專利名稱：：登革病毒疫苗組分的開發(fā)的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及在登革病毒血清型1、2、3和4的基因組3'非翻譯區(qū)中的突變，所述突變用在減弱登革病毒疫苗的生長特征中。相關技術的描述存在登革病毒的四種血清型(登革病毒1型[DENl]、DEN2、DEN3和DEN4)，它們每年造成估計五千萬至一億例登革熱和500,000例登革病毒感染的更嚴重形式，公知即登革出血熱/登革休克綜合征(Gubler，D.J.和M.Meltzer1999病毒學研究進展(A/viw)53:35-70)。登革病毒廣泛分布于世界熱帶和亞熱帶地區(qū)并且登革病毒感染病例數(shù)因登革病毒的蚊媒介-埃及伊蚊(j^fesa紹y/^)分布范圍擴大而持續(xù)增加。盡管作為一種再發(fā)疾病，登革病具有重要意義，然而沒有疫苗可用于其控制。免疫接種的目的是通過誘導針對全部四種血清型的長效中和抗體應答而保護免遭登革病毒病影響。需要針對全部四種血清型的同時保護作用，因為疾病嚴重性增加可能在具有針對異型登革病毒的預存抗體的人中出現(xiàn)。這種免疫接種可以用減毒活病毒疫苗經(jīng)濟地實現(xiàn)。登革病毒是屬于黃病毒屬的正義RNA病毒。大約11,000堿基的該病毒基因組含有編碼一種多聚蛋白的單個可讀框，其中所述的多聚蛋白由病毒源和細胞源蛋白酶加工成3種結構蛋白(C、prM和E)和至少7種非結構蛋白(NS)蛋白。登革病毒基因組的兩個末端含有非翻譯區(qū)(UTR)并且完整的基因組構造是5'UTR-C-prM-E誦NSl畫NS2A-NS2B-NS3國NS4A-NS4B-NS5-UTR-3'。3'UTR的長度接近400堿基并且預測其含有在登革病毒血清型中保守的幾個莖環(huán)結構(Brinton，M.A.等.1986病毒學(P7ra/ogy)153:113-121，Hahn,CS.等.1987分子生物學雜志UMo/腺)198:33-41,Proutski,V.等.1997核酸研究(A^c/e/c7es)25:1194-1202，Rauscher,S.等.1997RNA3:779-791,Shurtleff,A.等.2001病毒學(Wra/ogM)281:75-87)。通過從DEN4基因組中缺失30個核苷酸(3'核苷酸第172至143位)而事先除去在所提出的3'UTR二級結構中確定為TL-2(Proutski，V.等.1997核酸研究(Wwc/e/c^c/^i^)25:1194-51202)的一個這種莖環(huán)結構(Men,R.等.1996病毒學雜志UWra/)70:3930-3937)并且此莖環(huán)結構隨后命名為A30突變(Durbin,A.P.等.2001美國熱帶醫(yī)學與衛(wèi)生學雜志(^wJ7h;M^/7^)65:405-413)。與含有完整TL-2序列的親代病毒相比，所得的病毒rDEN4A30證實在獼猴(rhesusmonkey)中弱化并且它在人類中弱化(Durbin，A.R等.2001美國熱帶醫(yī)學與衛(wèi)生學雜志UmJrrapM^/外)65:405-413)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及在3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)中包含突變的登革病毒或嵌合登革病毒，其中所述突變選自由以下所組成的組中(a)除去登革病毒血清型1、2、3和4的每一種中TL-2同源結構的A30突變和除所述A30突變外從3，-UTR中缺失核苷酸，所述缺失以5'方向除去序列最遠至登革病毒血清型1、2、3和4的每一種中TL-3同源結構的5'邊界；和(b)用登革病毒第二血清型的3'-UTR，其任選地含有突變和除所述△30突變外從3，-UTR中缺失核苷酸，對登革病毒第一血清型的3，-UTR的替換；并且涉及免疫原性組合物、誘導免疫應答的方法和制備登革病毒或嵌合登革病毒的方法。圖1.弱化登革病毒的兩種方法。A)(a-c)從(DEN3野生型斯萊曼/78(DEN3wtSleman/78)，SEQIDNO:l)3，-UTR中缺失額外的核苷酸。B)用登革病毒第二血清型的3，-UTR替換登革病毒第一血清型的3'-UTR。圖2-5.每種DEN血清型3'-UTR的TL-1、TL-2和TL-3區(qū)的預測二級結構。顯示用于構建每種二級結構模型的序列的基因庫(GenBank)登錄號。7僅分別使用DENl、DEN2、DEN3和DEN4的包含TL-1、TL-2和TL-3的最末278、281、276和281個核苷酸，以避免所述結構的環(huán)化以及已知并經(jīng)實驗驗證的結構元件隨后錯誤折疊。顯示了對每個結構模型特異的mfold(根據(jù)最小自由能預測RNA二級結構折疊的軟件)程序約束條件(contraints)。圏定并編號劃定主要缺失邊界的核苷酸，核苷酸編號始于3'基因組末端(反向編號系統(tǒng))。圖2-SEQIDNO:2;圖3-SEQIDNO:3;圖4-SEQIDNO:4;圖5-SEQIDNO:5。圖6-9.對登革病毒血清型DEN1、DEN2、DEN3和DEN4的每一種所繪制的A30缺失突變。所述A30突變?nèi)笔Р捎梅聪蚓幪栂到y(tǒng)標明的DEN1的第174-145位核芬酸、DEN2的第173-144位核苷酸、DEN3的第173-143位核苷酸和DEN4的第172-143位核苦酸。缺失的區(qū)域由符號A標出。圖6-SEQIDNO:6;圖7曙SEQIDNO:7;圖8-SEQIDNO:8;圖9-SEQIDNO:9。圖10-13.對登革病毒血清型DEN1、DEN2、DEN3和DEN4的每一種所繪制的A30/31缺失突變。除了缺失包括A30突變的核苷酸之外，所述A31突變?nèi)笔Р捎梅聪蚓幪栂到y(tǒng)標明的DEN1、DEN2、DEN3和DEN4的第258-228位核苷酸。缺失的區(qū)域由符號A標出。圖10-SEQIDNO:10;圖ll-SEQIDNO:11;圖12-SEQIDNO:12;圖13-SEQIDNO:13。圖14-17.對登革病毒血清型DEN1、DEN2、DEN3和DEN4的每一種所繪制的A86缺失突變。所述A86突變?nèi)笔Р捎梅聪蚓幪栂到y(tǒng)標明的DEN1的第228-145位核芬酸、DEN2的第228-144位核苷酸、DEN3的第228-143位核苦酸和DEN4的第228-143位核普酸。缺失的區(qū)域由符號△標出。圖14-SEQIDNO:14;圖15-SEQIDNO:15;圖16-SEQIDNO:16;圖17-SEQIDNO:17。圖18.rDEN3與rDEN4或rDEN4A303，-UTR的嵌合化。A)重組3'-UTR嵌合登革病毒通過用得自rDEN4或rDEN4A30的區(qū)域替換rDEN3的3'-UTR加以構建。A30突變在3'-UTR中的相對位置由箭頭標出。將rDEN3和rDEN4的開放讀碼框(ORF)與UTR之間的接頭分別標記為接頭1和接頭2。也對所得嵌合病毒標出型間接頭3。B)顯示接頭區(qū)的核苷酸和氨基酸序列。對于接頭3，以小寫體(lowercase)顯示用來導入單一T/;a/限制酶識別位點的核苦酸置換。接頭l-SEQIDNO:18(核苷酸)和19(氨基酸)；接頭2-SEQIDNO:20(核苷酸)和21(氨基酸)；接頭3-SEQIDNO:22(核苷酸)和23(氨基酸)。圖19.在Vero細胞和C6/36細胞中的復制。比較四種突變病毒與野生型rDEN3在Vero細胞和C6/36細胞中的復制。75cm2培養(yǎng)瓶的匯合細胞以感染復數(shù)0.01進行感染。每日從培養(yǎng)瓶中取出0.5ml等分試樣，持續(xù)7日。在添加SPG至1x濃度后，樣品在千冰上凍結并貯存在-80。C。在Vero細胞上通過蝕斑測定法對全部樣品測定病毒滴度。纟企測限是1.01og1QPFU/ml(蝕斑形成單位/毫升)。具體實施方式定義除非另外定義，本文中所用技術及科學術語具有如本發(fā)明所述領域的普通技術人員通常所理解的相同意思。參見例如，SingletonP和SainsburyD.，微生4為學與分子生4勿學"^司典(￡)/c"on<3/"yo/Mz'cra6/o/ogy""<iAfo/ecw/ar5fo/ogy)第三版.，J.Wiley&Sons，奇切斯特(Chichester)，紐約(NewYork)，2001和費氏病毒學(Wra/ogy)第四版，KnipeD.M.和HowleyP.M編輯，LippincottWilliams&Wilkins，費城(Philadelphia)2001。術i吾"約"意指在l、2或3個核苷酸范圍內(nèi)。突變登革病毒和嵌合登革病毒本發(fā)明的目的是開發(fā)可以配制成安全、有效和經(jīng)濟的四價登革疫苗的一組型特異性活的減毒登革疫苗組分。所述A30突變在獼猴中弱化DEN4(Men,R.等.1996病毒學雜志(/Kra/)70:3930-3937)。A30突變除去登革病毒血清型1、2、3和4的每一種中的同源結構(TL-2)(圖2-5)。然而發(fā)現(xiàn)厶30突變在獼猴中不弱化DEN3。本發(fā)明的實施方式提供具有一個或多個造成減毒作用的突變的登革病毒和嵌合登革病毒、產(chǎn)生此類登革病毒的方法和使用這些登革病毒以預防或治療登革病毒感染的方法。在本發(fā)明登革病毒中的突變(或諸突變)存在于由病毒RNA的最下游大約384個核苷酸形成的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)中，已經(jīng)證明所述的3'非翻譯區(qū)在決定減毒中發(fā)揮作用。如下文進一步描述本發(fā)明的病毒和方法?？梢杂迷诒景l(fā)明中的一個登革病毒實例是血清型3，斯萊曼/78(Sleman/78)毒抹。本發(fā)明對登革病毒分類群全部成員的適用性通過這樣的觀察結果進行推斷，即，其它登革病毒毒抹的屬性與任何一個登革病毒毒林的屬性相似。登革病毒已經(jīng)劃分為四個血清型(DEN1、DEN2、DEN3和DEN4)。已經(jīng)在四個血清型的每一種中鑒定到眾多毒抹。在表A中提供基因庫(GenBank)登錄號的多個登革病毒毒抹的完整基因組序列。表A.登革病毒毒抹的實例血清型毒林登錄號102-20AB178040116007AF1薩7116007PDK-13AF1畫81259par00AF5148831280par00AF5148781293arg00.AY2064571295arg00AF5函51297arg00AF5148891301arg00AF514876198901518AB讓20198卯1530AB畫211A88AB0747611阿比讓(Abidjan)AF2988071ARG0028AY2776651ARG0048AY2776661ARG9920AY2776641服-90AF2266851BR陽01-MRAF5131101BR-97-111AF3119561BR-97-233AF3119581BR-97-409AF3119571柬埔寨(Cambodia)AF3096411FGA-89AF2266871FGA-NAdldAF2266861FJ231-04DQ1935721GD05-99AY3767381GD23-95AY3734271GZ-80AF3504981Dl-hu-Yap-NllD27-2004AB2048031Dl-H隱IMTSSA-98掘AF2988081望月(Mochizuki)AB0747601Dl.緬甸(Myanmari).059-01AY7080471Dl.緬甸.194-01AY7134741Dl.緬甸.206-01AY7134751zzAY722802<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>可以在野生型感染性克隆，例如登革病毒血清型3，毒抹Sleman/78或其他野生型強毒登革病毒的感染性克隆的3，-UTR中產(chǎn)生突變，并且突變體隨后可以在動物模型系統(tǒng)(例如在小鼠和/或猴模型系統(tǒng))中受到測試以鑒定造成減毒的位點。減毒作用通過例如檢測到降低的病毒血癥進行判定。任選地導入經(jīng)證明弱化野生型病毒的一個或多個額外突變至野生型登革病毒并且在(例如在小鼠和/或猴模型系統(tǒng))中測試這些突變體以確定所得的突變體是否弱化。發(fā)現(xiàn)受到弱化的突變體隨后可以用作新的疫苗毒林，其因減毒作用而具有增加的安全性。除上文所列的病毒外，在本發(fā)明中還包括包含嵌合登革病毒的登革病毒，其中所述的嵌合登革病毒包括一個或多個減毒性突變。這些嵌合體可以由登革病毒第一血清型(即背景登革病毒)組成，在所述登革病毒第一血清型中的一種結構蛋白(或諸結構蛋白)已經(jīng)替換為登革病毒第二血清型的一種相應結構蛋白(或諸結構蛋白)。例如，嵌合體可以由這樣的背景登革病毒組成，在所述背景登革病毒中登革病毒第一血清型的prM和E蛋白已經(jīng)替換為登革病毒第二血清型的prM和E蛋白。所述嵌合病毒可以從登革病毒不同血清型的任意組合中產(chǎn)生。針對其尋求免疫的登革病毒是所插入的結構蛋白的來源。如上提及，在本發(fā)明病毒中被包含的突變是減毒性的。這些突變存在于登革病毒3'-UTR結構中以弱化該病毒。可以使用標準方法如位點定向誘變法在3'-UTR中產(chǎn)生突變。存在于登革病毒3'-UTR結構中的此類型突變的一個實例是置換作用，不過也可以使用其它類型的突變，如缺失和插入。此外，如上提及，所述突變可以單個地存在或在一個或多個額外突變的條件下存在。參照圖1,采用兩種方法來弱化登革病毒。在一個方面，還從3'-UTR中缺失除A30突變之外的核苷酸。在另一方面，登革病毒第一血清型的3'-UTR替換為來自登革病毒第二血清型的3'-UTR(其任選地含有A30突變和除所述△30突變外從3，-UTR中缺失核苷酸)。從3'-UTR中缺失除A30突變之外的核普酸參照圖2-5，使用第一方法，登革病毒的3'-UTR含有多種保守序列基序。在圖5中顯示DEN43'-UTR的序列。DEN4毒抹814669的基因組含有10,646個核苷酸，其中在3，端處最后384個核苷酸是不翻譯(非編碼)的。各種序列組分在該區(qū)域內(nèi)的位置用反向編號系統(tǒng)命名。這些序列包括據(jù)預測形成莖環(huán)1(SL-1)的3'遠端二級結構(核苷酸第1-93位)，其中所述的莖環(huán)l含有末端環(huán)1(TL-1)。核香酸第117-183位形成含有TL-2的莖環(huán)2(SL-2)。核苷酸第201-277位形成部分地含有TL-3的一對莖環(huán)(SL-3)。雖然莖環(huán)1的一級序列在所述登革血清型中是略微不同的，然而其二級結構是嚴格保守的(比較圖2-5)。雖然在SL-2與相鄰SL-I和SL-3之間起到間隔作用的核苦酸在所述登革血清型中是不同的，然而SL-2的整體結構是極保守的。此外，9個暴露的包含TL-2的核苷酸在全部4個血清型中是相同的。正是通過A30突變除去TL-2及其起支撐作用的莖結構(約核苷酸第143-172位)。所述30個核苷酸的除去導致形成預測的新結構元件(SL-2A30)，其具有對每種登革病毒血清型均相同的一級序列和二級結構(比較圖6-9)。圖10-13顯示其中除A30突變之外從3，-UTR中缺失核苦酸的方法。所述A30突變除去登革病毒血清型1、2、3和4的每一種中的TL-2同源結構。除A30突變之外從3'-UTR中缺失核芬酸的方法除去TL-2同源結構及最遠至并任選地包含TL-3同源結構的序列，從而這種缺失延伸最遠至登革病毒血清型1、2、3和4的每一種中TL-3同源結構的5'邊界。在圖10-14內(nèi)所示的方法中，約31個核苦酸的額外缺失導致形成預測的新結構元件(SL-3A31)。參照圖14-17,A86突變除去登革病毒血清型DEN1、DEN2、DEN3和DEN4的每一種中的TL-2同源結構并除去最遠至TL-3同源結構的序列。這種缺失導致形成預測的新結構元件(SL-2A86)。在涉及缺失除A30突變之外的核苦酸的一些實施方式中，對登革病毒基17因組的3'-UTR結構開展核酸缺失以弱化該病毒，同時維持其免疫原性。所述的失包括A30缺失(以示例性方式缺失血清型3Sleman/78毒抹的核苷酸第173-143位或以其相應方式在DEN1、DEN2、DEN3或DEN4的其它毒抹中缺失；編號始于病毒基因組的3'末端)，還包括缺失與所述A30缺失連續(xù)或不連續(xù)的額外3'-UTR序列。所述A30缺失對應于3'-UTR的TL-2結構。實施方式的一種類型，稱作rDENlA30/31、rDEN2A30/31、rDEN3A30/31或rDEN4A30/31,包括原始的八30缺失和同時除去原始TL-2和TL-3結構的非連續(xù)性31個核苦酸缺失。實施方式的另一類型，稱作rDENlA61、rDEN2A61、rDEN3A61或rDEN4A61，包括A30缺失和缺失從所述A30缺失的3'端延伸的31個連續(xù)核苷酸。實施方式的另一類型，稱作rDENlA86、rDEN2A86、rDEN3A86或rDEN4A86，包括A30缺失和缺失從所述A30缺失的5'端延伸的56個連續(xù)核苷酸。對于DEN3而言，如下在表2中顯示^皮構建以含有3'-UTR缺失突變的突變病毒的完整列表。用來自登革病毒第二血清型的3'-UTR對登革病毒第一血清型的3，-UTR的替換使用第二方法，rDEN3的3'-UTR可以替換為rDEN4的3'-UTR，后者任選地含有A30突變和除所述A30突變外從3，-UTR中缺失核苷酸。其它實例包括rDEN3的3'-UTR替換為登革病毒血清型1和2的3，-UTR，后者任選地含有A30突變和除所述A30突變外從3'-UTR中缺失核苷酸。其它實例包括rDENl的3，-UTR替換為登革病毒血清型2、3和4的3，-UTR，后者任選地含有A30突變和除所述A30突變外從3'-UTR中缺失核苷酸；rDEN2的3'-UTR替換為登革病毒血清型1、3和4的3'-UTR，后者任選地含有A30突變和除所述A30突變外從3，-UTR中缺失核苦酸；并且rDEN4的3'-UTR替換為登革病毒血清型1、2和4的3，-UTR，后者任選地含有A30突變和除所述A30突變外從3，-UTR中缺失核苦酸。包含將登革病毒第一血清型的3，-UTR替換為登革病毒第二血清型的3'-UTR的實施方式包括a)rDENl-3'D2、rDENl-3'D2x、rDENl-3'D3、rDENl-3'D3x、rDENl畫3'D4、rDENl-3'D4x;rDENl/2-3，Dl、rDENl/2-3，Dlx、rDENl/2-3'D3、rDENl/2-3'D3x、rDENl/2-3'D4、rDENl/2-3，D4x;rDENl/3-3'Dl、rDENl/3-3，Dlx、rDENl/3-3'D2、rDENl/3-3'D2x、rDENl/3扁3'D4、rDENl/3-3'D4x;rDENl/4-3，Dl、rDENl/4-3，Dlx、rDENl/4-3'D2、rDENl/4-3'D2x、rDENl/4-3'D3、rDENl/4-253'D3x;b)rDEN2-3，Dl、rDEN2-3，Dlx、rDEN2-3'D3、rDEN2-3'D3x、rDEN2-3'D4、rDEN2-3'D4x;rDEN2/l-3，D2、rDEN2/l-3'D2x、rDEN2/l-3'D3、rDEN2/l-3'D3x、rDEN2/l-3'D4、rDEN2/l-3'D4x;rDEN2/3-3，Dl、rDEN2/3-3，Dlx、rDEN2/3-3'D2、rDEN2/3-3'D2x、rDEN2/3-3'D4、rDEN2/3-3，D4x;rDEN2/4-3,Dl、rDEN2/4-3，Dlx、rDEN2/4-3，D2、rDEN2/4-3!D2x、rDEN2/4-3，D3、rDEN2/4-3'D3x;c)rDEN3-3，Dl、rDEN3畫3，Dlx、rDEN3-3，D2、rDEN3-3，D2x、rDEN3-3，D4、rDEN3畫3'D4x;rDEN3/l畫3'D2、rDEN3/l-3，D2x、rDEN3/l-3，D3、rDEN3/l-3'D3x、rDEN3/l-3，D4、rDEN3/l-3'D4x;rDEN3/2-3，Dl、rDEN3/2-3，Dlx、rDEN3/2-3'D3、rDEN3/2-3'D3x、rDEN3/2-3，D4、rDEN3/2-3，D4x;rDEN3/4畫3，Dl、rDEN3/4-3，Dlx、rDEN3/4-3，D2、rDEN3/4-3'D2x、rDEN3/4-3'D3、rDEN3/4-3'D3x;和d)rDEN4-3,Dl、rDEN4畫3，Dlx、rDEN4-3*D2、rDEN4-3'D2x、rDEN4-3'D3、rDEN4-3，D3x;rDEN4/l畫3'D2、rDEN4/l-3，D2x、rDEN4/l-3'D3、rDEN4/l-3'D3x、rDEN4/l-3'D4、rDEN4/l-3，D4x;rDEN4/2-3，Dl、rDEN4/2-3，Dlx、rDEN4/2-3'D3、rDEN4/2-3'D3x、rDEN4/2-3，D4、rDEN4/2隱3，D4x;rDEN4/3-3，Dl、rDEN4/3-3，Dlx、rDEN4/3-3'D2、rDEN4/3-3，D2x、rDEN4/3-3'D4、rDEN4/3-3，D4x;19其中x是表2中所列的突變。產(chǎn)生及使用登革病毒或嵌合登革病毒的方法以使用本領域的標準方法產(chǎn)生本發(fā)明的病毒(包括嵌合病毒)可。例如，可以將與病毒基因組相對應的RNA分子導入宿主細月包，例如Vero細胞，隨后可以從所述宿主細胞(或其上清液)中純化出子代病毒。在這種方法中，將與病毒基因組相對應的核酸分子(例如RNA分子)導入宿主細胞，從細胞已經(jīng)在其中培養(yǎng)的培養(yǎng)基收獲病毒，并且配制所述病毒用于接種目的。本發(fā)明的病毒可以作為主要預防劑在有感染風險的成人或兒童中施用，或可以作為次要藥劑用于治療感染患者。例如，在DEN病毒和嵌合DEN病毒的情況下，疫苗可以用在有DEN病毒感染風險的成人或兒童中，或可以作為次要藥劑用于治療DEN病毒感染的患者?？梢允褂帽景l(fā)明的DEN病毒相關性疫苗和方法加以治療的患者的實例包括(i)在DEN病毒地方性流行地區(qū)的兒童，(ii)外國旅行者，(m)軍方人員和(iv)在DEN病毒流行地區(qū)的患者。此外，可以根據(jù)本發(fā)明治療如此地區(qū)的居民，即已經(jīng)觀察到該疾病正在擴大的地區(qū)(例如，超出斯里蘭卡、東非和拉丁美洲)或可能觀察到本病在將來擴大的地區(qū)。本發(fā)明病毒的配制可以使用在本領域中作為標準的方法實施。用在疫苗制品中的眾多可藥用溶液是熟知的并且可以由本領域技術人員輕易地調(diào)整以用在本發(fā)明中(參見例如，《雷明頓藥物科學》(iemz'"gto"，sP/2am7aceM"ca/5We"ce)(第十八版)，編者A.Gennaro,1990，麥克出版公司(MackPublishingCo.),伊斯頓阿(Eastern)，PA)。所述病毒可以稀釋在生理可接受的溶液，如無菌鹽水、無菌緩沖鹽水或L-15培養(yǎng)基中。在另一個實例中，病毒可以例如作為流體施用和配制，其中所述的流體從登革病毒或嵌合登革病毒感染的細胞培養(yǎng)中收獲。本發(fā)明的疫苗可以使用本領域熟知的方法施用并且所施用的疫苗的適宜量可以由本領域技術人員輕易地確定。例如，本發(fā)明的病毒可以配制成在0.1-1.0ml給藥體積中含有102和107個感染單位(例如蝕斑形成單位或組織培養(yǎng)感染劑量)的將通過例如肌內(nèi)、皮下或皮內(nèi)途徑施用的無菌水溶液。此夕卜，本發(fā)明的疫苗可以在單個劑量中施用，或任選地，施用可以包括使用引導性劑量，隨后例如在施用2-6個月之后使用加強性劑量，如本領域技術人員確定是適合的。任選地，本領域技術人員已知的佐劑可以用在本發(fā)明病毒的施用中?？梢杂脕碓鰪姴《镜拿庖咴缘淖魟┌ɡ缰|體制劑、合成性佐劑如(例如QS21)、胞壁酰二肽、單磷酰脂A或聚磷溱。盡管這些佐劑通常用來增強滅活疫苗的免疫應答，不過也可以與活疫苗一起使用。核酸序列DEN病毒的核酸序列用于設計核酸探針和引物以在樣品或標本中以高靈敏度和高特異性檢測缺失或嵌合性3'-UTR。與缺失或嵌合性3'-UTR相對應的探針或引物可以用來在樣品中一般地檢測缺失或嵌合性3'-UTR的存在，以量化該樣品中缺失或嵌合性3'-UTR的量，或以監(jiān)測用來治療DEN病毒感染的療法的進程。所述核酸及相應氨基酸序列用作實驗室工具以研究機體和疾病并開發(fā)針對該疾病的療法和治療。核酸探針和引物選擇性地與編碼缺失或嵌合性3'-UTR的核酸分子或其互補序列雜交。通過"5'選擇性"或"選擇性地"意指這樣的序列，其與其它核酸不雜交以不妨礙充分檢測所述的缺失或嵌合性3-UTR。因此，在雜交性核酸的設計中，選擇性將取決于樣品中存在的其它組分。雜交性核酸應當與其所雜交的核酸節(jié)段具有至少70%互補性。如本文中核酸描述所用，術語"選擇性雜交"排除偶然的隨機雜交的核酸并且因此具有與"特異性雜交"相同的意思。本發(fā)明選擇性雜交的核酸探針和引物可以與其所雜交的序列的節(jié)段具者至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%和99%互補性，優(yōu)選地85°/。或更大的互補性。本發(fā)明也構思選擇性地與編碼性核酸或該核酸的互補或對立鏈雜交的序列、探針和引物。與核酸的特異性雜交可以伴隨核酸中的微小修飾和置換而進行，只要維持功能性物種-物種雜交能力即可。"探針，，或"引物"意指這樣的或擴增，其中所述探針或引物可以在長度上是約5-100個核苷酸或優(yōu)選約10-50個核苷酸或最優(yōu)選約18-24個核苷酸。本文中提供這樣的分離核酸，其在嚴格條件下與物種特異性核酸選擇性雜交并且應當具有互補于目的序列的至少5個核芬酸，如《分子克隆實-瞼手冊》(^fo/gc"farC/ow'wg:4i:a6omtorvM朋"a/),第二版.，Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，冷泉港實-瞼室(ColdSpringHarborLaboratory),冷泉港(ColdSpringHarbor),NY,1989中描述。所需區(qū)域的至少兩種核酸分子。根據(jù)探針或引物的長度，靶區(qū)域可以在70%在缺失或嵌合性3'-UTR，在雜交性核酸(探針或引物)及與其所雜交的序列之間的互補性程度是至少足以區(qū)分與源自其它機體的核酸雜交的。本發(fā)明的核S臾序列包括起到報告檢測到cDNA擴增子的作用的診斷探針，其中所述的cDNA擴增子通過使用逆轉錄/聚合酴隨反應(RT-PCR)以及為擴增該cDNA擴增子所設計的正向擴增引物和反向擴增引物從病毒基因組RNA模板中擴增。在某些情況下，設計所述擴增引物之一以在該擴增引物3'末端處含有這樣的疫苗病毒特異性突變，其使所述試驗更特異，原因在于引物在靶位點處延伸和后繼擴增將僅在病毒RNA模板含有該特異性突變時才發(fā)生。最近開發(fā)了基于PCR的核酸序列自動檢測系統(tǒng)。廣泛使用泰克曼(TaqMan)測定法(美國應用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystems))。新近開發(fā)的用于診斷性遺傳檢測法的策略利用分子信標(Tyagi和Kramer1996《自然.生物技術》(NatureBiotechnology)14:303-308)。分子信標測定法釆用與TaqMan測定法中所用染料不同的猝滅染料和報告染料。這些檢測系統(tǒng)和其它檢測系統(tǒng)可以由本領域技術人員使用。通過在3'非翻譯區(qū)(UTR)中導入缺失或將DEN3的3'-UTR與DEN4的3'-UTR交換而產(chǎn)生的登革病毒3型(DEN3)疫苗組分存在四種登革病毒血清型(DEN1、DEN2、DEN3和DEN4),它們在超過二十五億人居住的世界熱帶和亞熱帶地區(qū)中傳播(GublerDJ1998臨床微生物學評論(ClinMicrobiolRev)11:480-496)。DEN病毒在至少100個國家呈地方流行并且比任何其它蟲媒病毒造成更多人類疾病。每年，存在估計五千萬至一億例登革熱和數(shù)十萬例登革出血熱/登革休克綜合征(Gubler，D.J.和M.Meltzer1999病毒學研究進展(j&Wn)53:35-70)。DHF/DSS仍是至少8個東南亞國家中兒童入院和死亡的主要病因(世界衛(wèi)生組織(WorldHealthOrganization)1997登革出血熱診斷、治療、預防和控制，第二版(DengueHaemorrhagicFever:Diagnosis,Treatment,PreventionandControl,2ndedition)，WHO,Geneva)。在過去二十年，因四種DEN血清型所致的疾病的發(fā)病率及嚴重性急劇增加，其原因主要是蚊子媒介即埃及伊蚊和白紋伊蚊(j^fey"/6o//"w)地理分布擴大和四種DEN血清型流行性增加(GublerDJ1998臨床微生物學評論(ClinMicrobiolRev)11:480-496)。登革病毒在蚊子至人至蚊子傳播的生活周期中得到維持，而城市環(huán)境中沒有參與該生活周期的其它明顯病毒貯存者(RiceCM,1996黃病毒科:病毒及其復制(Flaviviridae:Thevirusesandtheirreplication.).FieldsBN，KnipeDM,HowleyPM，ChanockRM，MelnickJL，MonathTP,RoizmanB,StrausSE編輯.費氏病毒學(FzW(isWra/ogy).Philadelphia:Lippincott-RavenPublishers,第931-959頁)。黃病毒科成員DEN病毒具有大約直徑40-60nm的球狀病毒粒子，其含有單鏈正義RNA基因組。一個單一多肽^皮病毒蛋白酶和細胞蛋白酶以共翻譯方式加工，產(chǎn)生三種結構蛋白(衣殼蛋白C、膜蛋白M和包膜蛋白E)和至少7種非結構(NS)蛋白。DEN病毒的基因組構造是5'-UTR-C-prM-E-NSl-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-UTR-3'(UTR-非翻譯區(qū)，prM-膜前體)(RiceCM，1996黃病毒科:病毒及其復制(Flaviviridae:Thevirusesandtheirreplication.).FieldsBN，KnipeDM,HowleyPM,Chanock脂，MelnickJL，MonathTP,RoizmanB,StrausSE編輯.費氏病毒學(尸/e/tfeWra/ogy).Philadelphia:Lippincott-RavenPublishers,第931-959頁)。應對于DEN感染的發(fā)病率和嚴重性日益增加，正在尋求開發(fā)疫苗以預防DEN病毒病。一種預防DEN病毒所致疾病的經(jīng)濟性疫苗已經(jīng)成為全球公共健康的優(yōu)先考慮。與針對黃熱病(YF)病毒(另一種蚊孽生的黃病毒)的減毒活疫苗伴隨的成本效益性、安全性和長效性成為開發(fā)DEN病毒減毒活疫苗的可行性才莫型(在PlotkinSA5OrensteinWA編輯《疫苗》中MonathTP，1999"黃熱病"(MonathTP,1999inYellowfever,PlotkinSA5OrensteinWA，eds.Vaccines)費城(Philadelphia):W.B.SaundersCo.,815-879)。此外，有效的日本腦炎(JE)病毒減毒活疫苗在亞洲使用并且針對日本腦炎病毒和蜱傳腦炎病毒的滅活病毒疫苗是可獲得的。迫切需要針對DEN病毒的疫苗，并且開發(fā)23安全和高效DEN病毒疫苗的目標還未達到，盡管付出巨大努力。有效的DEN病毒疫苗必需提供免遭每種血清型影響的保護作用，因為全部四種血清型通常在地方流行地區(qū)傳播并且異源血清型的繼發(fā)感染與疾病嚴重性增加相關。我們已經(jīng)利用兩種策略以產(chǎn)生針對每種血清型的減毒活疫苗組分，后者可以隨后配制成四價制劑(BlaneyJE等.2006病毒免疫學(Wra//附mw"o/).19:10-32)。首先，已經(jīng)使用反向遺傳學導入減毒性30核苷酸缺失(A30)突變至每種DEN血清型的cDNA克隆的3，-UTR內(nèi)(Durbin,AP等.2001美國熱帶醫(yī)學與衛(wèi)生學雜志(Jw/rrapMed//;;)65:405-413;WhiteheadSS等.2003病毒學雜志(JWra/)77:1653-1657;BlaneyJE等.2004美國熱帶醫(yī)學與衛(wèi)生學雜志"wJrra/7M^//^)71:811-821;BlaneyJE等20045MC4:39)。最初，發(fā)現(xiàn)rDEN4A30疫苗組分在獼猴中弱化(表l)并且在人類中的I/II期臨床試驗證實病毒感染導致輕微的病毒血癥，具有強烈的免疫原性并且表現(xiàn)最小的反應原性，未觀察到嚴重副作用(Durbin,A.P.等.2001美國熱帶醫(yī)學與衛(wèi)生學雜志(JTra;M^//^)65:405-413;Durbin等.2005傳染病雜志191:710-718)。最近，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在獼猴中也弱化的rDENlA30疫苗組分(表l)在臨床試驗中也具有與對rDEN4A30所觀察到的相似表型；在20名志愿者中輕^f鼓病毒血癥、強烈免疫原性和最小反應原性(WhiteheadSS等.2003病毒學雜志(/Wra/)77:1653-1657;BlaneyJE等.2006病毒免疫學(Wra//www"o/).19:10-32)。不幸地是，rDEN2A30和rDEN3A30疫苗組分在前臨床試驗期間似乎在獼猴中沒有令人滿意地弱化，并且沒有計劃在人類中測試這些疫苗組分(表1)(BlaneyJE等.2004美國熱帶醫(yī)學與衛(wèi)生學雜志71:811-821;BlaneyJE等.2004BMCInfDis4:39)。因此，用于疫苗開發(fā)的替代策略是通過將減毒rDEN4A30疫苗組分的結構蛋白分別替換為來自產(chǎn)生rDEN2/4A30和rDEN3/4A30疫苗組分的DEN2或DEN3中的那些結構蛋白而生成有抗原性的嵌合病毒(WhiteheadSS等.2003疫苗21:4307-4316;BlaneyJE等.2004美國熱帶醫(yī)學與衛(wèi)生學雜志(v4mJrra;M^/fy)71:811-821)。rDEN2/4A30疫苗病毒已經(jīng)在人類中進行測試并且顯示安全性和強烈免疫原性，同時目前計劃對rDEN3/4A30病毒臨床評估。表1.A30突變對獼猴中四種DEN血清型的影響病毒血癥3病毒表現(xiàn)病毒每只猴子表平均峰值病毒滴度iu血癥的猴現(xiàn)病毒血癥(log10PFUVml±SE)何羊始佶b子％的平均日數(shù)"i參考文獻Whitehead等,病毒學雜志(乂fW)'2003,77:1653Blaney等，SMC/"/2004,4:39Blaney等，美國熱帶醫(yī)學與衛(wèi)生學雜琳2004,71:811Hanley等，疫苗(Fofcd"ei2004,22:3440rDENlrDENlA30rDEN2rDEN2A30rDEN3rDEN3A30rDEN4rDEN4A3010050100100100100畫謂2.80.54.02.82.32.03.02.02.1±0.10.8±0.11.9±0.11.7±0.21.4±0.21.5±0.22.2±0.21.4±0.21,23078017391363265322154a獼猴組用在lml劑量中的5.0logu)PFU所示病毒進行皮下接種。每曰收集血清，持續(xù)10日。在Vero細胞中通過蝕斑測定法測定血清中的病毒滴度。b使用所述野生型病毒在第28日血清上測定蝕斑減少性(60%)中和抗體滴度。顯示幾何平均值的相應稀釋度。這里，我們描述通過遺傳性修飾DEN3cDNA克隆的3'-UTR所產(chǎn)生的DEN3血清型的新疫苗組分(BlaneyJE等.2004美國熱帶醫(yī)學與衛(wèi)生學雜志(」w/7k^MW//;;)71:811-821)。開發(fā)擁有野生型DEN3蛋白質的全套互補物的這些DEN3疫苗組分是重要的，這出于兩個原因。首先，可以在臨床試驗中發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有DEN3疫苗組分rDEN3/4A30是弱化不充分或過度弱化的。其次，針對由DEN3所致疾病賦予保護作用的最佳疫苗可能需要誘導針對全套DEN3蛋白質、而非僅針對M與E的T細胞應答，其中所述的M與E是存在于rDEN3/4A30嵌合病毒中的僅有DEN3序列。為了產(chǎn)生另外的DEN3疫苗組分，把在3'-UTR中包含A30缺失或劃定其邊界的新缺失導入rDEN3cDNA克隆?？蛇x地，將rDEN3cDNA克隆的3'-UTR替換為rDEN4或rDEN4A30的3'-UTR。在組織培養(yǎng)、移植具有HuH-7細胞的SCID小鼠和獼猴中就減毒表型分析活病毒。三種突變病毒(rDEN3A30/31、rDEN3A86和rDEN3-3'D4A30)具有在人類中表明它們可能具有安全性和免疫原性的前臨床表型。rDEN3缺失突變體的產(chǎn)生25我們試圖產(chǎn)生這樣的擴大缺失突變，其包括原始A30(核苦酸第173-143位)突變。表2列出包含原始A30突變的7種缺失突變，包括A50、A61、A80、△86、A116A、A116B和A146。此夕卜,A30/31突變包括原始的A30突變和非連續(xù)型31個核苦酸缺失。也單獨地產(chǎn)生A31突變以辨別A30或A31在A30/31缺失突變組合中的貢獻。在圖4中顯示劃定缺失邊界的核苷酸在預測的DEN33'-UTR二級結構中的位置。此外，在圖8、圖12和圖16中分別顯示預測的rDEN3A30、rDEN3A30/31和rDEN3A86的DEN33'-UTR二級結構。表2.在DEN3Sleman/78的3'-UTR中產(chǎn)生的缺失突變<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>編號始于病毒基因組的3'端使用PCR誘變來導入9個新的缺失突變至DEN3Sleman/78cDNA質粒p3,其中所述的p3先前用來產(chǎn)生rDEN3A30疫苗組分(BlaneyJE等.2004美國熱帶醫(yī)學與衛(wèi)生學雜志(/TrapMedify)71:811-821)。使用p3-frag.4cDNA亞克隆作為PCR反應的模板，所述的PCR反應具有在表3中列出的所示成對誘變性寡核苷酸，而對于A30/31缺失突變則例外，該缺失突變使用p3-frag.4A30cDNA亞克隆作為模板。將PCR產(chǎn)物連接并且用來轉化感受態(tài)細菌細胞。從細菌克隆中分離質粒DNA并且通過測序分析證實春栽適宜的缺失突變。為產(chǎn)生含有所述缺失突變的完整DEN3cDNA質粒，將源自突變p3-frag.4cDNA亞克隆中的Xpw/-」PW/片段(963個核芬酸)導入p3-7164cDNA質粒。此p3-7164質粒編碼先前證明在Vero細胞中增強生長及轉染效率的7164Vero細胞適應性突變(BlaneyJE等.2004美國熱帶醫(yī)學與衛(wèi)生學雜志(爿wJ7Vo;MWi/;;)71:811-821)。證實含有該缺失突變的全長p3質粒含有正確的3'-UTR序列。與DEN3p3質粒cDNA(Genbank#AY656169)相比時，鑒定到在rDEN3A30/31和rDEN3A86病毒中除所設計缺失之外的突變(表4)。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表4.與DEN3p3質粒cDNA(Genbank#AY656169)相比時，除所設計缺失之外在rDEN3A30/31和rDEN3A86病毒中所鑒定到的突變病毒基因核苷酸位置核苷酸置換氨基酸位置氨基酸變化rDEN3A30/31NS4B7164aU—C115Val—AlaNS4B7398C—U193Ala—ValrDEN3A86M512A—G26Lys—GluNS36076C—U521沉默NS4B7164aU—C115Val—AlaNS58623U—C353沉默NS510267bA—U末端(END)末端~>Tyr3'-UTR10455G—C——一7164突變是設計至cDNA構建體的Vero細胞適應突變。b在該核苷酸位置(A—A/U)處存在混合群體，其中所述的A—A/U把位于NS5末端處的終止密碼子(UAA)變成編碼Tyr的UAU。這使NS5延長2個氨基酸(Tyr-Thr-End),原因在于終止密碼子仍存在于核苷酸第10271-10273位處。為回收病毒，從cDNA質粒中體外合成5'-加帽的RNA轉錄物并使其轉染至Vero細胞或C6/36細胞。在轉錄并產(chǎn)生感染性病毒之前，接頭序列通過用消化而從cDNA質粒中除去。質粒隨后通過連接作用再環(huán)化、用Jcc<551(尺;wl的同切點酶，其切割留下僅單個3，核苦酸)線性化并使用SP6聚合酶進行體外轉錄。純化的轉錄物隨后轉染至Vero或C6/36細胞。在C6/36細胞中成功回收到編碼九種突變A30/31、A31、A50、A61、細、A86、A116A、A116B和A146中每種突變的重組病毒，而在Vero細胞中僅回收到rDENA31。rDEN3缺失突變病毒隨后在Vero細胞中傳代一次，爾后在Vero細胞中通過終點稀釋法進行生物學克隆?？寺〉牟《倦S后在Vero細胞中傳代2至7次，目的是達到視為足夠為經(jīng)濟性(cost-effective)生產(chǎn)創(chuàng)造條件的至少6.0log1GPFU/ml的貯存滴度。發(fā)現(xiàn)盡管3種重組病毒(rDEN3A50、rDEN3AU6A和rDEN3A146)有活力，然而它們在Vero細胞中的復制極有限。因此，這三種病毒不進行深入研究。測定達到至少6.01ogK)PFU/ml峰值病毒滴度的剩余6種缺失突變病毒的3'-UTR的遺傳序列。對rDEN3A61、rDEN3A80、rDEN3A86和rDEN3A30/31找到了具有適宜缺失的正確3'-UTR序列。然而發(fā)現(xiàn)兩種突變病毒含有額外的缺失或突變并且認為潛在具有不穩(wěn)定基因型。首先，rDEN3A31具有核苷酸第258-228位的正確3'-UTR缺失，不過還含有核苷酸第222-198位的一個25核苷酸缺失。其次，rDEN3Al16B具有核苷酸第258-143位的正確3'-UTR缺失，不過還含有核苷酸第430-423位的一個8核苦酸缺失和在核苦酸第265位處的單一A—G置換。伴隨這些病毒的潛在遺傳不穩(wěn)定性取消了它們作為疫苗組分的用途，從而這些病毒不進行深入研究。因此，在構建的9個原始缺失體中，發(fā)現(xiàn)4種突變病毒rDEN3A61、rDEN3A80、rDEN3A86和rDEN3A30/31在Vero細胞中高效復制并且對它們進一步研究。產(chǎn)生帶有來自rDEN4或rDEN4A30中的3'-UTR的rDEN3嵌合病毒使用另一種策略來產(chǎn)生新的rDEN3疫苗組分，即用rDEN4或rDEN4A30的3'-UTR替換rDEN3cDNA克隆的3'-UTR(圖18A)。設計3'-UTR嵌合病毒-rDEN3-3'D4A30作為四價制劑中所包含的疫苗組分，其中所述的四價制劑在全部四種血清型中共享A30缺失突變。設計rDEN3-3，D4病毒以區(qū)分3'-UTR嵌合化和A30突變對所觀察任意表型的貢獻。p3-3'D4A30質粒如下產(chǎn)生。首先，使用PCR誘變來導入限制位點至p3-frag.4cDNA亞克隆(圖18B)。將PCR產(chǎn)物連接并且用來轉化感受態(tài)細菌細胞。從細菌克隆中分離質粒DNA并通過測序分析證實適宜缺失突變的存在。為導入rDEN4A303'-UTR至p3-FragA(H/al)cDNA亞克隆，使用正向引物(5'-AACAACAACAAACACCAAAGGCTATTG-3,,SEQIDNO:32)和反向引物(5'畫CCTACCGGTACCAGAACCTGTTG-3'，SEQIDNO:33)，通過PCR擴增包含p4A303'-UTR的含364個核苷酸的片段。為產(chǎn)生p3-frag.4-3'D4A30cDNA亞克隆，將7/;al-J^"I片段從p3-frag.4(//;al)中除去并且替換為已經(jīng)由切割的p4A303，-UTRPCR片段。將p3-frag.4-3，D4A30的尸Wl-《;"I片段導入p3質粒以產(chǎn)生全長cDNA克隆p3-3'D4A30。證實3'-UTR和NS5接頭的序列是正確的。為產(chǎn)生p3-3'D4，將A30缺失突變的缺失核苷酸導入p3-frag.4-3'D4A30亞克隆。筒而言之，將p3-frag.4-3'D4A30中包含A30區(qū)的Mwl-《;wl片段替換為p4的相應片段以產(chǎn)生質粒p3-frag.4-3'D4。為產(chǎn)生全長p3基因組，將p3的尸Wl-i^wI片段替換為p3-frag.4-3'D4的相應片段。確定p3-3'D4質粒的3'-UTR序列是正確的并且該序列含有A30突變丟失的30個核苷酸。為回收病毒，從cDNA質粒中體外合成5'-加帽的RNA轉錄物并使其轉染至Vero細胞或C6/36細胞。在轉錄并產(chǎn)生感染性病毒之前，接頭序列通過用印el消化而從cDNA質粒中除去。質粒隨后通過連接作用再環(huán)化、用乂cc651(尺/"I的同切點酶，其切割留下僅單個3'核苷酸)線性化并使用SP6聚合酶進行體外轉錄。純化的轉錄物隨后轉染至Vero或C6/36細胞。在C6/36細胞和Vero細胞中回收到rDEN3-3'D4而在Vero細胞中僅可以回收到rDEN3-3'D4厶30。突變病毒隨后在Vero細胞中傳代一次，爾后在Vero細胞中通過終點稀釋法進行生物學克隆。rDEN3-3'D4和rDEN3-3'D4A30隨后在Vero細胞中分別傳代4次或6次。發(fā)現(xiàn)NS5-3'-UTR接頭和3'-UTR的遺傳序列對于rDEN3-3'D4和rDEN3-3'D4A30均是正確的。因此這兩種病毒均進行深入研究。與DEN3p3質粒cDNA克隆(5'-UTR和基因)和DEN4p4cDNA克隆相比，在DEN3-3，D4A30病毒中也鑒定到突變(表5)。表5.與DEN3p3質粒cDNA克隆(5'-UTR和基因)和DEN4p4cDNA克隆(3'-UTR)相比的在rDEN3-3D4A30病毒中的突變病毒基因核苷酸位置核苷酸置換氨基酸位置氨基酸變化rDEN3-3'D4雄C250U—C52沉默NS35899U—c462沉默NS4Ba7164U—c115Val—Ala3'-UTR10534A—G———29a7164突變是設計至cDNA構建體中的Vero細胞適應突變。DEN3突變病毒在SCID-HuH-7小鼠中的復制發(fā)現(xiàn)四種缺失突變病毒(rDEN3A30/31、rDEN3A61、rDEN3A80和rDEN3A86)在Vero細胞中復制至高滴度并且證實具有正確3'-UTR序列，并且首先在SCID-HuH-7小鼠中評價rDEN3-3'D4和rDEN3-3'D4A30病毒。比較rDEN3-3'D4和rDEN3-3'D4A30以確定3'-UTR嵌合化和通過A30突變賦予的任何其它減毒作用對復制的影響。SCID-HuH-7小鼠含有HuH-7人肝癌細胞系的實體腫瘤并且在這種小鼠模型中的病毒復制分析充當在人肝臟中DEN病毒復制分析的代用品。眾多DEN病毒突變病毒已經(jīng)通過在SCID-HuH-7小鼠中評價進行鑒定(BlaneyJE等.2002病毒學(Fra/ogy)300:125-139;Hanley等.2004疫苗(Vaccine)22:3440-3448;BlaneyJE等.2006病毒免疫學(Kra//mmw"o/).19:10-32)。該小鼠模型提供這樣的原始證據(jù)，即與親代病毒rDEN3相比，rDEN3A30病毒未弱化，而與野生型親代病毒相比時，抗原性嵌合病毒rDEN3/4A30在SCID-HuH-7小鼠中的復制受限制大約100倍(BlaneyJE等.2004美國熱帶醫(yī)學與衛(wèi)生學雜志MmjrrapM^///7)71:811-821)。為SClD-HuH-7小鼠中的病毒復制分析，4-6周齡SCID小鼠(Tac:Icr:Ha(ICR)-/V/c/cscid)(TaconicFarms)用含有組織培養(yǎng)中所增殖的107個HuFJ-7細胞的0.1mL磷酸鹽緩沖鹽水進行腹膜內(nèi)注射。在移植后5-6周于腹膜內(nèi)檢測到腫瘤并且攜帶腫瘤的小鼠通過直接用50^1Opti-MEMI中的104PFU病毒直接接種至腫瘤而感染。血清在感染后第7曰從感染小鼠中收集并且冷凍在-80。C。在Vero細胞中通過蝕斑測定法測定病毒滴度。如表6中所示，野生型DEN3Sleman/78復制到近乎106'9PFU/ml的平均峰值病毒滴度。雖然對6種突變病毒均觀察到降低的復制水平，然而復制的差異不是統(tǒng)計顯著的。不過，與野生型DEN3病毒相比，rDEN3A86和rDEN3-3，D4A30在復制方面受限大于10倍，而rDEN3A30/31的復制受限略微低于10倍?；谶@個主觀臨界值，選擇這三種病毒進一步評價。著重指出的是與野生型rDEN4病毒相比，發(fā)現(xiàn)rDEN4A30病毒在SCID-HuH-7小鼠中的復制僅受限6倍，其中所述的rDEN4A30病毒在人類中具有充分表征的減毒作用和無反應原性表型(Hanley等.2004疫苗(Vaccine)22:3440-3448)。表6.突變DEN3病毒在HuH-7-SCID小鼠中的復制<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>1HuH-7-SCID小鼠組用4.0log1QPFU的所示病毒接種至腫瘤。在第7日收集血清并且在Vero細胞中測定病毒滴度。因為rDEN3-3'D4A30病毒和rDEN3A30/31與rDEN3A86病毒編碼DEN3全套結構蛋白和非結構蛋白，故期望它們誘導完全互補的體液免疫與細胞免疫。與僅編碼DEN3結構蛋白的嵌合性rDEN3/4A30誘導的免疫誘導作用相比，這種更完整的免疫誘導作用是有利的。DEN3突變病毒在組織培養(yǎng)中的復制在Vero細胞和蚊子C6/36細胞中評估rDEN3A30/31和rDEN3A86缺失突變病毒以及具有或沒有A30的rDEN3-3'D4病毒的病毒復制水平。在Vero細胞中分析復制，因為這些細胞是生產(chǎn)基礎，而在C6/36細胞中評估生長，因為在這些蚊子細胞中的減毒表型可以與充當DEN病毒傳播^(某介的伊蚊中的受限復制關聯(lián)(Hanley等，2003病毒學(Wra/ogy)312:222-232)。生長動力學如下評價。75cn^培養(yǎng)瓶中Vero細胞和C6/36細胞的匯合細胞以感染復數(shù)O.Ol進行感染。每曰取出0.5ml組織培養(yǎng)上清液的等分試樣，持續(xù)7日，與SPG穩(wěn)定劑合并并且冷凍在-8(TC。通過蝕斑測定法在Vero細胞上測定全部樣品的病毒滴度。所述蝕斑測定法的檢測限是1.01og1GPFU/ml。在圖19中顯示每種病毒在這兩種細胞系中的復制動力學。在Vero細胞中，rDEN3A30/31、rDEN3八86和rDEN3-3'D4A30復制到接近于野生型rDEN3的峰值水平，并且具有與野生型rDEN3相似的動力學。這三種疫苗組分達到6.5-6.7log1QPFU/ml的峰值病毒滴度，其中所述的峰值病毒滴度表明制造全部這些病毒中每一種的可行性。在Vero細胞中，rDEN3-3'D4病毒復制到7.8logl。PFU/ml的峰值滴度，該峰值滴度比觀察到的野生型rDEN3峰值滴度高幾31乎100倍，表明并入DEN43'-UTR可以增進在Vero細胞中的復制。這也可能歸因于rDEN3-3'D4病毒更有效地適應Vero細胞。rDEN4復制到大約8.0Iog1QPFU/ml的峰值滴度，該峰值滴度表示此嵌合病毒實現(xiàn)不超過它的兩個親代病毒中任何一種親代病毒的峰值滴度(BlaneyJE等.2006病毒免疫學(Wra/7mwwwo/).19:10-32)。對C6/36細胞中病毒復制的分析證實rDEN3A86和rDEN3-3'D4A30達到比野生型rDEN3病毒的峰值病毒滴度6.9Iog1GPFU/ml低大約IO倍的峰值滴度(圖19)。rDEN3-3'D4病毒復制到與所觀察到的野生型rDEN3峰值滴度相似的峰值滴度。最令人震驚的結果是在C6/36細胞中觀察到的rDEN3A30/31病毒復制缺乏。在第1曰后，在來自用rDEN3A30/31病毒感染的C6/36細月包的培養(yǎng)基中未4企測到病毒，盡管在Vero細胞中觀察到高效復制。這些結果在第二獨立生長曲線實驗中得到證實并且顯示組織培養(yǎng)中的宿主范圍減毒表型，其中所述的宿主范圍減毒表型也被認為在蚊子中與減毒表型相伴。DEN3突變病毒在獼猴中的復制和免疫原性基于SCID-HuH-7小鼠中輕微減毒和在Vero細胞中高效生長，在獼猴中評價rDEN3A30/31、rDEN3A86和rDEN3-3'D4A30。就病毒血癥水平和持續(xù)期、中和抗體誘導和賦予免受野生型DEN3病毒攻擊的保護作用方面比較所述突變病毒與野生型DEN3。還評價具有或沒有A30突變的rDEN3-3'D4病毒以區(qū)分3'-UTR嵌合化對減毒作用的貢獻。在獼猴中的減毒表型通常是臨床試驗中疫苗組分安全性的有力指示物，所述的疫苗組分包括rDEN4A30,rDENlA30和rDEN2/4A30(BlaneyJE等.2006病毒免疫學(Wra//附附w"o/).19:10-32)。用1()SPFU的所示病毒(表7)皮下接種含四只獼猴的組。兩只獼猴用病毒稀釋劑進行模擬感染。為檢測病毒血癥，血清在第0-8日和第10日收集并且冷凍在-80。C。通過蝕斑測定法在Vero細胞中測定血清中的病毒滴度。在第28日收集血清以檢測針對DEN3的中和抗體。使用蝕斑減少中和測定法，在Vero細胞中測定針對野生型DEN3病毒的中和抗體水平。在感染后第35曰，通過皮下感染105PFUDEN3野生型病毒而對全部猴子激發(fā)。血清在第0-8日和第10日收集并且冷凍在-80。C。在Vero細胞中通過蝕斑測定法測定血清樣品中的病毒滴度。32表7.rDEN3突變病毒在獼猴中的復制和免疫原性血清中和抗體滴度(稀激發(fā)后4表現(xiàn)病毒每只？子表平均錢病毒Jpw的幾何平均-SE)哲a。癥的猴子％(log10pfli/ml病毒1猴子數(shù)目SE)DEN3(Sleman/78;)41003.51.8±0.1<52530<1.0rDEN3A30/31400<1.0<53040<1.0rDEN3A86400<1.0<52240<1.0rDEN3-3'D44751.51.3±0.2<52290<1.0rDEN3-3'D4A30400<1.0<5770<1.0模擬感染200<1.0<5<51001.8士0.24彌猴組在第0日用lml劑量中的5.0logK)PFU的所示病毒皮下接種。血清在第0-8日和第10日每日收集并在第28日收集-次。2通過蝕斑測定法在Vero細胞中測定血清中的病毒滴度。3使用DEN3(Sleman/78)測定蝕斑減少性(60%)中和抗體滴度。4猴子在35日后皮下施用在lml劑量中含有5.01ogK)PFU的DEN3(Sleman/78)進行攻毒。血清在第0-8日和第10日每日收野生型DEN3Sleman/78病毒在獼猴中復制到1.8log1()PFU/ml血清的平均峰值病毒滴度，同時全部猴表現(xiàn)病毒血癥(表7)。這些結果與先前在獼猴中對DEN3的研究相一致(BlaneyJE等.2004美國熱帶醫(yī)學與衛(wèi)生學雜志(/TrapMW//y)71:811-821)。在用三種疫苗組分rDEN3A30/31、rDEN3A86或rDEN3-3'D4A30中任意種組分感染的任何猴子中未檢測到病毒血癥，這顯示在獼猴中對全部這些病毒的清晰減毒表型。有趣的是，在75%的猴子中檢測到rDEN3-3'D4病毒，平均峰值病毒滴度是1.31og!。PFU/ml血清，這表明A30突變的存在對于弱化3'-UTR嵌合病毒是必需的。盡管缺少可檢測性病毒血癥，在用rDEN3A30/31和rDEN3A86感染的猴子中的平均中和抗體水平達到與野生型DEN3病毒的平均中和抗體水平1:253相似的水平(表7)。相反，rDEN3-3'D4A30病毒誘導比DEN3低三倍的平均中和抗體水平。然而，用每種疫苗組分免疫的100%猴子發(fā)生如感染后血清中和抗體水平上升四倍或更高倍所定義的陽轉。因此，盡管缺少可檢測性病毒血癥，然而認為全部猴子受每種疫苗組分感染。測定用DEN3病毒攻毒后血清中的病毒滴度表明，用每種疫苗-組分免疫接種誘導免受可檢測性病毒血癥影響的完全保護，如給定觀察到的中可抗體水平所預期的那樣。在蚊子中的復制在安汶巨蚊(7bxoo;"c/2/tesam6o/"e"a^)中研究rDEN3和rDEN3A30/31的復制。胸內(nèi)接種試驗病毒的連續(xù)10倍稀釋物如先前描述那樣(TroyerJ.M.等2001美國熱帶醫(yī)學與衛(wèi)生學雜志(Jw/rra;M^///y)65:414-9)進行。在14日潛伏期后，分離蚊子頭部并將其在稀釋劑中勻漿。在蚊子頭部勻漿中的病毒滴度通過蝕斑測定法在Vero細胞中測定?；趓DEN3A30/31在獼猴中弱化及其在C6/36蚊子細胞中復制受限，就高度敏感性安汶巨蚊中的感染性和復制水平方面比較rDENA30/31與野生型rDEN3(表8)。病毒的連續(xù)10倍稀釋物作胸內(nèi)接種并且通過14日潛伏期后在蚊子頭部勻漿上開展蝕斑測定法而評估感染頭部組織的能力。rDEN3和rDENA30/31的感染性是極相似的，因為50%蚊子感染劑量對于這兩種病毒均是大約1013PFU(表8)。然而，rDENA30/31在感染蚊子的頭部中的復制水平降低約5倍至50倍。這種降低在測試的1023和10"劑量上是顯著的。此項研34究結果表明盡管通過胸內(nèi)感染，rDEN3A30/31對巨蚊的感染性與野生型DEN3對巨蚊的感染性相似，然而存在對巨蚊中由A30/31突變賦予的復制水平的統(tǒng)計顯著性限制。表8.rDEN3和rDEN3A30/31在安汶巨蚊中的復制病毒劑量a(log10PFU)測試數(shù)目感染b%平均病毒滴度e(1og,oPFU/蚊子頭部)與相同劑量wt病毒^J比的P務低(logw)rDEN3wt2.320904.2±0.1d1.319534.2±0.1e0.317184.3士0.3rDEN3A30/312,312832.7±0.3d1.51,316443.1±0.3e1.10.38133.6±0.00.7a在0.2^1接種物中胸內(nèi)施用的病毒滴度b通過在Vera細胞中對蚊子頭部勻漿的蝕斑測定法測定接種后第14日具有可檢測性病毒的蚊子的百分數(shù)。M又使用病毒呈陽性的蚊子頭部的值進行計算d對于IO"PFU劑量的rDEN3和rDEN3A30/31，平均病毒滴度是顯著差異的，如Tukey-Kramerpost-hoc檢驗確定(P<0.001)。e對于10UPFU劑量的rDEN3和rDEN3A30/31，平均病毒滴度是顯著差異的，如Tukey-Kramerpost-hoc檢驗確定(P<0.005)。*氺爾盡管為清晰和理解目的，已經(jīng)以一定的詳細程度描述了本發(fā)明，然而本領域技術人員理解可以產(chǎn)生形式和細節(jié)的眾多變化而不脫離本發(fā)明的真正范圍。全部圖形、表格和附注以及以上引用的專利、申請和出版物因而通過引用的方式并入。權利要求1.一種登革病毒或嵌合登革病毒，其包含在3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)中的突變，所述的突變選自以下所組成的組中(a)除去登革病毒血清型1、2、3和4的每一種中TL-2同源結構的Δ30突變和除所述Δ30突變外從3′-UTR中缺失核苷酸，所述缺失以5′方向除去序列最遠至登革病毒血清型1、2、3和4的每一種中TL-3同源結構的5′邊界；和(b)用登革病毒第二血清型的3′-UTR，其任選地含有Δ30突變和除所述Δ30突變外從3’-UTR中缺失核苷酸，對登革病毒第一血清型的3′-UTR進行替換。2.根據(jù)權利要求1所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其中，所述的突變是(a)。3.根據(jù)權利要求2所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其中，所述的突變除去TL-2同源結構，并且以與所述A30突變連續(xù)的連續(xù)方式除去至多到和包含TL-3同源結構的序列。4.根據(jù)權利要求3所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其中，所述的突變是A86突變，從而所述的A86突變?nèi)笔Р捎梅聪蚓幪栂到y(tǒng)標明的DEN1的約228至約145位核苷酸、DEN2的約228至約144位核苷酸、DEN3的約228至約143位核苦酸和DEN4的約228至約143位核苦酸。5.根據(jù)權利要求4所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其中，所述的血清型是DEN3。6.根據(jù)權利要求2所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其中，所述的突變以與所述A30突變不連續(xù)的非連續(xù)方式除去TL-2同源結構和TL-3同源結構二者。7.根據(jù)權利要求6所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其中，所述的突變是A30/31突變，從而所述的A30突變?nèi)笔Р捎梅聪蚓幪栂到y(tǒng)標明的DEN1的約174至約145位核苦酸、DEN2的約173至約144位核苦酸、DEN3的約173至約143位核苷酸和DEN4的約172至約143位核苷酸，并且所述的A31突變?nèi)笔Р捎梅聪蚓幪栂到y(tǒng)標明的DEN1的約258至約228位核苷酸、DEN2的約258至約228位核苷酸、DEN3的約258至約228位核苷酸和DEN4的約258至約228位核苷酸。8.根據(jù)權利要求7所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其中，所述的血清型是DEN3。9.根據(jù)權利要求1所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其中，所述的突變是(b)。10.根據(jù)權利要求9所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其中DEN1的3'-UTR替換為登革病毒血清型2、3或4的3'-UTR，DEN2的3'-UTR替換為登革病毒血清型1、3或4的3'-UTR，DEN3的3'-UTR替換為登革病毒血清型1、2或4的3'-UTR或者DEN4的3'-UTR替換為登革病毒血清型1、2或3的3'-UTR。11.根據(jù)權利要求IO所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其還包含所述A30突變。12.根據(jù)權利要求10所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其還包含所述A30突變和除所述A30突變外/人3'-UTR中缺失核香酸。13.根據(jù)權利要求9所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其中，DEN3的3'-UTR替換為登革病毒血清型1、2或4的3'-UTR。14.根據(jù)權利要求13所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其還包含所述A30突變。15.根據(jù)權利要求13所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其還包含所述A30突變和除所述A30突變外從3'-UTR中缺失核芬酸。16.根據(jù)權利要求9所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其選自以下所組成的組中a)rDENl-3'D2、rDENl-3'D2x、rDENl-3'D3、rDENl畫3'D3x、rDENl-3'D4、rDENl-3'D4x;rDENl/2-3，Dl、rDENl/2-3'Dlx、rDENl/2-3'D3、rDENl/2-3'D3x、rDENl/2-3'D4、rDENl/2-3'D4x;rDENl/3-3，Dl、rDENl/3-3'Dlx、rDENl/3-3'D2、rDENl/3-3'D2x、rDENl/3-3'D4、rDENl/3-3'D4x;rDENl/4-3，Dl、rDENl/4畫3，Dlx、rDENl/4-3'D2、rDENl/4畫3'D2x、rDENl/4-3'D3、rDENl/4-3'D3x;b)rDEN2-3，Dl、rDEN2-3，Dlx、rDEN2-3'D3、rDEN2-3'D3x、rDEN2-3'D4、rDEN2-3'D4x;rDEN2/l-3'D2、rDEN2/l-3'D2x、rDEN2/l-3'D3、rDEN2/l-3'D3x、rDEN2/l國3'D4、rDEN2/l-3'D4x;rDEN2/3-3Dl、rDEN2/3-3，DlxrDEN2/3誦3'D4、rDEN2/3-3'D4x;.rDEN2/4畫3，DlxrDEN2/4-3'D3x;、rDEN3-3，Dlx、rDEN3-3'D2、rDEN3-3'D2x、rDEN3-3'D4、rDEN2/4-3，DlrDEN2/4-3'D3、c)rDEN3-3，DlrDEN3-3,D4x;rDEN3/l-3'D2rDEN3/l畫3'D4、rDEN3/2-3，DlrDEN3/2-3，D4、rDEN3/4國3，DlrDEN3/4-3'D3、d)rDEN4畫3，DlrDEN4-3'D3x;rDEN4/l-3'D2rDEN4/l-3'D4、rDEN4/2畫3，DlrDEN2/3-3'D2、rDEN2/3-3'D2x、rDEN2/4-3'D2、rDEN2/4-3'D2x、rDEN3/l畫3'D2x、rDEN3/l-3，D3、rDEN3/l國3，D3x、rDEN3/l-3'D4x;.rDEN3/2-3，Dlx、rDEN3/2國3'D3、rDEN3/2-3'D3x、rDEN3/2-3'D4x;.rDEN3/4-3，Dlx、rDEN3/4畫3'D2、rDEN3/4-3，D2x、rDEN3/4-3'D3x;和、rDEN4-3，Dlx、rDEN4-3，D2、rDEN4-3'D2x、rDEN4-3，D3、rDEN4/l-3'D3、rDEN4/l畫3'D3x、rDEN4/l-3'D2xrDEN4/l-3'D4x;rDEN4/2-3,DlxrDEM4/2國3'D4、rDEN4/2-3'D4x;rDEN4/3-3，Dl、rDEN4/3-3'DlxrDEN4/3-3'D4、rDEN4/3-3'D4x;其中x是表2中所列的突變。17.—種免疫原性組合物，其包含權利要求1-16中任一項所述的登革病rDEN4/2-3'D3、rDEN4/2-3'D3x、rDEN4/3-3'D2、rDEN4/3-3'D2x、毒或嵌合登革病毒。18.根據(jù)權利要求17所述的免疫原性組合物，其對于登革血清型l、2、3和4是四價的。19.一種在患者中誘導針對登革病毒的免疫應答的方法，其包括向患者給藥權利要求17所述的免疫原性組合物以誘導針對登革病毒的免疫應答。20.—種產(chǎn)生登革病毒或嵌合登革病毒的方法，其包括導入突變至3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)，所述的突變選自以下所組成的組中(a)除去登革病毒血清型1、2、3和4的每一種中TL-2同源結構的A30突變和除所述A30突變外從3'-UTR中缺失核苷酸，所述缺失以5'方向除去序列最遠至登革病毒血清型1、2、3和4的每一種中TL-3同源結構的5'邊界；和(b)用登革病毒第二血清型的3'-UTR，其任選地含有A30突變和除所述A30突變外從3'-UTR中缺失核苷酸，對登革病毒第一血清型的3'-UTR進行替換。全文摘要本發(fā)明涉及在3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)中包含突變的登革病毒或嵌合登革病毒，其中所述突變包括除去登革病毒血清型1、2、3和4的每一種中TL-2同源結構的Δ30突變和除所述Δ30突變外從3′-UTR中缺失核苷酸，所述缺失以5′方向除去序列最遠至登革病毒血清型1、2、3和4的每一種中TL-3同源結構的5′邊界；或用登革病毒第二血清型的3′-UTR，其任選地含有Δ30突變和除所述Δ30突變外從3′-UTR中缺失核苷酸，對登革病毒第一血清型的3′-UTR的替換；并且涉及免疫原性組合物、誘導免疫應答的方法和產(chǎn)生登革病毒或嵌合登革病毒的方法。文檔編號C07H21/04GK101657463SQ200780034189公開日2010年2月24日申請日期2007年8月15日優(yōu)先權日2006年8月15日發(fā)明者布賴恩·R.·墨菲,斯蒂芬·S.·懷特黑德,約瑟夫·E.·布萊尼申請人:美國國有健康與人類服務部(馬里蘭州)