專利名稱：：疏螺旋體屬抗原的制作方法疏螺旋體屬抗原本發(fā)明涉及編碼蛋白質(zhì)的分離的核酸分子，編碼超免疫血清反應(yīng)性抗原的分離的核酸分子，包含此類核酸分子的載體，包含此類載體的宿主細(xì)胞，來自疏螺旋體屬(^"e"s)物種的超免疫反應(yīng)性抗原，優(yōu)選為超免疫血清反應(yīng)性抗原的蛋白質(zhì)，超免疫血清反應(yīng)性抗原，抗原，用于產(chǎn)生此類蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原的方法、用于產(chǎn)生表達(dá)此類蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原的細(xì)胞的方法，結(jié)合此類蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原的抗體，產(chǎn)生此類抗體的雜交瘤細(xì)胞，用于產(chǎn)生此類抗體的方法，包含此類核酸分子、蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原、抗原或抗體的藥物組合物，此類核酸分子、蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原、抗原或抗體用于制備藥物的用途，用于鑒定能夠減少或抑制此類蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原的相互作用活性的拮抗劑的方法，用于診斷感染的方法和用于治療感染的方法。更特別地此類蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原通過引起萊姆病的細(xì)菌性病原體產(chǎn)生或與其或由廣義布氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferis.1)引起的細(xì)菌性感染相關(guān)。萊姆疏螺旋體病(Lymeborreliosis)或萊姆病是歐洲和北美最常報(bào)導(dǎo)的蜱傳播的疾病。所述疾病由節(jié)肢動(dòng)物傳播的螺旋體屬廣義布氏螺旋體(A^r^/or尸er/&A)引起的且為可牽涉多個(gè)器官或組織，從而導(dǎo)致皮膚、心臟(cardiac)、神經(jīng)學(xué)和肌骨骼病癥的多系統(tǒng)感染。廣義布氏螺旋體可分成12個(gè)基因型群(genospecies)。這12個(gè)基因型群發(fā)生在不同的地理區(qū)域，其在自然界中以涉及蓖子硬蜱復(fù)組(Ixodesricinuscomplex)(也稱為全溝硬蜱復(fù)組(Ixodespersulcatuscomplex))的蜱和廣泛的動(dòng)物宿主(表A))的地方性動(dòng)物病周期(enzooticcycle)生活。這12個(gè)基因型群中至少3個(gè)對(duì)于人是致病性的狹義布氏疏螺旋體(A^r^fw尸eWs.義)、阿氏疏螺旋體(Aa/^eh7)和嘎氏疏螺旋體(A^3r2'/zh')。兩個(gè)其他基因型群路西塔尼亞螺旋體(B.lusitaniae)和B.valaisiana偶爾在人中被檢測(cè)到，它們?cè)谌R姆疏螺旋體病中的作用仍未明確。三個(gè)病原性物種主要的媒介蜱(Principal位置tickvector)狹義布氏疏螺旋體肩板硬蜱美國的東北部和北部中太平洋硬蜱心蓖子硬蜱美國西部歐洲嘎氏疏螺旋體蓖子硬蜱歐洲全溝硬蜱亞洲阿氏疏螺旋體蓖子硬蜱歐洲太平洋硬蜱亞洲9個(gè)最小的病原性或非主要的媒介蜱位置病原性物種5orre//'aa"Person///xodesde/7fatt/s美國^^部》o"e//(26/we"〃/loc/ei"J美國西部太平洋硬蜱"orre//aM/a/s/a"a蓖子硬蜱歐洲和亞洲■5。r_re//s/""'^/ae蓖子硬蜱歐洲5。rre//<ss;/e/邁a/7/蓖子石更蜱歐洲Ao"e/2'aj'a/o/2/ca卵開》硬蜱曰本5orre//<3fa/Ji/i://'/jodesfa/:uir//日本5orre//atw/^ae//roc/esf盯o^51曰本5。/re//3"./h'C3全溝硬蜱中國表A:廣義布氏疏螺旋體基因型群、它們的媒介蜱和地理位置。萊姆疏螺旋體病在1976;陂描述為新型臨床實(shí)體。AllenC.Steere在OldLyme,Connecticut調(diào)查了一組患有皮診和腫脹關(guān)節(jié)(swollenjoint)的人，并且把萊姆疏螺旋體病誤診為青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Steere等人，1977)。然而，在歐洲，自1880年代以來，所述疾病已在各種名稱下得到了解。在1883年，Buchwald描述了稱為慢性萎縮性肢皮炎(ACA)的慢性皮膚變化。在1910,瑞典醫(yī)師Afzelius發(fā)現(xiàn)了昆蟲或蜱叮咬后產(chǎn)生的稱為游走性紅斑(EM)的環(huán)形移動(dòng)的紅診(circularlymovingredrash)。法國研究者Garin和Bujadoux于1922年描述了蜱叮咬后產(chǎn)生的神經(jīng)學(xué)癥狀。在1951年，瑞典臨床醫(yī)師Hollstr6m成功地用青霉素治療患有EM的患者，在1984年，在采自EM傷口的皮膚活組織檢查中觀察到疏螺旋體細(xì)胞。這暗示著，與腦膜炎相關(guān)的EM可能是蜱傳播或昆蟲傳播的細(xì)菌引起的感染的結(jié)果。萊姆疏螺旋體病的致病因子最終于1982年由W.Burgdorfer和同事發(fā)現(xiàn)，他們從硬蜱肩板硬蜱(ixodesscapularis)分離出后來命名為布氏疏螺旋體(5o"e//a6wi^/or/er/)的之前未鑒定的螺旋體細(xì)菌(Burgdorfer等人.，1982)。泉嫂蔬銀凌謬病W流/f^夢(mèng)萊姆疏螺旋體病是歐洲和北美最常見的蜱傳播的人獸共患病。然而在大多數(shù)國家，其不是法定傳染病，沒有每年發(fā)生的新病例的數(shù)目的確切數(shù)據(jù)。在美國，致病因子是廣義布氏疏螺旋體，萊姆疏螺旋體病局限在東北、中大西洋和中北部以北的州。在2002年，向CDC報(bào)告了總共23，763例萊姆疏螺旋體病，產(chǎn)生了每100，000個(gè)居民8.2例的全國發(fā)病率(LymeDiseaseSurveillanceinMorbidityMortalityWeeklyReports,2004)。在歐洲，阿氏疏螺旋體和嘎氏疏螺旋體與促成對(duì)地理位置更低程度依賴性的廣義布氏疏螺旋體一起是在歐洲萊姆疏螺旋體病的主要致病因子。在歐洲，萊姆疏螺旋體病的發(fā)病率在國家之間是有差異的。在東德，萊姆疏螺旋體病的平均發(fā)病分別是2002的每100，000人群中17.8個(gè)病例和2003年增加31%至23.3個(gè)病例。在奧地利，萊姆疏螺旋體病的發(fā)病率要高得多，每100，000個(gè)居民中130個(gè)病例(ReportofWHOworkshoponLymeborreliosisandDiagnosisandsurveillance,Warsaw,Poland,20-22June,1995)。在一些危險(xiǎn)群體例如農(nóng)民、林業(yè)工人、徒步旅行者、跑步者或度假者中，血清陽性率和疾病發(fā)病率在如15歲以下的兒童和39至59歲之間的成人中增加，無性別偏向性。萊姆疏螺旋體病的流行率在不32同的歐洲國家中變化相當(dāng)大，總體地從西向東增加。萊姆病的高發(fā)病率與森林棲息地和社會(huì)因素的變化相關(guān)聯(lián)。環(huán)境變化例如森林的片斷化已導(dǎo)致嚙齒目動(dòng)物捕食者例如狼和食肉鳥(birdsofprey)的減損，由此這又導(dǎo)致小鼠群體的增加和自動(dòng)地增加蜱群體。更近以來，斑片狀的人工造林已增加了鹿的數(shù)目，從而增加了蜱的數(shù)目。中產(chǎn)階級(jí)的郊外躺臥(suburbansprawl)和用于娛樂(例如野營和徙步旅行)的此類森林區(qū)域的使用的增加使人更多地接觸更大量的被感染的蜱。所有這些參數(shù)促成了萊姆疏螺旋體病的更廣泛分布?！渡┦咩y凌伴病W病j廣義布氏螺旋體屬于螺旋體科，其被再分為醫(yī)學(xué)上重要的屬密螺旋體屬(7>e/7W7e/z7s)、鉤端螺旋體屬(Zep&M/ra)和疏螺旋體屬(^rre//'a.)。廣義布氏螺旋體是螺旋形的(10-20|nm長(zhǎng)和0.2-0.5Mm寬)、劇烈運(yùn)動(dòng)的在微需氧條件下生長(zhǎng)的革蘭陰性細(xì)菌。螺旋體細(xì)胞壁由細(xì)胞質(zhì)膜組成，而細(xì)胞質(zhì)膜被肽聚糖和鞭毛包圍，然后由松散結(jié)合的外膜包圍。疏螺旋體基因組在細(xì)菌中可能是結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的，其由一個(gè)線性染色體和不同數(shù)目的線性和環(huán)形質(zhì)粒組成(Xu等人，1995)。1997年，通過TIGR對(duì)廣義布氏疏螺旋體林系B31的基因組進(jìn)行完全測(cè)序(Fraser等人，1997)，下列分析顯示1.5Mb的基因組序列編碼在單個(gè)染色體以及12個(gè)線性和9個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒的高度動(dòng)態(tài)的補(bǔ)充物中(Casjens等人，2000)。2004年公布了嘎氏疏螺旋體林系PBi的基因組序列(Gl6ckner等人，2004)。他們只能完全組裝兩個(gè)質(zhì)粒，剩下其余的質(zhì)粒序列作為可變的質(zhì)粒序列，這表明了重復(fù)序列的復(fù)雜性和高含量。在來自廣義布氏疏螺旋體抹系B31和嘎氏疏螺旋體林系PBi的基因組間存在92%的核苷酸序列同一性，質(zhì)粒的序列差異更大。大約90%的染色體基因組包含編碼區(qū)，大部分編碼的基因與已知功能的基因同源。它們編碼參與DM復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯；修復(fù)系統(tǒng)和重組；運(yùn)輸、營養(yǎng)物吸收和能量代謝；運(yùn)動(dòng)性和趨化性以及基因表達(dá)的調(diào)控的蛋白質(zhì)。與病原性相關(guān)的基因主要位于染色體外的基因組上。編碼用于氨基酸、脂肪酸、協(xié)同因子和核苷酸的合成的基因不存在于疏螺旋體基因組中。因此疏螺旋體需要補(bǔ)充有血清的復(fù)合培養(yǎng)基(例如BSK-II培養(yǎng)基)以在體外生長(zhǎng)。,嫂蔬銀凌謬病時(shí)侈^4^萊姆疏螺旋體病通常分期發(fā)生，在各期具有不同臨床表現(xiàn)的減輕和惡化(Steere，1989)。早期感染1期由皮膚的局部感染組成，然后在數(shù)天或數(shù)周類發(fā)展為2期，播散感染，數(shù)月或數(shù)年后發(fā)展為3期，持續(xù)感染。然而，感染是可變的；一些患者只具有皮膚的局部感染，而其他患者只展現(xiàn)疾病的更晚期的表現(xiàn)，例如關(guān)節(jié)炎。萊姆疏螺旋體病的不同臨床綜合征還可由不同廣義布氏螺旋體種的感染引起。狹義布氏疏螺旋體更常引起關(guān)節(jié)表現(xiàn)(關(guān)節(jié)炎)和心臟問題，阿氏疏螺旋體主要引起皮膚癥狀(EM和ACA)，嘎氏疏螺旋體是產(chǎn)生神經(jīng)型疏螺旋體癥(neuroborreliosis)的主要因素。局部感染-感染的1期的最常見癥狀是發(fā)生在70-80%的被感染的人中的游走性紅斑。該皮膚病損通常伴隨流行性感冒樣癥狀，例如肌痛、關(guān)節(jié)痛、頭痛和發(fā)燒。這些非特異性癥狀發(fā)生在50%的患有游走性紅斑的患者中。播散感染-在2期中，細(xì)菌從感染的部位遷移入血流中和遷移至更遠(yuǎn)的組織和器官。發(fā)生在該期的神經(jīng)學(xué)、心血管和關(guān)節(jié)炎癥狀包括腦膜炎、顱神經(jīng)病(cranialneuropathy)和間歇性炎性關(guān)節(jié)炎。持續(xù)感染-感染的3期是慢性的，在蜱叮咬后數(shù)月至數(shù)年發(fā)生。北美最常見的病癥是由廣義布氏疏螺旋體的感染引起的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。嘎氏疏螺旋體對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的持續(xù)感染在3期引起更嚴(yán)重的神經(jīng)學(xué)癥狀，阿氏疏螺旋體對(duì)皮趺的持續(xù)感染導(dǎo)致慢性萎縮性肢皮炎。早期萊姆疏螺旋體病的診斷的最佳參數(shù)是特征性的擴(kuò)展紅色皮膚病損或EM。不幸的是，30%的患者不發(fā)生該皮診，并且早期疾病的常見癥狀例如疲勞、發(fā)燒或頭痛是很非異性的以至不能被診斷。可使用多種血清學(xué)試驗(yàn)診斷具有癥候的患者的萊姆疏螺旋體病，最常用的診斷試驗(yàn)是針對(duì)血清中的Lyme特異性抗體的間接ELISA試驗(yàn)。抗微生物劑是治療萊姆疏螺旋體病感染的基本方法。所使用的抗生素取決于疾病的階段、癥狀和患者對(duì)藥物治療的變態(tài)反應(yīng)(allergy)。抗生素療程的長(zhǎng)度還取決于疾病的分期和癥狀的嚴(yán)重度。早期萊姆疏螺旋體病通常使用口服四環(huán)素類例如多西霉素(doxycycline)和半合成的青霉素例如阿莫西林或青霉素V來進(jìn)行治療。關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)學(xué)病癥使用高劑量的靜脈注射的青霉素G或頭孢三噪來治療。微作為改變的生態(tài)條件的結(jié)果，萊姆疏螺旋體病的病例的數(shù)目穩(wěn)定地增加。此外，預(yù)防的困難表明發(fā)病率將繼續(xù)成為公共衛(wèi)生憂慮。景觀改造、防護(hù)服、蜱檢驗(yàn)或個(gè)人防護(hù)措施是有幫助的但還不夠，因此需要抗萊姆疏螺旋體病的疫苗。疫苗可包含整個(gè)種類的不同抗原?？乖膶?shí)例是完全殺死的或減毒的生物體、這些生物體/組織的亞級(jí)分(subfraction)、蛋白質(zhì)或以它們的最簡(jiǎn)單形式存在的肽?？乖€可以以糖基化的蛋白質(zhì)或肽的形式被免疫系統(tǒng)識(shí)別，還可以是或包含多糖或脂質(zhì)。還可使用短肽，因?yàn)槔缂?xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)識(shí)別以與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)結(jié)合的、短的通常8至11個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽的形式的抗原。B細(xì)胞可識(shí)別短的4-5個(gè)氨基酸的線性表位以及三維結(jié)構(gòu)(構(gòu)象表位)。為了獲得持續(xù)的、抗原特異性免疫反應(yīng)，需要佐劑以觸發(fā)牽涉免疫系統(tǒng)的所有細(xì)胞的免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)。首先，佐劑對(duì)所謂的抗原遞呈細(xì)胞(APC)起作用，但不受限于它們的作用模式。此類細(xì)胞通常首先遇到抗原，然后將經(jīng)加工的或未修飾的抗原呈遞至免疫效應(yīng)細(xì)胞。還可涉及小細(xì)胞癌中間細(xì)胞型。只有具有合適的特異性的效應(yīng)細(xì)胞在有效的免疫反35應(yīng)(productiveimmuneresponse)中凈皮、激活。佐劑還可局部〗呆留抗原和共注射的其他因子。此外，佐劑可用作其他免疫細(xì)胞的趨化因子或可局部和/或全身性地用作免疫系統(tǒng)的刺激劑。存在對(duì)開發(fā)用于人的滅活的完整細(xì)胞疫苗的憂慮，因?yàn)槠淇烧T導(dǎo)針對(duì)人抗原的交叉反應(yīng)抗體的潛在危險(xiǎn)。因此，認(rèn)為亞單位疫苗在預(yù)防萊姆疏螺旋體病中具有最大的潛力。最近，開發(fā)預(yù)防萊姆疏螺旋體病的亞單位疫苗主要集中在外表面蛋白A(0spA)上。來自狹義布氏疏螺旋體林系ZS7的0spA的脂質(zhì)化形式與氫氧化鋁一起由GlaxoSmithKline(GSK)商業(yè)開發(fā)為L(zhǎng)YMErix以用于美國市場(chǎng)。0spA主要在蜱的消化道中表達(dá)，對(duì)疏螺旋體屬的人免疫反應(yīng)通常不包括針對(duì)0spA的體液或細(xì)胞適應(yīng)性免疫。因此通過接種產(chǎn)生的此類OspA抗體不用于抗擊體內(nèi)的感染。相反，當(dāng)蜱采食血液時(shí)，所述抗體進(jìn)入其腸。在那里，它們中和螺旋體和阻斷從中腸至允許廣義布氏螺旋體進(jìn)入脊稚動(dòng)物宿主的唾液腺的遷移。因此，所述疫苗阻止螺旋體從蜱至人宿主的傳播。在一年的時(shí)間內(nèi)需要3劑LYMErixTM來獲得最佳的保護(hù)作用，在前兩劑后，抗萊姆疏螺旋體病的疫苗功效為49%,在第三劑后為76%。然而，在LYMErixTM可商購獲得后很短的時(shí)間內(nèi)，其在2002年退出市場(chǎng)。其中的一些原因是需要每年或每隔一年的加強(qiáng)注射，與早期感染的抗生素治療相比該預(yù)防方法的成本相對(duì)較高。此外，存在理論和從未證明的擔(dān)心，即LYMErixTM可在人群的亞群中引起自身免疫反應(yīng)。本發(fā)明的問題是提供用于開發(fā)藥物例如抗引起萊姆疏螺旋體病的細(xì)菌病原體的疫苗的方法。更具體地，所述問題是提供有效的、相關(guān)的和全面的一組來自廣義布氏螺旋體的可用于制備所述藥物的核酸分子、蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)抗原或抗原。另外的問題是提供用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)抗原或抗原、或其片段的方法，用于鑒定能夠減少或抑制此類蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)抗原或抗原與其相互作用伴侶和優(yōu)選與其針對(duì)其的抗體的相互作用活性的拮抗劑的方法，用于治療感染的方法，用于免疫動(dòng)物或人的方法。-36本發(fā)明的問題在第一方面中通過編碼蛋白質(zhì)、優(yōu)選超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原、或其片段的分離的核酸分子來解決，所述核酸分子包括選自下列的核酸分子的核酸序列a)與具有選自SeqIDNo1-134的核苷酸序列的核酸分子具有至少70%的序列同一性的核酸分子，b)與a)的核酸分子互補(bǔ)的核酸分子，c)包含a)或b)的核酸分子的至少15個(gè)連續(xù)堿基的核酸分子，d)在嚴(yán)格雜交條件下與a)、b)、或c)的核酸分子退火的核酸分子，e)若非遺傳密碼的簡(jiǎn)并性的原因，則與a)、b)、c)或d)中定義的核酸分子雜交的核酸分子。本發(fā)明的問題在第二方面中通過編碼優(yōu)選超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原、或其片段的分離的核酸分子來解決，所述核酸分子包括選自下列的核酸分子的核酸序列a)與具有選自SeqIDNo269-387和507-628的核苷酸序列的核酸分子具有至少70%的序列同一性的核酸分子，b)與a)的核酸分子互補(bǔ)的核酸分子，c)包含a)或b)的核酸分子的至少15個(gè)連續(xù)堿基的核酸分子，d)在嚴(yán)格雜交條件下與a)、b)、或c)的核酸分子退火的核酸分子，e)若非遺傳密碼的簡(jiǎn)并性的原因，則與a)、b)、c)或d)中定義的核酸分子雜交的核酸分子。在第一和第二方面的實(shí)施方案中，序列同一性至少是70。/。、至少85%、至少90%、至少95%或100%。在第一和第二方面的實(shí)施方案中，核酸是DM。在第一和第二方面的備選實(shí)施方案中，核酸是RNA。在第一和第二方面的實(shí)施方案中，從基因組DNA，優(yōu)選來自選自狹義布氏疏螺旋體、嘎氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體、J(rre//a37fa/wi://、5orre//a"rdae和Aorre7/as/z7/ca的物種,和更優(yōu)選來自狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或吸氏疏螺旋體基因組DNA分離核酸分子。在第一和第二方面的實(shí)施方案中，片段是功能性或活性片段或其活性變體。在第一和第二方面的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)或超免疫血清反應(yīng)性抗原、或其片段由來自狹義布氏疏螺旋體、嘎氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體、化rre7/aa/fl^"o/z//、》or7"e7/aWi^e"http://、^/ve/is力/7o/7/.ca、Ao/ve//<2fa/7由V、&汀6_//<3^rfl^e或化rre/z.a"."/ca，優(yōu)選來自狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或嘎氏疏螺旋體的抗原組成。本發(fā)明的問題在第三方面中通過包含根據(jù)第一或第二方面的核酸分子的載體來解決。在第三方面的實(shí)施方案中，載體適合用于蛋白質(zhì)，優(yōu)選由第一-:或其片段的重組表二達(dá):—'5、，、、'本發(fā)明的問題在第四方面中通過包含第三方面中定義的載體的宿主細(xì)胞來解決。本發(fā)明的問題在第五方面中通過來自狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或嘎氏疏螺旋體的超免疫血清反應(yīng)性抗原來解決，所述抗原與來自具有由廣義布氏疏螺旋體屬感染、阿氏疏螺旋體屬感染或嘎氏疏螺旋體引起的感染的人或未感染的健康人的血清發(fā)生免疫反應(yīng)，其中超免疫血清反應(yīng)性抗原包含分離的來自狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或嘎氏疏螺旋體的肽或其肽片段。本發(fā)明的問題在第六方面中通過蛋白質(zhì)、優(yōu)選具有選自SeqIDNo135-268的氨基酸序列的超免疫血清反應(yīng)性抗原，或其活性片段或活性變體來解決。本發(fā)明的問題在第七方面中通過具有選自SeqIDNo388-506和629-750的氨基酸序列的超免疫血清反應(yīng)性抗原，或其活性片段或活性變體來解決。在第六方面的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)由第一方面中定義的核酸分子編碼。在第七方面的實(shí)施方案中，抗原由第二方面中定義的核酸分子編碼。在第六和第七方面的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)或抗原是來自狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或嘎氏疏螺旋體的抗原或由來自狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或嘎氏疏螺旋體的抗原組成。在第六和第七方面的實(shí)施方案中，活性片段由如第六和第七方面中定義的蛋白質(zhì)或超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原和更具體地SeqIDNo135-268、388-506或629-750的任一個(gè)的蛋白質(zhì)或超免疫血清反應(yīng)性抗原的至少60%、優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、最優(yōu)選99%組成。在第六和第七方面的實(shí)施方案中，活性變體具有與或抗原血清反應(yīng)性抗原或蛋白質(zhì)至少50%的序列同一性，特別地與第六和第七方No135-268、388-506或629-750的任一個(gè)的蛋白質(zhì)或超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原至少60%、優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95°/。、最優(yōu)選99%的序列同一性。本發(fā)明的問題在第八方面中通過抗原來解決，其中所述抗原包含表l的欄"預(yù)測(cè)的免疫原性aa"和"鑒定的免疫原性區(qū)域的定位"中顯示的、表5的欄"aa(起始-終止)"中顯示的、由表6的欄"從aa"和"至aa"顯示的、或由表8的欄"氨基酸從-至"定義的核心氨基酸序列，其中更優(yōu)選此類抗原包含如下核心氨基酸序列SeqIDNo135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116，112-137，133-158和154-179;SeqIDNo224的氨基酸331-352;SeqIDNo225的氨基酸116-143，139-166，162-189和185-212;SeqIDNo227的氨基酸3-27，616-640，636-659，655-678，576-598，594-615，611-632，693-718和714-739;SeqIDNo228的氨基酸32-45;SeqIDNo229的氨基酸112-135，131-153，324-349，345-370和366-391;SeqIDNo230的氨基酸122-143和170-195;SeqIDNo231的氨基酸377-400，396-419，91-115和111-135;SeqIDNo233的氨基酸3-27，23-47,43-68，4-30和26-52;SeqIDNo234的氨基酸400-429和521-545;SeqIDNo235的氨基酸61-84，80-103和99-122;SeqIDNo236的氨基酸8-31，124-149，166-191，207-232，265-294和290—318;SeqIDNo237的氨基酸20—43,39—62，95-122，117-143，133-159和155-181;SeqIDNo238的氨基酸1-29;SeqIDNo239的氨基酸121-143，139-160和156-178;SeqIDNo240的氨基酸195-219;SeqIDNo242的氨基酸4-32，27-54和50-77;SeqIDNo243的氨基酸160-186，182-208和122-149;SeqIDNo244的氨基酸48-73和69-94;SeqIDNo245的氨基酸151-173;SeqIDNo246的氨基酸14-41和37-63;SeqIDNo247的氨基酸7-30，26-49和45-69;SeqIDNo248的氨基酸1-21和17-44;SeqIDNo250的氨基酸43-66;SeqIDNo251的氨基酸47-71和67-91;SeqIDNo252的氨基酸39-60和56-78;SeqIDNo253的氨基酸199-224;SeqIDNo254的氨基酸70-94和90-113;SeqIDNo255的氨基酸48-70;SeqIDNo256的氨基酸1-25，21-45和41-65;SeqIDNo257的氨基酸27-51;SeqIDNo192的氨基酸98-125，144-170，165-187，201-223，285-309，305—329，325-348，400-425，513—541，537-564，560-587和583-610;SeqIDNo139的氨基酸138-164和160-187;55SeqIDNo141的氨基酸160-187;SeqIDNo144的氨基酸350-378，374-402，398-426和422-451;SeqIDNo148的氨基酸264-288，284-308和304-328;SeqIDNo150的氨基酸77-91;SeqIDNo151的氨基酸111-134;SeqIDNo155的氨基酸126-153，149-176和172-200;SeqIDNo158的氨基酸220-245，241-266和262-288;SeqIDNo159的氨基酸31-53,49-71和67-89;SeqIDNo163的氨基酸258-280，276-298，294-317和313-336;SeqIDNo164的氨基酸458-472;SeqIDN。167的氨基酸82-107，103-127，212-235和231-253;SeqIDNo168的氨基酸26-51和47-73;SeqIDNo169的氨基酸1053-1082;SeqIDNo170的氨基酸194-217，213-236,232-255，251-274和270-292;SeqIDNo173的氨基酸110-131，179-201，197-219和215-236;SeqIDNo176的氨基酸12-36，32-56和52-77;SeqIDNo177的氨基酸281-300和296-316;SeqIDNo178的氨基酸33-57和53-78;SeqIDNo182的氨基酸171-197，193-219和215-240;SeqIDNo183的氨基酸363-388，384-409和405-430;SeqIDNo184的氨基酸102-127，123-148和144-170;SeqIDNo185的氨基酸149-163;SeqIDNo189的氨基酸342-366和362-386;SeqIDNo193的氨基酸390-409;SeqIDNo197的氨基酸50-64;SeqIDNo199的氨基酸223-249和245-272;SeqIDNo201的氨基酸117-131;SeqIDNo203的氨基酸116-143和139-166;SeqIDNo205的氨基酸1-21;SeqIDNo207的氨基酸245-270，266-291，287-312和308-332;SeqIDNo209的氨基酸353-378，374-399和395-419;SeqIDNo212的氨基酸95-122和118-146;SeqIDNo135的氨基酸128-151，146-169，314-336，339-361和357-379;SeqIDNo137的氨基酸159-188和184-213;SeqIDNo138的氨基酸230-251和247-267;SeqIDNo140的氨基酸97—120，116—139，135-158和154-177;SeqIDNo142的氨基酸195-228;SeqIDNo143的氨基酸165-192和188-214;SeqIDNo149的氨基酸6-29，25-47，43-65,68-92，262-288，306-331，326-351，449-471，467-489和485-507;SeqIDNo153的氨基酸80-103，99-122，118-141和137-159;SeqIDNo156的氨基酸15-40，36-61，57-82，78-103，99-124和120-146;SeqIDNo157的氨基酸35-63，59-86，187-213，209-235和252-277;SeqIDNo160的氨基酸83-108，104-129，125-150,146-172，272-302和298-327;SeqIDNo165的氨基酸197-222，218-243，239-264和260-284;SeqIDNo166的氨基酸378-402，398-422，418-442和438-461;SeqIDNo171的氨基酸44-65,61-82和78-99;SeqIDNo172的氨基酸1230-1254和150-1275;SeqIDNo174的氨基酸372-395，391-414和410-434;SeqIDNo175的氨基酸439-464;SeqIDNo179的氨基酸718-744,740-766，762-788，906-931，927-951和947-971;SeqIDNo18Q的氨基酸66-93,135-161和494-518;SeqIDNo181的氨基酸40-61，57-79和75-97;SeqIDNo186的氨基酸440-462，458-480和476-497;SeqIDNo187的氨基酸91-114，110-133，129-152和148-170;SeqIDNo190的氨基酸156-183,179-206，202-229，225-252和248-274;SeqIDNo191的氨基酸747-773和769-795;SeqIDNo194的氨基酸6-33，29-55，52-79和74-100;SeqIDNo195的氨基酸148-176,172-200和196-223;SeqIDNo198的氨基酸28-53，49-73，165-188,203-226,292-320，316-344和531-560;SeqIDNo200的氨基酸180-208和200-228;SeqIDNo204的氨基酸203-227，223-247，243-267和263-287;SeqIDNo208的氨基酸339-363和359-384;SeqIDNo210的氨基酸1372-1398;SeqIDNo211的氨基酸14-38，34-58，74-98和94-117;SeqIDNo214的氨基酸41-67，63-89和129-155;SeqIDNo215的氨基酸165-185和181-200;SeqIDNo216的氨基酸26-44;SeqIDNo217的氨基酸15-44，40-68和64-92;SeqIDNo219的氨基酸90-114，110-133,140-168，164-192和188-215;SeqIDNo220的氨基酸91-116，112-137，133-158和154-179;SeqIDNo223的氨基酸311-338，334-361,357-385，381-409和405-433;SeqIDNo224的氨基酸331-352，348-369和365-386;SeqIDNo225的氨57<image>imageseeoriginaldocumentpage58</image>No239的氨基酸121-143，139-160和156-178;SeqIDNo196的氨基酸12-39，35-62，58-84和175-197;SeqIDNo146的氨基酸18-42，38-62，58-82，78-102,98-122，118-142，138-165，256-279，275-297，293-315，163-189，185-211，207-233和229-255;SeqIDNo147的氨基酸46-75，110-131，127-148，188-216，212-240，344-367，361-384，382-405和401-424;SeqIDNo154的氨基酸151-180，176-205，245-274和270-299;SeqIDNo152的氨基酸937-962,958-983，102-130，126-154，150-177，823-849,845-872,867-892，285-314，310-339和335-364;SeqIDNo245的氨基酸97-119，115-137,133-155和151-173;SeqIDNo161的氨基酸20-43，39-62，58-79，69-94，90-115，167-189，185-207，203-224，296-320:316-339，335-358，354-377，404-431，427-453，449-475，471-498和494-521;SeqIDNo162的氨基酸40-62，76-97，251-276,272-297，291-316和333-358;SeqIDNo218的氨基酸335-360，356-381，422-446，442-465和461-484;SeqIDNo236的氨基酸46-69，65-88，84-107,124—149,186-211，207—232，265-294和290-318;SeqIDNo188的氨基酸56—80，76-100，96—119，343-371，367-394，410-436和432-457;SeqIDNo202的氨基酸281-307和631-654;SeqIDNo145的氨基酸41-66，62-86，82-106，102-126，417-444，440-466，528-554，550-575和571-596。在第八方面的實(shí)施方案中，抗原進(jìn)一步由下列氨基酸殘基組成a)1至50個(gè)額外的氨基酸殘基，優(yōu)選1至40個(gè)，更優(yōu)選1至30個(gè)，更優(yōu)選至多1至25個(gè)，更優(yōu)選至多1至10個(gè)，最優(yōu)選1、2、3、4或5個(gè)額外的氨基酸殘基；和/或b)至少一個(gè)與所述核心氨基酸序列異源的氨基酸殘基。在第八方面的實(shí)施方案中，氨基酸殘基再核心氨基酸序列的C末端、N末端或者C末端和N末端的側(cè)翼。在第八方面的實(shí)施方案中，抗原包含至少2個(gè)，優(yōu)選至少3個(gè)第八方面中定義的核心氨基酸序列。在另外的實(shí)施方案中，優(yōu)選由本發(fā)明的所述核酸編碼的抗原是所述抗原的功能性或活性片段和/或功能性或活性變體。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，功能性或活性片段和/或功能性或活性變體如本文中所定義。本發(fā)明的問題在第九方面中通過用于產(chǎn)生第五、第六、第七或第八方面中定義的蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原、或其片段的方法來解決，包括表達(dá)第一或第二方面中定義的核酸分子。本發(fā)明的問題在第十方面中通過用于產(chǎn)生表達(dá)第五、第六、第七或第八方面中定義的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段的方法來解決，該方法包括用第三方面中定義的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞。在第九和第十方面的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段是來自狹義布氏疏螺旋體、嘎氏疏螺旋體、阿氏疏蟲累旋體、^rre7/aa/7de"0/72V、6/5^e〃/2'、乂.ap0/7/cs、"c>rre//afa/7t/ir//、Aorre/iafi/rt/se"orre//a^//2.ca抗原，優(yōu)選來自狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或嘎氏疏螺旋體的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段。本發(fā)明的問題在第十一方面中通過藥物組合物，優(yōu)選疫苗來解決，所述組合物包括第五、第六、第七或第八方面中定義的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段，或者第一或第二方面中定義的核酸分子，或者第三方面中定義的載體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物還包括優(yōu)選選自聚陽離子聚合物，更優(yōu)選聚陽離子肽，免疫刺激性脫氧核苷酸(ODN)，包含至少兩個(gè)LysLeuLys基序優(yōu)選KLKLLLLLKLK的肽，神經(jīng)活性化合物，更優(yōu)選人生長(zhǎng)激素，明釩，弗氏完全或不完全佐劑，或其組合的免疫刺激性物質(zhì)。在本發(fā)明的藥物組合物的更優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫刺激物質(zhì)是聚陽離子聚合物和免疫刺激脫氧核苷酸的混合物或包含至少兩個(gè)60LysLeuLys基序的肽和免疫刺激性脫氧核苷酸的混合物。在本發(fā)明的藥物組合物的更優(yōu)選實(shí)施方案中，聚陽離子是聚陽離子肽，特別是聚精氨酸。本發(fā)明的問題在第十二方面中通過笫一方面或笫二方面中定義的核酸分子，或者第五、第六、第七或第八方面中定義的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段用于制備藥物制劑或藥物、特別地用于制備抗狹義布氏疏螺旋體、嘎氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體、化rre/2'a/i/5"27a/n'ae、》0/Te"as//e/鵬/z/、^rre"aj'a/70//ca、"oe//a」s/7i/h'/、"0rre/2'a"ro^se和5orre7/3"'/2'ca的疫苗，優(yōu)選抗狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或嘎氏疏螺旋體的疫苗中的用途來解決。本發(fā)明的問題在第十三方面中通過抗體或至少其有效部分來解決，所述抗體或其有效部分結(jié)合第五、第六、第七或第八方面中定義的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段，優(yōu)選其活性片段或其變體(優(yōu)選其活性變體)的選擇性部分。在第十三方面的實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體。在笫十三方面的實(shí)施方案中，所述有效部分包括Fab片段、F(ab)片段、F(ab)N片段、F(ab)2片段或Fv片段。在第十三方面的實(shí)施方案中，抗體是嵌合抗體。在第十三方面的實(shí)施方案中，抗體是人源化抗體。本發(fā)明的問題在第十四方面中通過產(chǎn)生第十三方面中定義的抗體的雜交瘤細(xì)胞系來解決。本發(fā)明的問題在第十五方面中通過用于產(chǎn)生在第十三方面中定義的抗體的方法來解決，其特征在于下列步驟a)通過對(duì)非人動(dòng)物施用第五、第六、第七或第八方面中定義的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原或、其片段來在所述動(dòng)物中起始免疫反應(yīng)，b)從所述動(dòng)物中取出包含抗體的體液，和C)通過將包含抗體的體液經(jīng)歷進(jìn)一步的純化步驟來產(chǎn)生所述抗體。本發(fā)明的問題在第十六方面中通過用于產(chǎn)生第十三方面中定義的抗體的方法來解決，所述方法的特征在于下列步驟a)通過對(duì)非人動(dòng)物施用第五、第六、第七或第八方面中定義的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段來在所述動(dòng)物中起始免疫反應(yīng)，b)從所述動(dòng)物取出脾或脾細(xì)胞，c)產(chǎn)生所述脾或脾細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞，d)選擇和克隆對(duì)于所述蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段是特異性的雜交瘤細(xì)胞，e)通過培養(yǎng)所述克隆的雜交瘤細(xì)胞和任選地進(jìn)一步的純化步驟來產(chǎn)生抗體。本發(fā)明的問題在第十七方面中通過第三方面定義的抗體在制備藥物中的用途來解決，所述藥物用于治療或預(yù)防疏螺旋體、優(yōu)選病原性疏螺旋體，更優(yōu)選狹義布氏疏螺旋體、嘎氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體、jffc>rre//aa/2cfers10/7//、化rre7/a6/^e"http://、Sorre//a力/o//ca、ior_re//<2fa/2wir//、"orre7/a"i^ae和^rre/2'as7/7/ca,以及最優(yōu)選狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或嘎氏疏螺旋體引起的感染。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合或能夠結(jié)合本發(fā)明中公開的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性抗原或抗原、或者其活性片段或活性變體的拮抗劑。根據(jù)另一方面，本發(fā)明的拮抗劑是這樣的拮抗劑，其能夠減少或抑制根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原、或其活性片段、或者其變體與其相互作用伴倡的相互作用活性。此類相互作用伴侶在優(yōu)選實(shí)施方案中是所述蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原和/或抗原，或者其活性片段或其活性變體的抗體或受體，優(yōu)選生理學(xué)受體。62本發(fā)明的問題在第十八方面中通過用于鑒定能夠結(jié)合第五、第六、第七或第八方面中定義的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段的拮抗劑的方法來解決，所述方法包括a)在能夠?qū)蜻x拮抗劑與所述蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段的結(jié)合響應(yīng)而提供可檢測(cè)信號(hào)的組分存在的情況下，將分離的或固定的第五、第六、第七或第八方面中定義的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段在允許所述候選拮抗劑與所述蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段結(jié)合的條件下與所述候選拮抗劑接觸；和b)檢測(cè)在對(duì)拮抗劑與所述蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段的結(jié)合的響應(yīng)中產(chǎn)生的信號(hào)的存在或不存在。本發(fā)明的問題在第十九方面中通過用于鑒定能夠減少或抑制根據(jù)第五、第六、第七或第八方面的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段與其相互作用伴侶的相互作用活性的拮抗劑的方法來解決，所述方法包括a)提供第五、第六、第七或第八方面中定義的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段，b)為所述蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段提供相互作用伴侶，特別是根據(jù)本發(fā)明的第十三方面的抗體，c)使所述蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段與所述相互作用伴倡相互作用，從而形成相互作用復(fù)合物，d)提供候選拮抗劑，e)使候選拮抗劑和相互作用復(fù)合物之間發(fā)生竟?fàn)幏磻?yīng)，f)確定候選拮抗劑是否抑制或減少蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段與相互作用伴侶的相互作用活性。本發(fā)明的問題在第二十方面中通過第五、第六、第七或第八方面中定義的任意蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段在用于分離和/或純化和/或鑒定所述蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段的相互作用伴侶的用途來解決。63本發(fā)明的問題在第二十一方面中通過用于診斷疏螺旋體屬生物體引起的感染的方法來解決，所述方法包括步驟a)將從受試者獲得的樣品與第五、第六、第七或第八方面中定義的蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原、或其任何片段接觸；和b)檢測(cè)抗所述疏螺旋體屬生物體的抗體在所述樣品中的存在。.本發(fā)明的問題在第二十二方面中通過用于診斷疏螺旋體屬生物體引起的感染的方法來解決，所述方法包括步驟a)將從受試者獲得的樣品與對(duì)于第一或第二方面中定義的核酸分子或其片段是特異性的引物或探針接觸；和b)檢測(cè)此類核酸分子或其片段在所述樣品中的存在?？乖蚱淦蔚谋磉_(dá)相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括確定編碼根據(jù)據(jù)本發(fā)明的超免疫血清反應(yīng)性抗原或片段的存在。本發(fā)明的問題在第二十三方面中通過用于診斷疏螺旋體屬生物體引起的感染的方法來解決，所述方法包括步驟a)將從受試者獲得的樣品與根據(jù)第十三方面的抗體接觸；和b)檢測(cè)所述疏螺旋體屬生物體的抗原在所述樣品中的存在。在第二十三方面的實(shí)施方案中，所述疏螺旋體屬生物體的抗原是第五、第六、第七或第八方面中定義的蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原。在第二十一、二十二和二十三方面的實(shí)施方案中，疏螺旋體屬生物體是病原性疏螺旋體屬生物體，更優(yōu)選是選自狹義布氏疏螺旋體、嘎氏疏蟲累旋體、阿氏疏蟲累旋體、"orrea/7^ersow//、5orre/sp/e/zna//,50/Te"s力/70/7/cs、_5orre//afa/7wir2'/、5orre//a"i"i/ae和5orre7/aW/7/ca，和更優(yōu)選選自狹義布氏疏螺i走體菌林、阿氏疏螺旋體和哏氏疏螺旋體的疏螺旋體屬生物體。此外，本發(fā)明提供了本發(fā)明中定義的蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原、或者其片段或其變體用于產(chǎn)生與所述蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原、或者其片段或其片段結(jié)合的肽的用途，其中所述肽是抗促成素(anticaline)。本發(fā)明的問題在第二十四方面中通過第五、第六、第七或第方面中定義的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段在用于制備功能性核酸的用途來解決，其中所述功能性核酸選自適體和鏡像異構(gòu)體(spiegelmer)。本發(fā)明的問題在第二十五方面中通過第一或第二方面中定義的核酸分子用于制備功能性核糖核酸的用途來解決，其中所述功能性核糖核酸選自核酶、反義核酸和siRM。本發(fā)明的問題在第二十六方面中通過用于治療優(yōu)選有此需要的動(dòng)物或人中的疏螺旋體屬感染的方法來解決，所述方法包括對(duì)所述動(dòng)物或人施用治療有效量的任意之前的方面中定義的藥物組合物或藥物或第十三方面中定義的抗體的步驟。在第二十六方面的實(shí)施方案中，疏螺旋體屬感染是狹義布氏疏螺旋體、嘎氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體、萬0rre/2'aa/2￡/ersw3//、twro^e或s/刀/ca、優(yōu)選狹義布氏疏蟲累旋體、阿氏疏螺旋體或嘎氏疏螺旋體引起的感染。本發(fā)明的問題在第二十七方面中通過用于免疫動(dòng)物或人以抗疏螺旋體屬生物體引起的感染的方法解決，所述方法包括對(duì)所述動(dòng)物或人施用有效量的第五、第六、第七或第八方面中定義的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段，或者第一或第二方面中定義的核酸分子，或者第三方面中定義的載體的步驟，其中所述治療有效量適合用于在所述動(dòng)物或人中引發(fā)免疫反應(yīng)。在第二十七方面的實(shí)施方案中，疏螺旋體屬生物體選自狹義布氏《乾螺、方走體、嘎氏逸乾蟲累旋體、阿氏疏螺4t體、a/^/e/"510/727、Aorre//a"油e和A0rre/2.aW"/ca、優(yōu)選狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或嘎氏疏螺旋體。本發(fā)明的問題在第二十八方面中通過用于在動(dòng)物或人中刺激抗疏螺旋體屬生物體的免疫反應(yīng)的方法來解決，所述方法包括對(duì)所述動(dòng)物或人施用有效量的第五、第六、第七或第八方面中定義的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段，或者第一或第二方面中定義的核酸分子，或者第三方面中定義的載體的步驟，其中所述有效量適合在動(dòng)物或人中刺激免疫反應(yīng)。在第二十八方面的實(shí)施方案中，疏螺旋體屬生物體選自狹義布氏疏螺旋體、嘎氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體、Ao/Tei/sa/^e"o/7/7、5orre//a^油e和Aorre/2'aW/22'cs、優(yōu)選狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或嘎氏疏螺旋體。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，其中使用本發(fā)明中定義的蛋白質(zhì)、超蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原的片段(優(yōu)選其活性片段)，或者此類蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原的變體(優(yōu)選其活性變體)(每一種優(yōu)選如本文中描述)來進(jìn)行或?qū)嵤?。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的還有，此處公開為與根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原和/或抗原相互作用的或耙向其的各種化合物可額外地或備選地與所述蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原的活性片段或活性變體相互作用或靶向其。也在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，當(dāng)不使用抗體而使用本文中定義抗促成素或功能性核酸時(shí)，原則上可實(shí)施在其實(shí)施中使用抗體的每一種或任何方法，其中此類功能性核酸選自適體和鏡像異構(gòu)體。這可樣可用于本發(fā)明的各種用途。在優(yōu)選實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原的片段(每一種如本文中公開)是展示此類蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原的至少一個(gè)特征的此類蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原的一部分。優(yōu)選，所述特征是選自感染的治療、動(dòng)物包括人的免疫和動(dòng)物包括人中免疫反應(yīng)的刺激的特征。也在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，本文中公開的關(guān)于疏螺旋體屬和更優(yōu)選廣義布氏螺旋體的任何公開內(nèi)容同樣地可用于疏螺旋體屬物種，其中疏螺旋體屬物種優(yōu)選選自狹義布氏疏螺旋體、嗅氏疏螺旋體、阿氏疏蟲累旋體、_5orre7/aa/7de"0/7//、5orre//a6/5^e"/2'、"0i"i"e7/a/s;a//cs,萬OiV"e7ia"/wi^/,Aorre/i'a/^rdae和Aarre//s57j3/cs。如優(yōu)選在本文中所使用的，術(shù)語根據(jù)本發(fā)明的多肽在廣義上是指根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原，包括其每一種和任何一種變體、片段、類似物或衍生物(特別如本文中所描述的)。在每當(dāng)本文中使用術(shù)語多肽且如果沒有明確另外說明的情況下，各自的公開內(nèi)容也傾向于指或與根據(jù)本發(fā)明的任何蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原(包括每一種和任何一種其變體、片段、類似物或衍物，特別地如本文中所描述的)相關(guān)。也要理解，描述的與由根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語多肽涵蓋的任意上述化合物的任一種相關(guān)的任何用途或方面應(yīng)當(dāng)也可用于由根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語多肽涵蓋的上述化合物的每一種和任何其他化合物。通過使用來自多個(gè)人血漿庫和來源于廣義布氏螺旋體的基因組的表面表達(dá)文庫，本發(fā)明有利地提供了有效的、相關(guān)的和廣泛的成套的分離的核酸分子和由它們編碼的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性抗原或抗原，包括其活性片段和活性變體。因此，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了對(duì)于用于制備抗體和用于鑒定有效地抗由病原性疏螺旋體屬物種，優(yōu)選本文表A中描述的疏螺旋體屬物種，更優(yōu)選狹義布氏疏螺旋體菌林、阿氏疏螺旋體或嘎氏疏螺旋體引起的感染的化合物的方法的廣義布氏螺旋體抗原、疫苗、診斷劑和產(chǎn)品的廣泛的迫切需要。有效的疫苗應(yīng)當(dāng)由蛋白質(zhì)或多肽組成，所述蛋白質(zhì)或多肽由所67有抹系表達(dá)且能夠誘導(dǎo)抗所述病原性疏螺旋體屬物種(包括狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或嘎氏疏螺旋體)的細(xì)胞表面組分的高親和力、豐富的抗體。所述抗體應(yīng)當(dāng)是用于調(diào)理作用的IgG2和/或IgG3，以及用于中和附著和毒素作用的任何IgG亞型。化學(xué)上定義的疫苗與完整的細(xì)胞疫苗(減毒的或殺死的)相比必須是明確更優(yōu)的，因?yàn)樗霾≡允杪菪w屬物種(包括狹義布氏疏螺旋體菌林、阿氏疏螺旋體質(zhì)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸分子在它們的全長(zhǎng)上顯示與SeqIDNo1-134、269-387或507-628中所示的核苷酸序列70%的同一性。包含在它們的全長(zhǎng)上與SeqIDNo1-134、269-387或507-628中所示的核酸分子至少80%或至少85%的相同的區(qū)域的核酸是更優(yōu)選的。在這點(diǎn)上，在它們的全長(zhǎng)上與所述核苷酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%或96%相同的核酸分子是特別優(yōu)選的。此外，具有至少97°/。的同一性的核酸分子是高度優(yōu)選的，具有至少98°/。和至少99%的同一性的核酸分子是特別高度優(yōu)選的，具有至少99%或99.5%的同一性的核酸分子是更優(yōu)選的，具有100%的同一性的核酸分子是特別優(yōu)選的。此外，該方面中的優(yōu)選實(shí)施方案是核酸，所述核酸編碼蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原、或其片段(多肽)，其基本上保持與由SeqIDNo135-268、388-506或629-750中所示的所述核酸編碼的成熟多肽相同的生物學(xué)功能或活性。也在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，根據(jù)本發(fā)明的核酸分子編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)優(yōu)選為超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原。仍在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，由SeqIDNo135-268、388-506或629-750編碼的分子是蛋白質(zhì)，其優(yōu)選為抗原或超免疫血清反應(yīng)性抗原。同一性，如本領(lǐng)域中所已知的和本文中所使用的，是兩個(gè)或多系。在本領(lǐng)域中，同一性也指多肽或多核苷酸序列之間的序列相關(guān)性通過此類序列的字符串(string)之間的匹配所確定的?？扇菀椎赜?jì)算同一性。雖然存在許多測(cè)量?jī)蓚€(gè)多核普酸或兩個(gè)多肽序列之間的同一性的方法，但所述術(shù)語對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的(例如S(3(7i/e/7ce1wa7/512、inMolecularBiologyvonHeinje，G.，AcademicPress,1987)。確定同一性的優(yōu)選方法經(jīng)設(shè)計(jì)以使受試序列之間產(chǎn)生最大的匹配。將確定同一性的方法編碼在計(jì)算機(jī)程序中。確定兩個(gè)序列之間的同一性的優(yōu)選計(jì)算機(jī)程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.等人，1984),BLASTP，BLASTN和FASTA(Altschul，S.等人，1990)。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，作為通過參照SeqIDNo的在本文中描述的核酸分子(其描述在本文中也稱為第一備選)的第二備選，也可以是與根據(jù)本文的第一備選描述的核酸至少大體上互補(bǔ)的核酸分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，個(gè)體核酸分子與另一個(gè)個(gè)體核酸分子至少大體上互補(bǔ)。如本文中所使用的，互補(bǔ)是指核酸鏈通過Watson-Crick堿基配對(duì)與第二核酸鏈的堿基配對(duì)。本文中使用的大體上互補(bǔ)是指堿基配對(duì)不是對(duì)各自鏈的所有堿基發(fā)生，而是留下一定數(shù)目或百分?jǐn)?shù)的未配對(duì)的或錯(cuò)配的堿基。正確配對(duì)的堿基的百分?jǐn)?shù)優(yōu)選至少是70%、更優(yōu)選80%、更優(yōu)選90%和最優(yōu)選高于90%的任何百分?jǐn)?shù)。此類更高的百分?jǐn)?shù)包括91、92、93、94、95、96、97、98、99和100%，其中此類定義可用于其中使用該種命名法的本申請(qǐng)的各個(gè)方面。要指出的是，70%的配對(duì)堿基百分?jǐn)?shù)被認(rèn)為是同源的，具有該程度的匹配堿基對(duì)的雜交被認(rèn)為是嚴(yán)格的。該類型的嚴(yán)格雜交的雜交條件可來自CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWiley和Sons,Inc.,1987)。更具體地，雜交條件可以如下a)在68。C下在例如5xSSPE、5xDenhardt"試劑、0.1%SDS、100g/mL剪切的DNA中進(jìn)行的雜交b)在42'C下在0.2xSSC，0.1%SDS中進(jìn)行的中等嚴(yán)格清洗c)在68'C下0.lxSSC，0.1%SDS中的高嚴(yán)格清洗具有50%的GC含量的基因組DM具有大約96。C的TM。對(duì)于1%69的錯(cuò)配，L減少大約rc。此外，原則上同樣可使用本文中描述的任何其他雜交條件。當(dāng)然，編碼與由本發(fā)明鑒定的多肽分子相同的多肽分子的所有核酸序列分子包括在給定的編碼序列的任何公開內(nèi)容中，因?yàn)檫z傳密碼的簡(jiǎn)并性可直接用于明確確定編碼給定的多肽分子的所有可能的核酸分子，即使此類簡(jiǎn)并核酸分子的數(shù)目可以很多。這也可用于給定的多肽、蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原的活性片段或活性變體，只要所述片段或變體編碼多肽、蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原，使用所述肽、蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原適合以使可獲得與如下相同的效應(yīng)，就好象使用全長(zhǎng)多肽、蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原一樣，優(yōu)選其可以例如作為主動(dòng)或被動(dòng)疫苗用于接種背景(vaccinationconnection)。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，作為第三備選，也可以是包含根據(jù)上述本發(fā)明的核酸分子的第一或第二備選的核酸分子的至少15個(gè)堿基的片段(stretch)的核酸。優(yōu)選，堿基形成堿基的連續(xù)片段。然而，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，片段由被許多堿基分開的兩個(gè)或更多個(gè)部分組成。個(gè)，更優(yōu)選至少30個(gè)，特別地至少50個(gè)連續(xù)堿基組成。由于希望的使用的領(lǐng)域(例如作為(PCR)引物、探針、捕獲分子(例如在(DNA)芯片上)等)的原因，可容易地最優(yōu)化合適的長(zhǎng)度。優(yōu)選核酸分子包含表1、5和6中所列的一個(gè)或多個(gè)免疫原性氨基酸序列的至少連續(xù)15個(gè)堿基部分。特別優(yōu)選的是如下核酸，所述核酸包含本申請(qǐng)的序列方案中包括的任何序列的DNA序列的連續(xù)部分，其與通過它們的NCBI目錄號(hào)和質(zhì)粒名稱(可變質(zhì)粒片段；VPS)在下面顯示的狹義布氏疏螺旋體菌林和嘎氏疏螺旋體基因組和質(zhì)粒相比，展示l個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選超過2個(gè)，特別地超過5個(gè)不相同的核酸殘基狹義布氏疏螺旋體(B31)、NC—001318(線性染色體)、NC-000957(lp5)、NC-000956(lp56)、NC—000953(cp32-8)、70NC—000952(cp32-7)NC—000949(cp32-3)NC—000954(cp32-9)NC-001851(lp28-l)NC一001855(lp36)、NC一001852(lp28-2)NC-000951(cp32-6)、NC—000948(cp32-l)NC一001904(cp9)NC—001857(Ip54)NC-000950(cp32-4)、、NC—000955(lp21)、NC-001903(cp26)、NC—001856(Ip38)、NC-001853(lp28-3)、1001854(lp28-4),NC-001850(lp25)、NC—001849(Ipl7);嘎氏疏螺旋體PBi)、NC_006156(線性染色體)、NC-006128(cp26)、NC-006129(1p54)、NT—108263(VPSGllal5f12.sl)、NT一108262(VPSGlMlbllb03.sl)、NT—108261(VPSGlMlbl5c06.rl)、NT—108259(VPSPBi1la03e01.sl)、NT—108257(VPSGlMbl9g09.rl)、NT—108260(VPSNT一108258(VPSNT-108256(VPSNT一108254(VPSNT一108252(VPSNT一108250(VPSNT—108248(VPSNT—108246(VPSNT一108244(VPSNT一108242(VPSNT一108240(VPSNT—108238(VPSNT-108236(VPSNT一108234(VPSNT—108232(VPSNT一108230(VPSNT一108228(VPSGllal4d08.sl)、Glal3d03.rl),Gllal9d04.rl)Glal8el0.sl)Gllal5h12.rl)Gla07gl1.rl)'NT_108255(VPSGlal3d06.sl)、NT-108253(VPSGla22b07.rl)、NT_108251(VPSGlal8d09.sl)、NT-108249(VPSGlMb28a10.rl)、Gla23g09.rl)、NT—108247(VPSPBi1Mlb05c04.rl)、GlMlb09a03.rl)、NT—108245(VPSGlal0e03.rl)、,NT—108243(VPSGla25a05.rl)、NT-108241(VPSGllal4a06.rl)、NT一108239(VPSGlal9c04.rl)、NT-108237(VPSGllal6d07.rl)、NT_108235(VPSGla07d05.rl)、、NT—108233(VPSGllal5e03.sl)、、NT—108231(VPSGla34h09.sl)、NT—108229(VPSGlMlbl3a11.rl)、NT-108227(VPSGlal9d06.sl)。GlMbl2b07.sl)Gllal6g12.sl)、Gla34dl1.rl)、GlMb03b12.rl)、Gla09h07.rl)、GlMlb07c12.sl)GlMlb09g01.sl)Gla08d08.sl)、Gllal7h03.sl)、基。優(yōu)選，核酸序列編碼與上述的公布的或列出的廣義布氏螺旋體對(duì)應(yīng)物相比具有至少一個(gè)，優(yōu)選至少2個(gè)，優(yōu)選至少3個(gè)不同氨基酸的71多肽、蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原。優(yōu)選，該類型的多肽、蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原仍然具有本文中公開的具有相同氨基酸殘基的分子的特征的至少一個(gè)特征。此外，作為本文中公開的例如序列表中公開的蛋白質(zhì)(或完整蛋白質(zhì))、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原的具有至少6、7或8個(gè)氨基酸殘基和由這些核酸編碼的片段的分離的多肽也是優(yōu)選的。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，作為第四備選，也可以是在嚴(yán)格雜交條件下與根據(jù)本文中公開的第一、第二或第三備選的本發(fā)明的任意核酸退火的核酸分子。嚴(yán)格雜交條件通常是本文公開的嚴(yán)格雜交條件。最后，根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，作為笫五備選，也可以是若非遺傳密碼的簡(jiǎn)并性的原因，則與本文中所述第一、第二、第三和第四備選的根據(jù)本發(fā)明的任意核酸分子雜交的核酸分子。該類型的核酸分子是指如下事實(shí)即優(yōu)選地根據(jù)本發(fā)明的核酸編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原、或者其片段或其變體。該類型的核酸分子特別適合用于檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，從而適合用于診斷各微生物，例如狹義布氏疏螺旋體或任何病原性疏螺旋體屬物種，特別是本文中公開的那些病原性疏螺旋體屬物種，以及其中牽涉此類微生物的任何疾病或病狀，優(yōu)選地，此類微生物直接或間接引起例如才幾會(huì)'〖生孩i生物(opportunisticmicro-organism)的jt匕類疾病或病狀。優(yōu)選，可在關(guān)于本文中描述的第四備選所描述的嚴(yán)格條件下發(fā)生或進(jìn)行雜交。本文中所使用的核酸分子通常是指可以是未修飾的RNA或DM或者修飾的RNA或DNA的任何核糖核酸分子或脫氧核糖核酸分子。因此，例如，本文中所使用的核酸分子是指，除其他以外，單鏈和雙鏈DNA、為單鏈和雙鏈RM的混合物的DM和為單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物的RNA、包含可以為單鏈或更常見地雙鏈或三鏈的或單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物的DNA和RNA的雜種分子。此外，本文中所使用的核酸分子是指包含RNA或DNA或RNA和DNA兩者的三鏈區(qū)域。此類區(qū)域中的鏈可來自相同的分子或來自不同的分子。所述區(qū)域可包括所有一個(gè)或多個(gè)分的區(qū)域。三螺旋區(qū)域的分子中的一個(gè)通常是寡核苷酸。如本文中所使用的，術(shù)語核酸分子包括上述包含一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基的DNA或RNA。因此，具有為穩(wěn)定性或?yàn)槠渌蛐揎椀闹麈湹腄M或RNA是在本文中所指的術(shù)語"核酸分子"。此外，包含稀有堿基(僅舉兩例，例如肌苷或修飾的堿基例如三苯甲基化的堿基)的DNA或RNA是在本文中所使用的術(shù)語所指的核酸分子。應(yīng)當(dāng)理解，已對(duì)提供本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多有用的目的的DNA和RNA進(jìn)行了多種修飾。術(shù)語核酸分子，如其在本文中所使用的，包括核酸分子的此類化學(xué)、酶促或代謝上修飾的形式以及病毒和細(xì)胞(包括，除其他以外，簡(jiǎn)單和復(fù)雜細(xì)胞)的DNA和RNA特征的化學(xué)形式。術(shù)語核酸分子還包括通常稱為寡核苷酸的短核酸分子。"多核苷酸"和"核酸"或"核酸分子"在本文中通常可互換使用。的核酸分子序列更長(zhǎng)和更短的獨(dú)特片段，更特別地狹義布氏疏螺旋體編碼區(qū)的片段，所述片段可通過標(biāo)準(zhǔn)克隆方法產(chǎn)生。為了具有獨(dú)特性，片段必須具有足夠的大小以使其與其他已知的核酸序列相區(qū)別，其最容易通過將任何選擇的狹義布氏疏螺旋體片段與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫例如GenBank中的核苷酸序列相比較來確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本文中在關(guān)于廣義布氏疏螺旋體的任何方面所述的內(nèi)容同樣可用于本文中描述的任何其他疏螺旋體屬物種，更優(yōu)選本文中描述的任何病原性疏螺旋體屬物種。此外，可對(duì)本發(fā)明包括的核酸分子和多肽進(jìn)行修飾。例如，可進(jìn)行不影響由核酸編碼的多肽的核苷酸置換，從而編碼超免疫血清反應(yīng)性抗原或其片段的任何核酸分子包括在本發(fā)明內(nèi)。此外，通過使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)，可將任何由本發(fā)明調(diào)控序列(無論廣義布氏疏螺旋體的調(diào)控序列或異源調(diào)控序列、異源前導(dǎo)序列、異源標(biāo)記序列還是異源編碼序列)功能性連接，以產(chǎn)生融合蛋白。73本發(fā)明的核酸分子可以RM的形式，例如rnRM或cRNA，或MA的形式，例如通過克隆獲得的或通過化學(xué)合成技術(shù)產(chǎn)生的或通過其組合獲得的cDNA和基因組DNA。DM可以是三鏈、雙鏈或單鏈的。單鏈DM可以是編碼鏈，也稱為有義鏈，或其可以是非編碼鏈，也稱為反義鏈。義布氏疏螺旋體氨基酸序列的超免疫血清反應(yīng)性抗原和其片段的片段、類似物和衍生物的核酸分子的變體。核酸分子的變體可以是天然的變體例如天然的等位基因變體，或其可以是已知非天然的變體?？赏ㄟ^誘變技術(shù)包括用于核酸分子、細(xì)胞或生物的誘變技術(shù)產(chǎn)生核酸分子的此類非天然的變體。在這一點(diǎn)上，變體當(dāng)中的一些變體是通過核苷酸置換、缺失或添加而與上述核酸分子不同的變體。置換、缺失或添加可包涉及一個(gè)或多個(gè)核苷酸。可在編碼或非編碼區(qū)或兩者對(duì)變體進(jìn)行改變。編碼區(qū)中的改變可產(chǎn)生保守或非保守氨基酸置換、缺失或添加。編碼具有序列表中所示的廣義布氏疏螺旋體的序列(其中幾個(gè)、少數(shù)幾個(gè)、5至10個(gè)、l至5個(gè)、l至3個(gè)、2個(gè)、l個(gè)或無氨基酸以任何組合被置換、缺失或添加)的變體、類似物、衍生物或片段或者片段的變體、類似物或衍生物的核酸分子是優(yōu)選的。其中特別優(yōu)選的是不改變序列表中所示的廣義布氏疏螺旋體的多肽的性質(zhì)和活性的沉默置換、添加和缺失。在這一點(diǎn)上，保守置換也是特別優(yōu)選的。本文中公開的在它們的不同實(shí)施方案中的任何抗原以及特別地在本文中由SeqIDNo135-268、388-506或629-750指定的抗原和肽的變體，通常也可通過生物信息學(xué)的方法來表征。各工具例如NCBIBasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST)(A"schul，S.等人，1990)可從多個(gè)來源(包括國家生物^支術(shù)信息中(NCBI，Bethesda，MD)和在互聯(lián)網(wǎng)上)獲得，以與序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx結(jié)合使用。對(duì)于至少35個(gè)氨基酸的氨基酸序列的比較，通過使用設(shè)置成缺省參數(shù)(缺口blastp;缺口存在成本(gapexistencecost)為11和每殘基缺口成本(gapcost)為l)的缺省74BLOSUM62矩陣來使用NCBIBlast2.O的Blast2序列函數(shù)。當(dāng)比對(duì)短肽(少于大約35個(gè)氨基酸)時(shí)，通過使用設(shè)置成缺省參數(shù)(開放缺口9，延伸缺口l罰分)的PAM30矩陣，使用Blast2序列函數(shù)來進(jìn)行比對(duì)。用于確定這樣的短窗口例如15個(gè)氨基酸或更少氨基酸上的序列同一性的方法描述于由Bethesda，Maryland的國家生物技術(shù)信息中心的網(wǎng)站(http://ww，ncbi.nl亂nih.gov/BLAST)。可通過蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原(它們?cè)诒疚闹幸步y(tǒng)稱為根據(jù)本發(fā)明的多肽，如果沒有明確指出與之相反，包括包括其每一種和任何變體、片段、類似物或衍生物)的序列改變獲得抗原的功能性活性片段(其在本文中也稱為功能性變體或活性變體(它們因而可在本文中以可互換的形式使用))，其中根據(jù)本發(fā)明的具有序列改變的多肽保持根據(jù)本發(fā)明的無改變的多肽的功能，例如其特異性結(jié)合結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的多肽的無改變形式的多肽特異性抗體。此類序列改變可包括但不限于保守置換、缺失、突變和插入。優(yōu)選，活性變體展示與萊姆病患者的人血清的反應(yīng)性，更優(yōu)選介導(dǎo)血清轉(zhuǎn)換和最優(yōu)選顯示殺細(xì)菌活性?？梢匀鐚?shí)施例中所述估計(jì)活性變體的這些特征。在本發(fā)明的上下文中，變體特異性結(jié)合特定抗體(優(yōu)選為在動(dòng)物例如小鼠、兔子中針對(duì)重組蛋白產(chǎn)生的多克隆抗體或在小鼠中產(chǎn)生的單克隆抗體)，展示與萊姆病患者的人血清的反應(yīng)性，介導(dǎo)血清轉(zhuǎn)換或顯示殺細(xì)菌活性，如果變體的活性達(dá)到無序列變化的抗原的活性的至少10°/、優(yōu)選至少25%、更優(yōu)選至少50°/。、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、特別地至少90%、特別地至少95%、最優(yōu)選至少99%。術(shù)語"功能性活性變體"或"活性變體"包括天然的等位基因變體以及突變體或任何其他非天然的變體。如本領(lǐng)域內(nèi)已知的，等位基因變體是特征在于具有基本上不改變多肽的生物學(xué)功能的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、缺失或添加的多肽的備選形式。"生物學(xué)功能"優(yōu)選是指多肽在其天然所在的細(xì)胞或生物中的功能，即使所述功能分別不是細(xì)胞和生物的生長(zhǎng)或存活所必需的。例如，孔蛋白的生物學(xué)功能允許存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的化合物進(jìn)入細(xì)胞。生物學(xué)功能與抗原功能顯著不同。根據(jù)本發(fā)明的多肽可具有多種生物學(xué)功能。在生命界的任何種內(nèi)，等位基因變異是規(guī)律。例如，任何細(xì)菌物種例如廣義布氏疏螺旋體通常由多種相互之間相異于極小的等位基因變異的林系(特征在于無性系繁殖)代表。事實(shí)上，在不同林系中實(shí)現(xiàn)相同生物學(xué)功能的多肽可具有在各個(gè)林系中不相同的氨基酸序列。這樣的等位基因變異同樣地在多核苷酸水平上得到反映。如關(guān)于O^C所描述的，等位基因變異在疏螺旋體屬物種是非常普遍的(Livey，I.等人，1995)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過氨基酸交換、缺失或插入，從根據(jù)本發(fā)(本文中定義的反應(yīng)性、血清轉(zhuǎn)換和/或殺細(xì)菌活性)。此外，這些多肽還可包含觸發(fā)相同的或優(yōu)選改進(jìn)的T細(xì)胞反應(yīng)的表位。此類表位稱為本文中進(jìn)一步定義的"變態(tài)的(heteroclitic)"。它們具有對(duì)相似的或優(yōu)選更大的對(duì)MHC/HLA分子的親和力，和以相似或優(yōu)選更強(qiáng)的方式刺激針對(duì)原始表位的T細(xì)胞受體(TCR)的能力。可通過合理設(shè)計(jì)即考慮單個(gè)殘基對(duì)結(jié)合MHC/HLA的貢獻(xiàn)(如例如由Rammensee等人(Ram隨see，H.等人，1999，Immunogenetics.50:213-219)所描述的)，結(jié)合潛在地與TCR相互作用的殘基的系統(tǒng)交換和用針對(duì)原始表位的T細(xì)胞檢測(cè)所得的序列來獲得變態(tài)表位。這樣的設(shè)計(jì)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是可能的，無需過度的實(shí)驗(yàn)。在本發(fā)明的更優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽的活性變體是本文中公開的任何多肽，更特別地由SeqIDNo135-268、388-506或629-750定義的任何多肽，其具有與任何所述SeqIDNo的多肽至少50y。的序列同一性，特別地與任何所述SeqIDNo的多肽至少60。/。、優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、最優(yōu)選9H的序列同一性和/或通過保守置換衍生自任何SeqIDNo的序列的所述多肽。保守置換是在于它們的側(cè)鏈和化學(xué)性質(zhì)中相關(guān)的氨基酸的家族內(nèi)發(fā)生的置換。此類家族的實(shí)例是具有堿性側(cè)鏈的氨基酸、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸、具有非極性脂肪族側(cè)鏈的氨基酸、具有非極性芳香族側(cè)鏈的76氨基酸、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸、具有小側(cè)鏈的氨基酸、具有大側(cè)鏈的氨基酸等。在一個(gè)實(shí)施方案中，肽中包含一個(gè)保守置換。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在肽中包含2個(gè)保守置換或更少的保守置換。在另外的實(shí)施方案中，肽中包含3個(gè)保守置換或更少的保守置換。保守氨基酸置換的實(shí)例包括但不限于下面所列的保守置換原始?xì)埢Ｊ刂脫QAlaSerArgLysAsnGin;HisAspGluCysSerGinAsnGluAspHisAsir,GinlieValLeulie;ValLysArg;Gin;AsnMetLeu'，liePheMet;Leu;TyrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrpjPheVallie;Leu編碼此類修飾的表位的核酸序列組成，在所述修飾的表位中，優(yōu)選按照例如Tourdot，S.等人，2000中^>開的法則修飾或替代給定的表位的一個(gè)或兩個(gè)氨基酸。由根據(jù)本發(fā)明的多肽提供的表位在本文中也稱為本表位。很清楚，通過氨基酸交換從而提高、保持或至少不顯著削弱表位的T細(xì)胞激活能力而從本表位衍生的表位也包括在根據(jù)本發(fā)明的表位內(nèi)。因此，本發(fā)明還包括不包含如從廣義布氏疏螺旋體衍生的原始序列但觸發(fā)相同的或優(yōu)選改進(jìn)的T細(xì)胞反應(yīng)的表位。這些表位稱為"變態(tài)的"，它們需要具有相似的的或優(yōu)選更大的對(duì)MHC/HLA分子的親和力，和需要以相似或優(yōu)選更強(qiáng)的方式刺激針對(duì)原始表位的T細(xì)胞受體(TCR)的能力。鑒定表位，更具體的變態(tài)表位的另一種可能性包括用針對(duì)一種或幾種本表位的T細(xì)胞篩選肽文庫。優(yōu)選方法是合成肽文庫的位置掃描法(positionalscanning)。此類文獻(xiàn)已經(jīng)例如由Hemmer，B.等人，1999和其中給出的參考文獻(xiàn)詳細(xì)描述。作為由本發(fā)明的衍生的氨基酸序列顯示的表位或本文中公開的變態(tài)表位的備選，可以使用模擬這些表位、在本文中也稱為"肽模擬物(peptidemimetica)，，或"retro-inverse-peptides，，的物質(zhì)或化合物，從而其在本發(fā)明的范圍內(nèi)。改進(jìn)的表位的設(shè)計(jì)的另一個(gè)方面是用增加它們刺激T細(xì)胞的能力的物質(zhì)對(duì)它們的配制或修飾。此類物質(zhì)包括T輔助細(xì)胞表位、脂質(zhì)或脂質(zhì)體或W001/78767中描述的優(yōu)選修飾。增加表位的T細(xì)胞刺激能力的另一個(gè)方法是使用免疫刺激物質(zhì)對(duì)它們的配制，所述免疫刺激物質(zhì)例如細(xì)胞因子或趨化因子如白細(xì)胞介素-2、-7、-12、-18、I類和II類干擾素(IFN)特別是IFN-y、GM-CSF、TNF-cc、fl13-配體和其他物質(zhì)。本發(fā)明的核酸分子還可用作例如RNA、cDNA和基因組DM的雜交探針以分離編碼本發(fā)明的多肽的全長(zhǎng)cDNA和基因組克隆以及分離具有與本發(fā)明的核酸分子高度序列相似性的其他基因的cDM和基因組克隆。此類探針通常將包含至少15個(gè)堿基。優(yōu)選此類探針將具有至少20、至少25或至少30個(gè)堿基，和可具有至少50個(gè)堿基。特別優(yōu)選的78探針將具有至少30個(gè)堿基，和將具有50個(gè)堿基或更少的堿基，例如30、35、40、45或50個(gè)堿基。例如，本發(fā)明的核酸分子的編碼區(qū)可通過使用已知的DNA序列合成寡核苷酸探針來篩選相關(guān)文庫來進(jìn)行分離。然后使用具有與本發(fā)明的基因的序列互補(bǔ)的序列的標(biāo)記的寡核苷酸篩選cDNA、基因組DM或mRNA的文庫以確定所述探針與其雜交的文庫的成員。描述的疾病特別是人疾病的藥劑和/或診斷劑的試劑和材料。作為寡核苷酸的本發(fā)明的核酸分子可用于本文中所述的方法，但優(yōu)選用于PCR,以確定本文中限定的廣義布氏疏螺旋體的基因是以整體還是以部分存在于被感染的組織例如皮膚、滑液或血液中和/或在其中轉(zhuǎn)錄。要承認(rèn)，此類序列在已獲得的病原體的感染的分期和感染的類型的診斷中也具有功用。為了該目的和其他目的，可使用在本領(lǐng)域中已知的、包含本文中所描述的根據(jù)本發(fā)明的核酸或多肽的至少一種的陣列。生物體或樣品。優(yōu)選該檢測(cè)用于診斷，更優(yōu)選用于診斷與狹義布氏疏螺旋體或疏螺旋體屬的任何其他病原體物種(優(yōu)選阿氏疏螺旋體或哏氏疏螺旋體)的存在或豐度相關(guān)或關(guān)聯(lián)的疾病。感染狹義布氏疏螺旋體或疏螺旋體屬的任何其他病原體物種，優(yōu)選阿氏疏螺旋體或嘎氏疏螺旋體的真核生物(本文中也為稱為"個(gè)體")，特別地哺乳動(dòng)物，特別是人，可通過檢測(cè)(通過多種技術(shù)在DNA水平上檢測(cè))任何根據(jù)本發(fā)明的核酸分子來進(jìn)行鑒定?？色@得用于區(qū)分狹義布氏疏螺旋體或所述病原性疏螺旋體屬與其他生物體的優(yōu)選核酸分子候選物。本發(fā)明提供了用于診斷由狹義布氏疏螺旋體或疏螺旋體屬的任何其他病原體物種，優(yōu)選阿氏疏螺旋體或嘎氏疏螺旋體引起的感染所產(chǎn)生的疾病的方法，該方法包括在從個(gè)體分離或產(chǎn)生的樣品中確定具有本文中公開的核酸分子的序列，更優(yōu)選序列表中所示的序列的核酸分子的增加的表達(dá)水平。核酸分子的表達(dá)可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于定量核酸分子的任一方法，例如本文中描述的PCR、RT-PCR、RNA酶保護(hù)法、Northern印跡、其他雜交方法和陣列來測(cè)量。本文中所使用的分離的是指"通過人工"從其天然狀態(tài)分離，即，如果其天然發(fā)生，其已發(fā)生改變或從其天然環(huán)境取出或兩者都發(fā)生。不是"分離的"，但從其天然狀態(tài)的共存材料分離的相同核酸分子或多肽是"分離的"，和本文中使用的術(shù)語所指的意義一樣。作為分離的部分或分離后，可以例如將此類核酸分子與其他核酸分子例如DM連接以進(jìn)行誘變，從而形成融合蛋白，和用于在宿主中擴(kuò)增或表達(dá)?？蓪为?dú)的或與其他核酸分子例如載體連接的分離的核酸分子導(dǎo)入培養(yǎng)中或完整生物體中的宿主細(xì)胞。在導(dǎo)入培養(yǎng)中的或完整生物體中的宿主細(xì)胞后，此類DNA仍然是分離的，與術(shù)語在本文中使用時(shí)所指的意義一樣，因?yàn)樗鼈儗⒉灰运鼈兊奶烊坏男问交颦h(huán)境存在。類似地，核酸分子和多肽可發(fā)生在例如為非天然的組合物的組合物中，例如發(fā)生在用于將核酸分子或多肽例如導(dǎo)入細(xì)胞的媒介制劑、溶液、用于化學(xué)或酶促反應(yīng)的組合物或溶液中，從而使分離的核酸分子或多肽保持在該術(shù)語的意義(與其在在本文中使用的一樣)內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的核酸可化學(xué)合成。備選地，核酸可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法從狹義布氏疏螺旋體或疏螺旋體屬的其他病原體物種優(yōu)選阿氏疏螺旋體或嘎氏疏螺旋體分離。同樣適用于根據(jù)本發(fā)明的多肽。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了多組新型多肽。此類多肽，如本文中之前所提及的，是本文中公開的蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原和抗原，以及其片段，優(yōu)選其活性片段和其片段，優(yōu)選其活性變體。優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的多肽是超免疫血清反應(yīng)性抗原和其片段。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了包含優(yōu)選由本文中描述的核酸分子和其片段中的任一個(gè)編碼的氨基酸序列的超免疫血清反應(yīng)性抗原。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了包含選自SeqIDNo135-268、80388-506或629-750的氨基酸序列的一組新型蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原和抗原以及其活性片段和活性變體組。根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選多肽或其片段是表8和10中所列的多肽。根據(jù)本發(fā)明的多肽即由本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原和抗原優(yōu)選包括序列表中所示的任何多肽或分子，以及具有與根據(jù)本發(fā)明的該多肽至少70%的同一性，優(yōu)選具有與根據(jù)本發(fā)明的該多肽至少80%或85%的同一性，和更優(yōu)選具有與根據(jù)本發(fā)明的該多肽和更優(yōu)選序列表中所示的多肽至少90%的相似性(更優(yōu)選至少90%的同一性)和更優(yōu)選具有與根據(jù)本發(fā)明的該多肽至少95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的相似性(更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98°/。、99線99.5%的同一性)的多肽，其還包括此類多肽的部分，多肽的該部分通常包含至少4個(gè)氨基酸和更優(yōu)選至少8個(gè)，更優(yōu)選至少30個(gè)，更優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸，例如4、8、10、20、30、35、40、45或50個(gè)氨基酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，此類部分是根據(jù)本發(fā)明的多肽的活性片段。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的多肽的片段、類似物和衍生物以及其片段和其變體。當(dāng)提及其氨基酸序列優(yōu)選示于序列表的根據(jù)本發(fā)明的此類多肽時(shí)，術(shù)語"片段"、"衍生物"和"類似物"優(yōu)選是指單獨(dú)地或以任何組合的形式保持與該多肽大體上相同或相似的生物學(xué)功能或活性和/或相同或相似的結(jié)構(gòu)屬性的多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員將承認(rèn)，本文中所使用的術(shù)語"相似的生物學(xué)功能或活性"的意義優(yōu)選取決于所考慮的多肽，更具體來說是其功能。更優(yōu)選，相似的生物學(xué)功能或活性在根據(jù)本發(fā)明的該多肽的一個(gè)或幾個(gè)化學(xué)活性、生物學(xué)活性或其他活性方面與非片段或非衍生物的功能不同。更優(yōu)選，生物學(xué)功能或活性通過活性、親和力、抗原性的程度來確定，優(yōu)選表示為抗原性指數(shù)、免疫原性、穩(wěn)定性和/或特異性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，差異小于50%，小于75%或小于90%。特別優(yōu)選片段、類似物和衍生物是包含賦予狹義布氏疏螺旋體或任何其他病原性疏螺旋體屬物種的存活力所必需的功能、或在人中引起疾病的能力的受體或酶的結(jié)構(gòu)域的片段、類似物和衍生物。進(jìn)一步優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的片段、類似物和衍生物是81包括或包含動(dòng)物中特別是人中的抗原或免疫原決定簇的片段、類似物和衍生物。此類片段也分別稱為抗原性片段、抗原性衍生物和抗原性類似物。也在本發(fā)明的實(shí)施方案內(nèi)的是，此類相似的生物學(xué)功能或活性在不希望的活性方面得到減少。優(yōu)選，這樣的減少是由根據(jù)本發(fā)明的多肽展示的該活性的至少10%,優(yōu)選至少20%和更優(yōu)選至少50°/。。在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，這樣的減少的不希望的活性是酶促功能和毒性功能和/或人交叉反應(yīng)性抗體的產(chǎn)生。本領(lǐng)域技術(shù)人員也承認(rèn)，本文中所使用的術(shù)語"相似的結(jié)構(gòu)屬性"的意義優(yōu)選取決于所考慮的多肽和更具體是其功能和/或其結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，此類結(jié)構(gòu)屬性是根據(jù)本發(fā)明的多肽的cc螺旋和形成a螺旋的區(qū)域、p折疊片和形成P折疊片的區(qū)域、轉(zhuǎn)角和形成轉(zhuǎn)角的區(qū)域、巻曲(coil)和形成巻曲的區(qū)域、親水區(qū)、疏水區(qū)、oc兩親性區(qū)域、P兩親懷區(qū)域、柔韌區(qū)、形成表面的區(qū)域、底物結(jié)合區(qū)和高抗原性指數(shù)區(qū)和其任何組合。在實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽的片段、衍生物、變體或類似物是l)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選保守氨基酸殘基)置換并且該被置換的氨基酸殘基可以由或可以不由遺傳密碼編碼的多肽，或2)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包含取代基的多肽，或3)其中根據(jù)本發(fā)明的多肽或其片段與另一種化合物例如增加其根據(jù)本發(fā)明的多肽的半衰期的化合物例如聚乙二醇融合的多肽，或4)其中額外的氨基酸融合至根據(jù)本發(fā)明的多肽或其片段的多肽，例如蛋白序列-序列、。根;居本文中的教導(dǎo)，此類片段:衍生^、、變體^類似物據(jù)認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。本發(fā)明還涉及不同狹義布氏疏螺旋體分離抹和來自其他疏螺旋體屬物種優(yōu)選病原性疏螺旋體屬物種(包括阿氏疏螺旋體和嘵氏疏螺旋體)的分離林的、優(yōu)選為同源物的蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原和抗原。此類同源物可容易地基于本文中公開的核酸和氨基酸序列進(jìn)行分離。對(duì)于每一種病原體存在迄今為止明顯不同的多個(gè)血清型或臨床林系，分型基于血清型特異性抗血清或分子方法。因此對(duì)于每一種82血清可確定任何抗原的存在。此外，如對(duì)于o"C(Livey，I.等人，199"所描述的，可能確定特定抗原在不同廣義布氏疏螺旋體基因型群和林系中的差異性(variability)。不血清型對(duì)不同疏螺旋體屬感染的貢獻(xiàn)隨不同年齡組和特別是地理區(qū)域的變化而變化。重要的方面是，最有價(jià)值的保護(hù)性抗原需要在不同的臨床林系中保守。此外，本發(fā)明還包括包含此類超免疫血清反應(yīng)性抗原、其變體、類似物、衍生物的融合多肽和所述片段的變體、類似物和衍生物也包括在本發(fā)明中?？墒褂冒ㄓ糜诋a(chǎn)生和表達(dá)編碼融合蛋白的重組多核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來容易地制備此類融合多肽和蛋白質(zhì)以及編碼它們的核酸分子。其中優(yōu)選變體是通過保守氨基酸置換而與參照不同的變體。此類置換是用相似特征的另一種氨基酸置換根據(jù)本發(fā)明的多肽中的給定氨基酸的置換。通?？醋鞅Ｊ刂脫Q的是在脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之間用一種氨基酸取代另一種氨基酸的取代；羧基殘基Ser和Thr的互換，酸性殘基Asp和Glu的交換，酰胺殘基Asn和Gln之間的置換，堿性殘基Lys和Arg的交換以及芳香族殘基Phe和Tyr間的取代。在這點(diǎn)上特別優(yōu)選的是，具有本文中公開的根據(jù)本發(fā)明的任何多肽的氨基酸序列和優(yōu)選序列表中所示的氨基酸序列、其中以任何組合置換、缺失或添加幾個(gè)、少數(shù)幾個(gè)、5至1Q個(gè)、l至5個(gè)、l至3個(gè)、2個(gè)、1個(gè)氨基酸或無氨基酸的變體、類似物、衍生物和片段以及所述片段的變體、類似物和衍生物。其中特別優(yōu)選的是不改變本發(fā)明的肽的性質(zhì)和活性的沉默置換、添加和缺失。在這點(diǎn)上，保守置換也是特別優(yōu)選的。最優(yōu)選的是具有序列表中所示的氨基酸序列的、無置換的肽。根據(jù)本發(fā)明的多肽優(yōu)選以分離的形式提供，和優(yōu)選純化至均一。生抗原性的片段。因此，本發(fā)明使得能夠產(chǎn):生i示二個(gè)i特別地二于更長(zhǎng)的片段只有少數(shù)氨基酸交換的抗原或抗原性片段，只要具有氨基200780033994.5酸交換的此類片段的抗原性或抗原能力(antigeniccapacity)在交換后不被嚴(yán)重削弱，即適合用于在使用該抗原接種的個(gè)體引中發(fā)適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)和通過來自個(gè)體血清的個(gè)體抗體制劑來鑒定。根據(jù)本發(fā)明的多肽的此類片段的優(yōu)選實(shí)例是這樣的多肽，所述多肽也可獲自表l、5、6、8和10和優(yōu)選為在其不同的實(shí)施方案中相應(yīng)于根據(jù)本發(fā)明的第八方面的抗原，更優(yōu)選具有或包含與之一起顯示的核心氨基酸序列。面。要理解，本發(fā)明還涉及，除其他以外，編碼上述片段、變體、活性變體和活性片段的核酸分子、與編碼所述片段、變體、活性變體和活性片段的核酸分子雜交的核酸分子，特別地在嚴(yán)格條件下雜交的核酸分子以及用于擴(kuò)增編碼所述片段的核酸分子的核酸分子，例如PCR引物。在這幾點(diǎn)上，優(yōu)選核酸分子是相應(yīng)于上述優(yōu)選片段的核酸分子。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸分子的載體、使用本發(fā)明的載體進(jìn)行改造的宿主細(xì)胞和通過重組技術(shù)產(chǎn)生根椐本發(fā)明的多肽的。許多種表達(dá)載體可用于表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的多肽。通常在這點(diǎn)上，適合用于保持、擴(kuò)增或表達(dá)核酸以在宿主中表達(dá)多肽的任何載體可用于表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的該方面，載體可以是例如質(zhì)粒載體、單鏈或雙鏈?zhǔn)删w載體、單鏈或雙鏈RNA或DNA病毒載體。本文中公開的起始質(zhì)粒可商購獲得、公開地獲得，或可通過使用熟知的公布的常規(guī)方法從可獲得的質(zhì)粒構(gòu)建。在某些方面，其中優(yōu)選的載體是用于表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的核酸分子和多肽的載體。宿主細(xì)胞中的核酸構(gòu)建體可以以常規(guī)的方式用于產(chǎn)生由重組序列編碼的基因產(chǎn)物。備選地，根據(jù)本發(fā)明的多肽可通過常規(guī)肽合成儀合成產(chǎn)生。成熟的蛋白質(zhì)可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母、細(xì)菌或其他細(xì)胞中在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子控制下表達(dá)。無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)也可用于使用從本發(fā)明的DNA構(gòu)建體產(chǎn)生的RNA來產(chǎn)生此類蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可進(jìn)行基因工程改造以整合核酸分子和表達(dá)本發(fā)明的84核酸分子。合適的宿主的代表性實(shí)例包括細(xì)菌細(xì)胞例如鏈球菌("re/7fococc/)、葡萄球菌(staphylococci)、大腸桿菌(E.coli)、鏈霉菌屬(i7re/^啤ces)和枯草芽孢桿菌(》ac/"i^s由/"/s)細(xì)胞；真菌細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞和曲霉屬(J^er^7/i^)細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞例如果蠅S2和SpodopteraSf9細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞例如CHO、C0S、HeLa、C127、3T3、BHK、293和Bowes黑色素瘤細(xì)胞；以及植物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的多肽可以表達(dá)為修飾的形式例如融合蛋白的形式，和可以不僅包括分泌信號(hào)而且還包括額外的異源功能性區(qū)域。因此，例如，額外的氨基酸(特別地帶電荷的氨基酸)的區(qū)域可添加至多肽的N或C末端以在純化或隨后的操作和貯存過程中提高在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性和持續(xù)性。此外，也可將區(qū)域加至多肽以幫助純化。此類區(qū)域可在多肽的最終制備之前除去。將肽部分添加至多肽以造成分泌或外排，以提高穩(wěn)定性或以幫助純化等等，是本領(lǐng)域內(nèi)熟知和常規(guī)技術(shù)。優(yōu)選的融合蛋白包含來自免疫球蛋白的用于增溶或純化多肽的異源區(qū)域。例如，EP0464533(加拿大同族2045869)公開了包含免疫球蛋白分子的恒定區(qū)的不同部分連同另一種蛋白質(zhì)或其部分的融合蛋白。在藥物發(fā)現(xiàn)中，例如，為了進(jìn)行高通量篩選測(cè)定以鑒定拮抗劑，將蛋白質(zhì)與抗體的Fc部分融合。參見例如(Bennett,D.等人，1995)和(Johanson,K.等人，1995)。融合蛋白還可包括融合或偶聯(lián)至除了氨基酸外的部分(包括脂質(zhì)和糖類)的根據(jù)本發(fā)明的多肽。此外，本發(fā)產(chǎn)生的其他疫苗試劑類別一起使用。此類蛋白質(zhì)用于預(yù)防、治療和診斷由廣譜疏螺旋體屬分離林引起的疾病。在另外的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的肽與提供抗標(biāo)簽物質(zhì)可選擇性結(jié)合的表位的表位標(biāo)簽融合。通常將表位標(biāo)簽置于肽的氨基或羧基端，但當(dāng)生物學(xué)活性允許時(shí)，其也可以以內(nèi)部插物或置換的方式進(jìn)行整合?？墒褂梦镔|(zhì)例如抗標(biāo)記的多肽的抗體檢測(cè)肽的此類表位標(biāo)記的形式的存在。此外，提供表位標(biāo)簽使得能夠通過使用抗標(biāo)簽抗體或其他結(jié)合表位標(biāo)簽的親和基質(zhì)的親和純化來容易地純化肽。不同的標(biāo)簽多肽和它們各自的抗體在本領(lǐng)域內(nèi)85是熟知的。實(shí)例包括多組氨酸(poly-his)、多組氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)標(biāo)簽、HA標(biāo)簽多肽、c-myc標(biāo)簽、Strep標(biāo)簽和FLAG標(biāo)簽。根據(jù)本發(fā)明的多肽可以通過熟知的方法從重組細(xì)胞回收和純化，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀法、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、羥基磷酸灰石層析和凝集素層析。后在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。生產(chǎn)方法還可包括純化步驟以純化或分離待制備的多肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，載體是根據(jù)本發(fā)明的載體。根據(jù)本發(fā)明的多肽可用于檢測(cè)包含這些生物體或蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原(包括其片段)的樣品中的生物體。優(yōu)選，這樣的檢測(cè)用于診斷，更優(yōu)選用于診斷疾病，最優(yōu)選用于診斷與革蘭陰性細(xì)菌，特別地選自病原性疏螺旋體屬物種(包括但不必限于阿氏疏螺旋體、狹義布氏疏螺旋體、嘎氏疏螺旋體、B.lusitaniae和B.valaisiana)，更優(yōu)選選自狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體和嘎氏疏螺旋體的細(xì)菌的存在或豐度相關(guān)或關(guān)聯(lián)的疾病。根據(jù)本發(fā)明的核酸用還可用于診斷或檢測(cè)樣品中的生物體，其中途一起公開的生物體相同的生物體。在本公開內(nèi)容的教導(dǎo)下，分別設(shè)力之內(nèi)。更優(yōu)選此類診斷或檢測(cè)使用引物或探針以與根據(jù)本發(fā)明的核酸分子特異性相互作用。此類引物和探針的長(zhǎng)度和設(shè)計(jì)分別視實(shí)施的具體方法或診斷的變化而變化。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用引物進(jìn)行例如基于PCR的檢測(cè)或診斷系統(tǒng)，即方法或測(cè)定，引物的長(zhǎng)度將在大約IO至大約30個(gè)核苷酸和更優(yōu)選大約16至25個(gè)核苷酸的范圍內(nèi)變化。在基于探針的檢測(cè)或診斷的情況下，探針的長(zhǎng)度優(yōu)選為大約與對(duì)于基86于引物的系統(tǒng)所指定的相同。此外，在基于探針的系統(tǒng)的情況下，探針將包含允許其直接或間接檢測(cè)的部分。用于直接檢測(cè)的該部分可以是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記。用于間接檢測(cè)的該部分可以是生物素或介導(dǎo)與另外的化合物相互作用(所述化合物從而可被標(biāo)記，從而允許其檢測(cè))的任何其他部分。本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明的多肽，更優(yōu)選本發(fā)明的超免疫血清反應(yīng)性抗原和其片段在細(xì)胞和組織中的水平(包括確定正常和異常水平)的診斷測(cè)定法，例如定量和診斷測(cè)定法。因此，例如，用于檢測(cè)與正常對(duì)照組織樣品相比根據(jù)本發(fā)明的多肽的過度表達(dá)的、根據(jù)本發(fā)明的診斷測(cè)定法可用于檢測(cè)感染的存在，例如，和鑒定感染性生物體?？捎糜诖_定此類多肽在來源于宿主的樣品中的水平的測(cè)定技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。此類測(cè)定方法包括放射免疫測(cè)定法、竟?fàn)幗Y(jié)合測(cè)定法、Western印跡分析和ELISA測(cè)定法。在這些方法中，ELISA和Western印跡分析通常是優(yōu)選的。ELISA測(cè)定法一開始包括制備對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的多肽的一種是特異性的抗體，優(yōu)選單克隆抗體。此外，通常制備結(jié)合所述單克隆抗體的報(bào)告抗體。將報(bào)告抗體附著至可檢測(cè)的試劑例如放射性試劑、熒光試劑或酶試劑，例如辣根過氧化物酶?？蓪⒁环N或多種根據(jù)本發(fā)明的多肽，更優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的超免疫血清反應(yīng)性抗原和其片段固定在ELISA板上以用于待檢測(cè)的患者或受試者的血清中的反應(yīng)性抗體的檢測(cè)。Western印跡測(cè)定法最初單獨(dú)地或與SDS聚丙烯酰胺電泳一起分離根據(jù)本發(fā)明的多肽，然后將所述多肽轉(zhuǎn)移至并且固定在固體支持基質(zhì)例如硝酸纖維素、尼龍或其組合上。與報(bào)告抗體一起，可檢測(cè)反應(yīng)性抗體。將報(bào)告抗體附著至可檢測(cè)的試劑，例如放射性試劑、焚光試劑或酶試劑，例如辣根過氧化物酶。對(duì)其的引物或探針還可用于陣列的目的-或與其結(jié)合。在根據(jù)本發(fā):月的核酸分子和針對(duì)其的引物和探針的情況下，探針和引物的長(zhǎng)度也可以優(yōu)選在大約25至大約75個(gè)核苷酸，更優(yōu)選大約35至大約50個(gè)核苷87酸的范圍內(nèi)。更特別地，可將根據(jù)本發(fā)明的多肽的至少一個(gè)多肽固定在支持物上。所述支持物通常包含多種根據(jù)本發(fā)明的多肽和/或超免疫血清反應(yīng)性抗原其片段，其中可通過使用一種或幾種根據(jù)本發(fā)明的超和其片段來^生多樣性。'表征此類-陣列二^任何陣列的特征il常是i樣的事實(shí)，即在所述支持物或其表面上的不同的或預(yù)先確定的區(qū)域或位置上，固定不同的多肽。因此，陣列的不同位置或區(qū)域上的任何活性可與特定的多肽相關(guān)。固定在支持物上的不同多肽，更優(yōu)選不同超免疫血清反應(yīng)性抗原和其片段的數(shù)目可分別在少至10種至數(shù)千種不同多肽和超免疫血清反應(yīng)性抗原以及其片段的范圍內(nèi)變化。每cii^所述分子的密度在優(yōu)選實(shí)施方案中少至每cm210個(gè)至每cm2至少400個(gè)不同的此類多肽，更特別地每cm2至少1，000個(gè)不同的此類多肽，更優(yōu)選不同的超免疫血清反應(yīng)性抗原和其片段。本文中所述關(guān)于根據(jù)本分子和引物以及探針，這將被本領(lǐng)域技術(shù)人員將承認(rèn)。此類陣列的制備對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的和例如描述于美國專利5,744,309。陣列優(yōu)選包括平面的、多孔的或無孔的具有至少第一表面的固體支持物。根據(jù)本發(fā)明的多肽固定在所述表面上。優(yōu)選支持材料，除其他以外，是玻璃或纖維素。也在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，陣列用于本文中描述的任何診斷應(yīng)用。除了根據(jù)本發(fā)明的多肽外，根據(jù)本發(fā)明的核酸分子也可用于產(chǎn)生上述陣列，所述陣列原則上可用于此處公開的對(duì)于包含多肽的陣列的任何目的。這同樣可用于由本文中描述的抗體，優(yōu)選單克隆抗體等等制備的陣列。在另外的方面，本發(fā)明涉及針對(duì)任何根據(jù)本發(fā)明的多肽、根據(jù)本發(fā)明的其衍生物、片段、變體、活性片段和活性變體的抗體。本發(fā)明包括例如單克隆和多克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體和人源化抗體以及Fab片段或Fab表達(dá)文庫的產(chǎn)物。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，抗體可以是嵌合的，即其不同部分來自不同的物種或至少各自的序列獲自不同的物種。通過將所述多肽對(duì)動(dòng)物優(yōu)選非人動(dòng)物施用來獲得。然后所獲得的抗體將結(jié)合所述多肽本身。這樣，即使序列只編碼片段，所述多肽可用于產(chǎn)生結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的完整天然多肽的抗體。然后可將此類抗體用于從表達(dá)那些超免疫血清反應(yīng)性抗原和其片段的組織中分離本根據(jù)本發(fā)明的多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，該方法也可用于所述多肽的片段、變體、活性片段和活性變體。為了制備單克隆抗體，可使用提供通過連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)產(chǎn)生的抗體的本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何技術(shù)(如最初在(Kohler，G.等人，19W)中所描述的)。所述用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4，946，778)可適合在它們的根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案中產(chǎn)生針對(duì)免疫原性超免疫血清反應(yīng)性抗原和其他片段的單鏈抗體。同樣，轉(zhuǎn)基因小鼠或其他生物例如其他哺乳動(dòng)物可用于表達(dá)針對(duì)根據(jù)本發(fā)明的多肽的人源化抗體。備選地，噬菌體展示技術(shù)或核糖體展示可用于從PCR擴(kuò)增的來自人的淋巴細(xì)胞的v-基因的庫集(repertorie)(就具有各自的靶抗原篩選的)或從原始文庫(naivelibrary)中選擇具有針對(duì)根據(jù)本發(fā)明的多肽的結(jié)合活性的抗體基因(McCafferty，J.等人，1990;Marks,J.等人，1992)。這些抗體的親和力還可通過鏈替換來提高(Clackson，T.等人，1991)。如果存在兩個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，那么各結(jié)構(gòu)域可針對(duì)不同的表位-稱為'雙特異性，抗體。優(yōu)選修飾抗體或其衍生物以使其在個(gè)體中的免疫原性減少。例如，如果個(gè)體是人，那么抗體可以最優(yōu)選被"人源化"，其中雜交瘤產(chǎn)生的抗體的互補(bǔ)決定區(qū)已被移植入人單克隆抗體，例如如(Jones，P，等人，1986)或(Tempest，P.等人，1991)中所描述的。上述抗體可用于通過將抗體附著至固體支持物以通過親和層析進(jìn)行分離和/或純化來分離或鑒定表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的多肽的克隆。89因此，除其他以外，針對(duì)根據(jù)本發(fā)明的多肽的抗體可用于抑制和/或治療感染，具體地細(xì)菌感染，特別地由病原性疏螺旋體屬物種，優(yōu)選廣義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體和嘎氏疏螺旋體引起的感染。根據(jù)本發(fā)明的多肽，更特別地超免疫血清反應(yīng)性抗原和其片段在它們的不同實(shí)施方案中包括形成本發(fā)明的特定方面的抗原性的、表位性的(epitopically)或免疫性的等同的衍生物。本文中所使用的術(shù)語"抗原性的等同的衍生物"包括將被某些抗體(所述抗體，當(dāng)針對(duì)所述多肽產(chǎn)生時(shí)，干擾病原體和哺乳動(dòng)物宿主之間的相互作用)特異性識(shí)別的根據(jù)本發(fā)明的此類多肽或其等同物。本文中使用的術(shù)語"免疫性的等同的衍生物"包括當(dāng)在合適的制劑中用于在脊推動(dòng)物中產(chǎn)生抗體時(shí)，抗體發(fā)揮干擾病原體和哺乳動(dòng)物宿主之間的相互作用的功能的肽或其等同物。在它們的不同實(shí)施方案中的根據(jù)本發(fā)明的多肽，更特別地超免疫血清反應(yīng)性抗原和其片段，例如抗原性的或免疫性的等同的衍生物或其融合蛋白可用作抗原來免疫小鼠或其他動(dòng)物，例如大鼠或雞。融合蛋白可為根據(jù)本發(fā)明的多肽提供穩(wěn)定性。此類多肽可以例如通過綴合與免疫原性栽體蛋白，例如牛血清白蛋白(BSA)或鑰孔血藍(lán)蛋白(keyholelimpethae腦yanin,KLH)結(jié)合。備選地，包含多拷貝的根據(jù)本發(fā)明的多肽，更優(yōu)選地超免疫血清反應(yīng)性抗原和其片段或抗原有具有足夠的抗原性來提高免疫原性以避免載體的使用。遞送方法例如直接注射質(zhì)粒DNA至肌肉、遞送與特定蛋白質(zhì)載體復(fù)合DNA的、用磷酸鈣共沉淀DNA、將DM封裝在各種形式的脂質(zhì)體中、粒子轟擊(Tang，D.等人，1992)，(Eisenbraun，M.等人，1993)和使用克隆的逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體的體內(nèi)感染(Seeger，C.等人，1984)。在另外的方面，本發(fā)明涉及與任何根據(jù)本發(fā)明的多肽結(jié)合的肽，以及用于制備此類肽的方法，其中所述方法的特征在于所述多肽和基本步驟的用途對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。此類肽可通過使用根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的方法，例如噬菌體展示或核糖體展示來產(chǎn)生。在噬菌體展示的情況下，基本上以噬菌體的形式產(chǎn)生肽文庫，然后將該類型的文庫與靶分子接觸，在本案中靶分子是根據(jù)本發(fā)明的多肽。然后從各自的反應(yīng)物中取出(優(yōu)選以與靶分子的復(fù)合物形式)此類結(jié)合靶分子的肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，結(jié)合特征至少在某種程度上，取決于具體實(shí)現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)定，例如鹽濃度等。在將以離后，和任選地也在從靶分子和肽的復(fù)合物中除去靶分子后，隨后可表征各肽。在表征之前，任選地例如通過擴(kuò)增編碼肽的噬菌體來實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增步驟。表征優(yōu)選包括結(jié)合靶的肽的測(cè)序?；旧?，肽在它們的長(zhǎng)度上不受限制，然而優(yōu)選地具有大約8至20個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度的肽優(yōu)選地在各自方法中獲得。文庫的大小可以是大約102至1018，優(yōu)選108至1015個(gè)不同的肽，然而，不限于此。在優(yōu)選實(shí)施方案中，此類肽是高親和力結(jié)合肽。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述肽是肽適體。上述結(jié)合乾的肽的特定形式是除其他以外描述于德國專利申請(qǐng)DE19742706中的所謂的"抗促成素"。在這個(gè)范圍內(nèi)，本發(fā)明還療和診斷應(yīng)用的用途(優(yōu)選對(duì)于抗體)。在另外的方面，本發(fā)明涉及與任何根據(jù)本發(fā)明的多肽相互作用的核酸，和用于制備此類功能性核酸的方法，其中所述方法的特征在于的。功能性核酸優(yōu)選是適體和鏡像異構(gòu)體。在這個(gè)范圍內(nèi)，本發(fā)明還涉及特異性結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的多肽的適體和鏡像異構(gòu)體，和其用于本文中描述的任何治療和診斷應(yīng)用的用途(優(yōu)選對(duì)于抗體)。適體是D核酸，其是單鏈或雙鏈且特異性與靶分子相互作用。適體的制備或選擇描述于例如歐洲專利EPQ533838?；旧蠈?shí)現(xiàn)下列步驟。首先，提供核酸即潛在的適體的混合物，其中各核酸通常包含幾個(gè)，優(yōu)選至少八個(gè)連續(xù)的隨機(jī)核苷酸的片段。然后將該混合物與靶分子接觸，其中核酸，例如基于與候選混合物相比，增加的對(duì)靶的親91和力或具有更大的對(duì)其的力，結(jié)合該靶分子。隨后將結(jié)合核酸與混合物中其他物質(zhì)分離。任選地，使用例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增所獲得的核酸?？芍貜?fù)這些步驟數(shù)次，從而在結(jié)束時(shí)產(chǎn)生具有增加的比例的特異性結(jié)合耙的核酸的混合物，其中隨后任選地從該靶選擇最終的結(jié)合核酸。這些特異性結(jié)合核酸稱為適體。很明顯，在用于產(chǎn)生或鑒定適體的方法的任何階段，可采集個(gè)體核酸的混合物的樣品以通過使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來確定其序列。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，可以例如通過導(dǎo)入產(chǎn)生適體的領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的確定的化學(xué)基團(tuán)來穩(wěn)定適體。此類修飾可以例如存在于在核苷酸的糖部分的2'-位置上導(dǎo)入氨基。適體目前用作治療劑。然而，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，所選擇或產(chǎn)生的適體可用于靶標(biāo)確認(rèn)和/或作為用于開發(fā)藥劑，優(yōu)選基于小分子的藥劑的前導(dǎo)物質(zhì)。這事實(shí)上可通過竟?fàn)帨y(cè)定法來進(jìn)行，在所述竟?fàn)帨y(cè)定法中，靶分子和適體之間的特異性相互作用被候選藥物抑制，由此基于適體從耙和適體的復(fù)合物中的取代，可推測(cè)各藥物候選物允許靶和適體之間的相互作用的特異性抑制，并且如果相互作用是特異性的，所述候選藥物將，至少在原理上，適合用于阻斷靶，從而減少其在包含此類靶的各系統(tǒng)中的生物利用度或活性。然后將所獲得的小分子經(jīng)歷進(jìn)一步的衍生化和修飾，從而最優(yōu)化其物理、化學(xué)、生物學(xué)和/或醫(yī)學(xué)特征例如毒性、特異性、生物可降解性和生物利用度。鏡像異構(gòu)體和它們的產(chǎn)生或制備基于相似的原理。鏡像異構(gòu)體的制備描述于國際專利申請(qǐng)W098/08856。鏡像異構(gòu)體是L氨基酸，其表示它們由L核普酸組成而非如適體那樣由D核苷酸組成。鏡像異構(gòu)體的特征在于事實(shí)，即它們?cè)谏锵到y(tǒng)中具有非常高的穩(wěn)定性和可與適體相比的，特異性與它們所針對(duì)的靶分子相互作用。在產(chǎn)生鏡像異構(gòu)體的方法中，產(chǎn)生不均一的D核酸群體，將該群體與靶分子的旋光對(duì)映體(在本案中例如與根據(jù)本發(fā)明的超免疫血清反應(yīng)性抗原和其片段的天然的L對(duì)映體的D對(duì)映體)接觸。隨后，分離不與靶分子的旋光對(duì)映體相互作用的那些D核酸。但與靶分子的旋光對(duì)映體相互作用的那些D核酸也進(jìn)行分離，任選地進(jìn)行鑒定和/或測(cè)序，然后基于從D92核酸獲得的核酸序列信息合成相應(yīng)的L核酸。在序列上與上述與耙分子的旋光對(duì)映體相互作用的D核酸相同的這些L核酸將特異性地與天然的革巴分子而非與其旋光對(duì)映體相互作用。與用于產(chǎn)生適體的方法相似，也可能重復(fù)各種步驟數(shù)次，從而富集特異性地與靶分子的旋光對(duì)映體相互作用的那些核酸。在另外的方面，本發(fā)明涉及與任何根據(jù)本發(fā)明的核酸分子相互作用的功能性核酸以及用于制備此類功能性核酸的方法，其中所述方法的特征在于根據(jù)本發(fā)明的核酸分子和它們各自的序列和基本步驟的用途對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。功能性核酸優(yōu)選為核酶、反義寡核苷酸和siRNA。在這個(gè)范圍內(nèi)，本發(fā)明還涉及特異性結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的多肽的該類型的功能性核酸和其用于本文中描述的任何治療和診斷應(yīng)用的用途(優(yōu)選對(duì)于抗體)。核酶是優(yōu)選由RNA組成的的催化活性核酸，其基本上包括兩個(gè)部分。第一部分顯示催化活性而第二部分負(fù)責(zé)與靶核酸(在本案中是編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的核酸)特異性相互作用。一旦靶核酸和核酶的第二部分之間的相互作用(所述相互作用通常通過雜交和兩個(gè)雜交鏈上的大體上互補(bǔ)的堿基序列片段的Watson-Crick堿基配對(duì)產(chǎn)生)，催化活性部分可變得有活性，這意味著，其在分子內(nèi)或分子間催化靶核酸，如果核酶的催化活性是磷酸二酯酶活性。然后，可存在靶核酸的進(jìn)一步降解，這在最后導(dǎo)致耙核酸以及從所述靶核酸產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的降解。核酶、它們的用途和設(shè)計(jì)原理對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，且例如描述于(Doherty,E.等人，2001)和(Lewin，A.等人，2001)。用于制備藥劑和作為診斷劑的反義寡核苷酸的活性和設(shè)計(jì)分別基于相似的作用模式?；旧?，反義寡機(jī)核苷酸基于堿基互補(bǔ)而與靶RM，優(yōu)選與mRM雜交，從而激活RNA酶H。RNA酶H被磷酸二酯和磷硫酰偶聯(lián)的DNA激活。然而磷酸二酯偶聯(lián)的DNA被細(xì)胞核酸酶快速降解，而磷硫酰偶聯(lián)的DNA例外。這些具有抗性的、非天然的DM衍生物在與RNA雜交時(shí)不抑制RM酶H。換句話說，反義多核苷酸只有作93為DNARNA雜種復(fù)合物才有效。關(guān)于該類型的反義寡核苷酸的實(shí)例，除其他以外，描述于美國專利US5，849，902和US5,989,912。換句話說，基于在本案中為根據(jù)本發(fā)明的超免疫血清反應(yīng)性抗原和其片段的核酸序列和其片段的核酸分子的靶分子的核酸序列(所述序列來自各核酸序列可原則上從其推導(dǎo)的靶蛋白或通過同樣地知道的核酸序列，特別是mRNA)，可基于堿基互補(bǔ)性的原理設(shè)計(jì)適合的反義寡核苷酸。特別優(yōu)選的是具有磷硫酰DM的短片段(3至9個(gè)堿基)的反義寡核苷酸。最少3個(gè)DNA堿基是細(xì)菌RNA酶H的激活所必需的，最少5個(gè)堿基是哺乳動(dòng)物RNA酶H激活所必需的。在這些嵌合寡核苷酸中，存在形成RNA酶H的底物、側(cè)翼連接由不形成RNA酶H的底物的修飾的核苷酸組成的雜交"臂，，的中心區(qū)域。嵌合寡核苷酸的雜交臂可以例如通過2'-0-甲基或2'-氟來修飾。備選的方法在所述臂中使用曱基膦酸酯或氨基磷酸酯鍵。用于本發(fā)明的實(shí)施的反義寡核苷酸的另外的實(shí)施例是P-曱氧基寡核苷酸、部分P-甲氧基寡氧核糖核苷酸或P-曱氧基寡核苷酸。對(duì)于本發(fā)明特別相關(guān)和有用的是上述兩個(gè)美國專利中更詳細(xì)描述的那些反義寡核苷酸。此類寡核苷酸不包含天然的5'至3'連接的核苷酸。相反，所述寡核苷酸具有兩種類型的核苷酸激活MA酶H的2'-脫氧磷硫酰和不激活RNA酶H的2'-修飾的核苷酸。2'-修飾的核苷酸之間的鍵可以是磷酸二酯鍵、磷硫酰鍵或P-乙氧基磷酸二酯鍵。RNA酶H的激活通過連續(xù)的RNA酶H激活區(qū)來完成，所述區(qū)域包含3至5個(gè)2'-脫氧磷硫酰核苷酸以激活細(xì)菌RNA酶H和5至10個(gè)2，-脫氧磷疏酰核苷酸以激活真核生物，特別地哺乳動(dòng)物RNA酶H。免受降解的保護(hù)作用通過使產(chǎn)生5'和3'末端堿基高度核酸酶抗性和任選地通過設(shè)置3'末端封閉基團(tuán)來完成。更特別地，反義寡核苷酸包含5'末端和3'末端；和獨(dú)立地選自2'-修飾的磷酸二酯核苷酸和2'-修飾的P-烷氧基磷酸三酯核苷酸的從位點(diǎn)11至59的5'至3，連接的核苷酸；以及其中將5'-末端核苷94附著至3至IO個(gè)連續(xù)磷硫酰連接的脫氧核糖核苷酸的RM酶H激活區(qū)，和其中所述寡核苷酸的3'-端選自反向脫氧核糖核苷酸、1至3個(gè)磷硫酰2'-修飾的核糖核苷酸的連續(xù)片段、生物素基團(tuán)和P-烷氧基磷酸三酯核苷酸。也可使用反義寡核苷酸，其中如上所述，將3'末端核苷而非5'末端核苷附著至RNA酶H激活區(qū)。同樣，還從特定的基團(tuán)選擇所述寡核苷酸的5'末端而非3'末端。在它們的不同的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸和多肽可用作或用于制備藥物組合物，特別地疫苗。優(yōu)選此類藥物組合物，優(yōu)選疫苗，用于預(yù)防或治療由疏螺旋體屬物種優(yōu)選病原性疏螺旋體基因型群，更優(yōu)選狹義布氏疏螺旋體，阿氏疏螺旋體和嘎氏疏螺旋體引起的疾病或與其相關(guān)或關(guān)聯(lián)的疾病。在這個(gè)范圍內(nèi)，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于在個(gè)體，特別地哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括用足以產(chǎn)生抗體從而保護(hù)所述個(gè)體免受由上述微生物引起的感染的、在它們的不同實(shí)施方案中的根據(jù)本發(fā)明的肽或其片段、或變體接種個(gè)體。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及在個(gè)體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，該方法包括，通過基因療法或其他方法，遞送根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，優(yōu)選在它們的不同實(shí)施方案中的、功能性編碼超免疫血清反應(yīng)性抗原和其片段的核酸分子，用于在體內(nèi)表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的多肽，以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生抗體或細(xì)胞介導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)(產(chǎn)生細(xì)胞因子的T細(xì)胞或細(xì)胞毒性T細(xì)胞)以保護(hù)所述個(gè)體免受疾病的侵害，無論該疾病是否已在個(gè)體內(nèi)確立。施用基因的一個(gè)方法是通過將其作為顆粒上的包衣或其他形式加速進(jìn)入目的細(xì)胞。本發(fā)明的另外的方面涉及免疫組合物，所述免疫組合物當(dāng)被導(dǎo)入能夠在其內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的宿主時(shí)，在該宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，其中所述組合物包含編碼和表達(dá)至少一種在它們的不同實(shí)施方案中的根據(jù)本發(fā)明的多肽的重組DNA。免疫反應(yīng)可進(jìn)行治療性或預(yù)防性使用，其可采取抗體免疫或細(xì)胞免疫例如由CTL或CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞免疫的形式。在它們的不同實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽可以與輔蛋白融合，所述輔蛋白本身不產(chǎn)生抗體但能夠穩(wěn)定第一蛋白質(zhì)和產(chǎn)生具有免疫原性和保護(hù)性特性的融合蛋白。該融合重組蛋白優(yōu)選還包括抗原性輔蛋白，例如谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或P-半乳糖苷酶，增溶蛋白質(zhì)和促進(jìn)其產(chǎn)生和純化的相對(duì)較大的輔蛋白。此外，輔蛋白在提供免疫系統(tǒng)的廣泛刺激的意義上可用作佐劑?？蓪⑤o蛋白附著至第一蛋白質(zhì)的氨基或羧基末端。本發(fā)明還提供了方法，所述方法在本文中描述的任何疏螺旋體屬物種(最優(yōu)選狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體和嘎氏疏螺旋體)引起的感染的動(dòng)物模型中，在此類基因免疫實(shí)驗(yàn)中使用在它們的不同實(shí)施方案中的根據(jù)本發(fā)明的核酸分子。這些分子特別適用于鑒定能夠引起預(yù)防性或治療性免疫反應(yīng)的蛋白表位。該方法可允許隨后從成功地抵抗或清除感染的動(dòng)物的需要的器官中制備特定值的單克隆抗體，以用于開發(fā)本文中描述的疏螺旋體屬物種(最優(yōu)選狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體和嘎氏疏螺旋體)在哺乳動(dòng)物具體地人中引起的感染的預(yù)防藥劑或治療性處理。在它們的不同實(shí)施方案中的、根據(jù)本發(fā)明的多肽可用作用于接種宿主的抗原來產(chǎn)生特異性抗體，所述抗體例如通過阻止細(xì)菌對(duì)損傷的組織的附著來保護(hù)免受細(xì)菌的入侵。組織損傷和因此損傷的組織的實(shí)例包括例如通過病毒感染(特別地呼吸器官的，例如流感)、機(jī)械、化學(xué)或熱損傷引起的或通過內(nèi)置裝置的植入引起的皮膚或結(jié)締組織以及粘膜組織中的傷口，或粘膜中的傷口，例如口、乳腺、尿道或陰道粘膜中的傷口。本發(fā)明還包括疫苗制劑，所述疫苗制劑包含與合適的載體一起的一種或幾種在它們的不同實(shí)施方案中的根據(jù)本發(fā)明的多肽。因?yàn)樗龈鶕?jù)本發(fā)明的多肽在胃中被分解，因此它們優(yōu)選通過胃腸外途施用，包括例如為皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、鼻內(nèi)或經(jīng)皮途徑的施用。適合用于胃腸外施用的制劑包括水性和非水性無菌注射液，其可以包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使制劑與個(gè)體的體液(優(yōu)選血液)等滲96的溶質(zhì)；和水性和非水性無菌混懸劑，其可包括懸浮劑或增稠劑。制劑可以以單位劑量或多劑量容器例如密閉的安瓿和小瓶提供，和可以以冷凍干燥的條件下貯存，在即將使用前只需要加入無菌液體載體即可。疫苗制劑還可包含用于增強(qiáng)制劑的免疫原性的佐劑系統(tǒng)，例如水包油系統(tǒng)和本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他系統(tǒng)。劑量將取決于疫苗的特異性活性且可通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)容易地確定。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于本文中描述的各種疏螺旋體屬物種和最優(yōu)選廣義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體和嘎氏疏螺旋體的藥物組合物，所述藥物組合物包含一種或多種在它們的不同實(shí)施方案中的根據(jù)本發(fā)明的多肽。此類藥物組合物可包含一種，優(yōu)選至少兩種或更多種針對(duì)所述疏螺旋體屬物種的所述多肽。任選地，此類多肽還可以與針對(duì)另外的病原體的抗原一起組合在組合藥物組合物中。優(yōu)選，所述藥物組合物是用于預(yù)防或治療由疏螺旋體屬物種，更優(yōu)選病原性疏螺旋體屬物種例如狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體和嘎氏疏螺旋的感染。根據(jù)另外的方面，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的藥物組合物。此類藥物組合物可包含一種或多種編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的根據(jù)本發(fā)明的核酸分子。任選地，將編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的此類核酸分子與編碼針對(duì)其他病原體的抗原的核酸分子一起組合在組合藥物組合物中。優(yōu)選，所述藥物組合物是用于預(yù)防或治療由疏螺旋體屬物種，更優(yōu)選本文中公開的病原性疏螺旋體屬物種，更優(yōu)選包括狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體和嘎氏疏螺旋體和/或其他病原體(針對(duì)所述病原體的抗原已包括在所述疫苗中)引起的感染。藥物組合物可以包含任何合適的輔助物質(zhì)，例如緩沖物質(zhì)、穩(wěn)定劑或其他活性成分，特別地已知與藥物組合物和/或疫苗生產(chǎn)相關(guān)的成分。對(duì)于在它們的不同實(shí)施方案中的、根椐本發(fā)明的多肽或根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，優(yōu)選的載體和/或賦形劑是用于進(jìn)一步刺激對(duì)根振本發(fā)97明的多肽或其編碼核酸分子的免疫反應(yīng)的免疫刺激性化合物。優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑中的免疫刺激性化合物選自聚陽離子物質(zhì)，特別地肽，免疫刺激性核酸分子，優(yōu)選免疫刺激性脫氧核苷酸，明礬，弗氏完全佐劑，弗氏不完全佐劑，神經(jīng)活性化合物，特別地人生長(zhǎng)激素或其組合。也在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，藥物組合物，特別地疫苗，除了包含一種或幾種在它們不同的實(shí)施方案中的根據(jù)本發(fā)明的多肽和/或也根據(jù)本發(fā)明的編碼其的核酸分子外，還包含在生物學(xué)或藥學(xué)上具有活性的其他化合物。優(yōu)選，疫苗組合物包含至少一種聚陽離子肽。根據(jù)本發(fā)明使用的聚陽離子化合物可以是顯示根據(jù)W097/30721的特征效應(yīng)的任何聚陽離子化合物。優(yōu)選的聚陽離子化合物選自堿性多肽、有機(jī)聚陽離子、堿性聚氨基酸或其混合物。這些聚氨基酸應(yīng)當(dāng)具有至少4個(gè)氨基酸殘基的鏈長(zhǎng)度(W097/30721)。特別優(yōu)選的是物質(zhì)如多聚賴氨酸、多聚精氨酸和在超過8個(gè)，特別地超過20個(gè)氨基酸殘基的范圍內(nèi)包含超過20%，特別超過50%的堿性氨基酸的多肽或其混合物。其他優(yōu)選聚陽離子和它們的藥物組合物描述于WO97/30721(例如聚乙烯亞胺)和WO99/38528。優(yōu)選這些聚肽包含20至500個(gè)氨基酸殘基，特別地30至200個(gè)殘基。這些聚陽離子化合物可通過化學(xué)或重組產(chǎn)生或可從天然來源產(chǎn)生。陽離子(多)肽還可以是具有(Ganz，T.,1999)中綜述的特性的抗^:生物劑。這些(多)肽可以是原核生物或動(dòng)物或植物來源或者可通過化學(xué)或重組產(chǎn)生(WO02/13857)。肽也可屬于防御素類型(WO02/13857)。此類肽的序列可以例如見于下列國際互聯(lián)網(wǎng)址http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/pag2.html下的抗微生物序列數(shù)據(jù)庫。此類宿主防御肽或防御素也是根據(jù)本發(fā)明的聚陽離子聚合物的優(yōu)選形式。通常，允許作為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)(優(yōu)選由APC(包括樹突狀細(xì)胞)介導(dǎo)的)的終產(chǎn)物激活(或下調(diào))的化合物用作聚陽離子聚合物。對(duì)于在本發(fā)明中用作聚陽離子物質(zhì)特別優(yōu)選的是的導(dǎo)管素(cathelicidin)衍生的抗微生物肽或其衍生物(國際專利申請(qǐng)W002/13857，通過引用合并入本文)，特別地從哺乳動(dòng)物優(yōu)選從人、?；蛐∈蟮膶?dǎo)管素衍生的抗微生物肽。從天然來源產(chǎn)生的聚陽離子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT(衍生的陽離子肽、觸角足肽(antennapediapeptide)、殼聚糖)或殼多糖的其他衍生物)或通過生化或重組生產(chǎn)從這些肽或蛋白質(zhì)衍生的其他肽。其他優(yōu)選聚陽離子化合物是抗微生物肽前體或相關(guān)的或從其衍生的物質(zhì)。例如，小鼠抗微生物肽前體是具有氨基酸序列NH2-RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKLVPQPE-COOH的肽。相關(guān)的或衍生的抗微生物肽前體物質(zhì)包含完整的抗微生物肽前體或具有至少15至20個(gè)氨基酸殘基的抗微生物肽前體的部分衍生化可包括由不在20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸中的氨基酸對(duì)天然氨基酸的置換或修飾。此外，可將另外的陽離子殘基導(dǎo)入此類抗微生物肽前體分子。優(yōu)選將這些抗微生物肽前體分子與抗原組合。這些抗微生物肽前體令人驚訝地也與用于抗原的佐劑一樣有效而無需加入另外的佐劑。因此可能在其他免疫激活物質(zhì)存在或不存在的情況下，在疫苗中使用此類抗微生物肽前體分子作為有效佐劑。根據(jù)本發(fā)明使用的另一種優(yōu)選聚陽離子物質(zhì)是包含通過3至7個(gè)疏水氨基酸的連接體分隔的2個(gè)KLK基序的合成肽(國際專利申請(qǐng)W002/32451，通過引用合并入本文)。本發(fā)明的藥物組合物還可包括免疫刺激性核酸。免疫刺激性核酸是例如包含天然或人造CpG的核酸、從無脊推動(dòng)物衍生的核酸的短片段或是在某些堿基背景中包含非甲基化的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸(CpG)的短寡核苷酸(ODN)的形式(例如描述于WO96/02555)。備選地，例如描述于WO01/93903中的基于肌苷和胞嗜啶核苷的核酸或包含脫氧肌苷和/或脫氧尿苷殘基的脫氧核酸(描述于W001/93905和W0用不同的免疫刺激性核酸的混合物。也在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，將任何上述聚陽離子化合物與任何上述免疫刺激性核酸組合。優(yōu)選，這些組合根據(jù)W001/93905、W002/32451、W001/54720、W001/93903、W002/13857和W002/095027以及WO03/047602(通過引用全并入本文)中描述的組合。此外或備選地，此類疫苗組合物，除了根據(jù)本發(fā)明的多肽和根據(jù)本發(fā)明的核酸分子外，優(yōu)選還包括根據(jù)本發(fā)明的編碼核酸分子、神經(jīng)活性化合物。優(yōu)選，神經(jīng)活性化合物是人生長(zhǎng)因子(例如WO01/24822中所描述的)。也是優(yōu)選地，將神經(jīng)活性化合物與任何上述聚陽離子化合物和/或免疫刺激性核酸組合。此外，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物是包含至少任何下列化合物或其組合的藥物化合物根據(jù)本發(fā)明的核酸分子、在它們的不同實(shí)施方案中的根據(jù)本發(fā)明的多肽、根據(jù)本發(fā)明的載體、根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞、根據(jù)本發(fā)明的抗體、根據(jù)本發(fā)明的功能性核酸和分別根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合肽例如抗促成素和高親和力結(jié)合肽以及肽適體、優(yōu)選如本文中所述篩選的根據(jù)本發(fā)明的任何激動(dòng)劑和拮抗劑。任何這些化合物和與細(xì)胞、組織或生物體一起使用的非滅菌或滅菌載體例如適合用于對(duì)受試者施用的藥物載體混合在一起使用。此類組合物包括，例如，媒介添加劑(mediaadditive)或治療有效量的本發(fā)明的超免疫血清反應(yīng)性抗原和其片段和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。此類栽體可包括但不限于鹽溶液、緩沖鹽溶液、葡萄糖、水、甘油、乙醇和其組合。制劑應(yīng)當(dāng)適合施用模式。本發(fā)明的藥物組合物可以以任何有效的、方便的方式施用，包括例如，通過局部、口服、肛門、陰道、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)或皮內(nèi)等等途徑的施用。治療中或作為預(yù)防劑，可以以可注射的組合物例如作為無菌水混懸劑(優(yōu)選等滲的)將本發(fā)明的藥物組合物的活性劑對(duì)個(gè)體施用。備選地，組合物，優(yōu)選藥物組合物可經(jīng)配制用于局部應(yīng)用，例如100以軟膏、乳膏、洗劑、眼膏、滴眼液、滴耳液、漱口劑、浸透敷料(impregnateddressings)和縫線和氣溶劑的形式4吏用，并且可在軟膏和乳膏中包含適當(dāng)?shù)某Ｒ?guī)添加劑，其包括例如，防腐劑、幫助藥物滲透的溶劑和軟化劑。此類局部制劑還可包含相容性常規(guī)栽體，例如乳膏或軟膏基質(zhì)，以及用于洗劑的乙醇或油醇。此類載體可按重量計(jì)算組成制劑的大約1%至大約98%;更常見地它們將按重量計(jì)算組成達(dá)到制劑的大約80%。除了上述療法外，本發(fā)明的組合物通?？梢杂米鱾谔幚韯┮宰柚辜?xì)菌對(duì)傷口組織中暴露的基質(zhì)蛋白的附著和作為對(duì)抗生素預(yù)防的備選或與抗生素預(yù)防一起預(yù)防性地用于在牙科處理。在優(yōu)選實(shí)施方案中，藥物組合物是疫苗組合物。優(yōu)選，此類疫苗組合物是常規(guī)的可注射形式。常規(guī)佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)。對(duì)于成人用于使用蛋白質(zhì)抗原的接種的合適的單位劑量在0.02-3yg抗原/千克體重之間以及對(duì)于兒童在0.2-10iag抗原/每千克體重之間，這樣的劑量?jī)?yōu)選施用1至3次，間隔2至24周。對(duì)于指定的劑量范圍，對(duì)于本發(fā)明的化合物預(yù)期沒有不利的毒理學(xué)效應(yīng)，所述不利的毒理學(xué)效應(yīng)將妨礙對(duì)它們對(duì)合適的個(gè)體的施用。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括一個(gè)或多個(gè)裝有一種或多種本發(fā)明的上述組合物的成分的容器的診斷和藥物包以及試劑盒。成分可以以有用量、劑量、制劑或組合物的形式提供。與此類容器相隨的可以是以由管理藥物或生物學(xué)產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式存在的注意事項(xiàng)，其反映了被用于人施用的產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用或銷售的機(jī)構(gòu)的許可。根據(jù)本發(fā)明，與本文中公開的用途例如藥物組合物或疫苗的用途相關(guān)的任何疾病特別地是由疏螺旋體屬，更優(yōu)選任何病原性疏螺旋體屬物種，更優(yōu)選選自狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或嘎氏疏螺旋體的任何疏螺旋體屬物種引起的，與之相聯(lián)系的或與之相關(guān)的疾病或病狀。連同要指出的是，包括廣義布氏疏螺旋體的各種疏螺旋體屬物種包括幾個(gè)基因型群和林系，其中包括本文中公開的基因型群和抹系。101有待根據(jù)本發(fā)明預(yù)防和/或治療的與細(xì)菌感染相關(guān)、由其引起或與其關(guān)聯(lián)的疾病包括萊姆疏螺旋體病(萊姆病)。其他方面，萊姆疏螺旋體病的癥狀、分期和亞群以及遭受如本文，包括導(dǎo)言部分中公開的疾病的患者的特定組群，通過引用合并入本文。更具體而言，萊姆疏螺旋體病通常分期發(fā)生，在每一期對(duì)于不同的臨床表現(xiàn)都存在減輕和惡化(Steere，1989)。早期感染1期由皮膚的局部感染組成，在數(shù)天或數(shù)周內(nèi)發(fā)展為第2期，播散感染，和在數(shù)月至數(shù)年后發(fā)展為3期，持續(xù)感染。然而，感染是可變的；一些患者只具有皮膚的局部感染，而其他患者只展示疾病的更后期表現(xiàn)，例如關(guān)節(jié)炎。萊姆疏螺旋體病的不同臨床綜合征還由不同的廣義布氏疏螺旋體物種引起的感染引起。狹義布氏疏螺旋體更常見地引起關(guān)節(jié)表現(xiàn)(關(guān)節(jié)炎)和心臟問題，阿氏疏螺旋體主要引起皮膚癥狀(EM和ACA),以及嘎氏疏螺旋體是產(chǎn)生神經(jīng)疏螺旋體病的主要原因。局部感染-感染的1期的最常見癥狀是發(fā)生在70-80°/。的被感染的人中的游走性紅斑。該皮膚病損通常伴隨流行性感冒樣癥狀，例如肌痛、關(guān)節(jié)痛、頭痛和發(fā)燒。這些非特異性癥狀發(fā)生在50%的患有游走性紅斑的患者中。播散感染-在2期中，細(xì)菌從感染的部位遷移入血流中和遷移至更遠(yuǎn)的組織和器官。發(fā)生在該期的神經(jīng)學(xué)、心血管和關(guān)節(jié)炎癥狀包括腦膜炎、顱神經(jīng)病(cranialneuropathy)和間歇性炎性關(guān)節(jié)炎。持續(xù)感染-感染的3期是慢性的，在蜱嚇咬后數(shù)月至數(shù)年發(fā)生。北美最常見的病癥是由狹義布氏疏螺旋體的感染引起的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。吸氏疏螺旋體對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的持續(xù)感染在3期引起更嚴(yán)重的神經(jīng)學(xué)癥狀，阿氏疏螺旋體對(duì)皮膚的持續(xù)感染導(dǎo)致慢性萎縮性肢皮炎。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，本文中公開的直接或間接與生物體例如任何動(dòng)物或人和疏螺旋體屬物種，更優(yōu)選病原性疏螺旋體屬物種，最優(yōu)選狹義布氏疏螺旋體、嘎氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體、5arre/""/7[7h'2'、"07\^//<3twrifae和5orre//as/力/ca的接觸相關(guān)或由此產(chǎn)生的每一種和任何癥狀、疾病、病癥或綜合征在本發(fā)明的意義上是分別的和獨(dú)立的適應(yīng)癥、疾病或病癥。因此并正好通過舉例說明，本申請(qǐng)的意義上的疾病是萊姆疏螺旋體病以及游走性紅斑、神經(jīng)型疏螺旋體癥和萊姆關(guān)節(jié)炎。在本發(fā)明范圍內(nèi)的是，可對(duì)其使用本文中公開的各種化合物的疾例如根據(jù)本發(fā)明的多肽、疫苗、抗體和任何適體和鏡像異構(gòu)體分別適合用于其治療和/或診斷的任何疾病。此類潛在的用途可分別產(chǎn)生于交叉反應(yīng)性和同源性。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，所述與根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物相關(guān)的任何疾病可接受本文中描述的藥劑的使用，反之亦然。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用根據(jù)本發(fā)明的任何多肽或根據(jù)本發(fā)明的任何核酸的篩選方法。這樣的篩選方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，其可經(jīng)設(shè)計(jì)使得能夠篩選出激動(dòng)劑或拮抗劑。根據(jù)此類篩選方法，優(yōu)選篩選出在本案中抑制或阻止任何根據(jù)本發(fā)明的超免疫血清反應(yīng)性抗原或其片段與相互作用伴侶結(jié)合的拮抗劑。此類相互作用伴倡可以是天然的相互作用伴侶或非天然的相互作用伴侶。本發(fā)明還提供了用于篩選化合物以鑒定增強(qiáng)(激動(dòng)劑)或阻止(拮抗劑)根據(jù)本發(fā)明的多肽或根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的功能的方法，所述功能例如其與結(jié)合分子相互作用。篩選方法可涉及高通量。例如，為了篩選激動(dòng)劑或拮抗劑，根據(jù)本發(fā)明的核酸分子和核酸的相互作用伴侶分別可能是合成的反應(yīng)混合物，細(xì)胞區(qū)室，例如膜、細(xì)胞外被膜(cellenvelope)或細(xì)胞壁、或任何其的制備物，其從表達(dá)與根據(jù)本發(fā)明的多肽結(jié)合的分子的細(xì)胞制備。在可以是激動(dòng)劑或拮抗劑的候選分子存在或不存在的情況下，將制備物與此類多肽的標(biāo)記形式一起溫育。候選分子與結(jié)合分子結(jié)合的能力反映在減少的被標(biāo)記的配體的結(jié)合。無理由(gratuitously)結(jié)合，即不i秀導(dǎo)所述多肽的功能效應(yīng)的分子最可能是良好的拮抗劑。充分結(jié)合且引起與根據(jù)本發(fā)明的多肽相同或接近的功能效應(yīng)的分子是良好的激動(dòng)劑。103潛在的激動(dòng)劑和拮抗劑的功能效應(yīng)可以如下進(jìn)行測(cè)量，例如通過在候選分子與細(xì)胞或合適的細(xì)胞制劑相互作用后確定報(bào)告系統(tǒng)的活分子的效應(yīng)相比較?？捎糜谶@點(diǎn)上的報(bào)告系統(tǒng)包括但不限于轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的比色標(biāo)記底物、感應(yīng)根據(jù)本發(fā)明的多肽的功能活性的改變的報(bào)告基因和本領(lǐng)域內(nèi)已知的結(jié)合測(cè)定法。用于拮抗劑的測(cè)定法的另一個(gè)實(shí)例是竟?fàn)帨y(cè)定法，所述竟?fàn)帨y(cè)定法在對(duì)于竟?fàn)帨y(cè)定法的適合條件下，將根據(jù)本發(fā)明的多肽和潛在拮抗劑與膜結(jié)合的結(jié)合分子、重組結(jié)合分子、天然底物或配體、或者底物或配體模擬物組合在一起。根據(jù)本發(fā)明的多肽可以例如用放射性或比色化合物標(biāo)記，這樣可精確地確定與結(jié)合分子結(jié)合或轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的根據(jù)本發(fā)明的多肽的分子數(shù)目，從而估計(jì)潛在拮抗劑的功效。潛在拮抗劑包括結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的多肽并從而抑制或消除其活性的小有機(jī)分子、多肽和抗體。潛在拮抗劑還可以是結(jié)合至結(jié)合分子上的相同位置而不誘導(dǎo)根據(jù)本發(fā)明的多肽的功能活性的小有機(jī)分子、肽、多肽例如密切相關(guān)的蛋白質(zhì)或抗體。潛在拮抗劑包括這樣的小分子，其結(jié)合并占據(jù)根據(jù)本發(fā)明的多肽的結(jié)合位置，從而阻止與細(xì)胞結(jié)合分子的結(jié)合，這樣正常的生物學(xué)功能被阻止。小分子的實(shí)例包括但不限于小有機(jī)分子、肽或肽樣分子。其他潛在拮抗劑包括反義分子(參見0kano，H.等人，1991;或0LIG0DE0XYNUCLE0TIDESASANTISENSEINHIBITORSOFGENEEXPRESSION;CRCPress,BocaRaton,FL(1988)，關(guān)于此類分子的描述)。優(yōu)選的潛在拮抗劑包括本發(fā)明的超免疫血清反應(yīng)性抗原和其片段的衍生物。如此處所使用的，根據(jù)本發(fā)明的多肽的活性是其與任何其相互作用伴倡結(jié)合的能力或與其任何相互作用伴侶結(jié)合的該能力的程度。在特定的方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的超免疫血清反應(yīng)性抗原和其片段、核酸分子或抑制劑用于干擾造成感染后104遺癥的病原體與哺乳動(dòng)物宿主之間的初始物理相互作用的用途。特別地，本發(fā)明的分子可用于i)阻止本文中公開的疏螺旋體屬物種，更優(yōu)選其病原性物種，例如狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體和嘎氏疏螺旋體至哺乳動(dòng)物細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的附著；H)阻斷哺乳動(dòng)物細(xì)胞外基質(zhì)蛋白與介導(dǎo)組織反應(yīng)的細(xì)菌蛋白之間的細(xì)菌附著；iii)或?qū)е旅庖叻烙奶用?；iv)在除了由內(nèi)置裝置的植入或由其他外科技術(shù)，例如通過抑制營養(yǎng)物的獲得外引起的感染中阻斷發(fā)病的正常進(jìn)程。本文中提供的每一種DNA編碼序列可用于抗菌化合物的發(fā)現(xiàn)、開發(fā)和/或制備。表達(dá)后，編碼的蛋白質(zhì)可用作用于篩選抗菌藥物的靶。此外，編碼被編碼的蛋白質(zhì)的氨基末端區(qū)域的DNA序列或各mRNA的Shine-Delgarno或其他促進(jìn)翻譯的序列可用于構(gòu)建反義序列以控制目的編碼序列的表達(dá)。拮抗劑和激動(dòng)劑可以用于例如抑制由疏螺旋體屬物種包括狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體和嘎氏疏螺旋體引起的感染所造成的疾病，例如萊姆疏螺旋體病(萊姆病)。在另外的方面，本發(fā)明涉及親和裝置，此類親和裝置包括至少支持材料和被附著至支持材料的任何根據(jù)本發(fā)明的多肽。因?yàn)樗龆嚯膶?duì)于它們的靶細(xì)胞或靶分子或它們的相互作用伴侶的特異性，所以所述多肽允許從用于支持材料的任何類型的樣品中選擇性除去它們的相互作用伴侶，只要滿足用于結(jié)合的條件。所述樣品可以是生物學(xué)或醫(yī)學(xué)樣品，包括但不限于發(fā)酵液、細(xì)胞碎片、細(xì)胞制備物、組織制備物、器官制備物、血液、尿液、淋巴液、水溶液等。根據(jù)本發(fā)明的多肽可以以共價(jià)或非共價(jià)的方式附著至基質(zhì)。合適的支持材料對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的且可選自纖維素、二氧化硅、玻璃、鋁、磁珠、淀粉和葡聚糖。本發(fā)明還可通過可從其中獲得特征、實(shí)施方案和有利方面的下列圖、表、實(shí)施例和序列表來進(jìn)一步舉例說明。要理解，本實(shí)施例通過舉例說明的方式而不是通過對(duì)公開內(nèi)容的限制的方式給出。根據(jù)本發(fā)明圖1顯示作為病原體特異性抗體的來源的人血清的表征。圖2顯示文庫的表征。圖3顯示使用生物素化的人IgG通過MACS對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的選擇。圖4顯示確定選擇的抗原在各細(xì)菌病原體的臨床分離林中的基因分布的PCR分析。圖5顯示通過使用大腸桿菌裂解物的免疫在小鼠中誘導(dǎo)表位特異性抗體的實(shí)例。圖6顯示通過Western印跡分析確定的小鼠中的血清轉(zhuǎn)換。表1顯示使用基因組阿氏疏螺旋體文庫和人血清進(jìn)行的所有篩選的概述。表2顯示與狹義布氏疏螺旋體和嘎氏疏螺旋體具有同源性的、從阿氏疏螺旋體鑒定為抗原的所有基因。表3顯示用于基因分布分析的抹系。表4顯示就各細(xì)菌種類的不同林系中對(duì)選擇的抗原的數(shù)目進(jìn)行的基因分布分析的概述。表5顯示小鼠免疫原性實(shí)驗(yàn)的概述。表6顯示使用人血清進(jìn)行的肽ELISA的概述。表7使用小鼠中產(chǎn)生的表位血清進(jìn)行的FACS分析。表8在動(dòng)物中試驗(yàn)的表達(dá)的和純化的蛋白質(zhì)。表9細(xì)胞的最可能數(shù)目(來自Norman，R.L.和Kempe，L.L.，1960)。表10小鼠中的保護(hù)作用。本說明書中可能參考的圖和表在下面進(jìn)行更詳細(xì)的描述。圖l顯示通過使用免疫測(cè)定法測(cè)量對(duì)于狹義布氏疏螺旋體和阿氏疏螺旋體是特異性的抗體來對(duì)人血清進(jìn)行的表征。(A)使用從狹義布氏疏螺旋體制備的總細(xì)菌裂解物，通過標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)量總IgG抗體水平。在2種不同的血清稀釋度上分析來自具有不同癥狀的萊姆疏螺旋體病患者的血清樣品。顯示了關(guān)于25個(gè)血清的代表性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，所述25個(gè)血清包括在具有來自具有萊姆疏螺旋體病的不同癥狀(游走性紅斑(EM)、神經(jīng)型疏螺旋體癥(NB)、萊姆關(guān)節(jié)炎(LA)和慢性萎縮性肢皮炎(ACA))的人的血清的4個(gè)不同的血清庫和具有來自具有混合癥狀(LBI和LBII)的患者的血清的兩個(gè)庫中。數(shù)據(jù)表示為位于檢測(cè)的線性范圍內(nèi)的血清稀釋度下、在405認(rèn)處的吸光率計(jì)算的ELISA單位。(B，性。顯示使用從狹義布氏疏螺旋體(B)或從阿氏疏螺旋體(C)制備的總細(xì)菌裂解物與以5，OOO稀釋的人血清反應(yīng)的代表性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。通過抗人IgG特異性第二試劑檢測(cè)IgG抗體。-:不使用一抗(血清庫)的溫育，kDa:分子量標(biāo)記。圖2(A)顯示阿氏疏螺旋體小片段基因組文庫K78-LamB的片段大小分布。在對(duì)隨機(jī)選擇的克隆測(cè)序后，修剪序列(428)以除去載體殘基，將具有不同基因組片段大小的克隆的數(shù)目作圖。(B)顯示阿氏疏螺旋體大片段基因組文庫K78-FhuA的片段大小分布。在對(duì)隨機(jī)選擇的克隆測(cè)序后，修剪序列(466)以除去載體殘基，將具有不同基因組片段大小的克隆的數(shù)目作圖。圖3(A)顯示用使用來自患有游走性紅斑的患者的血清產(chǎn)生的生物素化的人IgG庫(EM-IgG)進(jìn)行的MACS選擇。使用10-20jug生物素化的IgG篩選pHIEll中的K78-FhuA文庫。作為陰性對(duì)照，不向用于篩選的文庫細(xì)胞加入血清。顯示在洗脫后選擇的細(xì)胞的數(shù)目。(B)顯示通過細(xì)菌表面展示選擇的特異性克隆(1-20)和通過免疫印跡分析(使用以1:3，000的稀釋的用于通過MACS進(jìn)行的選擇的人血清IgG庫(EM-IgG))分析的Wt(無插入的pHIEll)的反應(yīng)性。箭頭標(biāo)示檢測(cè)為陽性的克隆。作為載量對(duì)照，也使用以1:5，000稀釋的抗平臺(tái)蛋白FhuA的抗體分析相同的印跡。(C)顯示用使用來自患有萊姆關(guān)節(jié)炎的患者的血清產(chǎn)生的生物素化的人IgG庫(LA-IgG)和PHIE11中的K78-FhuA文庫進(jìn)行的MACS選擇。(D)顯示通過細(xì)菌表面展示選擇的特異性克隆(1-20)和通過免疫印跡分析(使用以1:3，000的稀釋的用于通過MACS進(jìn)行的選擇的人血清IgG庫(LA-IgG))分析的Wt(無插入的pHIEll)的反應(yīng)性。箭頭標(biāo)示檢測(cè)為陽性的克隆。圖4顯示使用各寡核苷酸和30個(gè)廣義布氏疏螺旋體林系對(duì)一個(gè)基因的基因分布的PCR分析的實(shí)例。從來自廣義布氏疏螺旋體的抗原BAP004衍生的PCR片段的預(yù)測(cè)大小是420bp。1-30，表3中顯示的株系或臨床分離林；-，未加入基因組DNA。圖5顯示使用阿氏疏螺旋體衍生的表位進(jìn)行的，由表達(dá)LamB或FhuA的大腸桿菌克隆的總細(xì)菌裂解物誘導(dǎo)的表位特異性小鼠血清IgG抗體水平的測(cè)量。該圖顯示使用三組小鼠血清(每一組5只小鼠的混合物)的代表性肽ELISA實(shí)驗(yàn)，所述三組血清分別通過由細(xì)菌克隆Baf2(BA0210)、Bafl2(BA0149)和Baf36(BA0181)表達(dá)的表位產(chǎn)生。血清在2種不同稀釋度(200x和1000x)上經(jīng)檢測(cè)抗覆蓋所述表位的交疊肽。黑色條，200X;白色條，IOOOX。相應(yīng)于各個(gè)受試表位的生物素標(biāo)記的合成肽的名稱顯示在稀釋度下面。圖6顯示通過Western印跡分析確定的血清轉(zhuǎn)交換。作為通過Western印跡分析確定小鼠的感染狀況的實(shí)例，顯示了來自用PBS緩沖液(PBS)中的疏螺旋體屬抗原BbuA0034-1或佐劑免疫的小鼠的血清。將與來自各組的個(gè)體小鼠血清(1-10)—起溫育的、具有總的疏螺旋體屬細(xì)胞裂解物的硝酸纖維素膜切成條帶。用+(正號(hào))標(biāo)示血清轉(zhuǎn)換(感染)和用-(負(fù)號(hào))標(biāo)示未感染的。kDa:千道爾頓。表1:通過細(xì)菌表面展示從阿氏疏螺旋體鑒定的免疫原性蛋白。A:具有包含P1755、P1766、P1772、P1806和P1811血清的LBI-IgG庫的fhuA中的阿氏疏螺旋體的300bp文庫(358)，B:具有包含P3055、P3144、P3186和P3219血清的EM-IgG庫的fhuA中的阿氏疏螺旋體的300bp文庫(336)，C:具有包含P3077、P3084、P3286、P3288和P3337血清的NB-IgG庫的fhuA中的阿氏疏螺旋體的300bp文庫(597)，D:具有包含P3016、P3150、P3301、P3344和P3394血清的108LBII-IgG庫的fhuA中的阿氏疏螺旋體的300bp文庫(634),E:具有包含P3183、P3209和P3336血清的ACA-IgG庫的fhuA中的阿氏疏螺旋體的300bp文庫(665)，F(xiàn):具有包含P3120、P3239和P3251血清的LA-IgG庫的fhuA中的阿氏疏螺旋體的300bp文庫(616)，G:具有LBI-IgG庫的lamB中的阿氏疏螺旋體的50bp文庫(412),H:具有EM-IgG庫的lamB中的阿氏疏螺旋體的50bp文庫(300)，I:具有NB-IgG庫的lamB中的阿氏疏螺旋體的50bp文庫(467)，J:具有LBII-IgG庫的lamB中的阿氏疏螺旋體的50bp文庫(435),K:具有ACA-IgG庫的lamB中的阿氏疏螺旋體的50bp文庫(357)，L:具有LA-IgG庫的lamB中的阿氏疏螺旋體的50bp文庫(349);*，使用程序ANTIGENIC(Kolaskar，A.等人，1990)進(jìn)行長(zhǎng)于5個(gè)氨基酸的抗原性序列的預(yù)測(cè)。列出的是通過對(duì)針對(duì)阿氏疏螺旋體、狹義布氏疏螺旋體和嘎氏疏螺旋體的基因組序列的確定的表位序列BLAST而鑒定的來自阿氏疏螺旋體的基因。表1:阿氏疏螺旋體的抗原性蛋白推定功能(通過同源性)預(yù)測(cè)的免疫原性aa*選擇的克隆數(shù)目篩選中的標(biāo)志備定的免疫原性區(qū)域(aa)的定位SeqID歸，蛋白)BA0056假定的蛋白6-20，25--51，58-83,9C,D,128-169,1,135質(zhì)94-105,111-122,E,F257-336，127-135,141-155,339-379162-173,179-186,188-207，213-226，230-248'253-265,269-282,285-291，367-378，384-393,401-425，453-464,471-477,504-514,519-527，532-555，557-572，584-598,609-616,624-630,638-645,648-653BA0060假定的蛋白質(zhì)23-31,4774-89,-53，57-64,91-106,9I180-1892，136109<table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table>328-338,340-358,364-380,408-426,434-441BA0314假定的蛋白質(zhì)4-24,36-43,70-81,89-100,109-120,127-132,141-158'165-178，183-191,193-202,208-215C,D31-8925,159BA0321假定的蛋白質(zhì)6-25,95-105,199-215,256-262,306-320,346—354,44-49,136-144,236-241,280-287，326-334,364-376A,B'D,F83-172,272-32726,160BA0327寡肽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，外周質(zhì)寡肽結(jié)合蛋白(oppA—2)4-21,27-100-107，142-149,216-222,258-310,334-344,367-373,394-400,485—500■44，85-92，112-118，161-190，231-238,317-323,352-359,380-387,429—441，40A,B,C,D,E,F20-79,404—52627,161BA0329寡肽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，外周質(zhì)寡肽結(jié)合蛋白(oppA-3)12-28，61-75,121-127,169-199,236-241,254-260,284-301，352-358,391-397,455-463,498—511,38-58，98-116,133-142,213-221,243-250,269-281，313-319,362-368,436-448,485-496,523-533C,D,E40-97,251-297,420—48828,162BA0343假定的蛋白質(zhì)8-15,24.86-91,143-156,204-212,245-267,328-336,377—388,-41,50-79,109-141,166-171，235-243，291-311,344-360,390—396258—33629,163115<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table>頁1308-1332，1343-1356,1363-1368,1384-1398，1401-1410，1423-1434,1443-1464,1478—1484BA04290期孢子形成蛋白J(spoOJ)5-15,2155-60,73103-110,157-168,190-201,250—257-35，42-51,80,87-94,134-146,174-188,209-223,C,I,110-131，179—23639,173BA0431DM促旋酶，亞單位B(gyrB)10-24,52-66,111-137,166-175,193-206,238-248，267-273，349-382，421-428,470-480'508-518,544-549,607—623,30-48，90-100,153-162,184-190,226-232,250-260,322-333,402-413,443-451,487-498,526-539，568-574，631—636B,C372—43440,17432-38,91-110，137--162,175-183，207-217,254--269,319-326,374--381,424-434,469-484,513-522,546-556,BA0442天冬氨酰-tRNA合成酶(aspS)20-28,45-77,124-130,164-170,185-205,235-240,291-296,342-354,397-403,442-455,494-501,529-534,558-564C,E439—46441，175BA0464假定的蛋白4—13,15-21,24—32,A,E12—7742，176120<table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table>1172-11781232-12411245-12521257-12661283-12881305-13111370-13771392-13981412-14171422-14341448-14581479-1487:1529-1534:1570-1576:1582-1590:1615-1622:1630-1645,1659-1668:1700-1708，1730-1736:1756-1762,1765-1776,1798-1803，1805-1819,1831-1837,1872-1882,1926-1936,1946-1952,1955-1961,1968-1980,1995-2002,2035-2045,2048-2056,2076-2083，2099-2107,2122-2128'2146-2156BA0513熱休克蛋白70(dnaK-2)12-19,22-29,37-43,48-56,79-90,114-119,136-147,162-172,174-180,23A,D,F,E,66-161,494—57646,180122186-194,200--213,232-238,275--282,288-297,303--319,329-338，341--351,363-371,383--397，416-423'430-438,454-472,476-483,536-542,576-581,626-632BA0514GrpE蛋白29-35,48-56,8D,E1-5247,181(grpE)82-89，106-112,118-126,"4-149,157-173,175-184BA0539假定的蛋白14-36,48-54,4C，F(xiàn)171-24048,182質(zhì)79-85,149-159,171-182,189-205，211-217BA0546假定的蛋白9-23，30-40，56-70,4C,D363-43049,183質(zhì)75-SO,97-103,111-117,130-135,139-145,149-160,250-256,276-286,309-315,326-331,364-376,385-391,400-412,429-434,446-462,472-498BA0553熱休克蛋白4-28,44--60,73-81,12D,E，F(xiàn)215-28350,18490(htpG)88-94,102-108,119-127,145-170,201-208,220-227,229-239,29卜297,306-323,327-335,342-369,372-394,414-420,427-445,456-462,471-478,494-503,505-510,536-542,549-567,585-594,614-627BA0564尿香酸激酶4一10,27-33，40-48,4I15卜16051,185(smbA)64-70,82-96，108-115,123-131,123<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table>440-446,462-469,494—502,504-522BA0653磷酸甘油酸酯變位酶(gpmA)7—14，30-36，43-52,A，E，F(xiàn)168-22361,19554-65,95-101,121-127,179-188，204—210，7卜85'113-119,153-170,191-200,214—222'227-233,244—250BA0663鞭毛纖維外層蛋白(flaA)14-21，54-64,102-129，159-166,214-220,245-255,276-295,315-321，25-39,74-99,139-153,188-206'236-243，262-269，300-309,324—331C,D12—8462,196B雄65噪呤結(jié)合趨化蛋白(cheW-3)4-13,26-55-68，96-114,150-161'237-254,280-286,320-337,373-382,433—439■33，35-49,74-82，116-148,229-235,257-266,305-312,343-356，384—427,H'I50—6463,197BA0675曱基接受趨化蛋白(methyl-acceptingchemotaxisprotein(mcp-4))4-46，103-113，144-149'176-183,207-238,271-277,315-326,412-423,472-478,531-542,562-576,602-608,658-666,721—73053-78,117-122,168-174'193-200,252-259,279-307,330-391,425-464，508-526，551-560,584-593,616-637'714—719,12B,D,G，I,C，F(xiàn),H'28-73，292-344,531-60864，198BA0682確酸曱羥戊4-21,26-33,69-78,223—27265,199127<table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage135</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage136</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage137</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage138</column></row><table>表2:通過細(xì)菌表面展示和它們的來自狹義布氏疏螺旋體和嘎氏疏螺旋體的直系同源物從阿氏疏螺旋體鑒定的免疫原性蛋白。表2顯示具有序列標(biāo)志號(hào)的來自阿氏疏螺旋體的鑒定的基因。Blast分析中來自狹義布氏疏螺旋體(http:〃www.tigr.org/tigr-scripts/CMR2/Ge議ePage3.spldatabase=gbb)和嘎氏疏螺旋體(http://sgb.imb—jena.de/cgi/index,pl)的最4圭匹酉己通過它《門各自的序列標(biāo)志號(hào)一起列出。表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage138</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage139</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage140</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage141</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage142</column></row><table>表3:用于基因分布分析的抹系的列表表3顯示對(duì)基因分布研究進(jìn)行分析的廣義布氏疏螺旋體分離林的不同林系的代表。給出了基因型群、OspA和ospC型(Wilske等人，1988;Livey等人，1995)和分離的來源(CSF;腦脊液)。此外，給出了與相應(yīng)的w/7C型相關(guān)的疾病類型，H;無侵襲性疾病，HInv;侵襲性疾病，-;與人中的疾病無關(guān)表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage142</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage143</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage144</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage145</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage146</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage147</column></row><table>表5:表位在小鼠中的免疫原性通過使用具有編碼與廣義布氏疏螺旋體肽融合的平臺(tái)蛋白FhuA或LamB的質(zhì)粒的大腸桿菌克隆的免疫就免疫原性檢測(cè)廣義布氏疏螺旋體抗原。通過肽ELISA檢測(cè)和測(cè)量表位特異性抗體的存在。結(jié)果表示為-至++++，和計(jì)算為基于OD405nm的個(gè)體小鼠血清的反應(yīng)性的和(-；0-0.1，+0.H.2，++;0.2-0.4,+++;0.4-0.8，++++;>0.8)。表5:<table>tableseeoriginaldocumentpage147</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage148</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage149</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage150</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage151</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage152</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage153</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage154</column></row><table>螺旋體的肽和22個(gè)人血清(P1755、P1766、P1772、P1806、P1811、P3055、P3144、P3186、P3219、P3017、P3084、P3288、P3150、P3301、P3344、P3394、P3183、P3336、P1789、P1796、P1938、P1941)進(jìn)行的ELISA實(shí)驗(yàn)。表6:<table>tableseeoriginaldocumentpage155</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage156</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage157</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage158</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage159</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage160</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage161</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage162</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage163</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage164</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage165</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage166</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage167</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage168</column></row><table>表8:在動(dòng)物中測(cè)試的表達(dá)的和純化的蛋白質(zhì)。該表列出了在疏螺旋體動(dòng)物模型中進(jìn)行測(cè)試的表達(dá)的和純化的蛋白。Ba:阿氏疏螺i走體，ORF:開放閱讀框架，BB:P圓桶(beta<table>tableseeoriginaldocumentpage169</column></row><table>表9:<table>tableseeoriginaldocumentpage170</column></row><table>8表10:小鼠中的保護(hù)作用該表顯示在用抗使用狹義布氏疏螺旋體林系N40的攻擊的疏螺旋體屬抗原的免疫后獲得的保護(hù)的水平。用攻擊后的血清和來自耳和膀胱的疏螺旋體屬的培養(yǎng)物(C)的Western印跡(WB)來確定小鼠的疏螺旋體屬感染。就各動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的測(cè)試抗原和對(duì)照組將未感染的小鼠的百分?jǐn)?shù)列于表中。nd:未確定的。表10:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)攻擊劑量蛋白結(jié)構(gòu)測(cè)試蛋白WBC°/未感染的小PBSWBC鼠OspAWBC1ndBbu0210-lBbu0210-2Baf0221Baf0237Baf0512-2Baf0627Bbu0680-2BbuA0034-150%50%40%40%40%40%30%30%30%30%30%30%30%30%60%60%20%20%100%100%218900BB0058-1Baf0581nd10%nd10%0%0%70%70%316300BB0794-3nd10%nd0%nd60%實(shí)施例實(shí)施例1:用于鑒定根據(jù)本發(fā)明的肽的一般篩選方法。已用于本發(fā)明的方法基于由廣義布氏疏螺旋體編碼的蛋白質(zhì)或肽與存在于人血清中的抗體的相互作用。由人免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的和存在于人血清中的抗廣義布氏疏螺旋體的抗體指示了抗原性蛋白和它們的免疫原性的體內(nèi)表達(dá)。此外，使用單個(gè)選擇或產(chǎn)生的血清在第二和第三輪的篩選中，處理通過細(xì)菌表面展示表達(dá)文庫使用預(yù)選擇的血清鑒定的抗原性蛋白。因此本發(fā)明以預(yù)防由廣義布氏疏螺旋體引起的感染的藥物組合物，特別是疫苗的形式提供了有效的、相關(guān)的、完全的成套抗原。在用于鑒定完全的根據(jù)本發(fā)明的成套抗原的抗原鑒定程序中，使m至少兩個(gè)不同的來自廣義布氏疏螺旋體的細(xì)菌表面表達(dá)文庫。從經(jīng)檢測(cè)抗廣義布氏疏螺旋體的抗原性化合物，例如完整細(xì)胞、總提取物的血清收集物產(chǎn)生抗體庫。優(yōu)選使用6個(gè)血清庫(具有25個(gè)個(gè)體樣品)。經(jīng)確定具有高ELISA滴度的血清在免疫印跡中應(yīng)當(dāng)與多種蛋白反應(yīng)以本發(fā)明中使用的表達(dá)文庫應(yīng)當(dāng)允許所有潛在抗原(例如從布氏疏螺旋體的所有分泌的和表面的蛋白產(chǎn)生的)表達(dá)。將由在細(xì)菌宿主膜上的兩個(gè)選擇的外膜蛋白(LamB和FhuA)上展示廣義布氏疏螺旋體的(總的)成套的表達(dá)的肽序列的細(xì)菌宿主的重組文庫來代表細(xì)菌表面展示文庫(Georgiou，G.，1997;Etz，H.等人，2001)。使用重組表達(dá)文庫的一個(gè)有利方面是經(jīng)鑒定的超免疫血清反應(yīng)抗原可以通過表達(dá)篩選的和選擇的表達(dá)該超免疫血清反應(yīng)性抗原的克隆的編碼序列來立即產(chǎn)生而無需另外的重組DNA技術(shù)或克隆步驟。通過一個(gè)或多個(gè)額外輪次的篩選進(jìn)一步分析通過所述的根據(jù)本發(fā)明的程序鑒定的完全的成套抗原。因此使用產(chǎn)生的抗選擇的肽的個(gè)體抗體制備物或抗體，所述肽經(jīng)鑒定為免疫原。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，用于第二輪篩選的個(gè)體抗體制備物來源于健康成人和/或顯示高于某最低水平的抗體滴度例如比80%，優(yōu)選比90%，特別優(yōu)選比95°/。的受試人(患者或健康個(gè)體)血清更高的抗體滴度的被攻擊的成人。在第二輪篩選中使用這樣的高滴度個(gè)體抗體制備物允許對(duì)來自廣義布氏疏螺旋體的超免疫血清反應(yīng)性抗原和其片段進(jìn)行充分選擇性鑒定。在完全篩選方法后，萬一其不能在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，將選擇的抗原性蛋白表達(dá)為重組蛋白或體外翻譯的產(chǎn)物，或通過系列ELISA和Western印跡測(cè)定法使用大的人血清收集物(最少大約20個(gè)健康者和患者的血清)的在第二輪篩選中測(cè)試鑒定的抗原性肽(合成產(chǎn)生的)以估計(jì)它們的免疫原性。重要的是個(gè)體抗體制備物(其也可以是選擇的血清)允許從來自第一輪的所有有希望的候選物中選擇性地鑒定所有超免疫血清反應(yīng)性抗原中最有希望的候選者。因此，應(yīng)當(dāng)使用優(yōu)選至少IO個(gè)個(gè)體抗體制備物(即來自至少10個(gè)患有對(duì)選擇的病原體的感染的不同的個(gè)體的抗體制備物(例如血清))在第二輪篩選中鑒定這些抗原。當(dāng)然，也可能使用少于10個(gè)個(gè)體制劑，然而，對(duì)于數(shù)量少的個(gè)體抗體制備物，步驟的選擇性可能不是最佳的。在另一方面，如果給定的超免疫血清反應(yīng)性抗原(或其抗原性片段)被至少10個(gè)個(gè)體抗體制備物、優(yōu)選至少30個(gè)，特別地至少50個(gè)個(gè)體抗體制備物識(shí)別，那么超免疫血清反應(yīng)性抗原的鑒定的選擇性也足以進(jìn)行正確的鑒定。超免疫血清反應(yīng)性當(dāng)然可以使用盡可能多(例如使用超過100個(gè)或甚至使用超過1，000個(gè))的個(gè)體制備物來測(cè)試。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法的超免疫血清反應(yīng)性抗體制備物的相關(guān)部分優(yōu)選應(yīng)當(dāng)為至少10個(gè)，更優(yōu)選至少30個(gè)，特別地至少50個(gè)個(gè)體抗體制備物。備選地(或以組合的方式)超免疫血清反應(yīng)性抗原優(yōu)選也可使用至少20%,優(yōu)選至少30%，特別地至少40%的第二輪篩選中使用的所有個(gè)體抗體制備物來鑒定。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，從其中制備用于第二輪篩選的個(gè)體抗體制備物的(或用作抗體制備物的)血清通過它們抗廣義布氏疏螺4t體(例如抗這些病原體的制備物，例如裂解物、細(xì)力包壁組分和重組蛋白)的滴度來選擇。優(yōu)選，當(dāng)完整的生物體(總裂解物或完整的細(xì)胞)在ELISA中用作抗原時(shí)，一些血清用高于1，000U，特別地高于5，000U(U=單位，根據(jù)在給定的稀釋度下的OD405nm讀數(shù)計(jì)算的)的IgG滴度來選擇。通過人免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的且存在于人血清中的抗廣義布氏疏螺旋體的抗體指示了抗原性蛋白的體內(nèi)表達(dá)和它們的免疫原性。由血清抗體識(shí)別的線性表位的識(shí)別可基于短至4至5個(gè)氨基酸的序列。當(dāng)然，這不一定意味著這些短肽能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)給定的抗體。因此，將就它們?cè)隗w內(nèi)誘導(dǎo)抗選擇的蛋白的能力在動(dòng)物中(主要在小鼠中)進(jìn)一步測(cè)試確定的表位、多肽和蛋白質(zhì)。優(yōu)選的抗原位于細(xì)胞表達(dá)或^皮分泌，從而可在細(xì)胞外接觸。抗細(xì)173胞壁蛋白的抗體預(yù)期用于多個(gè)目的抑制附著、干擾營養(yǎng)物的獲得、抑制免疫逃脫和促進(jìn)吞噬(Hornef，M.等人，2002)?？狗置诘鞍椎目贵w在中和它們作為毒素或毒性組分的功能中是有益的。也已知細(xì)菌通過分泌的蛋白相互交流。抗這些蛋白的中和抗體將破壞引起感染的病原體物種之間或之內(nèi)的促進(jìn)生長(zhǎng)的串?dāng)_(cross-talk)。證明生物信息學(xué)分析(信號(hào)序列、細(xì)胞壁定位信號(hào)、跨膜結(jié)構(gòu)域)在估計(jì)細(xì)胞表面定位或分泌中是非常有用的。實(shí)驗(yàn)方法包括從人血清中分離針對(duì)相應(yīng)的表位和蛋白質(zhì)的抗體、以及在小鼠中產(chǎn)生抗通過細(xì)菌表面展示篩選選擇的(多)肽的免疫血清。然后將這些血清在至少一個(gè)下列測(cè)定法中作為試劑用于第三輪篩選在不同條件下生長(zhǎng)的廣義布氏疏螺旋體的細(xì)胞表面染色(FACS或顯微鏡檢查法)、中和能力(毒素、附著)的確定、和調(diào)理作用和吞噬作用的提高(體外吞噬測(cè)定法)。為此目的，將細(xì)菌大腸桿菌克隆直接注射入小鼠，然后收集免疫血清，就功能性調(diào)理素或中和抗體在相關(guān)性體外測(cè)定法中對(duì)其進(jìn)行測(cè)試。備選地，可通過使用肽或蛋白質(zhì)作為底物從人或小鼠血清純化特異性抗體。根據(jù)本文中使用的抗原鑒定方法，本發(fā)明可令人驚訝地提供了，如本文中所描述的廣義布氏疏螺旋體的成套完全的新型核酸和新型蛋白質(zhì)、抗原，更特別地超免疫血清反應(yīng)性抗原和其片段等等。編碼超IDNo1-134、269-387和507-628的核苷酸序列，其中相應(yīng)的編碼的氨基酸序列具有SeqIDNo135-268、388-506和629-750中所示的氨基酸序列。特定抗原的所有線性超免疫血清反應(yīng)性片段可通過用成組的通過l個(gè)氨基酸交疊的具有至少IO個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度的肽分析蛋白質(zhì)抗原的整個(gè)序列來鑒定。隨后，非線性表位可通過使用表達(dá)的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)定。假定蛋白質(zhì)的不同結(jié)構(gòu)域足以形成不依賴于天然蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)，使用超免疫血清進(jìn)行的各重組或合成產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)域多肽的分析將允許在多結(jié)構(gòu)域蛋白的單個(gè)結(jié)構(gòu)域內(nèi)鑒定構(gòu)象表位。對(duì)于其中結(jié)構(gòu)域具有線性和構(gòu)象表位的這些抗原，使用相應(yīng)于線性表位的肽進(jìn)行的竟?fàn)帉?shí)驗(yàn)可用于確認(rèn)構(gòu)象表位的存在。實(shí)施例2:基于抗廣義布氏疏螺旋體抗體的人血清來源的表征和選擇，抗體篩選試劑的制備雄聯(lián)龍《吸法rn/s"。用5-10Mg/ml在包衣緩沖液(O.1M碳酸鈉pH9.2)中稀釋的總蛋白包被ELISA板(Maxisorb，Millipore)。對(duì)于完整細(xì)胞ELISA，將106個(gè)生物素標(biāo)記的和固定的細(xì)菌加入鏈霉抗生物素蛋白包被的ELISA板。在PBS-BSA中制備兩個(gè)稀釋度的血清(IO，OOOX，50，000X)。按照廠商的推薦(稀釋度1，OOOx)使用高特異性辣根過氧化物酶(HRP)綴合的抗人IgG第二抗體(SouthernBiotech)。通過基于通過自動(dòng)ELISA酶標(biāo)儀(TECANSUNRISE)讀出的004。^讀數(shù)測(cè)量底物(ABTS)至有色產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化來定量抗原-抗體復(fù)合物。細(xì)勞戎j炎承參的辨務(wù)^細(xì)^"襲席^:將狹義布氏疏螺旋體林系B31和阿氏疏螺旋體林系VS461在BSK-II培養(yǎng)基(37。C，5%002)培養(yǎng)一周，然后通過離心(3,000rpm，IO分鐘，4'C)收集。用PBS洗滌細(xì)胞兩次，在重懸浮后超聲處理2分鐘，在冰上在100%功率下脈沖5次。通過離心(3，500rpm，15分鐘，4X:)收集上清液。使用蛋白質(zhì)測(cè)定染色劑濃縮劑(Bio-RadLaboratories,Austria)ifiiBradford須'J《&觀寸f*自^"、;^;^。從體外培養(yǎng)的狹義布氏疏螺旋體抹系B31和阿氏疏螺旋體林系VS461制備總細(xì)菌裂解物。使用BioRadMini—ProteanCell電泳系統(tǒng)175通過SDS-PAGE分離10-25jLig總蛋白/泳道，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(ECL，AmershamPharmacia)。在5%牛奶中封閉過夜后，以2，OOOx稀釋度加入人血清，使用HRP標(biāo)記的抗人IgG進(jìn)行檢測(cè)。^,差^遂謬逸^拔傳^趟^基于用于篩選方法的血清的總的抗細(xì)菌滴度選擇每抗體庫5種血清。通過將熱滅活的血清與完整的細(xì)胞大腸桿菌DH5a細(xì)胞(用pHIEll轉(zhuǎn)化的，在與用于細(xì)菌表面展示的條件相同的條件下培養(yǎng))一起溫育來除去抗大腸桿菌大腸桿菌DH5a蛋白的抗體。按照廠商說明書(UltraLinkImmobilizedProteinG，Pierce)通過G蛋白親和層析產(chǎn)生來自匯合的、耗竭的血清的高度富集的IgG制劑。通過ELISA測(cè)量法檢查耗竭和純化的功效。潛^由人免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的且存在于人血清中的抗廣義布氏疏螺旋體的抗體表明抗原性蛋白的體內(nèi)表達(dá)和它們的免疫原性。這些分子對(duì)于在本發(fā)明中描述的方法中鑒定個(gè)體抗原是必需的，所述方法基于特異性抗細(xì)菌抗體與相應(yīng)的廣義布氏疏螺旋體肽或蛋白質(zhì)的相互作用。為獲得相關(guān)抗體庫，從具有不同萊姆疏螺旋體病癥狀的個(gè)體和顯示健康的人收集人血清。重要地是使用來自具有不同疾病表現(xiàn)的萊姆疏螺旋體病患者的抗體進(jìn)行篩選，因?yàn)椴煌瑥V義布氏疏螺旋體基因型群引起的萊姆疏螺旋體病產(chǎn)生不同的疾病癥狀。從奧地利和捷克的萊姆疏螺旋體病患者收集1325份樣品的不同血清組。通過系列免疫測(cè)定法就抗廣義布氏疏螺旋體抗體收集和表征1325份血清樣品。使用狹義廣義布氏疏螺旋體和嘎氏疏螺旋體的總細(xì)菌裂解物通過ELISA進(jìn)行初步表征。測(cè)量抗體滴度，根據(jù)反應(yīng)的線性范圍內(nèi)的血清稀釋度計(jì)算ELISA單位?；诳贵w反應(yīng)性對(duì)血清分級(jí)，選擇最高級(jí)的血清進(jìn)行進(jìn)一步的通過免疫印跡進(jìn)行的檢測(cè)。該分析確認(rèn)預(yù)選擇的血清抗多種廣義布氏疏螺旋體蛋白的高抗體反應(yīng)性。用于篩選的抗來自狹義布氏疏螺旋體屬的細(xì)菌裂解物的血清的反應(yīng)性示于表1A?？贵w庫將包含的血清的最終選擇主要基于免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的多條免疫原性條帶的存在，代表性Western印跡示于圖IB和C。該全面的抗體表征方法已導(dǎo)致抗廣義布氏疏螺旋體超免疫血清的明確鑒定。將選擇的血清用于6個(gè)不同的用于通過細(xì)菌表面展示進(jìn)行的抗原鑒定的IgG庫(每個(gè)庫中3-5份血清)。通過親和純析和DH5ot反義性抗的耗竭原以避免細(xì)菌表面展示篩選中的背景來從匯集的血清純化IgG抗體。血清庫代表游走性紅斑EM-IgG(P3055、P3144、P3186和P3219)、神經(jīng)型疏螺旋體癥NB-IgG(P3077、P3084、P3286、P3288和P3337)、慢性萎縮性肢皮炎ACA-IgG(P3183、P3209和P3336)、萊姆關(guān)節(jié)炎LA-IgG(P3120、P3239和P3251)以及使用來自具有混合癥狀的患者產(chǎn)生的兩個(gè)庫LBI-IgG(P1755、P1766、P1772、P1806和P1811)和LBII-IgG(P3016、P3150、P3301、P3344和P3394)。實(shí)施例3:廣義布氏疏螺旋體的高度隨機(jī)的、讀框選擇性(frame-selected)、小片段基因組DNA文庫的產(chǎn)生。差添逸ZWJ^浙務(wù)從400ml細(xì)菌培養(yǎng)物中收集(5，000rpm，20分鐘，室溫)細(xì)胞，用80ml的50mMTrispH7.4洗滌細(xì)胞，將其重懸浮于10ml的50mMTrispH7.4/25%蔗糖/5QmMEDTA中。將懸浮液轉(zhuǎn)移至新玻璃管，加入溶菌酶(終濃度1.5mg/ml)和SDS(終濃度2%)。將管在冰上溫育以進(jìn)行細(xì)胞裂解。加入蛋白酶K(終濃度0.1mg/ml)，然后在37。C下溫育IO分鐘，然后進(jìn)行酚/氯仿(l:l)提取，進(jìn)行數(shù)次該提取。使用氯仿/異戊醇(l:24)進(jìn)行終提取步驟以除去微量的酚。將樣品在室溫下用RNA酶A(終濃度10jLig/ml)處理1小時(shí)，如上所述進(jìn)行酚/氯仿和氯仿/異戊醇提取。通過加入1/10的起始體積的3MNaAc(pH5.3)m和2.5x體積的99.5%乙醇沉淀剩余上清液中的DM。于-20。C下溫育1小時(shí)后，離心(20，000rpm，15分鐘)混合物，用70%乙醇洗滌沉淀。最后，將沉淀溶解在TE-緩沖液中。V、差萄逸"W,授^賴務(wù)使用cup-horn超聲儀(配備有BB5cuphorn，在100%功率輸出10秒脈沖的BandelinSonoplusUV2200超聲儀)將基因組DNA片段機(jī)械剪切成大小在150-300bp范圍內(nèi)的片段，或者通過溫和的DNA酶I處理(Novagen)剪切成50-70bp大小的片段。觀察到，當(dāng)將DNA斷裂成150-300bp大小范圍的片段時(shí)，超聲處理產(chǎn)生緊密得多的片段大小分布。然而，盡管DNA對(duì)超聲波誘導(dǎo)的流體力學(xué)剪切力充分暴露，不能有效且重復(fù)性獲得片段大小的隨后減小。因此，使用Novagen的鳥槍切割(shotguncleavage)試劑盒通過溫和的DNA酶I處理獲得50-70bp大小的片段。制備1:20稀釋的試劑盒提供的DNA酶I,在WC下在60|a1體積中在MnCl2存在的情況下進(jìn)行消化5分鐘，以確保雙鏈被酶切割。用2ju1的0.5MEDTA終止反應(yīng)，在2%TAE-瓊脂糖凝膠上估計(jì)片段化效率。該處理導(dǎo)致基因組DNA的總片段化至接近50-70bp的片段。然后在100mM各dNTP存在的情況下，使用T4DM聚合酶對(duì)片段進(jìn)行平末端化兩次，以確保末端有效平齊(flushing)。將片段立即用于連接反應(yīng)或于-2(TC保存以待以后使用。裁沐W裙迷在用具有與卡那霉素抗性基因交換的P-內(nèi)酰胺酶(Wa)基因的pASK-IBA骨架(Skerra，A.，1994)上構(gòu)建載體pMAL4.31。此外，將6/a基因克隆入多克隆位點(diǎn)。將0邁W的前導(dǎo)肽序列置于編碼成熟P-內(nèi)酰胺酶的序列之前以允許其有效分泌穿過質(zhì)膜。此外，編碼成熟P-內(nèi)酰胺酶的前12個(gè)氨基酸的序列(間隔子序列)跟在o頂/^前導(dǎo)肽序列之后，以避免緊接前導(dǎo)肽酶切割位點(diǎn)后的序列融合，因?yàn)槔缭谠搮^(qū)域內(nèi)的帶正電荷的氨基酸簇將減少或消除穿過質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)(Kajava，A.等人，2000)。S邁a/限制性位點(diǎn)用于文庫插入。用于回收選擇的片段的上游Fsel位點(diǎn)和下游Notl位點(diǎn)在ifea/位點(diǎn)兩翼。這樣將所述三個(gè)限制性位點(diǎn)插入編碼12個(gè)氨基酸的間隔子序列的序列之后，使Wa基因在-1讀框處轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致在yVW/位點(diǎn)后15bp的終止密碼子。+1bp插入恢復(fù)ORF從而產(chǎn)生(3-內(nèi)酰胺酶蛋白，從而獲得氨爺青霉素抗性。通過將7礎(chǔ)B基因克隆入pEHl(Hashemzadeh-Bonehi，L.等人，1998)的多克隆位點(diǎn)來構(gòu)建載體pMAL9.1。然后，將包含限制性位點(diǎn)尸se/、S/z/a/和Wo〃的序列在氨基酸154后插入/a歷B。這樣構(gòu)建該插入的閱讀框架，以^吏通過^f吏用F"/和^f/的消化從質(zhì)粒pMAL4.31切割的讀框選擇性DNA片段的轉(zhuǎn)移產(chǎn)生7a/z/B和各插入片段的連續(xù)閱讀框架通過將/7wA基因克隆入pEHl的多克隆位點(diǎn)來構(gòu)建栽體pHIEll。此后，將包含限制性位點(diǎn)Wsl和^VW/的序列在氨基酸405之后插入/7力wA。這樣選擇該插入的閱讀框架，以使通過使用/""/和#^/的消化從質(zhì)粒pMAL4.31切割的產(chǎn)生讀框選擇性DNA片段的轉(zhuǎn)移產(chǎn)生/力wA和各插入片段的連續(xù)閱讀框架。^f諒喪逸脊的X岸W^謦和估^將基因組廣義布氏疏螺旋體DNA片段連接入栽體pMAL4.31的5^al位點(diǎn)。通過電穿孔將重組DNA導(dǎo)入DH10B電感受態(tài)(electrocompetent)大腸桿菌細(xì)胞(GIBCOBRL)，然后將轉(zhuǎn)化子涂板在含有卡那霉素(50)Lig/ml)和氨節(jié)青霉素(50jLig/ml)的LB-瓊脂板上。將板在37。C下溫育過夜，收集菌落以用于大規(guī)模DNA提取。將代表性板貯藏和保存以用于收集菌落的菌落PCR分析和大規(guī)模測(cè)序。簡(jiǎn)單菌落PCR測(cè)定法用于初步確定大致的片段大小分布和插入效率。根據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)，估計(jì)精確的片段大小、插入位點(diǎn)上接頭的完整性以及讀框選擇的精確度(&Wrzz/e)。179細(xì)蘿4面肩^^x岸使用限制性酶尸sel和從pMAL4.31栽體切取包含廣義布氏疏螺旋體文庫的基因組DNA片段。然后將整個(gè)片段群體轉(zhuǎn)移入已用尸"I和消化的質(zhì)粒pMAL9.1(LamB)或pHlEll(FhuA)。通過使用這兩個(gè)識(shí)別8bp富含GC的序列的限制性酶，將在pMAL4.31載體中選擇的閱讀框架保持在每一個(gè)平臺(tái)載體中。然后通過電穿孔將質(zhì)粒文庫轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5ct細(xì)胞內(nèi)。將細(xì)胞涂板在含有50Mg/ml卡那霉素的LB-瓊脂板上，然后在37。C下培養(yǎng)過夜以產(chǎn)生清晰可見的單個(gè)菌落的密度。然后將細(xì)胞刮離這些板的表面，用新鮮LB培養(yǎng)基洗滌，以等分的形式于-80。C下貯存以待文庫篩選。潛果讀蕃逸凈的X岸對(duì)于阿氏疏螺旋體林系K78在pMAL4.31載體中產(chǎn)生分別具有大約70和300bp大小的兩個(gè)文庫。對(duì)于每一個(gè)文庫，大約1jugpMAL4.31質(zhì)粒DNA和50ng片段化的基因組阿氏疏螺旋體DNA的連接和隨后的轉(zhuǎn)化在框架選擇后產(chǎn)生8x104-2x105個(gè)克隆。為了估計(jì)文庫的隨機(jī)性，對(duì)每一個(gè)文庫的500-600個(gè)隨機(jī)選擇的克隆進(jìn)行測(cè)序。兩個(gè)文庫(LBA-50和LBA-300)的代表性生物信息學(xué)分析顯示在相應(yīng)于這些文庫的克隆中，只有非常少的克隆出現(xiàn)多次。此外，對(duì)于LBA-50文庫，顯示平均插入大小為51bp，非常接近預(yù)期的插入大小(圖2A)。關(guān)于LBA-300文庫，平均插入大小為170bp，比預(yù)期的插入大小略短(圖2B)。肽在大腸桿菌表面上的展示需要將插入片段從來自讀框選擇載體的pMAL4.31的LBA-50和LBA-300文庫轉(zhuǎn)移至展示質(zhì)粒pMAL9.1(LamB)或pHIEll(FhuA)。使用Fsel和限制性切割基因組DNA片段，5ng插入片段與0.1Mg質(zhì)粒DNA的連接和隨后轉(zhuǎn)化至DH5a細(xì)胞，產(chǎn)生2x105-5x105個(gè)克隆。從LB板上刮取細(xì)胞，然后冷凍而不進(jìn)一步擴(kuò)增。實(shí)施例4:使用細(xì)菌表面展示的基因組文庫和人血清進(jìn)行的來自廣義布氏疏螺旋體的高免疫原性肽序列的鑒定。將來自給定文庫的大約2.5x108個(gè)細(xì)胞在37。C下培養(yǎng)在5ml含有50Mg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中2小時(shí)。通過加入1mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)行30分鐘。用新鮮LB培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，將大約2x107個(gè)細(xì)胞重懸浮于100m1的LB培養(yǎng)基中，然后轉(zhuǎn)入Eppendorf管。將IO至20Mg生物素化的從血清中純化的人IgG加入細(xì)胞，在輕微振蕩的條件下將懸浮物在4'C下溫育過夜。加入900ju1的LB培養(yǎng)基，混合懸浮物，隨后以6，000rpm在4°C下離心10分鐘。細(xì)胞用1ml的LB洗滌一次，然后重懸浮于100u1的LB培養(yǎng)基。加入10jul偶聯(lián)至鏈霉抗生物素蛋白的MACS小珠(MiltenyiBiotech,Germany),在4°C下繼續(xù)溫育20分鐘。然后加入900m1的LB培養(yǎng)基，將MACS小珠細(xì)胞懸浮物加在被回定至磁鐵的經(jīng)平衡的MS柱(MiltenyiBiotech,Germany)上。(通過用1ml的70%EtOH洗滌一次和用2ml的LB培養(yǎng)基洗滌兩次平衡MS柱。)然后用3ml的LB培養(yǎng)基洗滌柱子三次。在取出磁鐵后，通過用2ml的LB培養(yǎng)基洗滌來洗脫細(xì)胞。在用3ml的LB培養(yǎng)基洗滌柱子后，第二次將2ml洗脫物加在相同的柱子上，重復(fù)洗滌和洗脫步驟。第三次進(jìn)行上樣、洗滌和洗脫步驟，從而產(chǎn)生2ml的終洗脫物。將在兩輪選擇后選擇的細(xì)胞涂板在含有50jug/ml卡那霉素的LB-瓊脂板上，在37。C下培養(yǎng)過夜。遞i2^/淨(jìng)^re^er/7伊跡為V^f^^的逸舉的^謦的申估將隨機(jī)選擇的克隆在37'C于含有50ug/ml卡那霉素的3mlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，以使用標(biāo)準(zhǔn)方法來制備質(zhì)粒DNA。在MWG(Germany)進(jìn)行測(cè)序。關(guān)于Western印跡分析，將大約10-20Mg總細(xì)胞蛋白通過10。/。SDS-PAGE進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)印至HybondC膜(AmershamPharmaciaBiotech,England)上。使用以大約1:3，000-1:5，000稀釋的人血清作為一抗體和以1:5，000稀釋的偶聯(lián)至HRP的抗人IgG抗體作為第二抗體來檢測(cè)LamB或FhuA融合蛋白。使用ECL檢測(cè)試劑盒(AmershamPharmaciaBiotech,England)進(jìn)行檢測(cè)。備選地，將兔抗-FhuA或兔抗-LamB多克隆免疫血清用作一抗與各自的偶聯(lián)至HRP的第二抗體一起用于融合蛋白的檢測(cè)。潛^遞過炎^^參#化的&W磁^激活^勿^為S^^^船6"^/f的勿象我面^I^X岸的謬逸。使用生物素化的從萊姆疏螺旋體病患者的血清(P1755、P1766、P1772、P1806、P1811、P3055、P3144、P3186、P3219、P3077、P3084、P3286、P3288、P3337、P3016、P3150、P3301、P3344、P3394、P3183、P3209、P3336、P3120、P3239、P3251)制備的人IgG篩選pMAL9.1中的文庫K78-LamB和pHIEll中的K78-FhuA(參見實(shí)施例1:來自人血清的抗體的制備)。如在實(shí)驗(yàn)方法所述進(jìn)行選擇方法。圖3A顯示使用K78-FhuA文庫和EM-IgG進(jìn)行的篩選的代表性實(shí)例。如在從MACS篩選的第一輪選擇后通過菌落計(jì)數(shù)可看到的，結(jié)束時(shí)回收的細(xì)胞的總數(shù)目急劇地從lxl(T個(gè)細(xì)胞減少至大約3x104個(gè)細(xì)胞，不使用抗體的選擇顯示更顯著的細(xì)胞數(shù)目的減少，這表明選擇依賴于廣義布氏疏螺旋體特異性抗體(圖3A)。為了估計(jì)篩選的效能，隨機(jī)挑揀20個(gè)選擇的克隆，將其經(jīng)歷使用篩選EM-IgG庫的免疫印跡分析(圖3B)。該分析顯182示，大部分選擇的克隆顯示與存在于相關(guān)血清中的抗體的反應(yīng)性，然而表達(dá)FhuA而無阿氏疏螺旋體特異性插入片段的對(duì)照不與相同的血清反應(yīng)。通常，觀察到反應(yīng)性的比例在40至70%范圍內(nèi)。菌落PCR分析顯示所有選擇的克隆都包含預(yù)期的大小范圍內(nèi)的插入片段。在使用來自其他血清庫的文庫的篩選中觀察到類似的結(jié)果。作為第二實(shí)例，圖3C和D顯示了使用大插入片段K78-FhuA和LA-IgG抗體庫獲得的數(shù)據(jù)。一輪MACS選擇導(dǎo)致細(xì)胞只在特異性IgG存在而其非不存在的情況下富集(圖3C)，這表明選擇對(duì)于使用的抗體是特異性的。然后在使用相同的LA-IgG抗體庫的單個(gè)細(xì)菌菌落的Western印跡分析中確認(rèn)該特異性選擇(圖3D)。更大量的來自每一次篩選的隨機(jī)挑揀的克隆(600至800個(gè))的隨后測(cè)序?qū)е卤挥糜诤Y選的人血清抗體特異性識(shí)別的基因和相應(yīng)的肽或蛋白質(zhì)序列被鑒定。特異性克隆被選擇的頻率至少部分反映血清中用于選擇和識(shí)別由該克隆呈遞的表位的特異性抗體的豐度和/或親和力。在這點(diǎn)上，令人驚訝的是，來源于一些ORF(例如BAP001和BAP024)的克隆被挑揀超過100次，表明它們的高免疫原性特性。表l概述了獲得的關(guān)于所有12個(gè)進(jìn)行的篩選的數(shù)據(jù)。表1中所示的所有克隆已經(jīng)通過使用來自單克隆的完整細(xì)胞提取物的免疫印跡分析驗(yàn)證，顯示與用于各篩選的人血清庫的指定的反應(yīng)性。如可從表l看到的，相同ORF的不同區(qū)域被鑒定為免疫原性的，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的大小變化的片段通過平臺(tái)蛋白展示于表面。由于阿氏疏螺旋體的基因組序列在進(jìn)行篩選時(shí)是不可獲得的，因而首先使用來自狹義布氏疏螺旋體的基因組序列，然后使用來自嘎氏疏螺旋體的基因組序列進(jìn)行使用來源于阿氏疏螺旋體篩選的表位的所有BLAST分析。表1展示了來源于阿氏疏螺旋體K78基因組的最初注釋的阿氏疏螺旋體ORF名稱，質(zhì)粒來源的ORF按年代順序編號(hào)。值得進(jìn)一步注意的是，許多通過細(xì)菌表面展示篩選鑒定的基因編碼被附著至細(xì)菌表面的蛋白質(zhì)。這與表面附著蛋白在廣義布氏疏螺旋體的毒性中的預(yù)期作用相符。183實(shí)施例5:使用從阿氏疏螺旋體K78鑒定的高免疫原性蛋白進(jìn)行的基因分布研究遞過尸CT遽/f^戎^^差^為、布分林系中的抗原。為了確定編碼鑒定的阿氏疏螺旋體K78抗原的基因是否明確地發(fā)生在相關(guān)林系中，使用對(duì)于目的基因是特異性的引物對(duì)一系列獨(dú)立的細(xì)菌分離抹進(jìn)行pcr。獲得包括如表3中所示最頻繁存在于患者中的o"C型的廣義布氏疏螺旋體分離抹。設(shè)計(jì)作為引物的寡核苷酸序列以使所有鑒定的0RF產(chǎn)生大約l，OOObp的產(chǎn)物，如果可能包括所有鑒定的免疫原性表位。如根據(jù)實(shí)施例2如所述制備所有廣義布氏疏螺旋體林系的基因組DNA。按照廠商說明書(Invitrogen，TheNetherlands),使用Taq聚合酶(1U)，200nMdNTPs,10pMol各寡核苷酸和試劑盒在25m1的反應(yīng)體積中進(jìn)行pcr。作為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行個(gè)30循環(huán)(lx:5分鐘95。C，30x:3Q秒95。C，30秒56。C,3Q秒72。C，lx4分鐘72。C),除非條件必須適合單個(gè)引物對(duì)。潛^就鑒定的編碼免疫原性蛋白的基因在30個(gè)不同廣義布氏疏螺旋體抹系中的存在，通過PCR對(duì)所述基因進(jìn)行檢測(cè)(表3)。例如，圖4顯示使用所有指定的30個(gè)抹系進(jìn)行的對(duì)于阿氏疏螺旋體BAP004的PCR反應(yīng)。如清楚可見的，所述基因存在于所有分析的林系中。使用選擇的抗原的所有結(jié)果概述于表4。重要的是，一些鑒定的抗原在序列和大小上在各病原體的所有林系十分保守，從而是預(yù)防由廣義布氏疏螺旋體引起的感染的新型疫苗候選物。實(shí)施例6:用在大腸桿菌表面展示的、來自廣義布氏疏螺旋體的高免疫原性蛋白質(zhì)/肽免疫的小鼠獲得的免疫血清的免疫原性^^V、斌^^瘦A清^Z^將具有編碼融合至阿氏疏螺旋體K78的肽的平臺(tái)蛋白的質(zhì)粒的大腸桿菌克隆培養(yǎng)在37。C下、含有50jug/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中。以1:10稀釋過夜培養(yǎng)物，進(jìn)行培養(yǎng)直至達(dá)到0.5的0D6。。，然后使用0.2mM的IPTG誘導(dǎo)2小時(shí)。將沉淀的細(xì)菌細(xì)胞重懸浮于PBS緩沖液，在水上通過超聲破裂細(xì)胞，從而產(chǎn)生粗制細(xì)胞提取物。根據(jù)OD鋼測(cè)量值，將相應(yīng)于5xl(^個(gè)細(xì)胞的等分靜脈內(nèi)注射入NMRI小鼠，然后在2周后加強(qiáng)。在笫二次注射后1周采集血清。通過肽ELISA測(cè)量表位特異性抗體水平。潛果V、歲哞的^瘦^^通過肽ELISA確定特異性抗體的存在，如在圖5中舉例說明并概述于表5中。顯示由109個(gè)不同表位代表的來自廣義布氏疏螺旋體的99個(gè)抗原在小鼠中具有免疫原性。這些實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)許多鑒定的表位/蛋白質(zhì)不僅在人中而且還在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中具有免疫原性。實(shí)施例7:通過肽ELISA對(duì)來自阿氏疏螺旋體K78的肽的驗(yàn)證酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)用在包衣緩沖液(O.1M碳酸鈉pH9.2)中稀釋的5-10ug/ml總蛋白包被ELISA板(Maxisorb，Millipore)。在PBS-BSA中進(jìn)行血清的兩個(gè)稀釋(400X，2，000X)。按照廠商的推薦(稀釋度1，000x)使用高特異性辣根過氧化物酶(HRP)綴合的抗人IgG第二抗體(Southern185Biotech)。通過基于通過自動(dòng)ELISA酶標(biāo)儀(TECANSUNRISE)讀出的0仏。^讀數(shù)測(cè)量底物(ABTS)至有色產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化來定量抗原-抗體復(fù)合物。將在400x稀釋度下的測(cè)量值用于計(jì)算表6中顯示的結(jié)果。賴入#的名瘦^^如表6中概述的，通過肽ELISA確定特異性抗體在人中的存在。用于該分析的人血清相應(yīng)于用于通過細(xì)菌表面展示篩選進(jìn)行的抗原鑒定的各種血清庫中包括的血清。分析來自來源于阿氏疏螺旋體K78的個(gè)體抗原的單個(gè)或多個(gè)肽，顯示這些肽中有許多在人中具有免疫原性。很明顯，一些選擇的肽與許多或所有研究的人血清(例如BAOba0565.02或BAOba0077.Ol)具有很高的反應(yīng)性，然而其他肽顯示中等反應(yīng)性。關(guān)于對(duì)于選擇的表位包含超過30個(gè)氨基酸的那些抗原，設(shè)計(jì)具有5至6個(gè)氨基酸的交疊的多個(gè)肽。對(duì)于一些抗原，觀察到這些來自相同抗原的多個(gè)肽顯示不同的反應(yīng)性，進(jìn)一步描繪了各抗原(例如BA0314或BA0546)免疫原性區(qū)域。這些實(shí)驗(yàn)證明了許多鑒定的表位/蛋白質(zhì)在人中具有高度的免疫原性，這表明它們?cè)诟腥具^程中由病原體表達(dá)并且能夠誘導(dǎo)很強(qiáng)的免疫反應(yīng)。實(shí)施例8:從使用在大腸桿菌表面展示的、來自阿氏疏螺旋體K78的高免疫原性蛋白/肽免疫的小鼠獲得的免疫血清的對(duì)廣義布氏疏螺旋體的表面結(jié)合。度S為、浙在34。C下培養(yǎng)阿氏疏螺旋體林系K78;通過暗視場(chǎng)顯微鏡檢查確定螺旋體的數(shù)目，用新鮮BSK培養(yǎng)基稀釋螺旋體至每毫升106個(gè)生物體。用新鮮BSK培養(yǎng)基(IOOnl)以1:25稀釋每一份小鼠血清，在56。C下進(jìn)行熱滅活30分鐘。將100jul小鼠血清加入100Ml(105個(gè)細(xì)胞)疏螺旋體懸浮物(血清最后以l:50稀釋)。輕輕混合測(cè)定懸浮物，在室溫下溫育l小時(shí)。在溫育后，以5，000rpm離心樣品3分鐘，用1mlPBS，0.5%BSA洗滌一次。使用綴合有PE的抗小鼠抗體(所述抗體按照廠商說明書使用(稀釋于100(a1中))進(jìn)行第二次染色。在冰上進(jìn)行第二次染色45分鐘。溫育結(jié)束時(shí)，以5，000rpm離心樣品3分鐘，用1ml的PBS0.5%BSA進(jìn)行洗滌，重懸浮于1ml的PBS-1%多聚甲醛。將樣品進(jìn)行渦旋，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。潛^乂布《蔬銀《#勿應(yīng)^《面潛合在FACS分析中檢測(cè)識(shí)別阿氏疏螺旋體K78上的表面蛋白的抗體的存在。由40種不同血清代表的32種抗原在FACS分析中與緩沖液對(duì)照相比顯示顯著的轉(zhuǎn)換(表7)。該體外實(shí)驗(yàn)表明體外培養(yǎng)的廣義布氏疏螺旋體細(xì)胞的32種抗原在表面上表達(dá)。實(shí)施例9:重組疏螺旋體屬抗原誘導(dǎo)抗廣義布氏疏螺旋體的針攻擊(needlechallenge)的保護(hù)性免疫反應(yīng)。舉趁舉蛋冷j時(shí)^謦和4^使用特異性引物通過PCR，從分離自阿氏疏螺旋體K78的基因組DAN擴(kuò)增目基因。除了基因特異性部分外，引物還具有幫助定向克隆擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的限制性位點(diǎn)。引物的基因退火(特異性)部分在15-30個(gè)堿基的長(zhǎng)度范圍內(nèi)變化。用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化獲得的PCR產(chǎn)物，將其克隆入用于His標(biāo)記的蛋白的pET28b(+)栽體(Novagen)。187選擇的抗原的構(gòu)建體列于表8。當(dāng)確認(rèn)重組質(zhì)粒包含目的基因后，轉(zhuǎn)化用作表達(dá)宿主的大腸桿菌BU1CodonPlus(DE"-RIPL細(xì)胞(Invitrogen)。蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化以所需培養(yǎng)體積將具有重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21CodonPlus(DE3)-RIPL細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。當(dāng)OD,皿達(dá)到0.6時(shí)，用0.5mM的IPTG在37。C下誘導(dǎo)培養(yǎng)物3小時(shí)。通過離心收集細(xì)胞，通過凍-融方法，然后用Bug-buster(Novagen)破裂細(xì)胞的組合來裂解細(xì)胞。通過離心將裂解物分離成可溶性(上清液)和不溶性(沉淀)級(jí)分。取決于蛋白質(zhì)的定位，使用不同的純化策略。A)如果His標(biāo)記的蛋白質(zhì)在可溶性級(jí)分中，那么通過將上清液與Ni-Sepharose珠(Ni-Sepharose6FastFlow,GEHealthcare)結(jié)合來進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化。由于在表達(dá)的蛋白質(zhì)的C末端存在六組氨酸(6xHIS)，其結(jié)合Ni-Sepharose,然而其他污染性蛋白質(zhì)被洗滌緩沖液從柱子洗滌掉。用在20mMNaH2P04，0.5mMNaCl緩沖液pH7.4中的500mM的咪唑洗脫蛋白質(zhì)。濃縮洗脫物，通過Bradford測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，對(duì)其通過SDS-PAGE和Western印跡法進(jìn)行檢測(cè)。B)如果蛋白質(zhì)存在于不溶性級(jí)分，則將沉淀溶解在合適的包含8M尿素的緩沖液中，然后使用與上述相同的材料和方法在變性的條件(在包含8M尿素的緩沖液中)下用于Ni-NTA柱。污染性蛋白質(zhì)被不含尿素的洗滌緩沖液從柱子洗滌掉。進(jìn)行His標(biāo)記的蛋白質(zhì)的重折疊，同時(shí)將蛋白質(zhì)固定在Ni-NTA基質(zhì)上。復(fù)性后，通過加入500mM咪唑洗脫蛋白質(zhì)。將洗脫物進(jìn)行透析以除去痕量的尿素，如果體積大則進(jìn)行濃縮，對(duì)其通過SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)和通過Bradford法進(jìn)4亍測(cè)量。動(dòng)場(chǎng)使用C3H/HeN雌性小鼠(6-8周)。衛(wèi)#義^##、超^^V、篇羞^種/^.'將50Mg重組蛋白質(zhì)經(jīng)皮下注射入雌性C3H/HeN小鼠，以完全弗氏佐劑(CFA)作為佐劑。在第14和28天，使用相同量的蛋白質(zhì)和不完全弗氏佐劑(IFA)對(duì)動(dòng)物加強(qiáng)2次。公布的保護(hù)性O(shè)spA蛋白抗原用作陽性對(duì)照，使用PBS緩沖液中的單獨(dú)的佐劑進(jìn)行的免疫用作陰性對(duì)照(PBS)。在第35天，使用各自的重組蛋白通過ELISA測(cè)量抗體滴度。細(xì)霧攻擊..在BSK-II培養(yǎng)基中新鮮培養(yǎng)的廣義布氏疏螺旋體林系N40用作攻擊抹系。為了確定存在于細(xì)菌接種物中的存活細(xì)胞的數(shù)目，進(jìn)行使用有限稀釋的克隆。在34。C和5%C02T，以理論上IO、l.O或O.l個(gè)細(xì)胞/等分溫育8個(gè)等分的2mlBSK-II。三周后，通過暗視場(chǎng)顯微鏡檢查就活疏螺旋體細(xì)胞的存在評(píng)估等分。根據(jù)來自使用極限稀釋的克隆的結(jié)果，第一稀釋度中疏螺旋體細(xì)胞的最可能數(shù)目獲自表9。將1(T個(gè)細(xì)胞皮下用于小鼠。通過在BSK-II培養(yǎng)基中培養(yǎng)來自耳和膀胱的疏螺S走體屬細(xì)胞和通過使用Western印跡確定的血清轉(zhuǎn)移確定通過免疫產(chǎn)生的保護(hù)作用(圖6)。保護(hù)作用以未感染的動(dòng)物的總數(shù)(10只小鼠/組)的百分?jǐn)?shù)表示。Ve"er/7伊遊法按照說明手冊(cè)4吏用PAGE4-20%Tris-glycineZOOMGels1mmxIPG孔(Invitrogen)。將疏螺旋體屬裂解物(25jag/樣品)與5x還原樣品緩沖液混合，在95。C下加熱10分鐘。PageRulerprestainedproteinladderplus(MW10-250kDa;Fermentas，Germany)用作蛋白質(zhì)大小的指示劑。使用160V分離蛋白質(zhì)，進(jìn)行大約70分鐘，凝膠進(jìn)一步用于Western印跡。使用半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(semi-drytransfersystem)(Trans-BlotSD;BioRad，U.S.A.),將通過單相凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Hybond0.45Micron,AmershamBioscience,England)上。將凝膠和膜裝配在印跡夾(blotsandwich)中并且在80mA下在室溫下在轉(zhuǎn)移緩沖液中印跡1小時(shí)。通過PonceauS(Sigma,Austria)染色顯現(xiàn)印跡的蛋白質(zhì)。通過在5%牛奶-PBS-T中在室溫下溫育膜1小時(shí)來封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。用PBS-T溶液洗滌膜3次，每次15分鐘，然后與一抗溶液(使用5%牛奶-PBS-T以1:1，GOO稀釋的單個(gè)小鼠血清)在室溫下一起溫育l小時(shí)。如上所述洗滌膜，然后將其與二抗溶液(來自JacksonImmunoResearchLaboratoryInc.,U.S.A.的兔抗小鼠IgG-HRP;使用5%牛奶-PBS-T以1:5，OOO稀釋的)在室溫下溫育1小時(shí)。在檢測(cè)前，用PBS-T洗滌膜3次，每次15分4K吏用ECL檢測(cè)試齊'J盒(AmershamPharmaciaBiotech:England)顯現(xiàn)信號(hào)。來自小鼠器官的疏螺旋體的培養(yǎng)在無菌條件下從小鼠獲取器官(耳和膀胱)，將其轉(zhuǎn)移至具有含有400jug/ml磷霉素和50Mg/ml磺胺曱基異噁唑的10ml的BSK-II培養(yǎng)基的管中。將培養(yǎng)物在34。C，5%C02下溫育最長(zhǎng)4周。就活疏螺旋體細(xì)胞的存在使用暗視場(chǎng)顯微鏡檢查來檢查培養(yǎng)物。餘^在已用毒性狹義布氏疏螺旋體抹系N40建立起疏螺旋體屬動(dòng)物模型后，評(píng)估體外選擇的疫苗候選物的保護(hù)能力。在用狹義布氏疏螺旋體林系N40攻擊之前，用使用CFA/IFA作為佐劑的重組抗原(表8)免疫小鼠。在攻擊后四周，采集用于通過Western印跡分析確定血清轉(zhuǎn)換的血清(圖6)和用于通過在BSK-11培養(yǎng)基中的培養(yǎng)檢測(cè)活疏螺旋體的器官。血清轉(zhuǎn)換與來自小鼠器官的疏螺旋體的培養(yǎng)物之間的相關(guān)性為100%。在動(dòng)物研究中鑒定了(表10)具有不同保護(hù)水平的幾個(gè)抗原。將未感染小鼠的百分?jǐn)?shù)與陰性對(duì)照組(用PBS中的單獨(dú)的佐劑免疫的小鼠)(PBS)比較。保護(hù)抗原定義為其中免疫接種導(dǎo)致至少比190PBS對(duì)照組中多一只未感染小鼠的抗原。疫苗候選物的觀察到的保護(hù)作用可描述為交叉保護(hù)作用，因?yàn)榭乖男蛄衼碓从谂c攻擊林系不同的廣義布氏疏螺旋體基因型群。從阿氏疏螺旋體林系K78克隆抗原，用于動(dòng)物研究中的攻擊林系是狹義布氏疏螺旋體林系N40。因此，對(duì)于與受試疫苗候選物的氨基酸序列的來源相同的基因型群阿氏疏螺旋體，預(yù)期存在更高的抗攻擊抹系的保護(hù)水平。參考文獻(xiàn)本說明書中已引用的下列參考文獻(xiàn)以截短的形式通過以它們的全文引用合并入本文。Altschul，S.，etal.(1990).JournalofMolecularBiology215:403-10.Bennett,D.，etal.(1995).JMolRecognU8:52-8.Burgdorfer，W.，etal.(1982).Science216:1317-1319.Casjens，S.，et.al.(2000).Mol.Mirobiol.35:490-516.Clackson，T.，etal.(1991).Nature352:624-8.CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSonsInc.(1987).Devereux，J.,etal.(1984).Nucleicacidsresearch12:387-95.Doherty，E.，etal.(2001).ArmuRevBiophysBiomolStruct30:457-475.Eisenbraun，M.，etal.(1993).DMCellBiol12:791-7.Etz,H.，etal.(2001).JBacteriol183:6924-35.Fraser，C.，etal.(1997).Nature390:580-586.Ganz，T.(1999).Science286:420-421.Georgiou，G.(1997).NatureBiotechnology15:29-34.Gl6ckner，G.，etal，(2004).Nucleicacidsresearch32:6038-6046.Hashemzadeh-Bonehi，L.，etal.(1998).MolMicrobiol30:676-678.Heinje，vonG.(1987).SequenceAnalysisinMolecularBiology,AcademicPress.Hemmer，B.,etal.(1999).NatMed5:1375-82.Hornef，M.，etal.(2002).NatImmunol3:1033-40.Johanson，K.，etal.(1995).JBiolChem270:9459-71,Jones,P.，etal.(1986).Nature321:522-5.Kajava，A,，etal.(2000).JBacteriol182:2163-9.Kohler，G.，etal.(1975).Nature256:495-7.Kolaskar,A.，etal.(1990).FEBSLett276:172-4.Lewin，A.，etal.(2001).TrendsMolMed7:221-8.LiveyI.etal.(1995).MolMicrobiol.18:257-69.萊姆DiseaseSurveillance(2004).MMWR53:365-369.Marks,J.,etal.(1992).Biotechnology(NY)10:779-83.McCafferty,J.，etal,(1990).Nature348:552-4.Norman,R丄andKempe，L.L.(1960).J.Biochem.Microbiol.Technol.Engng.2:157-163.Okano，H.，etal.(1991).JNeurochem56:560-7.01igodeoxynucleotidesasAntisenseInhibitorsofGeneExpressionCRCPress,BocaRaton，(1988).Rammensee，H.，etal.(1999).Immunogenetics50:213-9.ReportofWHOworkshopon萊姆borreliosisandDiagnosisandsurveillance(1995).WHO/CDS/VPH/95141.Seeger，C.，etal.(1984).ProcNatlAcadSciUSA81:5849-52.Skerra，A.(1994).Gene151:131-5.Steere，A.C.，etal.(1977).ArthritisRheum.20:7-17.Steere，A.C.(1989).NewEnglandJournalofMedicine321:586-596.Survei1lanceof萊姆borreliosisinGermany,2002and2003(2005).EuroSurveill.10:83-85.Tang，D.，etai.(1992).Nature356:152-4'Tempest,P.，etal.(1991).Biotechnology(NY)9:266-71.Tourdot，S.，etal.(2000).EurJImmunol30:3411-21.WilskeB.etal.(1988).AnnNYAcadSci.539:126-43.Xu，Y.，etal.(1995).J.Clin.Microbiol.33:2679-2685.說明書中公開的本發(fā)明的特征、權(quán)利要求和/或附圖都可以分開地和以其任何組合作為用于以其不同形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的材料。19權(quán)利要求1.編碼蛋白質(zhì)、優(yōu)選超免疫血清反應(yīng)性抗原或其片段的分離的核酸分子，其包含選自下列的核酸序列a)與具有選自SeqIDNo1-134的核苷酸序列的核酸分子具有至少70％的序列同一性的核酸分子，b)與a)的核酸分子互補(bǔ)的核酸分子，c)包含a)或b)的核酸分子的至少15個(gè)連續(xù)堿基的核酸分子，d)在嚴(yán)格雜交條件下與a)、b)、或c)的核酸分子退火的核酸分子，e)若非遺傳密碼的簡(jiǎn)并性的原因，則與a)、b)、c)或d)中定義的核酸分子雜交的核酸分子。2.編碼超免疫血清反應(yīng)性抗原或其片段的分離的核酸分子，其包含選自下列的核酸序列a)與具有選自SeqIDNo269-387和507-628的核苷酸序列的核酸分子具有至少70%的序列同一性的核酸分子，b)與a)的核酸分子互補(bǔ)的核酸分子，c)包含a)或b)的核酸分子的至少15個(gè)連續(xù)堿基的核酸分子，d)在嚴(yán)格雜交條件下與a)、b)、或c)的核酸分子退火的核酸分子，e)若非遺傳密碼的簡(jiǎn)并性的原因，則與a)、b)、c)或d)中定義的核酸分子雜交的核酸分子。3.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的分離的核酸分子，其中序列同一性至少是70%、至少85%、至少90%、至少95%或100%。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的分離的核酸分子，其中核酸是DNA。5.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的分離的核酸分子，其中核酸是RNA。6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的分離的核酸分子，其中從基因組DNA,優(yōu)選來自選自狹義布氏疏螺旋體、嘎氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體、"orre/iaa/2^/ersoi2//、5orre7/a6/ssett//、_5orre//aKa/a/sia/7a、Aorre"afa/7wh'/、_5orre//<sti/ri/ae和"o/TeZ/a"'/zyca的物種的基因組DNA,更優(yōu)選來自狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或哏氏疏螺旋體的基因組DM分離核酸分子。7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的核酸，其中片段是其功能性或活性片段或活性變體。8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的核酸，其中蛋白質(zhì)或超免疫血清反應(yīng)性抗原或其片段是或由來自狹義布氏疏螺旋體、嘎氏疏螺旋體、阿氏疏蟲累旋體、"orre7/aa/7d/er5"c/H'/、5c>rr<3//a6/sse〃//、"or_re//a7a/a/Wa/2a、^汀e7/a^to"a/72'ae、Aorre/2'a57/e/y77a/7/、^rre7/a力/70/7/ca、Aorre/2'af<s/7i/ir//、5orre//afwrdfae或^rre7/a5"/"2'cs，優(yōu)選來自狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或嗅氏疏螺旋體的抗原組成。9.包含權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的核酸分子的載體。10.權(quán)利要求9的載體，其中載體適合用于蛋白質(zhì)，優(yōu)選由權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)定義的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)或超免疫血清反應(yīng)性抗原或其片段的重組表達(dá)。11.包含權(quán)利要求9或10定義的載體的宿主細(xì)胞。12.來自狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或吸氏疏螺旋體的超免疫血清反應(yīng)性抗原，所述抗原與來自具有廣義布氏疏螺旋體屬感染、阿氏疏螺旋體屬感染或嘵氏疏螺旋體屬感染的人或者未感染的健康人的血清發(fā)生免疫反應(yīng)，其中超免疫血清反應(yīng)性抗原包含來自狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或嘎氏疏螺旋體的分離的肽或其肽片段。13.蛋白質(zhì)，優(yōu)選具有選自SeqIDNo135-268的氨基酸序列的超免疫血清反應(yīng)性抗原，或者其活性片段或活性變體。14.具有選自SeqIDNo388-506和629-750的氨基酸序列的超免疫血清反應(yīng)性抗原，或者其活性片段或活性變體。15.權(quán)利要求13的蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)由權(quán)利要求1或3-8中任一項(xiàng)定義的核酸分子編碼。16.權(quán)利要求14的超免疫血清反應(yīng)性抗原，其中抗原由權(quán)利要求2-8中任一項(xiàng)定義的核酸分子編碼。17.權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或超免疫血清反應(yīng)性抗原，其中蛋白質(zhì)或超免疫血清反應(yīng)性抗原是來自狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或嘎氏疏螺旋體的抗原或由來自狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或嘎氏疏螺旋體的抗原組成。18.權(quán)利要求13-17中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或超免疫血清反應(yīng)性抗原，其中其活性片段由權(quán)利要求13-17中任一項(xiàng)定義的蛋白質(zhì)或超免疫血清反應(yīng)性抗原和更具體地任何SeqIDNo135-268、388-506或629-750的蛋白質(zhì)或超免疫血清反應(yīng)性抗原的至少60%、特別至少70%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%、甚至更優(yōu)選至少95%、最優(yōu)選99%組成。19.權(quán)利要求13-17中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或超免疫血清反應(yīng)性抗原，其中其活性變體具有與超免疫血清反應(yīng)性抗原或蛋白質(zhì)至少50%的序列同一性，與權(quán)利要求13-17中任一項(xiàng)定義的所述超免疫血表反應(yīng)性抗原或蛋白質(zhì)和更具體地任何SeqIDNo135-268、388-506或629-750的蛋白質(zhì)或超免疫血清反應(yīng)性抗原特別至少60%、優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%、甚至更優(yōu)選至少95°/。、最優(yōu)選99%的序列同一性。20.抗原，其中該抗原包含表1的欄"預(yù)測(cè)的免疫原性aa"和"鑒定的免疫原性區(qū)域的定位"中顯示的、表5的欄"aa(起始-終止)"中顯示的、由表6的欄"從aa，，和"至aa"定義的、或由表8的欄"氨基酸從-至"定義的核心氨基酸序列，其中更優(yōu)選包含如下核心氨基酸序列的抗原SeqIDNo135的氨基酸6-20，25-51，58-83，94-105，111—122，127-135，141-155，162-173，179—186，188-207，213—226，230-248，253-265，269-282，285-291，367-378，384-393，401-425，453-464，471-477，504-514，519-527，532-555，557-572，584-598，609-616，624-630，638-645，648-653，128-169，257-336，339-379和91-415;SeqIDNo136的氨基酸23-31，47-53，57-64，74-89，91-106，127-132，137-144，152-157，164-169，186-192，20卜206，208-217，223-235和180-189;SeqIDNo137的氨基酸4-32,43-52，54-66，78-88，91-122，124-131，144-150,153-159，161-178，183-191，195-201，205-215，236-252,258-263，276-284，288-294，302-312和159-213;SeqIDNo138的氨基酸8-23,30-35，44-54,65-73，77-83，89-110，117-129，132-137，156-165,169-175，189-199，225-237和229-267;SeqIDNo139的氨基酸5-31，40-50，52-58，64-72，112-118，137-142，170-175，179-185,192-201，299-305和138-187;SeqIDNo140的氨基酸11-18，23-47，113-119，131-137，143-149，197-203，215-222，247-256，264-290，298-303，311-358，368-401，403-409和97-177;SeqIDNo141的氨基酸5-20，27-32，34-40，43-64,66-72，78-85,91-97，104-110，118-141和94-119;SeqIDNo142的氨基酸5-22，25-32，39-45，51-58，60-104，106-114，129-155，160-166，174-182，195-204，207-213，223-239，243-250，257-267，270—276，279-285，293-302，304-317，328-335，360-372，374-382，386-397，404-418,429-438，441-447，450-460，467-472,480-497，501-507，515-521，562-572和195-228;SeqIDNo143的氨基酸4-10,31-42，44-59，65-72，75-115，119-127，146-155，181-188，198-207，213-219，228-244，254-264,269-293，295-310，313-321，323-336，350-369，380-389和165-214;SeqIDNo144的氨基酸11-25，27-45，66-73，75-85，104-113，126-135，143-154，160-166，178-185，201—215，231-245，254-261，266-296，298-306，308-332，339-344,360-370，385-391，412-419，449-457，461-469，472-478，495-505,511-518和350-451;SeqIDNo145的氨基酸14-35，64-72，81-87，90—99，110—116，137-152，158-166，171-178，207-216，225-232，239-250，264-271,276-286，316-323，325-343，350-356，393-407，416-422，440-445，448-453，469-475，497-506，509-529，537-543，586-592，603-610，41-107和528-596;SeqIDNo146的氨基酸56-62，83-96，161-167，170-179，184-197，205-214，235-243，285-296，302-308，324-333和18-315;SeqIDNo147的氨基酸4-11，35-41，57—65，82-88,99-115，118—124，126-134,146-151,159-167，174-180，187-192，195-206，216-222，237-247，261-269，295-304，327-334，341-347，363-374，382-388，398-404，410-424，430-436，441-448，451-461，473-484，493-507，509-522，528-536，544-550,566-573，588-604，608-614，22-75，110-148和344-404;SeqIDNo148的氨基酸4-14，21-28，32-38，59-71，84-106，110-120，127-140，146-167，184-190，197-203,223-232，249-278，280-292，309-324，342-355，367-374，377-384和264-328;SeqIDNo149的氨基酸13-18，47-55，65-75，132-138，140-146，149-155，157-168，218-227，241-248，275-281，283-289，306-315，329-336，352-360,372-378，388-394，396-404,411-416,424-429，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的氨基酸41-66，62-86，82-106，102-126，417-444，440-466528-554,550-575和571-596。21.權(quán)利要求20的抗原，其中抗原進(jìn)一步由下列組成a)1-50個(gè)額外的氨基酸殘基，優(yōu)選1-4Q個(gè)，更優(yōu)選1-30個(gè)，甚至更優(yōu)選至多1-25個(gè)，更優(yōu)選至多1-10個(gè)，最優(yōu)選1、2、3、4或5個(gè)額外的氨基酸殘基；和/或b)至少一個(gè)與核心氨基酸序列異源的氨基酸殘基。22.權(quán)利要求20-21中任一項(xiàng)的抗原，其中氨基酸殘基側(cè)翼連接核酸氨基酸序列的C末端、N末端或C和N末端兩者。23.權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)的抗原，其中抗原包含權(quán)利要求20定義的至少2個(gè)、優(yōu)選至少3個(gè)核心氨基酸序列。24.用于產(chǎn)生權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)定義的蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原、或其片段的方法，包括表達(dá)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)定義的核酸分子。25.用于產(chǎn)生表達(dá)權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)定義的蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原、或其片段的細(xì)胞的方法，包括用權(quán)利要求9或10定義的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞。26.權(quán)利要求24或25中任一項(xiàng)的方法，其中蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段是來自狹義布氏疏螺旋體、p旻氏疏螺旋體、阿氏疏蟲系旋體、5orre"as/^er5"o"http://、^rre/2'a6/^e〃2'/、^rre//a7a/a/57a"a、Aorre"a/i^"a/7/ae、^rre7/a57/e//M/72.、Aorre"a力/70//ca、Aorre//<3fa/wir//'、^rre7/afw_rdae4^orre//a".//ca，優(yōu)選來自狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或嘎氏疏螺旋體的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段。27.藥物組合物，優(yōu)選疫苗，其包含權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)定義的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段或者權(quán)利要求l-8中任一項(xiàng)定義的核酸分子或者權(quán)利要求9-10中任一項(xiàng)定義的載體。28.權(quán)利要求27的藥物組合物，優(yōu)選疫苗，其特征在于其還包含免疫刺激物，優(yōu)選選自聚陽離子聚合物，特別地聚陽離子肽，免疫刺激性脫氧核苷酸(ODN)，包含至少兩個(gè)LysLeuLys基序優(yōu)選KLKLLLLLKLK的肽，神經(jīng)活性化合物，特別地人生長(zhǎng)激素，明釩，弗氏完全或不完全佐劑，或其組合。29.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)定義的核酸分子，或者權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)定義的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段的用途，用于制備藥物制備物或藥物，特別地用于制備抗狹義布氏疏螺旋體、吸氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體、Sorre7/aa油"o/7//、紐re7/a5T72'e//z7a/2/、5orre7/a7.apo/7丫ca、萬orre/7af2/7i/ir//、_5orre7/'afwrdse和^rre//aw'/3/ca的疫苗，優(yōu)選抗狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺4t體或嘵氏疏螺旋體的疫苗。30.抗體或至少其有效部分，其結(jié)合權(quán)利要求12至23中任一項(xiàng)定義的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段，優(yōu)選其活性片段或其變體，優(yōu)選其活性變體。31.權(quán)利要求30的抗體，其中抗體是單克隆抗體。32.權(quán)利要求30或31的抗體，其中所述有效部分包含F(xiàn)ab片段、F(ab)片段、F(ab)N片段、F(ab)2片段或Fv片段。33.權(quán)利要求30-32中任一項(xiàng)的抗體，其中抗體是嵌合抗體。34.權(quán)利要求30-33中任一項(xiàng)的抗體，其中抗體是人源化抗體。35.產(chǎn)生權(quán)利要求30-34中任一項(xiàng)定義的抗體的雜交瘤細(xì)胞系。36.用于產(chǎn)生權(quán)利要求30-34中任一項(xiàng)定義的抗體的方法，其特征在于下列步驟a)通過對(duì)非人動(dòng)物施用權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)定義的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段來在所述動(dòng)物中起始免疫反應(yīng)，b)從所述動(dòng)物中取出包含抗體的體液，和C)通過將所述包含抗體的體液經(jīng)歷進(jìn)一步的純化步驟來產(chǎn)生抗體。37.用于產(chǎn)生權(quán)利要求30-34中任一項(xiàng)中定義的抗體的方法，其特征在于下列步驟a)通過對(duì)非人動(dòng)物施用權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)定義的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段來在所述動(dòng)物中起始免疫反應(yīng)，b)從所述動(dòng)物取出脾或脾細(xì)胞，c)產(chǎn)生所述脾或脾細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞，d)選擇和克隆對(duì)于所述蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段是特異性的雜交瘤細(xì)胞，e)通過培養(yǎng)所述克隆的雜交瘤細(xì)胞和任選地進(jìn)一步的純化步驟來產(chǎn)生抗體。38.權(quán)利要求30-34中任一項(xiàng)定義的抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療或預(yù)防由疏螺旋體屬、優(yōu)選病原性疏螺旋體屬，更優(yōu)選狹義布氏疏螺旋體、嘎氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體、^〃e7/aa/2d/e"orn'/、5oi"re7/a6/5^e"/i、Sorre/Za7a/a/"'a/a、_5orre//a&/7由7、^rre/Zafim/ae和Sorre7/as/zj/ca,以及最優(yōu)選狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或嘎氏疏螺旋體引起的感染。39.用于鑒定能夠結(jié)合權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)定義的蛋白質(zhì)、免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段的拮抗劑的方法，包括a)在能夠反應(yīng)候選拮抗劑與所述蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段結(jié)合的而提供可檢測(cè)信號(hào)的組分存在的情況下，將權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)中定義的分離的或固定的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段在允許候選拮抗劑與所述蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段結(jié)合的條件下與所述候選拮抗劑接觸；和b)檢測(cè)反應(yīng)拮抗劑與所述蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段的結(jié)合而產(chǎn)生的信號(hào)的存在或不存在。40.用于鑒定能夠減少或抑制權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)、免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段與其相互作用伴侶的相互作用活性的拮抗劑的方法，包括a)提供權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)定義的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段，b)為所述蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段提供相互作用伴倡，特別地權(quán)利要求30-34中任一項(xiàng)的抗體，c)使所述蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段與所述相互作用伴侶相互作用，從而形成相互作用復(fù)合物，d)提供候選拮抗劑，e)使候選拮抗劑和相互作用復(fù)合物之間發(fā)生竟?fàn)幏磻?yīng)，f)確定候選拮抗劑是否抑制或減少蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段與相互作用伴侶的相互作用活性。41.權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)定義的任何蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段的用途，其用于分離和/或純化和/或鑒定所述蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段的相互作用伴侶。42.用于診斷疏螺旋體屬生物體引起的感染的方法，包括步驟a)將從受試者獲得的樣品與權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)定義的蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原、或其任何片段接觸；和b)檢測(cè)樣品中抗所述疏螺旋體屬生物體的抗體的存在。43.用于診斷疏螺旋體屬生物體引起的感染的方法，所述方法包括步驟a)將從受試者獲得的樣品與對(duì)于權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)定義的核酸分子或其片段是特異性的引物或探針接觸；和b)檢測(cè)樣品中此類核酸分子或其片段的存在。44.用于診斷疏螺旋體屬生物體引起的感染的方法，包括步驟a)將從受試者獲得的樣品與權(quán)利要求30-34中任一項(xiàng)的抗體接觸；和b)檢測(cè)樣品中所述疏螺旋體屬生物體的抗原的存在。45.權(quán)利要求44的方法，其中所述疏螺旋體屬生物體的抗原是權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)定義的蛋白質(zhì)、抗原或超免疫血清反應(yīng)性抗原。46.權(quán)利要求42-45中任一項(xiàng)的方法，其中疏螺旋體屬生物體是病原性疏螺旋體屬生物體，更優(yōu)選選自狹義布氏疏螺旋體、嘎氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體、^rre/Zaa/zc/ers0/7/7、^rre7/a力/^e〃//、5orre/i.s力/o/7/ca、5orre/2'afa/7Z7ir//'、S0rre/2'a"rc^e和_5orre//<3s//H'ca,和甚至更優(yōu)選選自狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺方走體或吸氏疏螺旋體。47.權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)定義的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段在制備功能性核酸中的用途，其中功能性核酸選自適體和鏡像異構(gòu)體。48.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)定義的核酸分子在制備功能性核糖核酸中的用途，其中功能性核糖核酸選自核酶、反義核酸和siRNA。49.用于在優(yōu)選需要其的動(dòng)物或人中治療疏螺旋體屬感染的方法，包括對(duì)所述動(dòng)物或人施用治療有效量的前述權(quán)利要求中定義的藥物組合物或藥物或者權(quán)利要求30-34中任一項(xiàng)定義的抗體的步驟。50.權(quán)利要求49的方法，其中疏螺旋體屬感染是狹義布氏疏螺旋體、嗅氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體、脅re"aa/7cTer麵//、紐re/2.a^/e/zz/a//,Aorre7/s力；70/2/ca、Sorre7/afa/7i/ir/2'、Aorre7/a"rdae4^rre7/aW/2/ca、優(yōu)選狹義布氏疏螺i走體、阿氏疏螺i走體或嗅氏疏螺旋體引起的感染。51.用于免疫動(dòng)物或人以抗疏螺旋體屬生物體引起的感染的方法，包括對(duì)所述動(dòng)物和人施用有效量的權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)定義的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原或、其片段，或者權(quán)利要求l-8中任一項(xiàng)定義的核酸分子或者權(quán)利要求9至10中任一項(xiàng)定義的載體的步驟，其中有效量適合在所述動(dòng)物或人中引發(fā)免疫反應(yīng)。52.權(quán)利要求51的方法，其中疏螺旋體屬生物體選自狹義布氏疏螺旋體、嘎氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體、》0rre//3a/2derso/7//、Sorre/2'as/7/e/yz7a/22.、5orre/2'ays/o"/cs、5orre//afa/7i/h'/、5orre〃afi/rc^e和"0^6//3W//ca、優(yōu)選狹義布氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體或嘎氏疏螺旋體。53.用于在動(dòng)物或人中刺激抗疏螺旋體屬生物體的免疫反應(yīng)的方法，包括對(duì)所述動(dòng)物和人施用有效量的權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)定義的蛋白質(zhì)、超免疫反應(yīng)性血清抗原或抗原、或其片段，或者權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)定義的核酸分子或者權(quán)利要求9-10中任一項(xiàng)定義的載體的步驟，其中有效量適合在所述動(dòng)物或人中刺激免疫反應(yīng)。54.權(quán)利要求53的方法，其中疏螺旋體屬生物體選自狹義布氏疏螺旋體、囁氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體、Sorre"aa/7t/er510/7//、"orre//a57/e/邁a/7/、Aorre7/a力；o/72.ca、"orre/2'afa/7由./、Sorre/2'a^rdae和5orre7/as/zi/cs,優(yōu)選狹義布氏疏螺i走體、阿氏疏螺i走體或嘎氏疏螺旋體。全文摘要本發(fā)明涉及編碼蛋白質(zhì)的分離的核酸分子，編碼超免疫血清反應(yīng)性抗原的分離的核酸分子，包含此類核酸分子的載體，包含此類載體的宿主細(xì)胞，來自疏螺旋體屬物種的超免疫反應(yīng)性抗原，優(yōu)選為超免疫血清反應(yīng)性抗原的蛋白質(zhì)，超免疫血清反應(yīng)性抗原，抗原，用于產(chǎn)生此類蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原的方法、用于產(chǎn)生表達(dá)此類蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原的細(xì)胞的方法，結(jié)合此類蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原的抗體，產(chǎn)生此類抗體的雜交瘤細(xì)胞，用于產(chǎn)生此類抗體的方法，包含此類核酸分子、蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原、抗原或抗體的藥物組合物，此類核酸分子、蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原、抗原或抗體用于制備藥物的用途，用于鑒定能夠減少或抑制此類蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原的相互作用活性的拮抗劑的方法，用于診斷感染的方法和用于治療感染的方法。更特別地此類蛋白質(zhì)、超免疫血清反應(yīng)性抗原或抗原通過引起萊姆病的細(xì)菌性病原體產(chǎn)生或與其或由廣義布氏疏螺旋體引起的細(xì)菌性感染相關(guān)。文檔編號(hào)C07K14/20GK101516905SQ200780033994公開日2009年8月26日申請(qǐng)日期2007年9月14日優(yōu)先權(quán)日2006年9月15日發(fā)明者A·馮加拜因,A·博加克,A·邁因克,B·諾基斯,C·特里斯卡,D·格爾貝曼,E·納吉,U·倫德伯格申請(qǐng)人:英特塞爾股份公司