專利名稱：Smoothened多肽及使用方法
SMOOTHENED多肽及使用方法
相關(guān)申請的交叉參考00011 本專利申請要求于2006年10月31日提交的美國臨時專利申請?zhí)?60/855,422的利益，其通過引用結(jié)合于此。
通過引用結(jié)合的以電子形式提交的材料 此外，例如，所述功能變體可以是SMOi2-8 (SEQ ID NO: 23)的功 能變體，其包括在位置1-7、 9、 11、和12處的氨基酸之一被Ala置換的 SMOi2-8氨基酸序列。
在這一點上，本發(fā)明還提供任意本發(fā)明多肽(包括功能片段和功 能變體)和肽模擬物的脂化衍生物。本發(fā)明的脂化衍生物包括含有脂質(zhì)分 子的本文所述的任何多肽和肽模擬物。當(dāng)用于本文時，術(shù)語"脂質(zhì)分子" 是指任何包括這樣的疏水部分的分子，所述疏水部分促進(jìn)所述多肽(包括 功能片段和功能變體)或肽模擬物穿過細(xì)胞膜并且進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。所述脂 質(zhì)可以是本領(lǐng)域已知的任何脂質(zhì)，諸如，例如，脂肪酸，法呢基基團(tuán)(例如, 二磷酸法呢酯)，香葉基香葉基基團(tuán)(例如，二磷酸香葉基香葉酯)，磷脂基 團(tuán)，糖磷脂酰肌醇，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰乙醇胺，鞘磷脂，磷脂酰膽堿, 心磷脂，磷脂酰肌醇，磷脂酸，溶血磷酸甘油酯，和膽固醇基團(tuán)。0042優(yōu)選地，所述脂化衍生物是脂肪酸衍生物，其中本文所述的多肽 或肽模擬物包括脂肪酸分子。所述脂肪酸分子可以是任何C8 - C加脂肪酸。 所述脂肪酸分子可以是，例如，月桂酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、油 酸、亞油酸、a-亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳 六烯酸(docosohexenoicacid)、芥酸、花生酸、或山崳酸。所述脂肪酸可 以在任意碳原子上任選地包含其他官能團(tuán)，例如， -個或多個氨基。在一 個優(yōu)選的實施方案中，所述脂肪酸分子是Cs-dJ旨肪酸，例如，C,6脂肪 酸。在更優(yōu)選的實施方案中，所述脂肪酸是棕櫚酸。0043] 正如對于脂質(zhì)分子是真實的，所述脂肪酸分子可以附著在本發(fā)明 多肽(包括功能片段和功能變體)或肽模擬物的任何適當(dāng)?shù)牟糠?。在本發(fā)明 的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明多肽(包括功能片段和功能變體)或肽模擬 物的脂肪酸衍生物在氨基(N-)端、在羧基(C-)端、或在N-和C-兩端包括脂肪酸分子。10044] 脂肪酸分子可以直接或通過連接體附著到本發(fā)明多肽(包括功能 片段和功能變體)或肽模擬物上。在本發(fā)明的一個實施方案中，當(dāng)所述脂肪 酸分子位于本發(fā)明多肽或肽模擬物的C端時，所述脂肪酸分子通過選自由 下列各項組成的組的氨基酸連接體附著Lys、 Cys、高半胱氨酸(高Cys)、 Orn、 (x,Y-二氨基丁酸、和a,P-二氨基丙酸。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案 中，脂肪酸分子通過Lys附著。在本發(fā)明的一個更優(yōu)選實施方案中，脂肪 酸分子通過Lys的s碳附著。10045在另一個優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)脂肪酸分子位于本發(fā)明多肽或肽 模擬物的C-端時，所述脂肪酸分子被修飾，例如，以在諸如式I或式II 的修飾的分子中包括氨基，其中式I是NH2(CH2)nCOOH,式II是 CH3(CH2)mCH(NH2)COOH，其中每個n和m為1-24。在這一點上，所述 脂肪酸分子附著在所述多肽或肽模擬物C端氨基酸的羧基上。優(yōu)選地，n 或m是8-16。更優(yōu)選地，n或m是16。00461 備選地，本文所述的本發(fā)明多肽(包括功能片段和功能變體)或肽 模擬物可以包括細(xì)胞-穿透肽(CPP)。所述CPP促進(jìn)本發(fā)明多肽或肽模擬 物穿過細(xì)胞膜并且進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。CPPs在本領(lǐng)域中是已知的。參見，例如， Deshayes等，細(xì)胞分子生命科學(xué)(CW/. M /. <SW.) 62:1839-1849(2005); El-Andaloussi等，現(xiàn)代藥物設(shè)計(O^r,尸/w附，Z)ewg") 11: 3597-3611 (2005);以及M紐和Langel,現(xiàn)代藥學(xué)觀點(Cwat. 尸/zar附aco/.) 6:509-514 (2006))。所述CPP可以是本領(lǐng)域已知的那些中的任--種，例如， Transportan, VP22， Pepl，等。優(yōu)選地，所述CPP包括SEQ ID NO: 78或79 的氨基酸序列，其分別對應(yīng)penetratin和Tat (48-60)的氨基酸序列。00471 本發(fā)明的多肽(包括功能片段和功能變體)和肽模擬物，包括其脂 肪酸衍生物，可以是單體肽，或可以是二聚體或多聚體肽。例如，所述多 肽可以是下述通用結(jié)構(gòu)的二聚體序列x-連接體l 一NH-(CH2、序列x-連接體2-NH -(CH2),其中序列X選自由下列各項組成的組Ac-LAKFSTHWAYTL (全是-D) (SEQ ID NO: 85); Ac-AKFSTHWAYTL (全是-D) (SEQ ID NO: 86);和 Ac-KFSTHWAYTL (全是-D) (SEQ ID NO: 87);其中連接體1和連接體2 每一個是任選地存在，并且每一個獨立地是Gly、 P-Ala、氨基丙酸、？氨 基丁酸、氨基己酸(aminocaproic acid)、或氨基己酸(aminohexanoic acid); 其中n和m為0-6;其中Y是K、 C、高Cys、 Om、 二氨基丙酸(DPA)、 二氨基丁酸(DBA);并且其中所述脂肪酸是硬脂酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸、 月桂酸、癸酸或辛酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，序列X是SEQIDNO: 87， n是4， m是0，連接體1和連接體2的每一個是P-Ala，并且所述脂肪酸是 棕櫚酸。制備二聚體和多聚體多肽的方法在本領(lǐng)域中是已知的。參見，例 如，Wrighton等，自然生物技術(shù)(A^we歷ofecA"o/ogy) 15: 1261-1265 (1997)。制備二聚體多肽的一種優(yōu)選方法也記述在本文的實施例1中。0048
當(dāng)本發(fā)明的多肽(包括功能片段和功能變體)和肽模擬物，包括其 脂肪酸衍生物，是以鹽的形式存在時，優(yōu)選地，所述多肽或肽模擬物以藥 用鹽的形式存在。合適的藥用酸加成鹽包括衍生自礦物酸如鹽酸、氫溴酸、 磷酸、偏磷酸、硝酸、和硫酸的那些，和衍生自有機酸如酒石酸、乙酸、 檸檬酸、蘋果酸、乳酸、延胡索酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸、琥珀酸、 和芳基磺酸例如對-甲苯磺酸的那些。0049
本發(fā)明還提供編碼本文所述的任一種本發(fā)明多肽，包括功能片段 和功能變體的核酸。當(dāng)用于本文時，術(shù)語"核酸"包括"多核苷酸"、"寡 核苷酸"和"核酸分子"，并且通常是指.DNA或RNA的聚合物，其可以 是單鏈的或雙鏈的，合成的或從天然來源獲得(例如，分離和/或純化)， 其可以包含天然的、非天然的或改變的核苷酸，并且其可以包含天然的、 非天然的或改變的核苷酸之間鍵，諸如氨基磷酸酯(phosphoroamidate) 鍵或硫代磷酸酯鍵，代替在未修飾寡核苷酸的核苷酸之間存在的磷酸二 酯。通常優(yōu)選所述核酸不包括任何插入、刪除、倒位、和/或置換。然而， 在一些情形中，如本文所討論的，核酸包括一個或多個插入、刪除、倒位、 和/或置換可以是適當(dāng)?shù)摹?b>00501 優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸是重組的。當(dāng)用于本文時，術(shù)語"重組"是 指(i)通過使天然或合成的核酸片段與能夠在活細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的核酸分子連接而在活細(xì)胞外構(gòu)建的分子，或(ii)由以上(i)中所述的那些的復(fù)制形成 的分子。為了本文的目的，復(fù)制可以是體外復(fù)制或體內(nèi)復(fù)制。00511 核酸可以基于化學(xué)合成/或酶連接反應(yīng)使用本領(lǐng)域已知的方法構(gòu) 建。參見，例如，Sambrook等，^i:屏述，和Aus.ubd等，廚J:屏述。例如， 核酸可以使用天然存在的核苷酸或不同修飾的核苷酸化學(xué)合成，所述不同 修飾的核苷酸設(shè)計成增加分子的生物學(xué)穩(wěn)定性或增加在雜交時形成的雙 鏈體的物理穩(wěn)定性(例如，硫代磷酸衍生物和吖啶置換的核苷酸)。可以用 來生成所述核酸的修飾的核苷酸的實例包括，但不限于，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、 5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿 嘧啶、二氫尿嘧啶、卩-D-galactosylqueosine、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、 1-甲基鳥嘌呤、l-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥 嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N、置換的腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、 5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、 P-D-mannosylqueosine、 5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基 硫代-N、異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥基乙酸(v)、 wybutoxosine、假尿嘧 啶、queosine、 2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、 5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羥基乙酸甲基酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧 啶、和2，6-二氨基嘌呤。備選地，本發(fā)明的一種或多種核酸可以購自公司， 如大分子資源(Macromolecular Resources) (Fort Collins, CO)和Synthegen (休斯頓(Houston) ,TX)。00521 所述核酸可以包括編碼任一種本發(fā)明多肽，包括功能片段和功能 變體的任意核苷酸序列。例如，所述核酸可以包括編碼SEQ ID NOs: 2 - 29， 32， 33， 38 - 48， 53 - 56， 59 - 66， 70 - 72, 76,和80中任--種的核苷酸序列。 所述核酸備選地可以包括與這些序列中的任一種簡并的核苷酸序列或簡 并序列的組合。本發(fā)明還提供包括這樣的核苷酸序列的分離的或純化的核酸，所述核苷酸序列與本文所述的任- -種核酸的核苷酸序列互補或在嚴(yán)格 條件下與本文所述的任--種核酸的核苷酸序列雜交。00531 本發(fā)明的核酸可以結(jié)合到重組表達(dá)載體中。在這一點上，本發(fā)明 提供包括任一種本發(fā)明核酸的重組表達(dá)載體。為了本文的目的，術(shù)語"重組表達(dá)載體"意指遺傳修飾的寡核苷酸或多核苷酸構(gòu)建體，其在該構(gòu)建體包括編碼mRNA、蛋白、多肽、或肽的核苷酸序列，并且載體在足以使所 述mRNA、蛋白、多肽或肽在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的條件下與所述細(xì)胞接觸時， 允許宿主細(xì)胞表達(dá)mRNA、蛋白、多肽、或肽。本發(fā)明的載體作為一個整 體不是天然存在的。然而，載體的部分可以是天然存在的。本發(fā)明的重組 表達(dá)載體可以包括任意類型的核苷酸，包括但不限于，DNA和RNA,其 可以是單鏈的或雙鏈的，合成的或部分獲自天然來源，并且其可以包括天 然的、非天然的或改變的核苷酸。所述重組表達(dá)載體可以包括天然存在的、 非天然存在的核苷酸間鍵，或兩種類型的鍵。優(yōu)選地，所述非天然存在的 或改變的核苷酸或核苷酸間鍵不阻礙該載體的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制。 100541本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以是任何適當(dāng)?shù)闹亟M表達(dá)載體，并且可以用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染任何適當(dāng)?shù)乃拗?。適當(dāng)?shù)妮d體包括設(shè)計用于繁殖和擴增 或用于表達(dá)或用于二者的那些，諸如質(zhì)?；虿《尽Ｋ鲚d體可以選自由下 列各項組成的組pUC系列(Fermentas生命科學(xué)(Fermentas Life Sciences))、 pBluescript系歹lJ(Stmtagene, LaJolla， CA)、pET系歹(J(Novagen, Madison， WI)、 pGEX系列(法瑪西亞生物技術(shù)(Pharmacia Biotech), Uppsala, Sweden)、 和pEX系列(Clontech, Palo Alto, CA)。還可以使用噬菌體載體，諸如 入GTIO、人GTll、 IZapII (Stratagene)、入EMBL4、和ANM1149。植物表達(dá) 載體的實例包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19 (Ckmtech)。 動物表達(dá)載體的實例包括pEUK-Cl、 pMAM和pMAMneo (Clontech)。優(yōu)選地，所述重組表達(dá)載體是病毒載體，例如，反轉(zhuǎn)錄病毒載體。00551可以使用記述在例如，Sambrook等，展Z:^f述，和Ausubel等， J:歷:述中的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制備本發(fā)明的重組表達(dá)載體?？梢灾苽洵h(huán) 形的或線性的表達(dá)載體構(gòu)建體，以包含在原核或真核宿主細(xì)胞中起作用的 復(fù)制系統(tǒng)。例如，復(fù)制系統(tǒng)可以源自，例如，ColEl、 2p質(zhì)粒、X、 SV40、 牛乳頭狀瘤病毒等。00561 理想地，所述重組表達(dá)載體包括調(diào)控序列，諸如轉(zhuǎn)錄和翻譯起始 與終止密碼子，當(dāng)合適并且考慮載體是基于DNA的還是基于RNA的時候， 所述調(diào)控序列對于所述載體所引入的宿主類型(例如，細(xì)菌、真菌、植物、 或動物)是特異性的。0057
所述重組表達(dá)載體可以包括一種或多種標(biāo)記基因，其允許選擇轉(zhuǎn) 化的或轉(zhuǎn)染的宿主。標(biāo)記基因包括殺生物劑抗性，例如，對抗生素、重金 屬等的抗性，在營養(yǎng)缺陷型宿主中互補以提供原養(yǎng)型，等等。對于本發(fā)明 表達(dá)載體合適的標(biāo)記基因包括，例如，新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性 基因、組氨醇抗性基因、四環(huán)素抗性基因、和氨節(jié)青霉素抗性基因。00581 所述重組表達(dá)載體可以包括天然的或非天然的啟動子，所述啟動 子同編碼修飾的TCR、多肽、或蛋白(包括其功能部分和功能變體)的核 苷酸可操作性連接，或同與編碼修飾的TCR、多肽、或蛋白的核苷酸序列 互補或與之雜交的核苷酸序列可操作性連接。啟動子的選擇，例如，強、 弱、誘導(dǎo)型、組織特異型和發(fā)育特異型的，在技術(shù)人員的普通技能之內(nèi)。 相似地，核苷酸序列與啟動子的組合也在技術(shù)人員的技能之內(nèi)。啟動子可 以是非病毒啟動子或病毒啟動子，例如，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子、SV40 啟動子、RSV啟動子、以及在鼠干細(xì)胞病毒長末端重復(fù)中存在的啟動子。
本發(fā)明還提供包括至少--種本文所述的宿主細(xì)胞的細(xì)胞群體。所 述細(xì)胞群體可以是異種群體，包括包含任一種所述重組表達(dá)載體的宿主細(xì) 胞，以及至少一種其它細(xì)胞，例如，不包含任何所述重組表達(dá)載體的宿主細(xì) 胞(例如,T細(xì)胞)，或除T細(xì)胞之外的細(xì)胞，例如，B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜 中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、腦細(xì)胞，等。 備選地，所述細(xì)胞群體可以是基本同種群體，其中所述群體主要包括包含 所述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞(例如，主要由包含所述重組表達(dá)載體的宿 主細(xì)胞組成)。所述群體還可以是細(xì)胞的克隆群體，其中所述群體的所有細(xì) 胞是包含重組表達(dá)載體的單一宿主細(xì)胞的克隆，以致該群體的所有細(xì)胞包 含所述重組表達(dá)載體。在本發(fā)明的--個實施方案中，所述細(xì)胞群體是包括 包含本文所述的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的克隆群體。0063
在本發(fā)明范圍內(nèi)包括綴合物，例如，生物綴合物，其包括本發(fā)明多 肽(包括任一種功能片段或功能變體)或肽模擬物、核酸、重組表達(dá)載體、 或宿主細(xì)胞中的任一種。綴合物，以及通常合成綴合物的方法在本領(lǐng)域內(nèi) 也是已知的(參見，例如，Hudecz，F(xiàn).，分子生物學(xué)方法(Afe決oA Afo/.歷o/.) 298: 209-223 (2005)和Kirin等，無機化學(xué)(/"org CTze附.)44(15): 5405-5415 (2005))。00641 本發(fā)明多肽(包括功能片段和功能變體)、肽模擬物、脂肪酸衍生 物、核酸、重組表達(dá)載體、以及宿主細(xì)胞(包括其群體)可以是分離的、純 化的、合成的、和/或重組的。當(dāng)用于本文吋，術(shù)語"分離的"意指已經(jīng)從其 天然環(huán)境脫離的。當(dāng)用于本文時，術(shù)語"純化的"意指已經(jīng)在純度上提高的，其中"純度"是相對術(shù)語，并不必要地解釋為絕對純度。例如，純度可以是至少約50%，可以是大于60%、 70°/。、 80%、或卯％、或可以是100%。0065本發(fā)明多肽(包括功能片段和功能變體)、肽模擬物、脂肪酸衍生 物、綴合物.、核酸、重組表達(dá)載體、和宿主細(xì)胞(包括其群體)，以下全部 籠統(tǒng)稱為"本發(fā)明物質(zhì)"，可以配制成組合物，諸如藥物組合物。在這一點 上，本發(fā)明提供包括任意所述多肽(包括功能片段和功能變體)、肽模擬物、 脂肪酸衍生物、綴合物、核酸、重組表達(dá)載體、和宿主細(xì)胞(包括其群體)， 以及藥用載體的藥物組合物。包含任意本發(fā)明物質(zhì)的本發(fā)明藥物組合物可 以包括多于一種本發(fā)明物質(zhì)，例如，多肽和核酸，或兩種或更多不同的多 肽。備選地，所述藥物組合物可以包括與另一種藥物活性試劑或藥物組合 的發(fā)明物質(zhì)，所述另一種藥物活性試劑或藥物諸如化療劑，例如，天冬酰 胺酶，白消安，卡鉑，順鉑，柔紅霉素，多柔比星，氟尿嘧啶，吉西他濱， 羥基脲，甲氨蝶呤，紫杉醇，利妥昔單抗，長春堿，長春新堿，等等。00661 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述藥物組合物包括與脂質(zhì)組 合的本發(fā)明物質(zhì)。所述脂質(zhì)可以是任何脂質(zhì)，包括，例如，脂肪酸、磷脂、 固醇、鞘脂、萜、甘油脂、甘油磷酸酯、異戊烯醇脂、糖脂、聚酮化合物。 所述脂在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。參見，例如,Fahy等，脂質(zhì)硏究雜志( /h;pW46:839-861 (2005)。優(yōu)選地，所述脂質(zhì)是膽固醇。0067關(guān)于藥物組合物，藥用載體可以是任意常規(guī)所用的那些，并且僅 通過化學(xué)-物理考慮因素，諸如溶解性和缺乏與活性化合物的反應(yīng)性，以及 通過施用的途徑限定。本文所述的藥用載體，例如,媒介物(vehicles)、 佐劑、賦形劑、和稀釋劑，是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且容易為公眾獲 得。優(yōu)選地，所述藥用載體對活性試劑是化學(xué)惰性的和在使用條件下不具 有有害副作用或毒性。100681 載體的選擇應(yīng)該部分由特定的本發(fā)明物質(zhì)、以及由用于施用本發(fā) 明物質(zhì)的特定方法決定。因此，存在本發(fā)明藥物組合物的多種適當(dāng)制劑。 下述用于口服、氣霧劑、腸胃外、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、 腹膜內(nèi)、直腸、和陰道施用的制劑是示例性的，并且不以任何方式限制。 可以使用多于一種途徑施用本發(fā)明物質(zhì)，并且在特定情形中，特定的途徑可以提供比另一種途徑更直接和更有效的響應(yīng)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施 方案中，所述藥物組合物是局部制劑、靜脈內(nèi)制劑、或皮下制劑。0069在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述藥物組合是局部制劑。局 部制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在本發(fā)明施用到皮膚的情形中，所述制 劑特別適合。本發(fā)明的局部制劑可以是，例如，膏劑、洗液、油膏、貼片、 油、糊劑、噴霧劑例如氣霧劑噴霧劑、凝膠、慕思(mousse)、滾抹式的 液體、固體棒等。優(yōu)選地，本發(fā)明的局部制劑是膏劑、洗液、油膏、或貼 片。當(dāng)所述局部制劑是洗液時，優(yōu)選地，所述洗液還包括紫外(UV)光阻 隔劑，諸如生育酚(toc叩heiyl)、氨基苯甲酸、阿伏苯宗、西諾沙酯、二 羥苯宗、胡莫柳酯、鄰氨基苯甲酸甲酯、奧克立林、辛基甲氧基肉桂酸酯、 辛水楊酯、羥苯甲酮、帕地馬酯O、苯基苯并咪唑、磺酸、舒利苯酮、二 氧化鈦、三乙醇胺水楊酸酯(trolaminesalicylate)、和氧化鋅。0070適于口服施用的制劑可以由下列各項組成.，(a)液體溶液，諸如溶 解在稀釋劑如水、鹽水、或橙汁中的有效量的本發(fā)明物質(zhì);(b)膠囊、香囊 (sachet)、片劑、錠劑(lozenge)、和錠劑(troch),每一種包含預(yù)先 確定量的作為固體或顆粒的活性成分；(c)粉劑；(d)在適當(dāng)液體中的混懸 液；和(e)適當(dāng)?shù)娜閯?。液體制劑可以包括稀釋劑，諸如水和醇，例如，乙 醇、苯甲醇、和聚乙二醇，添加或不添加藥用表面活性劑。膠囊形式可以 是普通的硬-或軟-殼明膠型，其包含，例如，表面活性劑、潤滑劑、和惰 性填充劑諸如乳糖、蔗糖、磷酸鈣、和玉米淀粉。片劑形式可以包括下列 各項中的一種或多種乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、褐 藻酸、微晶纖維素、阿拉伯樹膠、明膠、瓜耳膠、膠狀二氧化硅、 croscarmellose sodium、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、硬脂酸、 和其它賦形劑、著色劑、稀釋劑、緩沖劑、崩解劑、潤濕劑、防腐劑、調(diào) 味劑、和其它藥物相容的賦形劑。錠劑(lozenge)形式可以包括處在調(diào)味 劑通常是在蔗糖和阿拉伯樹膠或黃蓍膠中的本發(fā)明物質(zhì)，以及包括處在惰 性基質(zhì)諸如明膠和甘油、或蔗糖和阿拉伯樹膠中的本發(fā)明物質(zhì)的軟錠劑， 另外包含本領(lǐng)域己知的賦形劑的乳劑、凝膠等。0071本發(fā)明物質(zhì)，單獨的或與其它適宜的成分組合，可以制成通過吸 入施用的氣霧劑制劑。這些氣霧劑制劑可以放置在加壓可用的推進(jìn)物中，諸如二氯二氟甲烷、丙垸、氮等。它們還可以配制成非加壓的制劑，如在 噴霧器或霧化器中。所述噴霧制劑還可以用于向粘膜噴霧。0072適于腸胃外施用的制劑包括水性和非水性、等滲無菌注射液，其 可以包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、和使得所,述制劑與預(yù)期接收者的血 液等滲的溶質(zhì)，以及水性和非水性無菌混懸液，其可以包括混懸劑、增溶 劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、和防腐劑。本發(fā)明物質(zhì)可以處在藥用載體中的生理 用稀釋劑中施用，諸如無菌液體或液體混合物，包括水、鹽水、水性葡萄 糖和相關(guān)的糖溶液、醇如乙醇或十六醇、二醇如丙二醇或聚乙二醇、二甲 亞砜、甘油、縮酮如2，2-二甲基-l，3-二氧戊環(huán)-4-甲醇、醚、聚(乙二醇)400、 油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯，或乙?；闹舅岣视王?，添加或不添 加藥用表面活性劑諸如皂或去污劑，混懸劑如果膠、carbomers、甲基纖維 素、羥丙基甲基纖維素、或羧甲基纖維素，或乳化劑和其它藥用佐劑。
。
實施例01051 本實施例論述按照本發(fā)明實施方案的多肽能夠抑制患病細(xì)胞的增 殖。
0106
如實施例1所述，構(gòu)建與具有N端棕櫚?；鶜埢腟MO的所有 三個胞內(nèi)環(huán)(SMOil-l,SMOi2-l，SMOi3-l)全長相對應(yīng)的多肽。然后，如實 施例2所述，使用MCF-7乳腺癌細(xì)胞和胃腺癌細(xì)胞檢測所述多肽毒性(生 長抑制)。比較SMOi2-l和SMOi3-l的活性和環(huán)杷明(5 pM)的活性，環(huán) 杷明是從玉米百合(corn lily)加州藜蘆(Veratrum califonicum)中分離的 致畸劑。
01071 如在
圖1中所示，所有三種肽均抑制MCF-7細(xì)胞的生長。SMOi3-l 多肽對細(xì)胞生長具有最顯著的作用，其次是SMOi2-l，而SMOil-l表現(xiàn) 出最小量的抑制活性。如在圖2中所示，SMOi3-l和SMOi2-l多肽能夠如 環(huán)杷明- -樣或者比環(huán)杷明更好地抑制胃腺癌細(xì)胞生長。
實施例4
I0108J 本實施例論述按照本發(fā)明的--個實施方案具有基于SMO蛋白的 第二個和第三個胞內(nèi)環(huán)的氨基酸序列的功能片段和功能變體能夠抑制患 病細(xì)胞的增殖。
01091 如在實施例1中所述，合成基于SMO的第二個或第三個胞內(nèi)環(huán) 的多肽(SMOi2或i3多肽)(如在表1中所示)，并且如在實施例2中所述， 使用MCF-7乳腺癌細(xì)胞或SK-Mel2黑素瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測。在暴露于所述肽48小時后在SK-Md2黑素瘤細(xì)胞中通過MTT測定法確定的每種肽的 ICw顯示在表4和5中。
表4
化合物 結(jié)構(gòu) IC幼，nM
SMOi2-l Pal-LTYAWHTSFKALG1TYQPLSGKYSY 0.45±0.05
SMOi2-2 Pal-LTYAWTSFKALGTTYQPLSGKTSY 0:45±0:05
SMOi2-3 Pal-LTYAWHTSFKALGTTYQPLSG !掘4 SMOi2~4 Ac-1/rYAWHTSFKALGTTYQPLSGKTSYK- e-Pal !.0^^ SMOi2-5Ac-YAWHTSFKALGTIYQPLSGKTSYK- ePal
SMOi2-6 Pal-LTYAWHTSFKALGTTYQP 0:3±0:05
SMOi2-7 AoGTTYQPLSGKTSYK-ePal 2.7±0.4
SMO i2-8 Pal-LTYAWHTSFKAL 0.08±0.02
SMO i2-9 Ac-LTYAWHTSFKAL >10
SMOi2-10 Pal隱TYAWHTSFKAL 0.7±0.
SMOi2-11 Pal-LTYAWHTSFKA 0.09±0.007
SMO i2-12 Pal-LTYAWHTSFK 0.06±0.007
SMO i2-13 Ac-TYAWHTSFKA 2.8±0.3
SMOi2-I4 VWFWLTYAWHTSFKAL >5
SMOi2-15 WFWLTYAWHTSFKAL >5
SMOi2-16 Ac-LAKFS"raWATYLK-8-Pal(allD-) 0.006±0.0005
SMOi2-17 AoAKFSTHWATYLK-sPal (all D-) 0.0004±0.0001
SMO i2-18 Pal-LTYABpaHTSFKAL 0.1±0.05
SMO i2-20 Ac-KFSTHWATYLK- ePal (all D-) 0.0003±0.0001
SMOi2-21 Pal-LTYABpaHTSFKAL"Hcy-生物素 >15
SMOi2-23 Pal-LTYAWHTSFKALGTTYQPLSGKTSYK- E-Pal 0 05±0 02
SM012-24 PalLTYAWHTSFKAL(AUD) 0.039±0 004
SMOi2-25 AcLTYAWHTSFKAL(MD) >10
SMOi2-26 Myr-LTYA麗SFKAL 0謂5
SMO i2-29 Ac-LTYAWHTSFKAL-P咖fratin >15
SMOi2-30 P節(jié)咖tin-LTYAWHTSFKAL "5
SMOi2-56 4.0 nm
\K-K-s-Pal AKFSTHWAYTL-P-Ala"7-NfiT""
Pal,棕櫚酸翻Ac,乙酸豳<A11 D),所述多肽的每一個氨基酸均是D異構(gòu)體；
Myr,肉豆楚酸；e-Pal,在Lys的e碳上添加的棕櫚酸酯；(Bpa), 4-苯甲酰苯丙氨酸.化合物
結(jié)構(gòu)
SMO i3-l PaIRGVMTLFSDCSNHPGLLSEKAASKINErML 0.64±0.1
SMOi3-2 PalRGVMTLFSKSNHPGLLSEKA 0.50±0.1
SMOi34 PalLFSnCSNHPGLLSEKAASKINETMLR 1.5±0.2
SMOi3-5 A汰GVMTLFSIKSNHPGLLSEKAAS]KINETMLRK-8-Pal 0.9±0.2
SMOi3-6 ' AoLLSEKAASKINETMLRKr8-Pal 0.8±0.1
SMO i3-7 Ao^LFSIKSNHPGLLSEKAAISKINETMLRK;- e -Pal 0.95±0.2
SMOi3-8 PalRGVMTLFSKSNHPGLLS 0.5勁..1
SMOi3-10 PalRGVMTLFSKSNH ' 0.95±0.2
SMO i3-12 AoLLSEKAASKINETMLR : e -Pal 1.33±0.0110〗 如在表5和圖3中所示，基于SMO第三個胞內(nèi)環(huán)的多肽表現(xiàn)出 抑制MCF-7細(xì)胞生長的能力。此外，與第三胞內(nèi)環(huán)片段相對應(yīng)的肽具有 與全長環(huán)(SMOi3-l)相當(dāng)?shù)幕虻陀谄涞幕钚浴?本實施例論述按照本發(fā)明的一個實施方案抑制細(xì)胞內(nèi)Hedgehog 信號傳導(dǎo)途徑蛋白的基因表達(dá)的方法。-丙基氨基)-2，10b-二氮雜-醋 蒽烯-6-酮)(Tarasov等，光化學(xué)和光生物學(xué)(i^otoc/z柳.尸/zotoWo/.) 78: 313-322(2003))?；衔?，如WMC-77在進(jìn)入生物大分子如DNA的兩親 性環(huán)境(Tarasova等，2003,廚J:厥述)或典型膠束的疏水性核心(Tarasov 等，光化學(xué)和光生物學(xué)(尸/^oc/2柳.尸/7oto6/o/J 70: 568-578 (1999))時，傾 向于顯著提高它們固有的熒光性。由于咪唑并吖啶酮由水性溶液中吸附到 石英上，所以將來自西格瑪-奧得里奇(Sigma-Aldrich) (St. Louis, MO)的 塑料聚甲基丙烯酸酯10x 10mm單元用于大部分檢測。發(fā)現(xiàn)大氣氧猝滅是 不重要的，原因在于在氮氣凈化之前和之后從BIAs獲得相似的熒光強度 值。在去離子水中制備溶液。在25°C在單光子計數(shù)分光熒光計 FLUOROMAX(S^2 (Horiba Jobin Yvon， Edison， NJ)上獲得未校正的熒光發(fā) 射光譜。分別將激發(fā)和發(fā)射單色儀裂縫調(diào)整為1.5和3.5 nm帶寬。使用 430 nm激發(fā)單色儀設(shè)置，在450-700 nm范圍內(nèi)收集發(fā)射光譜(增量1 nm, 整合吋間0.2秒)。對于預(yù)先混合的肽和咪唑并吖啶酮溶液等分試樣進(jìn)行熒 光光度測量。在所有探測中發(fā)熒光劑WMC-77的濃度是0.4 nM。
本實施例論述本發(fā)明的肽針對不同細(xì)胞系表現(xiàn)出不同敏感性。 [01291 在包含濃度為0.001、 0.01、 0.1、 1.0、或5 的SMOi2-12或 SMOi2-20的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)乳腺癌(T47D)、黑素瘤(SK-MEL-2)、肝細(xì)胞 瘤(H印G2， PLC, JM-1)、胰腺癌(Panc10.05, HS766T)、結(jié)腸癌(Cok)205， HCT15)、和肺癌(A549)的癌細(xì)胞。細(xì)胞按照實施例2中所述進(jìn)行測定。如 在圖9中所示，SMOi2-12和SMOi2-20根據(jù)受到處理的細(xì)胞表現(xiàn)出不同敏 感性。表現(xiàn)出GI50>5的細(xì)胞系包括PLC、JM-l、HS766T、Colo205、HCT15、 和A549。
實施例9
f0130j 本實施例論述本發(fā)明的肽具有二級結(jié)構(gòu)。
10131
通過圓二色性(CD)光譜法測量所述肽。通過將化合物溶解在含有 50 mM十二烷基膽堿磷酸(Avanti極性脂質(zhì)(Avanti Polar Lipids), Alabaster, AL)的PBS中而制備肽溶液(l pM)。通過AVIV mod. 202 CD-光譜儀(Aviv 儀器，Lakewood， NJ)，使用0.1 cm徑長石英杯在22-24°C記錄CD光譜。 掃描范圍為180-260 nm，并且從化合物的光譜中減去緩沖液的光譜。 [01321 SMOi2-8和SMOi2-16的CD光譜(圖IO)表明，所述肽主要釆取卩-鏈構(gòu)象。逆反(retro-inverso)肽似乎比親本全是-L負(fù)體更加結(jié)構(gòu)化和剛 性。
實施例IO
01331 本實施例論述本發(fā)明多肽的丙氨酸掃描硏究。0134
通過創(chuàng)建SMOi2-8肽的突變體集合，探測SMOi2-8序列 (PalLTYAWHTSFKAL)中不同殘基的重要性，其中所述集合的每個突變體 具有被Ala置換的氨基酸殘基，并且SMOi2-8的每個殘基被該集合中的至 少一個突變體靶向突變。
10135在SMOi2-8第10位置處的Lys殘基對于SMOi2-8肽的活性是關(guān) 鍵的。當(dāng)在SMOi2-8位置8的Ser被置換時，也觀察到活性的顯著損失。 當(dāng)在位置l的Leu被Ala替代時，活性增加?？梢栽诓伙@著改變活性的條 件下，用Ala置換位置9的Phe，位置3的Tyr，和位置5的Trp。其余置 換(2、 4、 6、 7、 11、和12)導(dǎo)致GIso的略微(40-60%)增加。
01361 本文引用的所有參考文獻(xiàn)，包括出版物、專利申請、和專利，通 過引用以如同每篇參考文獻(xiàn)單獨且特別指明通過引用結(jié)合相同的程度結(jié) 合于此，并且完全結(jié)合于此。
[0137
術(shù)語"a (—個)"和"an (—個)"以及"the (這個)"以及在描述本 發(fā)明的上下文中(特別是在下述權(quán)利要求的上下文中)的相似引用語，應(yīng) 該解釋為涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)，除非另外在本文中指明或明顯同上下文相抵 觸。術(shù)語"comprising (包括)，""having (具有)，""including (包括)，"以 及"containing(包含)"應(yīng)該解釋為開放術(shù)語(即，意指"包括但不限于")， 除非另外指明。本文數(shù)值范圍的引用僅意欲作為獨立引用落入該范圍內(nèi)的 每個單獨的數(shù)值的簡略表述方法，除非在本文中另外指明，并且每個獨立 的數(shù)值如同其單獨在本文中引用--樣結(jié)合在本說明書中。本文所述的所有 方法可以以任何適當(dāng)?shù)捻樞驅(qū)嵤?，除非在本文中另外指明或另外明顯與上 下文相抵觸。本文提供的任何以及所有實施例，或示例性語言(例如，" 諸如")的應(yīng)用僅意欲更好地闡述本發(fā)明，并不形成對本發(fā)明范圍的限制， 除非另外要求。本說明書中的任何語言不應(yīng)該解釋為指示任何不要求的要 素是對實施本發(fā)明重要的。
0138
在本文描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，包括本發(fā)明人已知實施本 發(fā)明的最佳模式。在閱讀了前述描述時，這些優(yōu)選實施方案的變化對本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員可以變得清楚。本發(fā)明人預(yù)計熟練的技術(shù)人員適當(dāng)?shù)乩?所述變化，并且本發(fā)明人意欲以與本文具體描述不同的方式實施本發(fā)明。
44因此，如適用法律所允許地，本發(fā)明包括在所附權(quán)利要求中引用的主題的^ 所有修改和等價物。此外，本發(fā)明包括在其所有可能的變化中的上述要素 任何組合中，除非本文另外指明，或另外明顯與上下文相抵觸。
權(quán)利要求
1.分離的或純化的多肽或肽模擬物，或其脂肪酸衍生物，所述多肽或肽模擬物包括Smoothened(SMO)蛋白(SEQ ID NO1)的一部分、其功能片段、或者所述部分或所述功能片段的功能變體的氨基酸序列，其中所述部分包括SEQ ID NOs2-4中的任一氨基酸序列，其中所述功能變體包括與SEQ ID NO2、3、或4具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽或肽模擬物長度小于或等于50個氨基酸，其中所述功能片段包括SEQ ID NO2、3、或4的至少7個連續(xù)氨基酸，并且其中所述功能片段或功能變體抑制患病細(xì)胞的增殖。
2. 權(quán)利要求1的分離的或純化的多肽或肽模擬物或脂肪酸衍生物，其 中所述肽模擬物是擬肽。
3. 權(quán)利要求1或2的分離的或純化的多肽或肽模擬物或脂肪酸衍生 物，其中所述功能片段包括SEQIDNOs: 5-8中的任一氨基酸序列。
4. 權(quán)利要求l-3任一項的分離的或純化的多肽或肽模擬物或脂肪酸衍 生物，其中所述功能片段包括選自由SEQ ID NOs: 9 — 33組成的組中的一 個氨基酸序列。
5. 權(quán)利要求1或2的分離的或純化的多肽或肽模擬物或脂肪酸衍生 物，其中所述功能變體包括SEQIDNO:23的氨基酸序列，其中在SEQID NO: 23位置1-7、 9、 11、和12中的任一位置具有一個氨基酸置換，其中 在所述位置的氨基酸被Ala置換。
6. 權(quán)利要求1或2的分離的或純化的多肽或肽模擬物或脂肪酸衍生 物，其中所述功能變體包括SEQIDNO:23、 26、或33的逆反類似物。
7. 權(quán)利要求6的分離的或純化的多肽或肽模擬物或脂肪酸衍生物，其 中所述逆反類似物包括SEQIDNOs:34- 37、 84、和92-94中的任一氨基 酸序列。
8. 權(quán)利要求6的分離的或純化的多肽或肽模擬物，其包括下述通用結(jié)構(gòu)序列X-連接體1 -NH-(CH2)n^^^^CH-C0-Y-脂肪酸 序列X畫連接體2國NH -(CH2)m其中序列X選自由下列各項組成的組Ac-LAKFSTHWAYTL (全是-D) (SEQ ID NO: 85); Ac畫AKFSTHWAYTL (全是畫D) (SEQ ID NO: 86);和 Ac-KFSTHWAYTL (全是-D) (SEQ ID NO: 87);其中連接體1和連接體2每 —個是任選地存在，并且每一個獨立地是Gly、卩-Ala、氨基丙酸、？氨基 丁酸、氨基己酸(咖inocaproic acid)、或氮基己酸(aminohexanoic acid); 其中n和m為0-6;其中Y是K、 C、高Cys、 Om、 二氨基丙酸(DPA)、 二氨基丁酸(DBA);并且其中所述脂肪酸是硬脂酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸、 月桂酸、癸酸或辛酸。
9. 權(quán)利要求1或2的分離的或純化的多肽或肽模擬物或脂肪酸衍生 物，其中所述功能變體包括SEQ ID NOs: 38-59中的任--氨基酸序列。
10. 權(quán)利要求1-9任一項的分離的或純化的多肽或肽模擬物或脂肪酸 衍生物，其中所述脂肪酸衍生物在氨基(N-)端，羧基(C-)端，或N-和C-端 兩端包括脂肪酸分子，所述脂肪酸分子任選地包含至少--個氨基基團(tuán)。
11. 權(quán)利要求10的分離的或純化的多肽或肽模擬物或脂肪酸衍生物， 其中，當(dāng)脂肪酸分子位于C端時，所述脂肪酸分子通過選自由下列各項組 成的組的--個氨基酸附著到所述多肽或肽模擬物上Lys、 Cys、高半胱氨 酸、Orn、 aj-二氨基丁酸、禾卩a,P-二氨基丙酸。
12. 權(quán)利要求ll的分離的或純化的多肽或肽模擬物或脂肪酸衍生物， 其中所述教基酸是Lys。
13. 權(quán)利要求10-12任一項的分離的或純化的多肽或肽模擬物或脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸分子是C8-C20脂肪酸。
14. 權(quán)利要求13的分離的或純化的多肽或肽模擬物或脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸分子是C,6脂肪酸。
15. 權(quán)利要求10的分離的或純化的多肽或肽模擬物或脂肪酸衍生物，其中，當(dāng)脂肪酸分子位于c端時，所述脂肪酸分子是式i或式n的分子，其中式I是NH2(CH2)。COOH，并且式II是CH3(CH2)mCH(NH2)COOH，其 中每一個n和m是1-24。
16. 權(quán)利要求15的分離的或純化的多肽或肽模擬物或脂肪酸衍生物， 其中n或m是16。
17. 權(quán)利要求1-9任一項的分離的或純化的多肽或肽模擬物或脂肪酸 衍生物，其還包括細(xì)胞-穿透肽(CPP)。
18. 權(quán)利要求17的分離的或純化的多肽或肽模擬物或脂肪酸衍生物， 其中所述CPP包括SEQ ID NO: 78或79的氨基酸序列。
19. 權(quán)利要求l-18任一項的分離的或純化的多肽或肽模擬物或脂肪酸 衍生物，其中所述肽模擬物包括具有下述結(jié)構(gòu)的甲基化肽主鏈..■ NCH3-Ca—CO-NCH3，a-CO...側(cè)鏈 側(cè)鏈。
20. 權(quán)利要求l-19任一項的分離的或純化的多肽或肽模擬物或脂肪酸 衍生物，其包括約10-約12個氨基酸。
21. —種綴合物，其包括(i)多肽或肽模擬物，或其脂肪酸衍生物，所 述多肽或肽模擬物包括Smoothened(SMO)蛋白(SEQ ID NO: 1)的一部分、 其功能片段、或者所述部分或所述功能片段的功能變體的氨基酸序列，其 中所述部分包括SEQ ID NOs: 2 - 4中的任一氨基酸序列，其中所述功能片 段包括SEQIDNO:2、 3、或4的至少7個連續(xù)氨基酸，并且其中所述功能片段或功能變體抑制患病細(xì)胞的增殖，和(ii)靶向部分。
22. 編碼多肽的分離的或純化的核酸，所述多肽包括Smoothened (SMO)蛋白(SEQIDNO: l)的一部分、其功能片段、或者所述部分或所述 功能片段的功能變體的氨基酸序列，其中所述部分包括SEQ ID NOs: 2 - 4 中的任一氨基酸序列，其中所述功能片段包括SEQ ID NO: 2、 3、或4的 至少7個連續(xù)氨基酸，并且其中所述功能片段或功能變體抑制患病細(xì)胞的 增殖。
23. 重組表達(dá)載體，其包括編碼多肽的核酸，所述多肽包括Smoothened (SMO)蛋白(SEQIDNO: l)的一部分、其功能片段、或者所述部分或所述 功能片段的功能變體的氨基酸序列，其中所述部分包括SEQ ID NOs: 2 - 4 中的任一氨基酸序列，其中所述功能片段包括SEQIDNO:2、 3、或4的 至少7個連續(xù)氨基酸，并且其中所述功能片段或功能變體抑制患病細(xì)胞的增殖。
24. 包括重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述重組表達(dá)載體包括編碼多肽 的核酸，所述多肽包括Smoothened (SMO)蛋白(SEQ ID NO: l)的一部分、 其功能片段、或者所述部分或所述功能片段的功能變體的氨基酸序列，其 中所述部分包括SEQ ID NOs: 2 - 4中的任一氨基酸序列，其中所述功能片 段包括SEQ ID NO: 2、 3、或4的至少7個連續(xù)氨基酸，并且其中所述功 能片段或功能變體抑制患病細(xì)胞的增殖。
25. 藥物組合物，其包括權(quán)利要求l-20任一項的多肽或肽模擬物或脂 肪酸衍生物，任選地，脂質(zhì)、和藥用載體。
26. 藥物組合物，其包括權(quán)利要求21的綴合物，任選地，脂質(zhì)、和藥 用載體。
27. 藥物組合物，其包括權(quán)利要求22的核酸，任選地，脂質(zhì)、和藥用 載體。
28. 藥物組合物，其包括權(quán)利要求23的重組表達(dá)載體，任選地，脂質(zhì)、 和藥用載體。
29. 權(quán)利要求25-28任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物是局 部制劑。
30. 權(quán)利要求29的藥物組合物，其中所述局部制劑是膏劑、洗液、油 膏、或貼片。
31. 權(quán)利要求30的藥物組合物，其中所述洗液還包括紫外(UV)光 線阻隔劑。
32. 權(quán)利要求25-28任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物是靜 脈內(nèi)制劑或皮下制劑。
33. 抑制患病細(xì)胞增殖的方法，其包括使所述患病細(xì)胞與有效抑制所 述患病細(xì)胞增殖的量的權(quán)利要求25-32任一項的藥物組合物接觸。
34. 權(quán)利要求33的方法，其中所述患病細(xì)胞存在于宿主中。
35. 權(quán)利要求34的方法，其中所述宿主是哺乳動物。
36. 權(quán)利要求35的方法，其中所述哺乳動物是人。
37. 權(quán)利要求33-36任一項的方法，其中所述方法治療或預(yù)防宿主的 癌癥。
38. 權(quán)利要求37的方法，其中所述癌癥是乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、 胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、黑素瘤、基細(xì)胞癌、橫紋肌肉瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、 胰腺癌、肺癌、甲狀腺癌、骨髓瘤、淋巴瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、或肉瘤。
39. 權(quán)利要求38的方法，其中所述胃癌是胃腺癌。
40. 權(quán)利要求33-36任一項的方法，其中所述方法治療或預(yù)防宿主的 腫瘤。
41. 權(quán)利要求33-40任一項的方法，其中所述藥物組合物局部施用給 宿主。
42. 權(quán)利要求33-37任一項的方法，其中所述藥物組合物腫瘤內(nèi)施用 給宿主。
43. 治療或預(yù)防宿主中的癌癥的方法，其包括給所述宿主施用有效治 療或預(yù)防所述癌癥的量的權(quán)利要求25-32任一項的藥物組合物。
44. 治療宿主中的銀屑病的方法，其包括給所述宿主施用有效治療銀 屑病的量的權(quán)利要求25-32任一項的藥物組合物。
45. 治療宿主中的腫瘤的方法，其包括給所述宿主施用有效治療所述 腫瘤的量的權(quán)利耍求25-32任一項的藥物組合物。
46. 抑制患病細(xì)胞中選自由下列各項組成的組的基因的表達(dá)的方法 G7!W、 G7/-2、 G7!'-3、尸fc/j、幼/ 、 Swo、 A^S*、以及它們的組合，所述方法 包括使所述患病細(xì)胞與有效抑制所述基因表達(dá)的量的權(quán)利要求25-32任一 項的藥物組合物接觸。
47. 抑制患病細(xì)胞中Hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的方法，所述方法包括使 所述患病細(xì)胞與有效抑制Hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的量的權(quán)利要求25-32 任--項的藥物 組合物接觸。
48. 分離的或純化的多肽或肽模擬物，包括Smoothened (SMO)蛋白 (SEQIDNO: l)的一部分、其功能變體的氨基酸序列，其中所述部分包括 SEQ ID NOs: 5 - 8中的任一氨基酸序列，其中所述多肽或肽模擬物長度小 于約50個氨基酸，其中所述功能變體包括SEQ ID NO: 80的氨基酸序列。
49. 權(quán)利要求1-20和48任--項的多肽或肽模擬物或脂肪酸衍生物在 制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于在宿主中治療或預(yù)防癌癥、治療銀屑病、 或治療腫瘤。
50.權(quán)利要求1-20和48任一項的多肽或肽模擬物或脂肪酸衍生物， 用于在宿主中治療或預(yù)防癌癥、治療銀屑病、或治療腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開一種分離的或純化的多肽或肽模擬物，或其脂肪酸衍生物，所述多肽或肽模擬物包括Smoothened(SMO)蛋白一部分、其功能片段、或所述部分或所述功能片段的功能變體的氨基酸序列，其中所述部分包括SMO蛋白任一胞內(nèi)環(huán)的氨基酸序列，其中所述功能片段包括所述胞內(nèi)環(huán)的至少7個連續(xù)氨基酸，并且其中所述功能片段或功能變體抑制患病細(xì)胞的增殖。還提供了相關(guān)綴合物、核酸、重組表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、和藥物組合物。本發(fā)明還提供抑制患病細(xì)胞增殖、治療或預(yù)防癌癥、治療腫瘤或銀屑病、和抑制參與Hedgehog信號傳導(dǎo)途徑的基因表達(dá)由此抑制Hedgehog信號傳導(dǎo)途徑的方法。
文檔編號C07K14/705GK101616931SQ200780046085
公開日2009年12月30日 申請日期2007年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月31日
發(fā)明者娜佳·塔拉索瓦, 宏 樓, 邁克爾·迪安 申請人:美國政府衛(wèi)生與公共服務(wù)部