮，用30。/。CloroxTM漂白劑加0.5%微去垢劑將其表面殺菌20分鐘，用蒸餾水漂洗兩次。切下并放置未成熟胚，胚軸一側(cè)向下(子葉盤(pán)一側(cè)向上)，每板25個(gè)胚，于560Y培養(yǎng)基放置4小時(shí)，隨后將其在2.5cm的靶區(qū)域內(nèi)排列，以備轟擊。DNA的制備制備包含與泛素啟動(dòng)子可操作連接的毒素核苷酸序列(例如SEQIDNO:l)的質(zhì)粒載體。例如，適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化載體包含與PinII終止子組合的玉米UBI1啟動(dòng)子、UBI1的5'UTR和UBI1內(nèi)含子。該載體另外包含CAMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的PAT可選擇標(biāo)志物基因，并包含CAMV35S終止子。任選地，可選擇標(biāo)志物可以位于單獨(dú)的質(zhì)粒上。使用如下的CaCl2沉淀程序，將包含毒素核苷酸序列和PAT可選擇標(biāo)志物的DNA分子沉淀至1.1pm(平均直徑)鴒球100nL含所制備鴒粒的水10pL(1lLig)溶于TrisEDTA緩沖液的DNA(1|ig總DNA)100(iL2.5MCaCl210pLO.lM亞精胺將每一試劑順次加入鴒粒懸浮液，同時(shí)置于多管渦旋器上。將最終混合物短暫超聲破碎，并使其在持續(xù)渦旋下孵育10分鐘。在沉淀期后，短暫離心所述管，移除液體，用500mL100%乙醇清洗，離心30秒。再移除液體，將105jxL100%乙醇添加至最終鎢粒小球。為粒子槍轟擊，將該鎢/DNA粒短暫超聲處理，并將10(iL點(diǎn)至每一大載體(macrocarrier)中心，并使其干燥約2分鐘，隨后進(jìn)行轟擊。粒子槍處理用粒子槍弁HE34-1或弁HE34-2在水平#4下轟擊樣品板。所有樣品接受650PSI下的單次射擊，總共一式十份，其取自具有所制備粒/DNA的每一管。隨后的處理轟擊后，將胚置于560Y培養(yǎng)基2天，隨后將其轉(zhuǎn)至含有3mg/升雙丙氨磷的560R選擇培養(yǎng)基，每2周傳代培養(yǎng)。選擇約10周后，將抗選擇的愈傷克隆轉(zhuǎn)至288J培養(yǎng)基，以起始植物再生。在體細(xì)胞胚成熟(2-4周)后，將發(fā)育良好的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)至出芽培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)室。約7-10天后，將發(fā)育中的苗轉(zhuǎn)至管中的272V無(wú)激素培養(yǎng)基，培養(yǎng)7-10天，直至苗得到良好建成。隨后將植物轉(zhuǎn)至含有盆栽土的淺箱(等同于2.5〃盆)的墊子上，使其在生長(zhǎng)室內(nèi)生長(zhǎng)l周，隨后再在溫室中生長(zhǎng)l-2周，接著將其轉(zhuǎn)移至典型的600盆(1.6加侖)，并使其生長(zhǎng)至成熟。通過(guò)本領(lǐng)域已知的或如上所述的分析，監(jiān)測(cè)并評(píng)分植物的毒素表達(dá)。轟擊和培養(yǎng)的培養(yǎng)基轟擊培養(yǎng)基(560Y)包含4.0g/LN6基本鹽(SIGMAC-1416)，1.0mL/LEriksson維生素混合物(1000xSIGMA-1511),0.5mg/L硫胺HC1，120.0g/L蔗糖，1.0mg/L2，4-D和2.88g/LL-脯氨酸(用KOH調(diào)至pH5.8后，用dlH20定容)；2.0g/LGelriteTM(用(111120定容后添加);和8.5mg/L硝酸4艮(將培養(yǎng)基滅菌并冷卻至室溫后添加)。選擇培養(yǎng)基(560R)包含4.0g/LN6基本鹽(SIGMAC國(guó)1416)，1.0mL/LEriksson維生素混合物(1000xSIGMA-1511)，0.5mg/L硫胺HC1，30.0g/L蔗糖，和2.0mg/L2,4-D(用KOH調(diào)至pH5.8后，用dlH20定容)；3.0g/LGelrite(用dlH20定容后添加)；和0.85mg/L硝酸銀和3.0mg/L雙丙氨磷(均在將培養(yǎng)基滅菌并冷卻至室溫后添加)。植物再生培養(yǎng)基(288J)包含4.3g/LMS鹽(GIBCO11117-074),5.0mL/LMS維生素母液(0.100g煙酸，0.02g/L硫胺HCl，0.10g/L吡卩多醇HCl和0.40g/L甘氨酸，用精制D-IH20定容)(MurashigeandSkoog(1962)尸/^Wo/.15:473)，100mg/L肌-肌醇，0.5mg/L玉米素，60g/L蔗糖，和1.0mL/L的0.1mM脫落酸(調(diào)至pH5.6后，用精制dlH20定容)；3.0g/LGelrite(用dlH20定容后添加)；和1.0mg/L吲哚乙酸和3.0mg/L雙丙氨磷(均在將培養(yǎng)基滅菌并冷卻至60°C后添加)。無(wú)激素培養(yǎng)基(272V)包含4.3g/LMS鹽(GIBCO11117-074)，5.0mL/LMS維生素母液(0.100g煙酸，0.02g/L硫胺HC1,0.10g/L吡口多醇HC1，和0.40g/L甘氨酸，用精制dlH20定容)，0.1g/L月幾-肌醇，和40.0g/L蔗糖(調(diào)pH至5.6后，用精制dlH20定容)；和6g/L細(xì)菌瓊脂4分(用精制dlH20定容后添加)，將其滅菌并冷卻至60°C。實(shí)施例5:農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植物再生對(duì)于用毒素核苷酸序列(例如，SEQIDNO:l)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化，可以使用Zhao的方法(美國(guó)專(zhuān)利第5,981,840號(hào)和PCT專(zhuān)利公開(kāi)W098/32326;其內(nèi)容通過(guò)引用并入本文)。簡(jiǎn)言之，/人玉米分離未成熟胚，使該胚與農(nóng)桿菌懸浮液接觸，所述接觸在所述細(xì)菌能夠?qū)⒍舅睾讼闼嵝蛄?SEQIDNO:l)轉(zhuǎn)移至至少一個(gè)未成熟胚的至少一個(gè)細(xì)胞的條件下進(jìn)行(步驟l:感染步驟)。在該步驟中，可以將未成熟胚浸入農(nóng)桿菌懸浮液以起始接種。將胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一定時(shí)間(步驟2:共培養(yǎng)步驟)。在感染步驟之后，將未成熟胚在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在該共培養(yǎng)期后，涉及任選的"靜息"步驟。在該靜息步驟中，在存在至少一種已知抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的抗生素但不添加用于植物轉(zhuǎn)化體的選擇試劑下，孵育所述胚(步驟3:靜息步驟)。為清除農(nóng)桿菌和為所感染細(xì)胞的靜息期，將未成熟胚在具有抗生素但無(wú)選擇試劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。接下來(lái)，將所接種胚在含有選擇性試劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并將生長(zhǎng)中的轉(zhuǎn)化愈傷組織恢復(fù)(步驟4:選擇步驟)。將未成熟胚在具有選擇性試劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，導(dǎo)致所轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇性生長(zhǎng)。隨后使愈傷組織再生成植物(步驟5:再生步驟)，將在選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的愈傷組織在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以再生植物。實(shí)施例6:轉(zhuǎn)化大豆胚如下用含有與pinll啟動(dòng)子可操作連接的SEQIDNO:l毒素核苷酸序列的質(zhì)粒轟擊大豆胚。為誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，將從適當(dāng)大豆栽培種的表面殺菌的未成熟種子所切割的長(zhǎng)3-5mm的子葉在光照或黑暗中于26。C在適當(dāng)?shù)沫傊囵B(yǎng)基培養(yǎng)6-10周。隨后切下產(chǎn)生次級(jí)胚的體細(xì)72胞胚，并將其置入合適的液體培養(yǎng)基中。在重復(fù)選擇如早期、球形期胚倍增的體細(xì)胞胚細(xì)胞團(tuán)后，如下維持所述懸浮液。將大豆胚發(fā)生懸浮液培養(yǎng)物在150rpm旋轉(zhuǎn)振搖器上的35mL液體培養(yǎng)基中于26°C維持，所述維持在16:8小時(shí)的晝/夜時(shí)間表的熒光下進(jìn)行。通過(guò)將約35mg的組織接種至35mL液體培養(yǎng)基，每?jī)芍軅鞔囵B(yǎng)培養(yǎng)物。隨后通過(guò)粒子槍轟擊方法(KleinWa/.(1987)A^w327:70-73，美國(guó)專(zhuān)利第4,945,050號(hào))，轉(zhuǎn)化大豆胚發(fā)生懸浮液培養(yǎng)物?？梢詫⒍虐罨驑孭DS1000/HE設(shè)備(氦加裝)用于這些轉(zhuǎn)化?？梢杂糜诖龠M(jìn)大豆轉(zhuǎn)化的可選擇標(biāo)志物基因是由如下所構(gòu)成的轉(zhuǎn)基因花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(Odellefa/.(l985)Atowe3丄3:810-812)、質(zhì)粒pJR225(來(lái)自大腸桿菌；Gritz^(1983)G騰25:179-188)的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒T-DNA的胭脂堿合酶基因3，區(qū)?？梢詫cpinll啟動(dòng)子可操作連接的毒素核苷酸序列(例如，SEQIDNO:l)的表達(dá)盒作為限制性片段分離。隨后可以將該片段插入攜帶標(biāo)志物基因的載體的獨(dú)特限制性位點(diǎn)。向50|iL的60mg/mL1|im金粒懸浮液(依次)力口入5pLDNA(1pg/|iL),20jiL亞精胺(O.lM)和50nLCaCl2(2.5M)。隨后將該粒制備.物振搖3分鐘，在微型離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)10秒，將上清液移除。隨后用400nL70%乙醇將DNA包碎皮的粒子清洗一次，并將其在40pL的無(wú)水乙醇中重懸?？梢詫NA/粒懸浮液超聲破碎3次，每次1秒。隨后將5微升DNA包被的金粒上樣至每一大載體盤(pán)。將約300-400mg的兩周齡懸浮液培養(yǎng)物置于空的60x15mm陪替氏培養(yǎng)皿，并用移液器將殘留液體從組織中移除。對(duì)每一轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，通常轟擊約5-10個(gè)板的組織。將膜破壞壓力設(shè)在1100psi，將該室抽真空至28英寸水銀真空。在離阻滯篩約3.5英寸遠(yuǎn)處放置組織，將其轟擊三次。在轟擊后，將組織切成兩半，并將其放回液體，并如上所述進(jìn)行培養(yǎng)。在轟擊后5-7天，可以用新鮮培養(yǎng)基更換液體培養(yǎng)基，在轟擊后11-12天，可以用含有50mg/mL潮霉素的新鮮培養(yǎng)基來(lái)更換?？梢悦恐芨略撨x擇性培養(yǎng)基。轟擊后7-8周，可以觀(guān)察自未轉(zhuǎn)化的壞死胚性細(xì)胞團(tuán)生長(zhǎng)的綠色轉(zhuǎn)化組織?？梢砸瞥蛛x的綠色組織，并將其接種至單個(gè)燒瓶，以生成新的、克隆增殖的、轉(zhuǎn)化的胚發(fā)生懸浮液培養(yǎng)物。可以將每一新系作為獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件來(lái)處理。隨后可以傳代培養(yǎng)這些懸浮液，并將其作為未成熟胚的細(xì)胞團(tuán)來(lái)維持，或者通過(guò)個(gè)體體細(xì)胞胚的成熟和萌發(fā)，將其再生成整體植物。本申請(qǐng)文件提及的所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)表示本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。通過(guò)引用將所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)并入本文，以達(dá)到如同每一單獨(dú)的出版物、專(zhuān)利或?qū)＠暾?qǐng)被具體且單獨(dú)地指明為通過(guò)引用而并入的程度。雖然為清楚理解的目的，已經(jīng)通過(guò)說(shuō)明和實(shí)例在一定細(xì)節(jié)上描述了上文的發(fā)明，但是很明顯可以在實(shí)施方式的范圍內(nèi)實(shí)踐某些變化和修飾。權(quán)利要求1.分離的核酸分子，選自(a)包含SEQIDNO1核苷酸序列或其全長(zhǎng)互補(bǔ)體的核酸分子；(b)編碼包含SEQIDNO2氨基酸序列的多肽的核酸分子；(c)與(a)的核苷酸序列具有至少80％序列一致性的核苷酸序列；(d)與(a)的核苷酸序列具有至少85％序列一致性的核苷酸序列；(e)編碼包含氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，所述氨基酸序列的特征在于與(b)的氨基酸序列具有至少70％的序列一致性；和(f)編碼包含氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，所述氨基酸序列的特征在于與(b)的氨基酸序列具有至少75％的序列一致性。2.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列是設(shè)計(jì)為在植物中表達(dá)的合成序列。3.DNA構(gòu)建體，包含如權(quán)利要求1所述的核酸分子。4.如4又利要求3所述的DNA構(gòu)建體，還包含編碼異源多肽的核酸分子。5.宿主細(xì)胞，包含如權(quán)利要求3所述的DNA構(gòu)建體。6.如權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。7.如權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。8.轉(zhuǎn)基因植物，包含如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞。9.如權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自玉米、高粱、小麥、巻心菜、向日葵、番茄、十字花科植物、椒、馬鈴薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥和油菜。10.如權(quán)利要求9所述的植物的轉(zhuǎn)化的種子，其中所述種子包含所述DNA構(gòu)建體。11.具有殺蟲(chóng)活性的分離的多肽，選自(a)包含SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽；(b)由SEQIDNO:1核苷酸序列編碼的多肽；(c)與(a)或(b)的多肽序列具有至少80%序列一致性的多肽序列；和(d)與(a)或(b)的多肽序列具有至少85%序列一致性的多肽序列。12.如權(quán)利要求11所述的多肽，還包含異源氨基酸序列。13.組合物，包含如權(quán)利要求11所述的多肽。14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述組合物選自粉末、粉劑、小球、顆粒、噴霧劑、乳劑、膠體和溶液。15.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中通過(guò)干燥、凍干、勻漿、萃取、過(guò)濾、離心、沉降或濃縮蘇云金芽孢桿菌(5ac/〃Mf/mn'"g/e"w's)細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)制備所述組合物。16.如權(quán)利要求13所述的組合物，包括以重量計(jì)約1%至約99%的所述多肽。17.控制鱗翅目害蟲(chóng)群體的方法，包括使所述群體與殺蟲(chóng)有效量的如權(quán)利要求11所述的多肽接觸。18.殺死鱗翅目害蟲(chóng)的方法，包括使所述害蟲(chóng)與殺蟲(chóng)有效量的如權(quán)利要求11所述的多肽接觸，或向所述害蟲(chóng)喂食殺蟲(chóng)有效量的如權(quán)利要求11所述的多肽。19.產(chǎn)生具有殺蟲(chóng)活性的多肽的方法，包括將如權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞在表達(dá)編碼所述多肽的核酸分子的條件下培養(yǎng)，所述多肽選自(a)包含SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽；(b)由SEQIDNO:1核苷酸序列編碼的多肽；(c)與(a)或(b)的多肽序列具有至少80%序列一致性的多肽序列；和(d)與(a)或(b)的多肽序列具有至少85%序列一致性的多肽序列。20.植物，所述植物使DNA構(gòu)建體穩(wěn)定整合至其基因組，所述DNA構(gòu)建體包含編碼具有殺蟲(chóng)活性的蛋白的核普酸序列，其中所述核苷酸序列選自(a)包含SEQIDNO:1核苷酸序列或其全長(zhǎng)互補(bǔ)體的核酸分子；(b)編碼包含SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽的核酸分子；(c)與(a)的核苷酸序列具有至少80%序列一致性的核苷酸序列；(d)與(a)的核苷酸序列具有至少85%序列一致性的核芬酸序列；(e)編碼包含氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，所述氨基酸序列的特征在于與(b)的氨基酸序列具有至少70%的序列一致性；和(f)編碼包含氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，所述氨基酸序列的特征在于與(b)的氨基酸序列具有至少75%的序列一致性，其中所述核苦酸序列與驅(qū)動(dòng)編碼序列在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子可操作連接。21.如權(quán)利要求20所述的植物，其中所述植物是植物細(xì)胞。22.保護(hù)植物免于害蟲(chóng)的方法，包括將至少一種包含編碼殺蟲(chóng)多肽的核苷酸序列的表達(dá)載體引入所述植物或其細(xì)胞，其中所述核香酸序列選自(a)包含SEQIDNO:1核苷酸序列或其全長(zhǎng)互補(bǔ)體的核酸分子；(b)編碼包含SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽的核酸分子；(c)與(a)的核芬酸序列具有至少80%序列一致性的核苷酸序列；(d)與(a)的核苷酸序列具有至少85%序列一致性的核苷酸序列；(e)編碼包含氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，所述氨基酸序列的特征在于與(b)的氨基酸序列具有至少70%的序列一致性；和(f)編碼包含氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，所述氨基酸序列的特征在于與(b)的氨基酸序列具有至少75%的序列一致性。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述植物產(chǎn)生具有針對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性的殺蟲(chóng)多肽。全文摘要本發(fā)明提供獲自蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)菌株的核酸，及其變體和其片段，其編碼具有針對(duì)包括鱗翅目的蟲(chóng)害的殺蟲(chóng)活性多肽。本發(fā)明的特定實(shí)施方式提供編碼殺蟲(chóng)蛋白的分離的核酸、殺蟲(chóng)組合物、DNA構(gòu)建體，和包含實(shí)施方式的核酸的轉(zhuǎn)化的微生物和植物。所述組合物用于控制害蟲(chóng)尤其是植物害蟲(chóng)的方法。文檔編號(hào)C07K14/325GK101511863SQ200780032908公開(kāi)日2009年8月19日申請(qǐng)日期2007年7月20日優(yōu)先權(quán)日2006年7月21日發(fā)明者休·B·羅,安德烈·R·阿貝德,施曉梅,華董申請(qǐng)人:先鋒高級(jí)育種國(guó)際公司