專利名稱：：改良的重組人類精氨酸i表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及人類精氨酸酶I的克隆。特別地，本發(fā)明涉及對應(yīng)于所述人類精氨酸酶I的核酸分子和質(zhì)粒。本發(fā)明還涉及一種用以表達(dá)所述人類精氨酸酶I的重組蛋白的大腸桿菌。本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)重組蛋白的方法。
背景技術(shù)：
：重組工序是利用基因工程生物去生產(chǎn)有醫(yī)藥用途的蛋白。好些例子如胰島素，生長激素和疫苗就是重組工序的產(chǎn)品。上述的蛋白可以在工廠里大量地以大桶的基因工程細(xì)菌來生產(chǎn)。在重組工序中，最普遍使用的生物是大腸桿菌。相比于其它生物，我們大概對于細(xì)菌的生理和基因更為了解得多。然而，一個(gè)工序的成功與否通常依靠所述用基因工程技術(shù)制作的細(xì)菌的存活率和所述帶有重要訊息以制做最后成品的重組脫氧核糖核酸。建構(gòu)差劣的質(zhì)粒可能不能夠產(chǎn)生有意義數(shù)量的成品但同時(shí)降低所述用基因工程技術(shù)制作的細(xì)菌的存活率。而且，亦會有產(chǎn)生難以剔除的污染物和損害最終成品質(zhì)量的風(fēng)險(xiǎn)。
發(fā)明內(nèi)容基于上述原因，本發(fā)明目的是提供一個(gè)更好的基因工程技術(shù)制作的細(xì)菌以生產(chǎn)人類精氨酸酶I，從而擴(kuò)大所述精氨酸酶的產(chǎn)量，令所述方法安全及有效地制造出符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范的材料。因此，在一方面本發(fā)明是一分離并純化的核酸分子用以表達(dá)重組人類精氨酸酶I。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例是使用所述核酸分子以建構(gòu)用以表達(dá)重組人類精氨酸酶I的質(zhì)粒。在另一方面，本發(fā)明是使用所述質(zhì)粒以建構(gòu)一分離品種的大腸桿菌，用以制做重組人類精氨酸酶I。圖1顯示從已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)DH5(a)大腸桿菌細(xì)胞中萃取的質(zhì)粒pET30(+)/ARGC的瓊脂糖電泳分析。萃取后的pET30(+)/ARGC以限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI酶解。預(yù)期中大小為1.4kb和5kb的片段顯現(xiàn)。LaneM:XDNA/EcoRI+Hindm標(biāo)記(MBI);Lanel:以Ndel和Xhol雙重酶解后的pET30a(+)/ARGC;Lane2:未經(jīng)酶解的pET30a(+)/ARGC。圖2顯示包含1,383個(gè)核酸的重組pET30(+)/ARGC中的插入核苷酸序列。圖3顯示從已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)DH5(a)大腸桿菌細(xì)胞中萃取的質(zhì)粒pET30(+)/ARGM的瓊脂糖電泳分析。萃取后的pET30(+)/ARGM以限制性內(nèi)切酶Ndel和Xhol酶解。預(yù)期中大小為lkb和5kb的片段顯現(xiàn)。LaneM:ADNA/EcoRI+Hind111標(biāo)記(MBI);Lanel:以Ndel和Xhol雙重酶解后的pET30a(+)/ARGM;Lane2:未經(jīng)酶解的pET30a(+)/ARGM。圖4顯示包含993個(gè)核酸的重組pET30(+)/ARGM中的插入核苷酸序列，其中包括2套終止密碼子TAA。圖5顯示由pET30a(+)/ARGM的核苷酸序列中的993個(gè)核酸編碼區(qū)域推論出的蛋白序列。所述已表達(dá)的人類精氨酸酶I蛋白是一322氨基酸殘基加上起始的甲硫氨酸和6個(gè)組氨酸標(biāo)記的蛋白，或總共329氨基酸殘基。圖6顯示所述以BL21(DE3)表達(dá)的pAED-4/ARGC的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。LaneM:低分子量蛋白標(biāo)記;Lanel:沒有IPTG誘導(dǎo)的重組人類精氨酸酶I;Lane2:誘導(dǎo)后一小時(shí);Lane3:誘導(dǎo)后2小時(shí);Lane4:誘導(dǎo)后3小時(shí);Lane5:誘導(dǎo)后4小時(shí);Lane6:誘導(dǎo)后5小時(shí)。圖7顯示所述以BL21(DE3)表達(dá)的pET30a(+)/ARGC的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。LaneM:低分子量蛋白標(biāo)記；Lanel:沒有IPTG誘導(dǎo)的重組人類精氨酸酶I;Lane2:誘導(dǎo)后一小時(shí);Lane3:誘導(dǎo)后2小時(shí);Lane4:誘導(dǎo)后3小時(shí);Lane5:誘導(dǎo)后4小時(shí);Lane6:誘導(dǎo)后5小時(shí)。圖8顯示所述以BL21(DE3)表達(dá)的pET30a(+)/ARGM的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。LaneM:低分子量蛋白標(biāo)記;LaneP鄰人類精氨酸酶I;Lanel:沒有IPTG誘導(dǎo)的重組人類精氨酸酶I;Lane2:誘導(dǎo)后一小時(shí);Lane3:誘導(dǎo)后2小時(shí);Lane4:誘導(dǎo)后3小時(shí);Lane5:誘導(dǎo)后4小時(shí);Lane6:誘導(dǎo)后5小時(shí)。具體實(shí)施方式實(shí)施例1:建構(gòu)pET30a(+)/ARGC質(zhì)粒pET30a(+)/ARGC質(zhì)?？捎没蚩寺☆I(lǐng)域中的普通實(shí)驗(yàn)技巧制備。首先，pAED-4/ARGC質(zhì)粒和pET30a(+)質(zhì)粒獨(dú)立地分別以限制性內(nèi)切酶Ndel和Xhol在37°C中酶解過夜。然后，已酶解的片斷與T4DNA連接酶在16°C中混合過夜。所述己連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)DH5(a)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)。在包含30ug/ml卡那霉素的LBplate中進(jìn)行篩選。挑選單一菌落并培養(yǎng)。所述已連接質(zhì)粒以限制性內(nèi)切酶Ndel和Xhol在37°C中酶解一小時(shí)萃取，并以電泳方法核實(shí)。最后，所述已連接并萃取的質(zhì)粒，當(dāng)中包含一pET30(+)骨干和所述人類精氨酸酶基因(包含非編碼序列)被命名為pET30(+)/ARGC。所述核酸序列經(jīng)InvitrogenBiotechnologyCo.，Ltd.(Shanghai)核實(shí)。如圖2所示，所述核酸序列與理論上的序列完全相同，其包含1,383核酸。實(shí)施例2:pET30a(+)/ARGC質(zhì)粒的表達(dá)所述已建構(gòu)的pET30a(+)/ARGC在包含30jag/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)碟中用以轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21(DE3)大腸桿菌細(xì)胞。經(jīng)過12小時(shí)的生長時(shí)間后，挑選單一菌落并轉(zhuǎn)移至50mLLB培養(yǎng)基。所述細(xì)胞在37°C，250rpm中發(fā)酵。當(dāng)OD,是0.6到0.8時(shí)，加入IPTG使?jié)舛冗_(dá)到0.4mM以誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。以SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測試表達(dá)水平。實(shí)施例3:建構(gòu)pET30a(+)/ARGM質(zhì)粒如下所示的兩個(gè)引物(SEQIDNO.l和2)，是設(shè)計(jì)為利用限制性內(nèi)切酶Ndel禾卩Xhol建構(gòu)pET30a(+)/ARGM質(zhì)粒所用1-F:5，-GGAATTCCATATGCATCACCATCACCATCAC-3'2畫R:5，-CCGCTCGAGTTATTACTTAGGTGGGTTAAGGTAGTCAATAG隱3pET30a(+)/ARGM質(zhì)粒可用基因克隆領(lǐng)域中的普通實(shí)驗(yàn)技巧制備。首先，以pAED-4/ARGC質(zhì)粒作為模板用PCR(聚合酶鏈鎖反應(yīng))技術(shù)擴(kuò)增pAED-4/ARGC質(zhì)粒。所述己擴(kuò)增的基因片段和pET30a(+)質(zhì)粒獨(dú)立地分別以限制性內(nèi)切酶Ndel和XhoI在37。C中酶解過夜。然后，已酶解的片斷與T4DNA連接酶在16°C中混合過夜。所述己連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)DH5(a)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)。在包含30ug/ml卡那霉素的LBplate中進(jìn)行篩選。挑選單一菌落并培養(yǎng)。所述已連接質(zhì)粒以限制性內(nèi)切酶Ndel和XhoI在37。C中酶解一小時(shí)萃取，并以電泳方法核實(shí)。最后，所述已連接并萃取的質(zhì)粒，當(dāng)中包含一pET30(+)骨干和所述人類精氨酸酶基因(不包含非編碼序列)被命名為pET30a(+)/ARGM。所述核酸序列經(jīng)InvitrogenBiotechnologyCo.，Ltd.(Shanghai)核實(shí)。如圖4所示，所述核酸序列與理論上的序列完全相同，其包含993核酸。實(shí)施例4:pET30a(+)/ARGM質(zhì)粒的表達(dá)所述已建構(gòu)的pET30a(+)/ARGM在包含30pg/mL卡那霉素的LBplate中用以轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21(DE3)大腸桿菌細(xì)胞。經(jīng)過12小時(shí)的生長時(shí)間后，挑選單一菌落并轉(zhuǎn)移至50mLLB培養(yǎng)基。所述細(xì)胞在37°C，250rpm中發(fā)酵。當(dāng)OD纖是0.6到0.8時(shí)，加入IPTG使?jié)舛冗_(dá)到0.4mM以誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。以SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測試表達(dá)水平。實(shí)施例5:比較以BL21(DE3)大腸桿菌表達(dá)的人類精氨酸酶I的表達(dá)水平圖6顯示以pAED-4/ARGC轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)大腸桿菌細(xì)胞的人類精氨酸酶的表達(dá)水平。顯然，雜質(zhì)高而表達(dá)水平低。圖7顯示以pET30a(+)/ARGC轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)大腸桿菌細(xì)胞的重組人類精氨酸酶的表達(dá)水平。顯然而見，如與以pAED-4/ARGC轉(zhuǎn)化的細(xì)胞比較，其內(nèi)容包含更少純度。雖然如圖6所示，pET30a(+)/ARGC的表達(dá)水平是稍微高于pAED-4/ARGC，但人類精氨酸酶I的產(chǎn)量依然低。圖8顯示以pET30a(+)/ARGM轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)大腸桿菌細(xì)胞的人類精氨酸酶的表達(dá)水平?？梢砸姷?，在三個(gè)質(zhì)粒當(dāng)中，其內(nèi)容是最純凈而表達(dá)水平也是最高的。實(shí)施例6:比較表達(dá)人類精氨酸酶I的BL21(DE3)大腸桿菌的穩(wěn)定性表1，2禾Q3顯示以pAED-4/ARGC，pET30a(+)/ARGC和pET30a(+)/ARGM轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞的生理特征在質(zhì)粒穩(wěn)定性的一方面的比較。最初，以pAED-4/ARGC和pET30a(+)/ARGC轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞表現(xiàn)出正常的生長率和抗卡那霉素的能力。但經(jīng)過4個(gè)月儲存在-80。C的甘油里面后，除非將稀釋倍數(shù)減至10e4-10e5，否則沒有任何菌落可以檢測到。而在發(fā)酵液培養(yǎng)基當(dāng)中，沒有任何基因表達(dá)可以檢測到。以pET30a(+)/ARGM轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞，最初在稀釋倍數(shù)為10e9-10e10的情況下，顯示正常的抗卡那霉素能力。而且，其表達(dá)水平亦為15%至25%，這是相比pAED-4/ARGC和pET30a(+)/ARGC轉(zhuǎn)化的細(xì)胞更高。而經(jīng)過6個(gè)月儲存在-80。C的甘油里面后，pET30a(+)/ARGM轉(zhuǎn)化的細(xì)胞仍然保持正常水平的抗卡那霉素能力，而表達(dá)水平亦比經(jīng)過4個(gè)月儲存在-80。C的甘油里面后，以pET30a(+)/ARGC轉(zhuǎn)化的細(xì)胞更高。表1-pAED-4/ARGC轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)的生理性質(zhì)時(shí)間監(jiān)測菌落的稀釋倍數(shù)從SDSPAGE推斷的IPTG誘導(dǎo)基因表達(dá)To10e9-10el07%丁4月10e4-10e50%表2-pET30a(+)/ARGC轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)的生理性質(zhì)時(shí)間監(jiān)測菌落的稀釋倍數(shù)從SDSPAGE推斷的IPTG誘導(dǎo)基因表達(dá)To10e9-10el07%T4月10e4-10e50%表3-pET30a(+)/ARGM轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)的生理性質(zhì)時(shí)間監(jiān)測菌落的稀釋倍數(shù)從SDSPAGE推斷的IPTG誘導(dǎo)基因表達(dá)To10e9-10el015%-25%<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例在此完全描述。雖然具體描述提及個(gè)別的實(shí)施例，但本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在本發(fā)明范圍內(nèi)對其加以修改。因此，本文描述的實(shí)施例不應(yīng)視作為限制本發(fā)明的解釋。例如，盡管本發(fā)明參照使用由Novagen所出品的pET30a(+)載體，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可以知道其它的載體也可以使用，例如pTrcHis(Invitrogen)，pGEX(AmershamBiosciences),pBAD(Invitrogen)，pRSET(Invitrogen)，pBV220，和pQE(Qiagen)。本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員亦能充分意識到，雖然本發(fā)明使用一lac啟動子，本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可以知道其它的啟動子例如色氨酸啟動子，Trc啟動子，Tac啟動子，araBAD啟動子，T7啟動子，T5啟動子，和溫度誘導(dǎo)啟動子也可使用。此外，本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員亦知道，雖然本發(fā)明使用BL21(DE3)為宿主，其它的表達(dá)系統(tǒng)例如TOPIO，M15，和DH5a大腸桿菌亦可以使用。本發(fā)明描述了使用人類精氨酸酶I的編碼區(qū)域，其包含990bp并包括最后轉(zhuǎn)譯為終止密碼子UAA的TAA。本發(fā)明的最優(yōu)選實(shí)施例使用人類精氨酸酶I的編碼區(qū)域，其包含993bp，并有一附加系列的TAA以進(jìn)一步確保終止訊號會表達(dá)。權(quán)利要求1.一種表達(dá)重組人類精氨酸酶I的分離和純化的核酸分子，其中所述核酸分子包括人類精氨酸酶I的編碼序列和一可操作地與之連接的預(yù)先設(shè)定的啟動子序列，所述啟動子序列刺激一預(yù)先設(shè)定的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)所述人類精氨酸酶I，其中所述核酸序列不包括人類精氨酸酶ImRNA的非編碼序列。2.如權(quán)利要求1的分離和純化核酸分子，其中所述核酸分子進(jìn)一步包括一編碼多個(gè)組氨酸的核酸序列。3.如權(quán)利要求2的分離和純化核酸分子，其中所述核酸序列編碼最少六個(gè)組氨酸。4.一種表達(dá)重組人類精氨酸酶I的質(zhì)粒，其中所述質(zhì)粒包括人類精氨酸酶I的編碼序列和一可操作地與之連接的預(yù)先設(shè)定的啟動子序列，所述啟動子序列刺激一預(yù)先設(shè)定的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)所述人類精氨酸酶I，其中所述質(zhì)粒不包括人類精氨酸酶ImRNA的非編碼序列。5.如權(quán)利要求4的質(zhì)粒，其中所述質(zhì)粒包括一編碼多個(gè)組氨酸的核酸序列。6.如權(quán)利要求5的質(zhì)粒，其中所核酸序列編碼最少六個(gè)組氨酸。7.如權(quán)利要求4的質(zhì)粒，其中所述啟動子序列編碼一可操作地與所述人類精氨酸酶I編碼序列連接的lac操縱子。8.—種表達(dá)重組人類精氨酸酶I的大腸桿菌種，其中所述大腸桿菌包括一核酸分子，所述核酸分子包括人類精氨酸酶I的編碼序列和一可操作地與之連接的預(yù)先設(shè)定的啟動子序列，所述啟動子序列刺激一預(yù)先設(shè)定的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)所述人類精氨酸酶I，其中所述核酸序列不包括人類精氨酸酶ImRNA的非編碼序列。9.如權(quán)利要求8的大腸桿菌種，所述核酸分子包括一編碼多個(gè)組氨酸的核酸序列。10.如權(quán)利要求9的大腸桿菌種，其中所述核酸序列編碼最少六個(gè)組氨酸。11.如權(quán)利要求8的大腸桿菌種，其中所述核酸分子包括一在一T7啟動子下游序列的lac操縱子序列，所述lac操縱子序列可操縱地與所述核酸分子連接。12.—種生產(chǎn)重組蛋白的方法，所述方法包括a)建構(gòu)一如權(quán)利要求8所示的重組大腸桿菌種；b)以批次發(fā)酵法發(fā)酵所述重組大腸桿菌細(xì)胞；c)誘導(dǎo)所述重組大腸桿菌細(xì)胞以刺激所述重組蛋白的表達(dá)；和d)由所述發(fā)酵產(chǎn)品純化出所述重組蛋白。13.如權(quán)利要求12的方法，其中所述人類精氨酸酶I有最少六個(gè)組氨酸與之連結(jié)，所述純化方法包括在一螯合柱中的親和層析。全文摘要本發(fā)明提供一種用以改善重組人類精氨酸酶I表達(dá)的新重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包含一用以改善重組人類精氨酸酶I表達(dá)的分離和純化核酸分子以建構(gòu)質(zhì)粒和大腸桿菌種。在另一方面，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)分離的大腸桿菌種的方法用以表達(dá)所述精氨酸酶。文檔編號C07K14/00GK101605807SQ200780045958公開日2009年12月16日申請日期2007年11月20日優(yōu)先權(quán)日2006年12月12日發(fā)明者先宗樹,黃予良申請人:康達(dá)醫(yī)藥科技有限公司