專利名稱：：具有改良的種子產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物及其制備方法具有改良的種子產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般地涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域并涉及用于改良植物中多種經(jīng)濟(jì)上重要的產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。更具體地，本發(fā)明涉及通過在植物中調(diào)節(jié)編碼III類海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)多肽的核酸的表達(dá)而改良植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。本發(fā)明還涉及具有III類TPP多肽編碼核酸序列改變的表達(dá)的植物，其中所述植物相對(duì)于對(duì)照植物具有改良的產(chǎn)量相關(guān)性狀。本發(fā)明還涉及新的III類TPP核酸和多肽序列。本發(fā)明還提供用于本發(fā)明方法中的核酸和多肽序列，以及包含此類核酸的構(gòu)建體。持續(xù)增長(zhǎng)的世界人口和農(nóng)業(yè)用可耕地供應(yīng)萎縮刺激了有關(guān)增加農(nóng)業(yè)效率的研究。常規(guī)的作物及園藝學(xué)改良手段利用選擇育種技術(shù)以鑒定具有受歡迎特性的植物。然而，此類選擇育種技術(shù)具有幾個(gè)缺陷，即這些技術(shù)一般耗費(fèi)很多勞動(dòng)并且產(chǎn)生這樣的植物，其經(jīng)常含有異源性遺傳組分，其可能不總是導(dǎo)致從親代植物中傳遞的所希望性狀。分子生物學(xué)i^已經(jīng)允許人類改良動(dòng)物及植物的種質(zhì)。植物的遺傳工程使得可以分離和操作遺傳物質(zhì)(一般處于DNA或RNA形式)并且隨后導(dǎo)入該遺傳物質(zhì)至植物中。此類技術(shù)具有產(chǎn)生具備多種經(jīng)濟(jì)學(xué)、農(nóng)學(xué)或園藝學(xué)改良性狀的作物或植物的能力。具有特殊經(jīng)濟(jì)意義的性狀是增加的產(chǎn)量。產(chǎn)量通常定義為來自作物的經(jīng)^h值的可測(cè)量結(jié)果。該結(jié)果可以就數(shù)量和/或品質(zhì)方面進(jìn)行定義。產(chǎn)量直接取決于幾個(gè)因素，例如器官的數(shù)目和大小、植物結(jié)構(gòu)(例如枝條的數(shù)目)、種子產(chǎn)生、葉衰老等。纟艮發(fā)育、養(yǎng)分纟HX量、脅迫耐受性和早期萌發(fā)勢(shì)(earlyvigor)也可以是決定產(chǎn)量的重要因素。優(yōu)化前述因素因而可以對(duì)增加作物產(chǎn)量有貢獻(xiàn)。種子產(chǎn)量是尤其重要的性狀，因?yàn)樵S多植物的種子對(duì)于人類和動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)非常重要。作物如谷物、稻、小麥、蕓苔和大豆占人類總卡路里攝取量的一半以上，不論是通過種子本身的直接消費(fèi)，還是通過由加工的種子所飼養(yǎng)的肉類產(chǎn)品的消費(fèi)。它們也是工業(yè)加工所用的糖類、油類和多類代謝物的來源。種子含有胚(新的芽和根的來源)和胚乳(萌發(fā)以及幼苗早期生長(zhǎng)過程中胚生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)源)。種子的發(fā)育涉及許多基因，并且需要代謝物自根、葉和莖轉(zhuǎn)移至正在生長(zhǎng)的種子。特別是胚乳，吸收糖類、油類和蛋白質(zhì)的代謝前體，將其合成為貯存高分子，以使谷粒飽滿。對(duì)于眾多作物的另一個(gè)重要性狀是早期萌發(fā)勢(shì)。改良早期萌發(fā)勢(shì)是現(xiàn)代稻育種計(jì)劃在溫帶和熱帶稻品種上的重要目標(biāo)。長(zhǎng)根在水栽稻中對(duì)于正確土壤固定是重要的。在將稻直接播種至被淹沒田地的情況下，以及在植物必須從水中迅速出苗的情況下，較長(zhǎng)的莖與萌發(fā)勢(shì)相關(guān)。在實(shí)施條播的情況下，較長(zhǎng)的中胚軸和胚芽鞘對(duì)于良好出苗是重要的。將早期萌發(fā)勢(shì)人工改造到植物內(nèi)的能力將在農(nóng)業(yè)中是極其重要的。例如，不良的早期萌發(fā)勢(shì)已經(jīng)限制了基于玉米帶種質(zhì)(CornBeltgermplasm)的玉蜀黍(ZeamayesL.)雜種在歐洲大西洋地區(qū)的引種。另一重要性狀是改良的非生物脅迫耐受性。非生物脅迫是世界范圍作物損失的主要原因，對(duì)于大多數(shù)主要作物植物而言降低平均產(chǎn)量超過50。/。(Wang等、Planta(2003)218:1-14)。非生物脅迫可以由干旱、鹽度、極端溫度、化學(xué)毒性和氧化脅迫引起。提高植物對(duì)非生物脅迫耐受性的能力將在世界范圍對(duì)農(nóng)民是極大經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)并且會(huì)允許在不利條件期間及在作物栽培否則是不可能的陸地上栽培作物。另一個(gè)重要的產(chǎn)量相關(guān)性狀是植物生物量，尤其是對(duì)于飼料作物如苜蓿、青J^谷物和干草。具有更大葉面積的較大植物通常能夠比較小的植物吸收更多的光和二氧化碳，因此很可能在同期增重更多(Fasoula&Tollenaar2005Maydica50:39)。增加植物產(chǎn)量的能力將在諸如農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中具有許多應(yīng)用，包括觀賞植物的生產(chǎn)、樹木栽培、園藝和森林業(yè)。增加產(chǎn)量也可以用于在生物反應(yīng)器中^f吏用的藻類生產(chǎn)(用于諸如藥物、抗體或疫苗等物質(zhì)的生物技術(shù)生產(chǎn)，或用于有機(jī)廢物的生物轉(zhuǎn)化)及其它這類領(lǐng)域。植物種植者通?；谒槍?duì)的作物或植物，以及經(jīng)濟(jì)上有價(jià)值的植物或作物的部分，對(duì)改良產(chǎn)量的特定方面感興趣。例如，對(duì)于某些作物或某些最終用途，植物種植者可能特別看重植物一個(gè)或多個(gè)部分的植物生物量(重量)的提高，所述部分包括地上(可收獲)部分和/或地下(可收獲)部分。這與植物消費(fèi)的是地上部分還是地下部分尤其相關(guān)。對(duì)于許多作物，尤其是谷物，特別期望提高種子產(chǎn)量。提高的種子產(chǎn)量可以以多種方式表現(xiàn)，基于所針對(duì)的作物或植物及其最終用途，種子產(chǎn)量的各個(gè)方面對(duì)于植物種植者的重要性不同。能夠凈4選和選擇待改變的產(chǎn)量或種子產(chǎn)量的方面，對(duì)于植物種植者將是尤其有利的。特別期望挑出可用的基因，即合適改變種子產(chǎn)量的具體方面或組分的基因。例如，增加的飽滿率和增加的千粒重對(duì)于諸如玉米的作物是高度期望的。對(duì)于稻和小麥，增加的飽滿率、收獲指數(shù)和增加的千粒重是高度期望的?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在植物中調(diào)節(jié)編碼III類海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)多肽的核酸的表達(dá)，產(chǎn)生具有多種改良的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物。在幾個(gè)生物界(lifekingdom)發(fā)現(xiàn)海藻糖，其是由通過en-l，l鍵連接的兩個(gè)葡萄糖分子組成的非還原性二糖。在細(xì)菌、真菌和昆蟲中，顯示海藻糖具有糖類儲(chǔ)存功能并在脅迫耐受性中發(fā)揮功能。在植物中，海藻糖開始被認(rèn)為限于嗜極端生物(extremophite)例如更蘇植物復(fù)活草(Selaginellalepidophylla),但是現(xiàn)在廣泛接受的是海藻糖代謝在植物界是遍在的。海藻糖在兩個(gè)酶促反應(yīng)中從UDP-葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸合成。在第一步中通過酶TPS(海藻糖磷酸合酶)，UDP-葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為UDP(尿苷二磷酸)和a，a-海藻糖6-磷酸(TA-P)。在第二步中，通過酶TPP(海藻糖磷酸磷酸酶)的催化，T-6-P去磚酸化產(chǎn)生海藻糖和正磚酸。在酵母中，大的蛋白質(zhì)復(fù)合物中存在兩中酶活性(TPS和TPP活性)，所述蛋白質(zhì)復(fù)合物包含活性亞基TPS1和TPS2以及調(diào)節(jié)亞基，TPS1具有TPS活性，而TPS2具有TPP活性。在大腸桿菌(E.coli)中，這兩種酶活性在不同的蛋白質(zhì)復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)。在植物中，至今沒有表征這種蛋白質(zhì)復(fù)合物。擬南芥中，海藻糖生物合成酶分為三類I類包含四個(gè)基因，AtTPSl至AtTPS4與ScTPSl具有高度相似性；II類具有7個(gè)成員，AtTPS5至AtTPSll與ScTPS2具有高M(jìn)列相似性。以及III類具有10個(gè)成員，AtTPPA至AtTPPJ，編碼的蛋白質(zhì)與大腸桿菌TPS2和ScTPS2蛋白質(zhì)的C端具有相似性。編碼這些類別的蛋白質(zhì)的基因也存在于其他植物物種中。在I類和II類中，僅明確確定了AtTPSl的酶活性，所述AtTPSl顯示TPS活性(Blazquez等，PlantJ.1998年3月；13(5):685畫9.)。令人驚訝的是，至今沒有任何其他II類TPS蛋白質(zhì)的TPP活性報(bào)導(dǎo)。相反，之前已對(duì)AtTPPA和AtTPPB(III類的兩個(gè)成員)描述了TPP活性(Vogel等，Plant丄1998年3月；13(5):673-83)。植物III類TPP含有兩個(gè)磷酸酶共有結(jié)構(gòu)基序，其在至今描迷的所有TPP酶中發(fā)現(xiàn)(Thaller等，ProteinSci.1998年7月；7(7):1647-52)。已報(bào)導(dǎo)海藻糖生物合成基因的基因操作導(dǎo)致植物中提高的脅迫耐受性，并導(dǎo)致巨大的發(fā)育改變。已報(bào)導(dǎo)大腸桿菌OtsA和OtsB基因在轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯植物中的過量表達(dá)導(dǎo)致根和葉發(fā)育失常，以及植物發(fā)育遲緩。在OtsA轉(zhuǎn)基因煙草植物中產(chǎn)生較少的種子，而在OtsB轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物中沒有產(chǎn)生塊莖(Goddijn等，PlantPhysiol,l"7年1月；113(l):181-90)，其他人描述了相似的結(jié)果(Holmstrom等，Nature,379，683-684;Romero等，Planta，201，293-297;Pilont-Smits等，1998;JPlantPhysiol.152:525-532;Schluepmann等，ProcNatlAcadSci美國(guó)，2003;100(ll):6849-54)。據(jù)報(bào)導(dǎo)TPS和TPP基因中的突變?nèi)毕蒿@示發(fā)育缺陷。擬南芥中TPS1敲除突變體胚發(fā)育受損(Eastmond等，PlantJ.2002年1月；29(2):225-35)。Jackson等的公開的US專利申請(qǐng)，US20060191040提及玉米基因RAMOSA3(RA3)的分離和表征，據(jù)報(bào)導(dǎo)所述RAMOSA3負(fù)責(zé)分生組織發(fā)育和花序發(fā)育，包括分枝(branching)。這表明基因、基因產(chǎn)物和調(diào)節(jié)區(qū)可用于控制分枝、分生組織生長(zhǎng)、花序發(fā)育和排列，并最終提高植物產(chǎn)量。雖然改變的結(jié)構(gòu)(由于分枝的改變或花序結(jié)構(gòu)的改變)在一些情況下可以導(dǎo)致產(chǎn)量的增加或種子產(chǎn)量的增加，但這不確定。有許多在增加產(chǎn)量或增加種子產(chǎn)量能夠?qū)崿F(xiàn)之前需要取代(inplace)的其他組分。例如，沒有結(jié)實(shí)率(seedset)、種子飽滿(率)、植物能育性等，將沒有種子產(chǎn)量的增加。另外，Jackson等沒有提及可以改良產(chǎn)量的哪個(gè)方面，是植物特定部分的生物量還是提高種子產(chǎn)量(其可以是種子大小、種子數(shù)量、千粒重、收獲指數(shù)或其他種子產(chǎn)量相關(guān)的。因此，令人驚訝的發(fā)現(xiàn)在植物中調(diào)節(jié)III類TPP多肽的表達(dá)產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物，具有多種改良的產(chǎn)量相關(guān)性狀(尤其是增加的種子產(chǎn)量)的植物。此后之后"用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)，，的任何引用意指如本文定義的III類TPP多肽。在此之后"用于本發(fā)明方法的核酸"的任何引用意指能夠編碼此類III類TPP多肽的核酸。術(shù)語(yǔ)"多肽，，和"蛋白質(zhì)，，在本文中可互換使用并且指任意長(zhǎng)度的聚合形式的氨基酸。術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"、"核酸序列"、"核苷酸序列"、"多核苷酸分子，，在本文中可互換使用并且指處于任意長(zhǎng)度聚合形式中的核苷酸，即核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或這二者組合。選捧合適的對(duì)照植物是實(shí)驗(yàn)設(shè)置的慣用部分并且可以包括對(duì)應(yīng)的野生型植物或無目的基因的對(duì)應(yīng)植物。對(duì)照植物一般是與待評(píng)估植物相同的植物物種或甚至是相同的變種。對(duì)照植物也可以是待評(píng)估植物的失效合子。如本文中所用的"對(duì)照植物"不僅指整林植物，還指植物部分，包括種子及種子部分。用于調(diào)節(jié)(優(yōu)選增加)用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)的編碼核酸表達(dá)的優(yōu)選方法是通過在植物中引入和表達(dá)如下文定義用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)的編碼核酸。待引入植物(并且因而用于實(shí)施本發(fā)明方法)的核酸是編碼現(xiàn)將描述的蛋白質(zhì)類型的任意核酸，下文又稱作"ni類tpp核酸"或"ni類tpp基因"或"III類TPP多肽，，。如本文所定義的"III類TPP多肽"意指任意具有海藻糖-6-磷酸磷酸酶活性，包含至少一個(gè)海藻糖-^酸酶(海藻糖-磷酸磷酸酶)結(jié)構(gòu)域的多肽。海藻糖-磷酸鱗酸酶結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度一般為200-250個(gè)氨基酸，且一般包含磷酸酶共有序列基序，所述基序在至今所有描述的TPP酶中發(fā)現(xiàn)(Thaller等，1998)。海藻糖-磷酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域的代表性的共有序列在SEQIDNO:93中給出。SEQIDNO:2中包含的海藻糖-磷酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域的^Ju^列在SEQIDNO:94中給出。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用本領(lǐng)域已知的工具和技術(shù)，將容易的鑒定海藻糖-磷酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域的存在。本文中的實(shí)施例2、3和4提供有關(guān)海藻糖-磷酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域鑒定的進(jìn)一步細(xì)節(jié)。在III類TPP多肽中，該磷酸酶共有序列基序一般含有兩個(gè)磷酸酶框，稱為A和B-磷酸酶框。SEQIDNO:96表示磷酸酶框A的共有序列，SEQIDNO:97表示磷酸酶框B的共有序列。用于本發(fā)明方法的核酸編碼包含至少一個(gè)海藻糖-磷酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域的III類TPP多肽，所述結(jié)構(gòu)域按照遞增的優(yōu)選順序，優(yōu)選與SEQIDNO:93或SEQIDNO:94具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%或更高的氨基酸序列同一性。進(jìn)一步優(yōu)選地，海藻糖-磷酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域包含至少一個(gè)(優(yōu)選兩個(gè))磷酸酶框，所述磷酸酶框按照遞增的優(yōu)選順序，與磷酸酶框或SEQIDNO:96或SEQIDNO:97具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%或更高的序列同一性。III類TPP多肽還包含絲氨酸富含區(qū)，所述絲氨酸富含區(qū)一般位于海藻糖-磷酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域的N端。SEQIDNO:95代表絲氨酸富含結(jié)構(gòu)域的共有序列。優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法的核酸編碼III類TPP多肽，所述m類TPP多肽包含絲氨酸富含結(jié)構(gòu)域，所迷絲氨酸富含結(jié)構(gòu)域按照遞增的優(yōu)選順序，與SEQIDNO:95具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、卯％、95%或98%或更高的序列同一性。優(yōu)選地，引入植物的核算編碼III類TPP蛋白質(zhì)，所述III類TPP蛋白質(zhì)按照遞增的優(yōu)選順序，與選自SEQIDNO:4、6和8的序列具有至少80%、85%、卯％、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。最優(yōu)選地，III類TPP核酸由SEQIDNO:3、5和7中的任一個(gè)所示。一般的，當(dāng)III類TPP多肽用于構(gòu)建TPP/TPS系統(tǒng)樹(例如圖2A所示的)時(shí)，趨向聚蔟于包含SEQIDNO:2所示M酸序列的III類TPP蛋白質(zhì)組，而不是聚蔟于任何其他組。用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)的實(shí)例和其編碼核酸由本文實(shí)施例的1表A提供。還可以用于本發(fā)明方法的是實(shí)施例的1表A中給出的任意氨基酸序列的同源物。蛋白質(zhì)的"同源物，，包括這樣的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)及酶，它們相對(duì)于非修飾的上述蛋白質(zhì)具有M酸取代、缺失和/或插入并且與所述肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)及酶來源的非修飾蛋白質(zhì)具有相似生物學(xué)活性和功能活性。缺失指從蛋白質(zhì)中移除一個(gè)或多個(gè)氨基酸。插入指一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基在蛋白質(zhì)中預(yù)定位點(diǎn)內(nèi)的引入。插入可以包含單個(gè)或多個(gè)氣基酸的N端融合和/或C端融合以及序列內(nèi)插入。通常，在M酸序列內(nèi)部的插入會(huì)比N端融合或C端融合更小，約1-10個(gè)殘基級(jí)別。N端或C端融合蛋白或融合肽的實(shí)例包括如酵母雙雜交系統(tǒng)中所用轉(zhuǎn)錄激活物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)-6-標(biāo)簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-標(biāo)簽、A蛋白、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag'100表位、c-myc表位、FLAG⑧-表位、lacZ、CMP(鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。取代指以具有相似特性(如相似疏水性、親水性、抗原性、形成或破壞a-螺旋結(jié)構(gòu)或P-折疊結(jié)構(gòu)的傾向)的其他M酸替換蛋白質(zhì)的氨基酸。M酸取代一般是單個(gè)殘基的，不過可以是蔟集性的，這取決于置于多肽的功能性約束；插入通常會(huì)是約1-10個(gè)氨基酸殘基級(jí)別。JL&酸取代優(yōu)選地是保守性氨基酸取代。保守性取代表是本領(lǐng)域眾所周知的(見例如Creighton(1984)Proteins.W.H.FreemanandCompany和下表1)。表l:保守性M酸取代的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>氨基酸取代、缺失和/或插入可以使用本領(lǐng)域眾所周知的肽合成技術(shù)如固相肽合成法等或通過重組DNA操作而輕易地進(jìn)行。用于操作DNA序列以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的取代、插入或缺失變體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，用于在DNA中的預(yù)定位點(diǎn)處產(chǎn)生取代突變的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的并且包括M13誘變法、T7-Gen體外誘變法(USB，Clevelaand,OH)、QuickChange位點(diǎn)定向誘變法(Stratagene，SanDiego,CA)、PCR-介導(dǎo)的位點(diǎn)定向誘變或其他位點(diǎn)定向誘變法。還可以用于本發(fā)明方法的是實(shí)施例的l表A中給出的任一多肽的衍生物，或?qū)嵤├?表A中給出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物，或表A中給出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物的衍生物。"衍生物"包括這樣的肽、寡肽、多肽，其中與天然發(fā)生形式的蛋白質(zhì)(如SEQIDNO:2所示的)的M酸序列相比，它們包含以非天然發(fā)生的氛基酸殘基對(duì)氨基酸的取代或非天然發(fā)生的M酸殘基的添加。實(shí)施例的l表A中給出的多肽的衍生物是合適用于本發(fā)明方法的其他實(shí)例。用于本發(fā)明方法的衍生物優(yōu)選與其衍生自的非修飾蛋白質(zhì)具有相似的生物學(xué)活性和功能活性。多肽的"衍生物"包含這樣的肽、寡肽、多肽，其中與蛋白質(zhì)(例如目的蛋白質(zhì))的天然發(fā)生形式的氨基酸序列相比，它們包含以非天然發(fā)生的氨基酸殘基對(duì)氨基酸的取代或非天然發(fā)生的氛基酸殘基的添加。蛋白質(zhì)"衍生物"也包含這樣的肽、寡肽、多肽，其中與多肽的天然發(fā)生形式的氨基酸序列相比，它們包含天然發(fā)生的改變(糖基化、?；?、異戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻?；?、硫酸鹽化等)氨基酸殘基或非天然的改變氨基酸殘基。與衍生物所來源的氨基酸序列相比，該衍生物可以也包含與所述M酸序列共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)非氨基酸取代基或添加(例如報(bào)道分子或其他配體)，如為促進(jìn)檢測(cè)該衍生物而結(jié)合的報(bào)道分子，和與天然發(fā)生的蛋白質(zhì)的氨基酸序列相對(duì)比的非天然發(fā)生的氨基酸殘基。另外，"衍生物"也包括蛋白質(zhì)的天然發(fā)生形式和諸如FLAG、HIS6或硫氧還蛋白(標(biāo)簽肽的綜述參見Terpe，Appl.Microbiol.Biotechnol.60，523-533，2003)的標(biāo)簽肽的融合物。本發(fā)明通過用由SEQIDNO:l所示的編碼多肽序列SEQIDNO:2的擬南芥核酸序列轉(zhuǎn)化的植物加以說明，然而，本發(fā)明的實(shí)施不限于這些序列。本發(fā)明方法可以有利地使用編碼如文中所定義的用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)的任意核酸進(jìn)行，所述核酸包括SEQIDNO:2的直向同源物、旁系同源物和同源物的編碼核酸，例如(但不限于)實(shí)施例1的表A中給出的任何核酸序列。實(shí)施例的1表A中給出的M酸序列是用于本發(fā)明方法的SEQIDNO:2所示的III類TPP多肽的直向同源物和旁系同源物，和其編碼核酸的實(shí)例。直向同源物和旁系同源物包含用來描迷基因祖先關(guān)系的進(jìn)化概念。旁系同源物是相同物種內(nèi)起源于先祖基因復(fù)制的基因，而直向同源物是來自不同生物的起源于物種形成的基因，也源自相同的先祖基因。直向同源物和旁系同源物可以通過開展所謂交互性blast搜索而容易地找到。其一般包括笫一BLAST,所述第一BLAST參與提交查詢序列(例如使用實(shí)施例1的表A中列出的任何序列)用于針對(duì)任一序列數(shù)據(jù)庫(kù)(如公眾可用的NCBI數(shù)據(jù)庫(kù))的BLAST搜索。當(dāng)從核苷酸序列開始時(shí)，通常使用BLASTN或TBLASTX(使用標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)值)，并且當(dāng)從蛋白質(zhì)序列開始時(shí)，可以使用BLASTP或TBLASTN(使用標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)值)。任選地可以篩選BLAST結(jié)果。隨后提交篩選結(jié)果和非篩選結(jié)果的全長(zhǎng)序列以針對(duì)來自生物的序列進(jìn)行反向BLAST(第二BLAST),其中查詢序列來自所述的生物(其中在查詢序列是SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的情況下，第二BLAST因而將針對(duì)擬南芥序列)。隨后比較第一和第二BLAST搜索的結(jié)果。若來自第一BLAST的高階位命中源自與查詢序列從其中衍生的物種相同的物種，反向BLAST隨后理想地以最高命中的查詢序列中產(chǎn)生，則鑒定到旁系同源物；若第一BLAST的中的高階位命中不源自與查詢序列從其中衍生的物種相同的物種，并且優(yōu)選地在反向BLAST時(shí)產(chǎn)生屬于最高命中之列的查詢序列，則鑒定到直向同源物。高階位命中是具有低E-值的那些命中。E-值越低，評(píng)分越顯著(或換句話說，此命中因偶然而發(fā)生的幾率越低)。E-值的計(jì)算是本領(lǐng)域眾所周知的。除了E-值外，比較結(jié)果還由同一性百分?jǐn)?shù)記分。同一性百分?jǐn)?shù)指兩個(gè)所比較核酸(或多肽)序列之間在特定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的相同核苷酸(或M酸)數(shù)目。在大型家族的情況下，可以使用CIustalW,隨后使用鄰接樹法以便幫助顯示相關(guān)基因的聚類和以便鑒定直向同源物和旁系同源物。實(shí)施例1的表A給出由SEQIDNO:2所示的III類TPP蛋白質(zhì)的直向同源物和旁系同源物的實(shí)例。使用上迷BLAST過程可以容易地鑒定到其他直向同源物和旁系同源物。本發(fā)明的蛋白質(zhì)通過一個(gè)或多個(gè)保守的海藻糖磷酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域的存在是可以鑒定的(如圖1和實(shí)施例4所示)術(shù)語(yǔ)"結(jié)構(gòu)域"指沿進(jìn)化相關(guān)蛋白質(zhì)的序列比對(duì)結(jié)果而在特定位置處保守的一組氛基酸。盡管在其他位置處的氛基酸可以在同源物之間變動(dòng)，然而在特定位置處的高度保守的M酸指示在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或活性方面是必需的氨基酸。結(jié)構(gòu)域因通過在蛋白質(zhì)同源物家族的比對(duì)序列中的高保守程度而被鑒定，它們可以用作鑒定物以確定任意的所討論多肽是否屬于先前已鑒定的多肽家族(在此情況下，用于本發(fā)明方法中的蛋白質(zhì)及其編碼核酸如本文所定義)。術(shù)語(yǔ)，，基序"或"共有序列"或"標(biāo)簽，，指在進(jìn)化相關(guān)蛋白質(zhì)的序列中的短保守區(qū)。基序往往是結(jié)構(gòu)域的高度保守部分，不過也可以僅包括結(jié)構(gòu)域的部分，或可以位于保守結(jié)構(gòu)域之外(若基序的全部M酸位于定義的結(jié)構(gòu)域之外)。也存在用于簦定結(jié)構(gòu)域的專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)，如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.美國(guó)95，5857-5864;Letunic等(2002)NucleicAcidsRes30，242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，用于生物分子序列基序的廣義圖i瞽語(yǔ)法及其在自動(dòng)化序列判讀中的功能，(在)ISMB-94;第二屆分子生物學(xué)智能系統(tǒng)國(guó)際^H義文集.AltmanR.，BrutlagD.，KarpP.，LathropR.,SearlsD.編，笫53-61頁(yè)，AAAIPress，MenloPark;Hulo等，Nucl.Acids-Res.32:D134-D137,(2004))或Pfam(Bateman等，NucleicAcidsResearch30(1):276-280(2002))鑒定。用于計(jì)算機(jī)芯片上分析蛋白質(zhì)序列的一組工具可在ExPASY蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)器上獲得(在SwissInstituteofBioinformatics上駐留(Gasteiger等，ExPASy:用于深入認(rèn)識(shí)和分析蛋白質(zhì)的蛋白組學(xué)服務(wù)器，NucleicAcidsRes.31:3784-3788(2003))。也使用本領(lǐng)域熟知的常規(guī)技術(shù)可以容易地鑒定結(jié)構(gòu)域，例如通過序列比對(duì)鑒定。用于比對(duì)序列用于比較的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，此類方法包括GAP、BESTF1T、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)JMolBiol48:443-453)以找到使匹配數(shù)最大化并使空位數(shù)最小化的兩個(gè)完整序列(覆蓋整個(gè)序列的)的全局比對(duì)。BLAST算法(Altschul等(1990)JMolBiol215:403-10)計(jì)算序列同一性百分?jǐn)?shù)并執(zhí)行對(duì)兩個(gè)序列間相似性的統(tǒng)計(jì)分析。用于執(zhí)行BLAST分析的軟件是公眾通過國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)可獲得的。同源物物可以使用例如ClustalW多重序列比對(duì)算法(1.83版本)以默認(rèn)配對(duì)比對(duì)參數(shù)和評(píng)分方法(以百分?jǐn)?shù)計(jì))而輕易地鑒定。相似性和同一性的全局百分?jǐn)?shù)也可以使用在MatGAT軟件包中可獲得的方法之一而確定(Campanella等，BMCBioinformatics.2003Jul10;4:29.MatGAT:使用蛋白質(zhì)或DNA^列而產(chǎn)生相似性/同一性矩陣的應(yīng)用)?？梢赃M(jìn)行細(xì)微手工編著以優(yōu)化保守基序之間的比對(duì)，如本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見。此外除了使用全長(zhǎng)序列以鑒定同源物，也可以使用特定結(jié)構(gòu)域(如海藻糖磷酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域或上面定義的基序之一)。在實(shí)施例3中以百分比描述的序列同一性值使用上述程序，利用默認(rèn)參數(shù)，針對(duì)完整核酸或M酸序列和針對(duì)選擇的結(jié)構(gòu)域或保守基序確定。另外，III類TPP蛋白質(zhì)(至少以其天然形式)一般具有海藻糖磷酸酶活性。具有海藻糖磷酸酶活性的多肽屬于根據(jù)生物化學(xué)與分子生物學(xué)國(guó)BiochemistryandMolecularBiology(NC畫IUBMB))的酶委員會(huì)分類的EC:3.1.3.12類酶。EC:3.1.3.12類酶催化反應(yīng)海藻糖-6-磷酸+H20=海藻糖+磷酸。海藻糖磷酸酶蛋白質(zhì)的活性可通過確定體外反應(yīng)中處理的底物水平和積累的產(chǎn)物水平測(cè)定，即通過反應(yīng)積累的海藻糖-6-磷酸和海藻糖的水平測(cè)定。測(cè)定海藻糖的酶學(xué)方法可基于海藻糖水解為葡萄糖，例如VanDijck等，BiochemJ.2002年8月15日;366(Pt1):63-71和Zentella等，PlantPhysiol.1999年4月；119(4):1473-82描述的那些方法。海藻糖-6-磷酸水平也可以通過Avonce等，PlantPhysiol.2004年11月；136(3):3649-59;Schluepmann等，2003所描述的方法，通過用HPLC(高效液相層析)測(cè)定?；跍y(cè)定從海藻糖-6-磷酸釋放的無機(jī)磷酸的其他的方法也已由Klutts等，JBiolChem.2003年1月24日;278(4):2093-100描述。另一個(gè)使用偶聯(lián)MS-Q3(三級(jí)四極式MS)的液相層析測(cè)定海藻糖-6-磷酸水平的方法已由Lunn等，BiochemJ.2006年7月1日；397(1):139-48描述。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)在實(shí)施例5和實(shí)施例6中提供。適合用于實(shí)施本發(fā)明方法的核酸實(shí)例包括實(shí)施例1的表A中給出的核酸序列，但不限于這些序列。核酸變體可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。這樣的核酸變體實(shí)例包括用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)的編碼核酸的部分、與用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)的編碼核酸雜交的核酸、用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)的編碼核酸的剪接變體、用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)的編碼核酸的等位變體，和通過基因改組獲得的用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)的編碼核酸的變體?，F(xiàn)將描述術(shù)語(yǔ)部分、雜交序列、剪接變體、等位變體和基因改組。用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)的編碼核酸不需要是全長(zhǎng)核酸，因?yàn)楸景l(fā)明方法的實(shí)施不依賴全長(zhǎng)核酸序列的使用。用于本發(fā)明方法的部分編碼多肽，所述多肽落入如本文定義的用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)的編碼核酸的定義內(nèi)，且與實(shí)施例1的表A中給出的M,列具有基本上相同的生物學(xué)活性。優(yōu)選地，部分是實(shí)施例1的表A中給出的任一核酸的部分。部分通常長(zhǎng)度至少為625個(gè)連續(xù)核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)度至少為825個(gè)連續(xù)核苷酸，更優(yōu)選長(zhǎng)度至少為1025個(gè)連續(xù)核苷酸，最優(yōu)選長(zhǎng)度至少為1125個(gè)連續(xù)核苷酸，所述連續(xù)核苷酸是實(shí)施例1的表A中給出的任一核酸序列。最優(yōu)選，部分是核酸SEQIDNO:l的部分。優(yōu)選地，部分編碼^J^酸序列，當(dāng)所迷M^4列用于構(gòu)建TPP/TPS系統(tǒng)樹(例如圖2A所示的)時(shí)，趨向聚蔟于包含SEQIDNO:2所示氨基酸序列的III類TPP蛋白質(zhì)組，而不是聚鎂于任何其他組。如本文所定義的III類TPP蛋白質(zhì)的編碼核酸的部分可以通過對(duì)核酸進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)缺失來制備。部分可以以分離的形式使用，或者可將其與其他編碼(或非編碼)序列融合，以便，例如，產(chǎn)生組合了若干活性的蛋白質(zhì)。當(dāng)與其他編碼序列融合時(shí)，經(jīng)翻譯后所產(chǎn)生的多肽可能比預(yù)測(cè)的III類TPP蛋白質(zhì)部分要大。本發(fā)明提供改良植物產(chǎn)量相關(guān)性狀(尤其是增加種子產(chǎn)量)的方法，其包括在植物中引入和表達(dá)實(shí)施例1的表A中給出的任一核,列的部分、或?qū)嵤├?的表A中給出的任意#^*列的直向同源物、旁系同源物或同源物的編碼核酸的部分。用于本發(fā)明方法的另一核酸變體是在降低的嚴(yán)格條件下、優(yōu)選在嚴(yán)格條件下，能夠與本文所定義的III類TPP蛋白質(zhì)的編碼核酸或與本文所定義的部分雜交的核酸。用于本發(fā)明方法的雜交序列編碼多肽，所述多肽具有海藻糖磷酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域(見圖2A和圖3的比對(duì))，且與實(shí)施例1的表A中給出的任意氨基^列所代表的III類TPP蛋白質(zhì)具有基本上相同的生物學(xué)活性。雜交序列通常長(zhǎng)度至少為625個(gè)連續(xù)核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)度至少為825個(gè)連續(xù)核苷酸，更優(yōu)選長(zhǎng)度至少為1025個(gè)連續(xù)核苷酸，最優(yōu)選長(zhǎng)度至少為1125個(gè)連續(xù)核苷酸，所述連續(xù)核苷酸是實(shí)施例1的表A中給出的任一核酸序列。優(yōu)選地，雜交序列是能夠與實(shí)施例1的表A中給出的任意核酸雜交的序列，或是這些序列的部分，部分如上所定義。最優(yōu)選，雜交序列能夠與核酸SEQIDNO:l所示的核酸或其部分雜交。優(yōu)選地，雜交序列編碼氨基酸序列，當(dāng)所述氨基酸序列用于構(gòu)建TPP/TPS系統(tǒng)樹(例如圖2A所示的)時(shí)，趨向聚簇于包含SEQIDNO:2所示氨基酸序列的m類TPP蛋白質(zhì)組，而不是聚簇于任何其他組。最優(yōu)選地，分離的多核苷酸分子能夠在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:4、6和8所示的任一序列雜交。本發(fā)明提供改良植物產(chǎn)量相關(guān)性狀(尤其是增加種子產(chǎn)量)的方法，其包括在植物中引入和表達(dá)能夠與實(shí)施例1的表A中給出的任一核酸雜交的核酸，或在植物中引入和表達(dá)能夠與實(shí)施例1的表A中給出的任意核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的編碼核酸雜交的核酸。如本文中所定義的術(shù)語(yǔ)，，雜交"是其中基本上同源的互補(bǔ)核苷酸序列相互復(fù)性的過程。雜交過程可以完全在溶液中進(jìn)行，即兩種互補(bǔ)性核酸均處于溶液中。雜交過程也可以在互補(bǔ)性核酸之一固定到基質(zhì)如磁珠、瓊脂糖(Sepharose)珠或任何其他樹脂的情況下發(fā)生。雜交過程也可以在互補(bǔ)性核酸之一固定至固相支持體如硝酸纖維素膜或尼龍膜上或通過例如照相平版印刷術(shù)固定至例如硅酸玻璃支持物(后者稱作核酸陣列或微陣列或稱作核酸芯片)上的情況下進(jìn)行。為使雜M生，通常將核酸分子熱變性或化學(xué)級(jí)結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格性"指在其中發(fā)生雜交的絲。雜交的嚴(yán)格性受條件如溫度、鹽濃度、離子強(qiáng)度和雜交緩沖液組成影響。通常，將低嚴(yán)格性條件選擇為在確定的離子強(qiáng)度及pH時(shí)低于特定序列熱解鏈溫度(Tm)約30°C。中等嚴(yán)格性條件是此時(shí)溫度低于Tm約20。C并且高嚴(yán)格性條件是此時(shí)溫度低于Tm約IO'C。高嚴(yán)格性雜交條件一般用于分離與耙核酸序列具有高序列相似性的雜交序列。然而，核酸可以在序列上偏離并且因遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性而依舊編碼基本上相同的多肽。因而有時(shí)候可能需要中等嚴(yán)格性雜交條件以鑒定此類核酸分子。Tm是在確定的離子強(qiáng)度及pH時(shí)的溫度，在所述溫度下50%的耙序列與完全匹配的探針雜交。Tm取決于溶液條件和探針的堿基組成及長(zhǎng)度。例如，較長(zhǎng)的序列在較高溫度下特異性地雜交。從低于Tm約16'C直至32。C獲得最大雜交速率。一價(jià)陽(yáng)離子在溶液中的存在降低了兩條核酸鏈間的靜電排斥，因而促進(jìn)雜交分子形成；這種作用對(duì)于高達(dá)0.4M的鈉濃度是明顯的(對(duì)于更高濃度，這種效應(yīng)可以忽略)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA雙鏈體的解鏈溫度，每百分?jǐn)?shù)甲酰胺降低0.6-0.7。C，并且添加50。/。甲酰胺允許在30-45。C進(jìn)行雜交，雖然雜交速率會(huì)降低。g對(duì)錯(cuò)配降低了雜交速率及雙鏈體的熱穩(wěn)定性。平均而言并且對(duì)于大的探針來說，每%堿基錯(cuò)配Tm下降約1。C。取決于雜交分子的類型，Tm可以使用下列等式計(jì)算1)DNA-DNA雜交體(Mdnkoth和Wahl,Anal.Biochem.，138:267-284，1984):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>甲酰胺2)DNA-RNA或RNA-RNA雜交體<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>3)寡DNA或寡RNAd雜交體對(duì)于<20個(gè)核苷酸Tm=2(ln)對(duì)于20-35個(gè)核苷酸Tm=22+1.46(ln)a或?qū)τ谄渌粌r(jià)陽(yáng)離子，但是僅在0.01-0.4M范圍內(nèi)是精確的。b僅對(duì)于V。GC在30%-75%范圍內(nèi)是精確的。cL=雙鏈體的長(zhǎng)度(以堿基對(duì)計(jì))。d01igo，寡核苷酸；ln,=引物的有效長(zhǎng)度-2x(G/C數(shù))+(A/T數(shù))?？梢砸员姸嘁阎夹g(shù)的任何一種控制非特異性結(jié)合，例如用含蛋白質(zhì)的溶液封閉薄膜、添加異源性RNA、異源性DNA及SDS至雜交緩沖液并且用RNA酶處理。對(duì)于非同源性探針，一系列雜交可以通過改變以下條件之一進(jìn)行(i)漸進(jìn)地降低復(fù)性溫度(例如從68'C至42。C)或(ii)漸進(jìn)地降j氐曱酰胺濃度(例如從50%至0%)。技術(shù)人員了解雜交期間可以加以改變和將維持或改變嚴(yán)格性條件的多種參數(shù)。除雜交條件之外，雜交特異性一般還取決于雜交后洗滌的功能。為除去因非特異性雜交所致的背景，樣品用稀釋的鹽溶液洗滌。此類洗滌的關(guān)鍵因素包括最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度及溫度鹽濃度越低并且洗滌溫度越高，則洗滌的嚴(yán)格性越高。洗滌條件一般在雜交嚴(yán)格性上或低于雜交嚴(yán)格性而進(jìn)行。陽(yáng)性雜交產(chǎn)生至少兩倍于背景信號(hào)的信號(hào)。通常，用于核酸雜交分析法或基因擴(kuò)增檢測(cè)方法的合適嚴(yán)格性條件如上所述。也可以選擇更嚴(yán)格或更不嚴(yán)格的條件。技術(shù)人員了解洗滌期間可以加以改變和將維持或改變嚴(yán)格性條件的多種參數(shù)。例如，用于長(zhǎng)度大于50個(gè)核苷酸的DNA雜交分子的常見高嚴(yán)格性雜交條件包括在65'C于lxSSC中或在42°C于lxSSC和50%曱酰胺中雜交，隨后在65。C于0.3xSSC中洗滌。用于長(zhǎng)度大于50個(gè)核苷酸的DNA雜交分子的中等嚴(yán)格性雜交條件的實(shí)例包括在55°C于4xSSC中或在40°C于6xSSC和50。/。甲酰胺中雜交，隨后在50。C于2xSSC中洗滌。雜交分子的長(zhǎng)度是雜交核酸的預(yù)期長(zhǎng)度。當(dāng)序列已知的核酸雜交時(shí)，可以通過比對(duì)序列并鑒定本文中所述的保守區(qū)而確定雜交分子長(zhǎng)度。lxSSC是0.15MNaCl和15mM檸檬酸鈉；雜交溶液和洗滌溶液可以額外地包含5xDenhardt試劑、0.5-1.0%SDS、100jig/ml變性的片段化鮭精DNA、0.5%焦磷酸鈉。為了定義嚴(yán)格性水平的目的，可以參考Sambrook等(2001)MolecularCloning:alaboratorymanual,第三版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,CSH，NewYork或參考CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989和每年更新版本)。另一可用于本發(fā)明方法的核酸變體是編碼本文如上所定義的III類TPP蛋白質(zhì)的剪接變體。如本文中所用的術(shù)語(yǔ)"剪接變體"包含其中已經(jīng)切除、替換、移位或添加所選內(nèi)含子和/或外顯子或其中內(nèi)含子已經(jīng)縮短或加長(zhǎng)的核*列的變體。此類變體將是其中基本上保留了蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的一種變體；這可以通過選擇性保留蛋白質(zhì)的功能性片段而實(shí)現(xiàn)。此類剪接變體可以在自然界中找到或可以人工制造。用于預(yù)測(cè)和分離此類剪接變體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(見例如Foissac和Schiex,BMCBioinformatics.，2005;6:25)。本發(fā)明提供改良植物產(chǎn)量相關(guān)性狀(尤其是增加種子產(chǎn)量)的方法，其包括在植物中引入和表達(dá)實(shí)施例1的表A中給出的任一核^列的剪接變體、或?qū)嵤├?的表A中給出的任意氨基*列的直向同源物、旁系同源物或同源物的編碼核酸的剪接變體。優(yōu)選的剪接變體是SEQIDNO:1所示核酸的剪接變體，或SEQIDNO:2的直向同源物或旁系同源物的編碼核酸的剪接變體。優(yōu)選地，編碼剪接變體的氨基酸序列包含任何一個(gè)或多個(gè)本文所定義的基序或結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，當(dāng)剪接變體編碼的M^^列用于構(gòu)建TPP/TPS系統(tǒng)樹(例如圖2A所示的)時(shí)，趨向聚蔟于包含SEQIDNO:2所示M酸序列的III類TPP蛋白質(zhì)的組，而不是聚簇于任何其他組。用于實(shí)施本發(fā)明方法的另一核酸變體是如上文所定義的III類TPP蛋白質(zhì)的編碼核酸的等位變體。等位基因或等位變體是給定基因的替代形式，位于相同染色體位置內(nèi)。等位變體天然存在，并且涵蓋在本發(fā)明方法中的是這些天然等位變體的用途。等位變體包含單核苷酸多態(tài)性(SNP)和小插入/缺失多態(tài)性(INDEL)。INDEL的尺寸通常小于100bp。SNP和INDEL形成在大部分生物的天然發(fā)生性多態(tài)性林系中序列變體的最大集合。用于本發(fā)明方法中的等位變體與SEQIDNO:2的III類TPP蛋白質(zhì)具有基本相同的生物學(xué)活性。本發(fā)明提供改良植物產(chǎn)量相關(guān)性狀(尤其是增加種子產(chǎn)量)的方法，其包括在植物中引入和表達(dá)實(shí)施例1的表A中給出的任一核酸的等位變體、或包括在植物中引入和表達(dá)實(shí)施例1的表A中給出的任意M^列的直向同源物、旁系同源物或同源物的編碼核酸的等位變體。優(yōu)選地，等位變體是SEQIDNO:1的等位變體，或SEQIDNO:2的直向同源物或旁系同源物的編碼核酸的等位變體。優(yōu)選地，編碼等位變體的氨基酸序列包含任何一個(gè)或多個(gè)本文所定義的基序或結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選地，當(dāng)?shù)任蛔凅w編碼的M,列用于構(gòu)建TPP/TPS系統(tǒng)樹(例如圖2A所示的)時(shí)，趨向聚簇于包含SEQIDNO:2所示M酸序列的III類TPP蛋白質(zhì)的組，而不是聚簇于任何其他組。用于本發(fā)明方法的另一核酸變體是通過基因改組獲得的核酸變體?；蚋慕M或定向進(jìn)化也可以用來產(chǎn)生編碼如上所定義的III類TPP蛋白質(zhì)的核酸的變體。這包括DNA改組的重復(fù)，繼之以適當(dāng)篩選和/或選擇，以產(chǎn)生具有改變的生物學(xué)活性，編碼具有III類TPP蛋白質(zhì)的核酸的變體或其部分(Castle等(2004)Science304(5674):1151-4;美國(guó)專利5,811,238和6，395，547)。本發(fā)明提供改良植物產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在植物中引入和表達(dá)實(shí)施例1的表A中給出的核,列中任一個(gè)的變體，或包括在植物中引入和表達(dá)實(shí)施例1的表A中給出的任意氨基,列的直向同源物、旁系同源物或同源物的編碼核酸序列的變體，所述變體核酸通過基因改組獲得。優(yōu)選地，通過基因改組獲得的變體核酸編碼的^J^酸序列包含任意一個(gè)或多個(gè)本文定義的基序或結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，當(dāng)通過基因改組獲得的變體核酸編碼的M酸序列用于構(gòu)建TPP/TPS系統(tǒng)樹(例如圖2A所示的)時(shí)，趨向聚簇于包含SEQIDNO:2所示^J^酸序列的III類TPP蛋白質(zhì)的組，而不是聚簇于任何其他組。此外，還可以通過位點(diǎn)定向誘變獲得核酸變體。幾種方法可用于實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)定向誘變；最常用的是基于PCR的方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology.Wiley編)。III類TPP蛋白質(zhì)的編碼核酸可以來自任何天然或人工的來源?？梢酝ㄟ^仔細(xì)的人為操作在組成和/或基因組環(huán)境上修飾所述核酸的天然形式。優(yōu)選in類TPP編碼核酸來自植物，又優(yōu)選源自雙子葉植物，更優(yōu)選源自十字花科，最優(yōu)選核酸來自擬南芥。因此本文任何III類TPP蛋白質(zhì)的引用意指如上文定義的III類TPP蛋白質(zhì)。編碼此類ni類TPP蛋白質(zhì)的任意核酸適合用于實(shí)施本發(fā)明方法。本發(fā)明也包括可通過本發(fā)明方法獲得的植物或其部分(包括種子)。所迷植物或其部分包含編碼如上文定義的III類TPP蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明還提供迄今未知的III類TPP核酸序列和III類TPP蛋白質(zhì)序列。這些序列也可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案由此提供分離的核酸分子，其包含(i)SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127或SEQIDNO:129所示的核酸；(ii)(i)中給出的任一SEQIDNO的互補(bǔ)物；(iii)編碼III類TPP蛋白質(zhì)的核酸，所述III類TPP蛋白質(zhì)按照遞增的優(yōu)選順序，與SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128或SEQIDNO:130給出的任一絲齡列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；(iv)在嚴(yán)格條件下能夠與上面(i)、(ii)或(iii)中給出的任一核酸雜交的核酸。本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供分離的多肽，其包含(i)SEQIDNO:4、SEQID隱6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128或SEQIDNO:130所示的氨基^列；(ii)按照遞增的優(yōu)選順序，與SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128或SEQIDNO:130給出的任一M餅列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99。/0或100%的序列同一性的氨基酸序列；(iii)上面(i)或(ii)中給出的任意M^列的衍生物。本發(fā)明還提供遺傳構(gòu)建體和載體以促進(jìn)在植物中引入和/或表達(dá)用于本發(fā)明方法中的核酸序列。所述基因構(gòu)建體可以插入適于轉(zhuǎn)化至植物內(nèi)并適于在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)目的基因的市售載體。本發(fā)明也提供如文中所定義的基因構(gòu)建體在本發(fā)明方法中的用途。更具體地，本發(fā)明提供構(gòu)建體，其包含(a)編碼如上面所定義的III類TPP蛋白質(zhì)的核酸；(b)—個(gè)或多個(gè)能夠驅(qū)動(dòng)(a)的核酸序列表達(dá)的調(diào)控序列；和任選地(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選本發(fā)明構(gòu)建體中的核酸是編碼III類TPP蛋白質(zhì)的多核苷酸分子，其氨基酸序列按照遞增的優(yōu)選順序，與SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128或SEQIDNO:130中任一個(gè)所示的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。最優(yōu)選地，該III類TPP多核苦酸分子是任意核苷酸序列SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127或SEQIDNO:129。植物用包含目的序列(即本文定義的編碼III類TPP多肽的核酸序列)的載體轉(zhuǎn)化。技術(shù)人員非常了解為成功轉(zhuǎn)化、選擇和增殖含有目的序列的宿主細(xì)胞而必須于載體上存在的遺傳元件。目的序列有效地與一種或多種調(diào)控序列(至少與啟動(dòng)子)連接。術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)元件"、"調(diào)控序列"和"啟動(dòng)子"均在本文中可互換使用并且在廣義上意指能夠?qū)崿F(xiàn)與之連接的序列表達(dá)的調(diào)節(jié)性核酸序列。術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"一般指位于基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游并參與識(shí)別及結(jié)合RJNA聚合酶和其他蛋白質(zhì)，因而指導(dǎo)有效連接的核酸轉(zhuǎn)錄的核酸調(diào)控序列。前述術(shù)語(yǔ)包括從典型的真核基因組基因(包括對(duì)于精確轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)所需的TATA框，具有或沒有CCAAT框序列)中衍生的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列和應(yīng)答發(fā)育刺激和/或外部刺激或以組織特異性方式改變基因表達(dá)的額外調(diào)節(jié)元件(如，上游激活序列、增強(qiáng)子和沉默子)。本術(shù)語(yǔ)還包括典型的原核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，在此情況下它可以包括-35框序列和/或-10框轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)元件，，也包含賦予、激活或增強(qiáng)核酸分子在細(xì)胞、組織或器官中表達(dá)的合成的融合分子或衍生物。如本文中所用的術(shù)語(yǔ)"有效連接"指啟動(dòng)子序列與目的基因之間功能性地連接，以至于啟動(dòng)子序列能夠啟動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄。有利地，可以使用任何類型的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)核酸序列的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"指位于基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游的核酸控制序列，且參與識(shí)別和結(jié)合RNA聚合酶以及其他蛋白質(zhì)，由此指導(dǎo)有效連接核酸的轉(zhuǎn)錄。"植物"啟動(dòng)子包含調(diào)控元件，其介導(dǎo)編碼序列區(qū)段在植物細(xì)胞中的表達(dá)。從而，植物啟動(dòng)子無需為植物來源的，而是可以來源于病毒或微生物，例如，特別是來源于攻擊植物細(xì)胞的病毒。"植物啟動(dòng)子，，也可以來源于植物細(xì)胞，例如，來源于欲表達(dá)的核酸序列轉(zhuǎn)化的植物。這對(duì)于其他"植物"調(diào)控信號(hào)同樣適用，例如"植物"終止子的情況。位于用于本發(fā)明方法的核苷酸序列上游的啟動(dòng)子可以通過一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代、插入和/或缺失進(jìn)行修飾，而不會(huì)千擾啟動(dòng)子、開放閱讀框(ORF)或3，-調(diào)控區(qū)如終止子或遠(yuǎn)離ORF位置上的其他3，調(diào)控區(qū)的功能或活性。此外還有可能通過修飾啟動(dòng)子的序列增加其活性，或者完全替換為更具活性的啟動(dòng)子、甚至是來自異源生物體的啟動(dòng)子。為在植物中表達(dá)，核酸分子有效連接于合適的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子，是指在生長(zhǎng)發(fā)育的大多數(shù)但不必是所有階段中、并且在大多數(shù)環(huán)境條件下、在至少一種細(xì)胞、組織或器官中轉(zhuǎn)錄激活的啟動(dòng)子?？蛇x地，啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，即響應(yīng)化學(xué)(綜述參見Gatz1997，Annu.Rev.PlantPhysiol,PlantMol.Biol"48:89-108)、環(huán)境或物理刺激，具有誘導(dǎo)的或增加的轉(zhuǎn)錄起始。其他誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例是脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，即當(dāng)植物接觸多種脅迫條件時(shí)激活的啟動(dòng)子或者是病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。另外或備選的，啟動(dòng)子可以是器官特異性或組織特異性的啟動(dòng)子，即能夠在某些器官或組織，如在葉、根、種子等組織中優(yōu)先起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子；或者可以是普遍存在的啟動(dòng)子，基本上在生物體的所有組織或細(xì)胞中激活；或者啟動(dòng)子可以是發(fā)育調(diào)控型的，從而在某些發(fā)育階段或在發(fā)生發(fā)育改變的植物部分激活。能夠僅在某些器官或組織中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子在文中稱為"器官特異性"或"組織特異性，，啟動(dòng)子，與此類似，能夠僅在某些細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子在文中稱為"細(xì)胞特異性"啟動(dòng)子。優(yōu)選地，III類TPP核酸或其變體與組成型啟動(dòng)子有效連接。優(yōu)選的組成型啟動(dòng)子是基本上遍在表達(dá)的組成型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子還優(yōu)選地從植物、更優(yōu)選從單子葉植物中得到。最優(yōu)選使用GOS2啟動(dòng)子(尤其是來自稻的GOS2啟動(dòng)子)，最優(yōu)選是基本如SEQIDNO:98所示的啟動(dòng)子。應(yīng)當(dāng)明白本發(fā)明的適用性不限于SEQIDNO:l所示的III類TPP核酸，同時(shí)本發(fā)明的適用性也不限于在GOS2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)時(shí)III類TPP核酸的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選特征，組成型啟動(dòng)子是高速泳動(dòng)族蛋白質(zhì)(HMGP)啟動(dòng)子，優(yōu)選HMGP啟動(dòng)子來自稻，更優(yōu)選與SEQIDNO:131基本類似，最優(yōu)選與SEQIDNO:131相同。其他也可用于驅(qū)動(dòng)III類TPP核酸表達(dá)的組成型啟動(dòng)子如下表2所示。表2:組成型啟動(dòng)子的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>為鑒定功能等同的啟動(dòng)子，可以對(duì)候選啟動(dòng)子的啟動(dòng)子長(zhǎng)度和/或表達(dá)模式進(jìn)行分析，例如將啟動(dòng)子有效連接于報(bào)道基因，并測(cè)定l艮道基因在植物多種組織中的表達(dá)水平和模式。適宜的眾所周知的報(bào)道基因包括例如p-葡糖醛酸糖苷酶或(3-半乳糖苷酶。通過測(cè)量p-葡糖窿酸糖苷酶或P-半乳糖苷酶的酶促活性來測(cè)定啟動(dòng)子活性。然后可以將啟動(dòng)子長(zhǎng)度和/或表^^莫式與參照啟動(dòng)子(如本發(fā)明方法中所用的啟動(dòng)子)進(jìn)行比較?？梢莸兀梢岳帽绢I(lǐng)域公知的方法如Northern印跡(RNA分析)結(jié)合放射自顯影圖的密度定量分析、定量實(shí)時(shí)PCR或RT-PCR,通過定量mRNA水平或者通過將本發(fā)明方法中所用核酸的mRNA水平與持家基因如18SrRNA的mRNA水平進(jìn)行比較，來測(cè)定啟動(dòng)子長(zhǎng)度(Heid等，1996GenomeMethods6:986-994)。通常，術(shù)語(yǔ)"弱啟動(dòng)子"意指驅(qū)動(dòng)編碼序列低水平表達(dá)的啟動(dòng)子，所述低水平為每個(gè)細(xì)胞大約1/10，000個(gè)轉(zhuǎn)錄物至大約1/100，000個(gè)轉(zhuǎn)錄物，至大約1/500,0000個(gè)轉(zhuǎn)錄物的水平。相反，"強(qiáng)啟動(dòng)子，，驅(qū)動(dòng)編碼序列高水平表達(dá)，或者每個(gè)細(xì)胞大約1/10個(gè)轉(zhuǎn)錄物至大約1/100個(gè)轉(zhuǎn)錄物，至大約1/1，000個(gè)轉(zhuǎn)錄物的水平。任選的，可以在引入植物的構(gòu)建體中使用一個(gè)或多個(gè)終止子序列。術(shù)語(yǔ)"終止子，，包括控制序列，其為位于轉(zhuǎn)錄單位末端的DNA序列，傳遞信號(hào)引發(fā)初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的3，加工和多聚腺普酸化以及轉(zhuǎn)錄的終止。終止子可以來自天然基因、多種其它植物基因或來自T-DNA。例如，待加入的終止子可以來自胭脂堿合酶或章魚堿合酶基因、或可選地源自其他植物基因、或次優(yōu)選地源自任何其它真核基因。另外的調(diào)控元件可以包括轉(zhuǎn)錄和翻譯增強(qiáng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道適合用于實(shí)施本發(fā)明的終止子和增強(qiáng)子的序列。這類序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所/^或者可以容易地獲得。內(nèi)含子序列也可以添加至5'非翻譯區(qū)(UTR)或編碼序列中，以增加在胞漿內(nèi)積累的成熟信息的量。已經(jīng)證實(shí)可剪接內(nèi)含子在植物表達(dá)構(gòu)建體和動(dòng)物表達(dá)構(gòu)建體中轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的包含在mRNA水平及蛋白質(zhì)水平上增加基因表達(dá)至多達(dá)1000倍(Buchman和Berg，Mol.CellBiol.8:4395-4405(1988);Callis等，GensDev1:1183-1200(1987))?；虮磉_(dá)的此類內(nèi)含子增強(qiáng)作用一般在位于轉(zhuǎn)錄單位5'端附近時(shí)最強(qiáng)烈。使用玉米內(nèi)含子Adhl-S內(nèi)含子l、2和6、Bronze-l內(nèi)含子是本領(lǐng)域已知的。對(duì)于一般信息，見TheMaizeHandbook,第116章，F(xiàn)reeling和Walbot編，Springer,N.Y.(1994)。其他控制序列(除啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、內(nèi)含子序列、3，UTR和/或5，UTR區(qū)域之外)可以是蛋白質(zhì)和/或RNA穩(wěn)定元件。這類序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知或者可以容易地獲得。本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體還包括在特定細(xì)胞類型中維持和/或復(fù)制所需的復(fù)制起點(diǎn)序列。一個(gè)實(shí)例是需要將遺傳構(gòu)建體作為附加型遺傳元件(如質(zhì)?；蛘沉７肿?在細(xì)菌細(xì)胞中維持的情況。優(yōu)選的復(fù)制起點(diǎn)包括但不限于fl-ori和colEl。為檢測(cè)本發(fā)明方法中所用核酸序列的成功轉(zhuǎn)移和/或選擇含有這些核酸的轉(zhuǎn)基因植物，最好使用標(biāo)記基因(或報(bào)道基因)。因此，遺傳構(gòu)建體可以任選地包括可選擇的標(biāo)記基因。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"選擇性標(biāo)記"或"選擇性標(biāo)記基因"或"報(bào)道基因，，包括賦予細(xì)胞表型的任何基因，該基因在細(xì)胞中表達(dá)，有利于鑒定和/或選擇經(jīng)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。這些標(biāo)記基因能夠通過一系列不同的原理鑒定核酸分子的成功轉(zhuǎn)移。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記可以選自賦予抗生素或除草劑抗性的標(biāo)記，其引入新的代謝性狀或允許可視選擇?？蛇x擇標(biāo)記基因的實(shí)例包括賦予抗生素抗性的基因(例如磷酸化新霉素和卡那霉素的"/^J7，或磷酸化潮霉素的/y^，或者賦予對(duì)例如博來霉素、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素、氨芐青霹素、慶大霉素、遺傳霉素(G418)、壯觀霉素或殺稻瘟菌素抗性的基因)、賦予除草劑抗性的基因(例如提供Basta⑧抗性的/w;提供草甘膦抗性的ara^4或g狄，或者賦予對(duì)例如咪唑啉酮、膦絲菌素或磺胺脲的抗性的基因)、或者提供代謝性狀的基因(例如允許植物使用甘露糖作為唯一碳源的附a"」，或有關(guān)木糖利用的木糖異構(gòu)酶；或抗?fàn)I養(yǎng)標(biāo)記如對(duì)2-脫氧葡萄糖的抗性)?？梢晿?biāo)記基因的表達(dá)導(dǎo)致形成顏色(例如P-葡糖醛酸糖苷酶GUS或P-半乳糖苷酶及其著色底物例如X-Gal)、發(fā)光(例如熒光素/熒光素酶系統(tǒng))或熒光(綠色熒光蛋白GFP及其衍生物)。這僅僅是一小部分可能的標(biāo)記的清單。技術(shù)人員對(duì)這類標(biāo)記極為熟悉。優(yōu)選根據(jù)不同生物體和選擇方法來使用不同的標(biāo)記。已知核酸穩(wěn)定或瞬時(shí)整合進(jìn)植物細(xì)胞，僅少數(shù)細(xì)胞攝入外來DNA，并整合進(jìn)其基因組(如果期望的話)，這取決于所用的表達(dá)載體和所用的轉(zhuǎn)染技術(shù)。為鑒定并選擇這些整合體，通常將編碼可逸擇標(biāo)記(如上文所迷那些)的基因與目的基因一起引入宿主細(xì)胞中。例如，這些標(biāo)記可在突變體中使用，所述突變體中原有的這些基因沒有功能，例如通過常規(guī)方法而缺失。此外，編碼可選擇標(biāo)記的核酸分子與編碼本發(fā)明多肽或本發(fā)明方法所用的序列可以在同一個(gè)載體中引入宿主細(xì)胞，或者在單獨(dú)的栽體中。由所引入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以例如通過選擇(例如，整合有可選擇標(biāo)記的細(xì)胞存活而其他細(xì)胞死去)予以鑒定。一旦成功引入核酸，將不再需要或不期望轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中存在標(biāo)記基因，特別是抗生素和除草劑抗性基因，所以根據(jù)本發(fā)明引入核酸的方法有利地采用能夠除去或切除這些標(biāo)記基因的技術(shù)。一種這樣的方法是稱為共轉(zhuǎn)化的方法。共轉(zhuǎn)化法采用兩個(gè)載體同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，一個(gè)載體攜帶才艮據(jù)本發(fā)明的核酸，而第二載體攜帶標(biāo)記基因。較大比例的轉(zhuǎn)化體接收或者對(duì)于植物而言含有(高達(dá)40%或以上的轉(zhuǎn)化體)兩個(gè)載體。對(duì)于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化體通常只接收載體的一部分，即為T-DNA所側(cè)接的序列，其通常指表達(dá)盒。隨后可通過雜交從轉(zhuǎn)化植物中除去標(biāo)記基因。在另一種方法中，利用整合進(jìn)轉(zhuǎn)座子的標(biāo)記基因與期望的核酸一起進(jìn)行轉(zhuǎn)化(稱為Ac/Ds技術(shù))。轉(zhuǎn)化體可與轉(zhuǎn)座酶來源雜交，或者用賦予轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的核酸瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體。在有些情況下(約10%),—旦成功進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)座子跳出宿主細(xì)胞基因組并丟失。在其他一些情況下，轉(zhuǎn)座子跳至不同的位置。在這些情況下，必須通過雜交消除標(biāo)記基因。在微生物學(xué)領(lǐng)域，研發(fā)了有可能或便于檢測(cè)此類事件的技術(shù)。另一有利的方法有賴于稱為重組系統(tǒng)的方法，其優(yōu)勢(shì)在于可以免除雜交消除步驟。最著名的這類系統(tǒng)稱為Cre/lox系統(tǒng)。Crel為重組酶，其切除位于loxP序列之間的序列。如果標(biāo)記基因整合在loxP序列之間，一旦成功進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，由于該重組酶的表達(dá)，其得以切除。其他重組系統(tǒng)有HIN/HIX、FLP/FRT及REP/STB系統(tǒng)(Tribble等，J.Biol.Chem"275,2000:22255-22267;Velmurugan等，J.CellBiol"149,2000:553-566)。根據(jù)本發(fā)明的核酸有可能位點(diǎn)特異性地整合進(jìn)植物基因組。這些方法自然也可以應(yīng)用于微生物如酵母、真菌或細(xì)菌。本發(fā)明還提供了相對(duì)于對(duì)照植物，產(chǎn)生具有改良的產(chǎn)量相關(guān)性狀(尤其是增加的種子產(chǎn)量)的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括在植物中引入和表達(dá)如上文所定義的III類TPP蛋白質(zhì)的任意編碼核酸。為本發(fā)明目的，"轉(zhuǎn)基因的"、"轉(zhuǎn)基因"或"重組"就核,列而言意指包含此核酸序列的表達(dá)盒、基因構(gòu)建體或載體或用本發(fā)明的核酸序列、表達(dá)盒或栽體轉(zhuǎn)化的生物，這些構(gòu)建均通過重組方法產(chǎn)生，其中(a)編碼用于本發(fā)明方法中的蛋白質(zhì)的核酸序列，或(b)與本發(fā)明核酸序列有效連接的遺傳調(diào)控序列，例如啟動(dòng)子，或(c)a)和b)。不處于其天然遺傳環(huán)境中或已經(jīng)通過遺傳操作方法修飾，修飾有可能采用例如取代、添加、缺失、倒位或插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基的形式。天然遺傳環(huán)境理解為意指來源植物中的天然基因組基因座或染色體基因座或在基因組文庫(kù)中存在。在基因組文庫(kù)的情況下，核酸序列的天然遺傳環(huán)境優(yōu)選地得到保留，至少部分地得以保留。該環(huán)境分布在核酸序列的至少一側(cè)并且具有至少50bp，優(yōu)選至少500bp，特別優(yōu)選至少1000bp，最優(yōu)選至少5000bp的序列長(zhǎng)度。天然發(fā)生的表達(dá)盒-例如核酸序列的天然啟動(dòng)子與編碼本發(fā)明方法中所用多肽的對(duì)應(yīng)核酸序列的天然發(fā)生的組合，如上文所定義-在這種表達(dá)盒通過非天然的合成("人工")方法(如誘變處理)而受到修飾時(shí)，變成轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。合適方法例如在US5,565,350或WO00/15815中描述。更具體地，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有增加的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所迷方法包括(i)向植物、植物部分或植物細(xì)胞中引入和表達(dá)III類TPP核酸或其變體j和(ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞?？梢詫⒑怂嶂苯右胫参锛?xì)胞或植物本身(包括引入組織、器官或植物的任何其他部分)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方面，優(yōu)選通過轉(zhuǎn)化將核酸引入植物。如本文中所提及的術(shù)語(yǔ)"引入"或"轉(zhuǎn)化，，包括外源性多核苷酸轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞內(nèi)，無論用于轉(zhuǎn)化的方法是什么。能夠后續(xù)克隆性增殖(無論通過器官發(fā)生或胚胎發(fā)生)的植物組織可以用本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化并且可以從中再生整林植物。選擇的具體組織將取決于可用于并且最適于正進(jìn)行轉(zhuǎn)化的具體物種的克隆性增殖系統(tǒng)。示例性組織靶包括葉盤、花粉、胚、子葉、下胚軸、大配子體、愈傷組織、現(xiàn)存分生組織(例如頂端分生組織、腋芽和根分生組織)和誘導(dǎo)的分生組織(例如子葉分生組織和下胚軸分生組織)。多核苷酸可以瞬時(shí)或穩(wěn)定地引入宿主細(xì)胞并且可以非整合地維持，例如作為質(zhì)粒。備選地，多核苷酸可以整合至宿主基因組內(nèi)。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞隨后可以用來以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式再生出轉(zhuǎn)化植物。外來基因轉(zhuǎn)化至植物基因組內(nèi)稱作轉(zhuǎn)化。植物物種的轉(zhuǎn)化現(xiàn)在是相當(dāng)常規(guī)的技術(shù)。有利地，幾種轉(zhuǎn)化方法中的任一方法可以用來將目的基因引入合適的祖先細(xì)胞。用于從植物組織或植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)化并再生出植物所述的方法可以用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化或用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化方法包括使用脂質(zhì)體、電穿孔法、增加游離DNA攝入的化學(xué)品、DNA直接注射至植物、粒子槍轟擊法、使用病毒或花粉的轉(zhuǎn)化法和顯微投射法(microprojection)。轉(zhuǎn)化方法可以選自用于原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇法(Krens，F(xiàn).A.等，(1982)Nature296，72-74;NegruthiI等(1987)PlantMolBiol8:363-373);原生質(zhì)體的電穿孔法(ShiimoR.D.等(1985)Bio/Techno13，1099-1102);對(duì)植物材料的微量注射法(CrosswayA等，(1986)Mol.GenGenet202:179-185);DNA或RNA涂布的粒子轟擊法(KleinTM等，(1987)Nature327:70)、(非整合性)病毒感染法等。轉(zhuǎn)基因植物，包括轉(zhuǎn)基因作物植物，優(yōu)選地通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法產(chǎn)生。有利的轉(zhuǎn)化方法是在植物中(inplanta)的轉(zhuǎn)化法。為此目的，例如有可能使農(nóng)桿菌作用于植物種子或有可能用農(nóng)桿菌接種植物的分生組織。根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)證明使轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌混懸液作用于完整植物或至少作用于花原基是特別有利的。植物隨后繼續(xù)培育直至獲得所處理才直物的種子(Clough和Bent,PlantJ.(1998)16，735~743)。用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的稻轉(zhuǎn)化的方法包括用于稻轉(zhuǎn)化的公知方法，如在任一以下文獻(xiàn)中描迷的那些方法歐洲專利申請(qǐng)EP1198985Al，Aldemita和Hodges(Planta199:612-617，1996);Chan等(PlantMolBiol22(3):491-506,1993)，Hiei等(PIantJ6(2):271-282，1994)，其公開內(nèi)容在本文中引入作為參考，如同完全給出那樣。在玉米轉(zhuǎn)化的情況下，優(yōu)選的方法如Ishida等(NatBiotechnol14(6):745-50,1996)或Frame等(PlantPhysiol129(1):13-22,2002)描述，其公開內(nèi)容在本文中如充分所述那樣引入作為參考。所述方法通過舉例方式進(jìn)^步由B.Jenes等，TechniquesforGeneTransfer，在TransgenicPlants,第1巻，EngineeringandUtilization,S.D.Kung和R,Wu編，AcademicPress(1993)128-143及在PotrykusAnnu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42(1991)205-225)中描述。待表達(dá)的核酸或構(gòu)建體優(yōu)選地克隆至適于轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaeiens)的載體，例如pBinl9(Bevan等，Nucl.AcidsRes.12(1984)8711)。由這種載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌隨后可以按照已知方式用于轉(zhuǎn)化植物，例如作為模型使用的植物，如擬南芥(擬南芥屬于本發(fā)明的范圍，不視為作物植物)或作物植物，例如煙草植物，通過在農(nóng)桿菌溶液中浸泡擦傷的葉或切碎的葉并隨后將它們?cè)诤线m的培養(yǎng)基內(nèi)培育。植物通過根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化例如由Hdfgen和Willmitzer在Nucl.AcidRes.(1988)16,9877中描述或尤其從F.F.White,VectorsforGeneTransferinHigherPlants;在TransgenicPlants,第1巻，EngineeringandUtilization,S.D.Kung和R.編,AcademicPress,1993,第15-38頁(yè)中獲知。除了轉(zhuǎn)化體細(xì)胞(其隨后必須再生成完整植物)之外，還有可能轉(zhuǎn)化植物分生組織的細(xì)胞及特別轉(zhuǎn)化發(fā)育成配子的那些細(xì)胞。在這種情況下，轉(zhuǎn)化的配子遵循天然的植物發(fā)育過程，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。因此，例如擬南芥種子用農(nóng)桿菌處理并且從發(fā)育植物中獲得種子，其中一定比例的所述植物受到轉(zhuǎn)化并且因此是轉(zhuǎn)基因的[Feldman，KA和MarksMD(1987)MolGenGenet208:274-289;FeldmannK(1992)。在CKoncz編，N-HChua和JShell,MethodsinArabidopsisResearch.WordScientific,Singapore,第274-289頁(yè)l。替代性方法基于反復(fù)去掉花序并使蓮座葉叢中心中的切除部位與轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌溫育，因而轉(zhuǎn)化的種子同樣可以在較晚的時(shí)間點(diǎn)獲得(Chang(1994)PlantJ.5:551-558;Katavic(1994)MolGenGene"245:363-370)。然而，尤其有效的方法是改良的真空滲入法，如"花浸染"法。在擬南芥真空滲入法的情況下，完整植物在減壓下用農(nóng)桿菌混懸液處理[Bechthold，N(1993)。CRAcadSciParisLifeSci，316:1194-1199，而在"花浸染法，，的情況下，正在發(fā)育的花組織與表面活性劑處理的農(nóng)桿菌混懸液短暫溫育[Clough，SJ和(imd)Bent,AF(1998)ThePlantJ.16，735-743。在兩種情況下收獲了一定比例的轉(zhuǎn)基因種子，并且這些種子可以通過在如上所迷的選擇條件下培育而與非轉(zhuǎn)基因種子區(qū)分。此外，質(zhì)體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化是有利的，因?yàn)橘|(zhì)體在大部分作物中以母體方式遺傳，降低或消除了轉(zhuǎn)基因經(jīng)花粉流動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)。葉綠體基因組的轉(zhuǎn)化一般通過已在Klaus等，2004[NatureBiotechnology22(2)，225-229中示例性加以展示的方法實(shí)現(xiàn)。簡(jiǎn)而言之，待轉(zhuǎn)化的序列連同選擇性標(biāo)記基因一起克隆至與葉綠體34基因組同源的側(cè)翼序列之間。這些同源的側(cè)翼序列指導(dǎo)位點(diǎn)特異性整合至原質(zhì)體系內(nèi)。已經(jīng)對(duì)眾多不同植物物種描述了質(zhì)體轉(zhuǎn)化并且綜述可以出自Bock(2001)在基礎(chǔ)研究和植物生物技術(shù)中的轉(zhuǎn)基因質(zhì)體(Transgenicplastidsinbasicresearchandplantbiotechnology).JMolBiol.2001年9月21日；312(3):425-38或Maliga，P(2003)質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)商業(yè)化進(jìn)展(Progresstowardscommerdalizationofplastidtransformationtechnology).TrendsBiotechnol.21，20-28。進(jìn)一步生物技術(shù)選艮最近已經(jīng)以無標(biāo)記質(zhì)體轉(zhuǎn)化體的形式作了報(bào)道，所述無標(biāo)記質(zhì)體轉(zhuǎn)化體可以通過瞬時(shí)共整合的標(biāo)記基因產(chǎn)生(Klaus等，2004，NatureBiotechnology22(2)，225-229)。遺傳修飾的植物細(xì)胞可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的所有方法再生。合適的方法可見于S.D.Kung和RWu、Potrykus或H6fgen和Willmitzer的上述出版物。通常在轉(zhuǎn)化后，選擇一種或多種標(biāo)記存在的植物細(xì)胞或細(xì)胞群體，其中所述的標(biāo)記由與目的基因一起共轉(zhuǎn)移的植物可表達(dá)的基因編碼，隨后將轉(zhuǎn)化的材料再生成整林植物。為了選擇轉(zhuǎn)化的植物，在轉(zhuǎn)化中獲得的植物材料原則上接受選捧條件處理，以至于轉(zhuǎn)化的植物可以與未轉(zhuǎn)化的植物區(qū)分。例如，以上文所述方式獲得的種子可以播種，在初始培育時(shí)期后，通過噴霧進(jìn)行合適的選擇。另一種可能性包含于4吏用合適選擇劑的瓊脂平板上生長(zhǎng)種子(根據(jù)需要在消毒之后)，使得僅轉(zhuǎn)化的種子可以生長(zhǎng)成植物。或者，轉(zhuǎn)化的植物通過上述那些選擇標(biāo)記的存在篩選。在DNA轉(zhuǎn)移和再生后，推測(cè)的轉(zhuǎn)化植物還可以例如^f吏用Southern分析對(duì)目的基因的存在、拷貝數(shù)和/或基因組構(gòu)造進(jìn)行評(píng)價(jià)。備選或此外，新引入的DNA的表達(dá)水平可以使用Northern和/或Western,這兩種技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物可以通過多種方法加以增殖，如通過克隆增殖法或經(jīng)典育種技術(shù)。例如，第一代(或Tl)轉(zhuǎn)化植物可以進(jìn)行自交并選擇純合的第二代(或T2)轉(zhuǎn)化體，并且T2植物可以隨后通過經(jīng)典育種技術(shù)進(jìn)一步增殖。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物可以采取多種形式。例如，它們可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體；克隆轉(zhuǎn)化體(例如被轉(zhuǎn)化以含有表達(dá)盒的全部細(xì)胞)；轉(zhuǎn)化組織和未轉(zhuǎn)化組織的移植體(例如在植物中，與未轉(zhuǎn)化嫩枝嫁接的轉(zhuǎn)化的根狀莖)。本發(fā)明明確地?cái)U(kuò)展至通過文中所述的任意方法產(chǎn)生的任何植物細(xì)胞或植物，并擴(kuò)展至全部植物部分及其繁殖體。本發(fā)明進(jìn)一步擴(kuò)展至包含已經(jīng)通過任意前述方法產(chǎn)生的原代轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞、組織、器官或整抹植物的后代，唯一要求是后代表現(xiàn)與通過本發(fā)明方法中的親代所產(chǎn)生的那些后代相同的一種或多種基因型特征和/或表型特征。本發(fā)明也包括宿主細(xì)胞，其含有分離的編碼如上文定義的III類TPP蛋白質(zhì)的核酸。本發(fā)明優(yōu)選的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。宿主植物對(duì)于本發(fā)明方法中所用核酸或栽體、表達(dá)盒或構(gòu)建體或栽體而言原則上有利地是能夠合成本發(fā)明方法中所用多肽的全部植物。因此，如上文所述，用于本發(fā)明目的的轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)理解為表示在所述植物的基因組中，本發(fā)明方法所用的核酸不在其天然基因座上，有可能核酸將要進(jìn)行同源或異源表達(dá)。不過，正如所提到的那樣，轉(zhuǎn)基因的也表示盡管在植物基因組中，根據(jù)本發(fā)明的核酸或本發(fā)明方法中所用的核酸在其天然位置上，但是所述序列已相對(duì)于天然序列而,皮修飾，和/或天然序列的調(diào)控序列已被修飾。轉(zhuǎn)基因的優(yōu)選理解為表示根據(jù)本發(fā)明的核酸在基因組中非天然的座位上表達(dá)，即同源表達(dá)，或者優(yōu)選地發(fā)生核酸的異源表達(dá)。優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物在本文提及。本發(fā)明也擴(kuò)展至植物的可收獲部分如，但不限于種子、葉、果實(shí)、花、莖干、根狀莖、塊莖和球莖。本發(fā)明進(jìn)一步涉及來自，優(yōu)選直接來自這種植物的可收獲部分中的產(chǎn)物，如干燥顆?；蚍勰?、油、脂肪及脂肪酸、淀粉或蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，調(diào)節(jié)的表達(dá)是增加的表達(dá)。在本領(lǐng)域內(nèi)詳細(xì)記載了用于增加核酸或基因、或基因產(chǎn)物表達(dá)的方法并且它們包括例如，由適宜啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的超量表達(dá)、使用轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子?？梢栽诜钱愒葱问降亩嗪塑账岬倪m宜位置(一般是上游)內(nèi)引入作為啟動(dòng)子或增強(qiáng)子元件的分離核酸，以便上調(diào)表達(dá)。例如，內(nèi)源性啟動(dòng)子可以通過突變、缺失和/或取代而在體內(nèi)改變(見Kmiec，美國(guó)專利第5,565,350號(hào)；Zarling等，PCT/US93/03868)，或可以將分離的啟動(dòng)子以相對(duì)于本發(fā)明基因的正確方向^J巨離引入植物細(xì)胞，以便控制基因表達(dá)。若需要多肽表達(dá)，通常希望在多核苦酸編碼區(qū)的3，端包括多聚腺苷化區(qū)。多聚腺苷化區(qū)可以來自天然基因、來自多種其他植物基因或來自T-DNA。待添加的3'端序列可以來自例如胭脂堿合酶或章魚堿合酶基因或備選地來自另一植物基因或更不優(yōu)選來自任何其他真核基因。如上所述，也可以添加內(nèi)含子序列。其他調(diào)控序列(除啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、內(nèi)含子序列、3，UTR和/或5，UTR區(qū)，微小RNA耙位點(diǎn)之夕卜)可以是蛋白質(zhì)和/或RNA穩(wěn)定化元件。如上文所述，用于調(diào)節(jié)(優(yōu)選增加)III類TPP蛋白質(zhì)的編碼核酸的表達(dá)的優(yōu)選方法是在植物中51入和表達(dá)III類TPP蛋白質(zhì)的編碼核酸；然而，實(shí)現(xiàn)本方法的效果即改良產(chǎn)量相關(guān)性狀也可以使用其他公知技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。以下將是一些此類技術(shù)的描述。一種此類技術(shù)是T-DNA激活標(biāo)注(Hayashi等，Science(1992)1350-1353)，其涉及在目的基因的基因組區(qū)域內(nèi)或基因編碼區(qū)上游或下游IOkb處以如此結(jié)構(gòu)插入T-DNA(通常含有啟動(dòng)子(也可以是翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子))，使得啟動(dòng)子指導(dǎo)被耙定基因的表達(dá)。通常，由靶定基因的天然啟動(dòng)子控制下。啟動(dòng)子一般嵌入在T-DNA中。這種T-DNA隨機(jī)地插入植物基因組，例如通過農(nóng)桿菌感染，并導(dǎo)致在所插入T-DNA附近的基因的改良表達(dá)。因靠近所引入啟動(dòng)子的基因的改良表達(dá)，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)顯性表型。本發(fā)明的效果也可以使用TILLING(基因組內(nèi)定向誘導(dǎo)的局部損傷)技術(shù)產(chǎn)生。這是用于產(chǎn)生和/或鑒定具有改變的表達(dá)和/或活性的III類TPP蛋白質(zhì)的編碼核酸的誘變技術(shù)。TILLING還允許選擇攜帶此類突變變體的植物。這些突變變體可以顯示在強(qiáng)度方面或在位置方面或在時(shí)間方面改良的表達(dá)(例如若突變影響啟動(dòng)子)。這些突變變體可以顯示比由處于其天然形式的基因所顯出活性更高的III類TPP蛋白質(zhì)活性。TILLING將高密度誘變與高通量篩選方法組合。一般在TILLING中遵循的步驟是(a)EMS誘變(RedeiGP和KonczC(1992)在MethodsinArabidopsisResearch,KonczC，ChuaNH，SchellJ,Singapore編，WorldScientificPublishingCo,第16—82頁(yè)；Feldmann等，(1994)在MeyerowitzEM，SomervilleCR編，Arabidopsis.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，第137-172頁(yè)；LightnerJ和CasparT(1998)在JMartinez-Zapater，JSalinas編,MethodsonMolecularBiology第82巻.HumanaPress,Totowa，NJ，第91-104頁(yè))；(b)個(gè)體的DNA制備和匯集；(c)PCR擴(kuò)增目的區(qū)；(d)變性和復(fù)性以允許形成異源雙鏈體；(e)DHPLC,其中將異源雙鏈體是否在匯集物中的存在檢測(cè)為色譜圖中的一個(gè)額外峰；(f)鑒定突變個(gè)體；和(g)對(duì)突變PCR產(chǎn)物測(cè)序。用于TILLING的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(McCallum等，(2000)NatBiotechnol18:455-457;綜述見Stemple(2004)NatRevGenet5(2):145-50)。本發(fā)明的效果也可以使用同源重組產(chǎn)生，所述同源重組允許選擇的核酸于確定的選擇位置上引入基因組中。同源重組是在生物科學(xué)中常規(guī)地用于低等生物如酵母或苔蘚劍葉蘚(Physcomitrella)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。用于在植物中開展同源重組的方法已經(jīng)不僅對(duì)模式植物(Offringa等(1"0)EMBOJ9(10):3077-84)而且對(duì)作物植物例如稻(Terada等(2002)NatBiotech20(10):1030-4;Kda和Terada(2004)CurrOpinBiotech15(2):132-8)進(jìn)行了描述。本文提及改良的產(chǎn)量相關(guān)性狀意指植物一個(gè)或多個(gè)部分增加的生物量(重量)，所述部分可包括地上(可收獲)部分和/或地下(可收獲)部分。具體地，此類可收獲部分是種子，且本發(fā)明方法的實(shí)施產(chǎn)生相對(duì)于合適的對(duì)照植物的種子產(chǎn)量，具有增加的種子產(chǎn)量的植物。術(shù)語(yǔ)，，產(chǎn)量，，通常意指經(jīng)濟(jì)價(jià)值的可測(cè)量結(jié)果，其必然與指定作物、與面積并與時(shí)間段有關(guān)。單個(gè)植物部分基于它們的數(shù)目、大小和/或重量而直接對(duì)產(chǎn)量有貢獻(xiàn)，或?qū)嶋H產(chǎn)量是對(duì)于某作物和年份的每英畝產(chǎn)量，這通過總產(chǎn)量(包括收獲的和評(píng)估的產(chǎn)量)除以種植的英畝數(shù)而確定。術(shù)語(yǔ)"增加"、，，改善，，或"增強(qiáng)，，是可互換的并且應(yīng)當(dāng)在本申請(qǐng)含義上指與如本文中定義的野生型植物相比至少5%、6%、7%、8%、9%或10%、優(yōu)選至少15%或20%、更優(yōu)選地25%、30%、35%或40%更多的產(chǎn)量和/或生長(zhǎng)。增加的種子產(chǎn)量本身可以表現(xiàn)為下列一種或多種指標(biāo)a)種子生物量(種子總重量)增加，這可以基于單粒種子和/或每林植物和/或每公項(xiàng)或英畝；b)每林植物增加的花數(shù)；c)增加的(飽滿)種子數(shù)；d)增加的種子飽滿率(其表述為飽滿種子數(shù)與種子總數(shù)之間的比率)；e)增加的收獲指數(shù)，其表述為可收獲部分(如種子)產(chǎn)量與總生物量的比率；和f)增加的千粒重(TKW),這從計(jì)數(shù)的飽滿種子數(shù)及其總重量外推而來。增加的TKW可以因增加的種子大小和/或種子重量所致，并且也可以因胚和/或胚乳尺寸的增加所致。種子產(chǎn)量的增加也可以表現(xiàn)為種子大小和/或種子體積的增加。此外，種子產(chǎn)量的增加本身也可以自我表現(xiàn)為種子面積和/或種子長(zhǎng)度和/或種子寬度和/或種子周長(zhǎng)的增加。以玉米為例，產(chǎn)量增加可以表現(xiàn)為下列一種或多種指標(biāo)每公項(xiàng)或英畝所栽培的植物數(shù)的增加、每林植物穗數(shù)的增加、行數(shù)、每行粒數(shù)、粒重、千粒重、穗長(zhǎng)度/直徑的增加、種子飽滿率的增加(其中種子飽滿率是飽滿種子數(shù)除以種子總數(shù)并乘以100)及其他。以稻為例，產(chǎn)量增加本身可以表現(xiàn)為下列一種或多種指標(biāo)的增加每公項(xiàng)或英畝植物數(shù)、每林植物圓錐花序數(shù)、每圓錐花序小穗數(shù)、每圓錐花序花(小花)數(shù)(其表達(dá)為飽滿種子數(shù)對(duì)原圓錐花序數(shù)之比)、種子飽滿率的增加(其中種子飽滿率是飽滿種子數(shù)除以種子總數(shù)并乘以100)、千粒重的增加及其他。由于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的種子產(chǎn)量，因而相對(duì)于對(duì)照植物的生長(zhǎng)速率，這些植物有可能在其生活周期中的對(duì)應(yīng)階段上表現(xiàn)增加的生長(zhǎng)速率(在其生活周期的至少部分期間)。增加的生長(zhǎng)速率可以對(duì)于植物的一個(gè)或多個(gè)部分(包括種子)是特異性的，或可以基本上遍及整林植物。具有增加的生長(zhǎng)速率的植物可以具備較短的生活周期。植物的生活周期可以視為意指從干燥成熟種子成長(zhǎng)至植物已經(jīng)產(chǎn)生與起始材料相似的干燥成熟種子的階段所需要的時(shí)間。這個(gè)生活周期可以受下列因素影響，如早期萌發(fā)勢(shì)、生長(zhǎng)速率、綠度指數(shù)、開花時(shí)間和種子成熟速度。生長(zhǎng)速率的增加可以在植物生活周期中的一個(gè)或多個(gè)階段上或在基本上整個(gè)植物生活周期期間發(fā)生。在植物生活周期中的早期期間增加的生長(zhǎng)速率可以反映增強(qiáng)的萌發(fā)勢(shì)。生長(zhǎng)速率的增加可以改變植物的收獲周期，允許植物較晚播種和/或較早收獲，否則這將不可能(相似的作用可以用較早的開花時(shí)間獲得)。若生長(zhǎng)速率充分地增加，可以允許進(jìn)一步播種相同植物物種的種子(例如播種并收獲稻米植物，隨后在一個(gè)常規(guī)生長(zhǎng)周期中播種并任選收獲其他稻植物)。類似地，若生長(zhǎng)速率足夠地增加，可以允許進(jìn)一步播種不同植物物種的種子(例如播種并收獲玉米植物，隨后例如播種并任選收獲大豆、馬鈴薯或任何其他合適植物)。從相同的根莖中收獲額外次數(shù)在一些作物植物的情況中也是可能的。改變植物的收獲周期可以導(dǎo)致每英畝的年生物量產(chǎn)量的增加(因任何特定植物可以生長(zhǎng)并收獲的次數(shù)(如在一年中)增加)。生長(zhǎng)速率的增加也可以允許比其野生型對(duì)應(yīng)物在更廣泛的地理區(qū)域內(nèi)培育轉(zhuǎn)基因植物，因?yàn)閷?duì)培育作物的區(qū)域限制往往由栽種時(shí)節(jié)(早季)或在收獲時(shí)期(晚季)的不利環(huán)境條件所決定。若縮短收獲周期，則可以避開這類不利條件。生長(zhǎng)速率可以通過從生長(zhǎng)曲線中得到多種參數(shù)而確定，此類參數(shù)可以是T-Mid(植物達(dá)到其50%最大尺寸所花費(fèi)的時(shí)間)和T-90(植物達(dá)到其90%最大尺寸所花費(fèi)的時(shí)間)，等等。本發(fā)明方法的實(shí)施產(chǎn)生與對(duì)照植物相比具有增加的生長(zhǎng)速率的植物。因而4艮據(jù)本發(fā)明，提供增加植物生長(zhǎng)速率的方法，其包括調(diào)節(jié)，優(yōu)選增加增加編碼如本文定義的III類TPP蛋白質(zhì)的核酸序列在植物中的表達(dá)。與對(duì)照植物相比，無論植物處于非脅迫條件下還是植物暴露于多種脅迫下，都發(fā)生產(chǎn)量和/或生長(zhǎng)速率的增加。植物一般通過生長(zhǎng)得更慢而對(duì)暴露于脅迫作出應(yīng)答。在嚴(yán)重脅迫條件下，植物甚至可以完全停止生長(zhǎng)。另一方面，輕微脅迫在本文中定義為植物對(duì)其暴露的任何脅迫，其中所述的脅迫未導(dǎo)致植物完全停止生長(zhǎng)而沒有恢復(fù)生長(zhǎng)的能力。與非脅迫條件下的對(duì)照植物相比，輕微脅迫在本發(fā)明意義中導(dǎo)致受脅迫植物生長(zhǎng)降低小于40%、35%或30%,優(yōu)選小于25%、20%或15%,更優(yōu)選小于14%、13%、12%、11%或10%或更低。由于農(nóng)業(yè)實(shí)踐(灌溉、施肥、殺蟲劑處理)上的進(jìn)步，在栽培作物植物中并不經(jīng)常遇到嚴(yán)重脅迫。因此，由輕微脅迫誘導(dǎo)的受損生長(zhǎng)往往是農(nóng)業(yè)上不希望的特征。輕微脅迫是植物暴露的常見生物性和/或非生物性(環(huán)境)脅迫。非生物脅迫可以因干旱或水澇、厭氧脅迫、鹽脅迫、化學(xué)毒性、氧化脅迫和熱、寒冷或冰凍溫度所致。非生物脅迫可以是由水脅迫(尤其因?yàn)楦珊?、鹽脅迫、氧化脅迫或離子脅迫引起的滲透脅迫。生物脅迫一般是由病原體如細(xì)菌、病毒、真菌和昆蟲引起的那些脅迫。其他非生物脅迫可能導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)匱乏，例如氮、磷和鉀的匱乏。尤其，本發(fā)明的方法可以在非脅迫條件下或在輕微干旱條件下實(shí)施以產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物而具有增加的產(chǎn)量的植物。如在Wang等(Planta(2003)218:l-14)中才艮道，非生物脅迫導(dǎo)致不利地影響植物生長(zhǎng)及生產(chǎn)力的一系列形態(tài)學(xué)變化、生理學(xué)變化、生物化學(xué)變化和分子變化，已知干旱、鹽度、極端溫度和氧化脅迫是相互聯(lián)系的并可以通過相似機(jī)制而誘導(dǎo)生長(zhǎng)損害及細(xì)胞損害。Rabbani等(PlantPhysiol(2003)133:1755-1767)描述了干旱脅迫與高鹽度脅迫間極高程度的"串話"。例如，干旱和/或鹽化作用主要表現(xiàn)為滲透脅迫，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和離子分布的破壞。經(jīng)常伴隨高溫或低溫、鹽度或干早脅迫的氧化脅迫可以造成功能性蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白變性。因此，這些多樣的環(huán)境脅迫常常激活相似的細(xì)胞信號(hào)途徑和細(xì)胞應(yīng)答，如產(chǎn)生脅迫蛋白質(zhì)、上調(diào)抗氧化物質(zhì)、積累相容性溶質(zhì)和生長(zhǎng)抑制。如本文中所用的術(shù)語(yǔ)"非脅迫"條件是允許植物最佳生長(zhǎng)的環(huán)境條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚對(duì)于給定地點(diǎn)的正常土壤條件和氣候條件。本發(fā)明方法的實(shí)施相對(duì)于在可比條件下培育的合適對(duì)照植物，賦予在非脅迫條件下或在輕微干旱條件下培育的植物增加的產(chǎn)量。因而本發(fā)明提供用于在非脅迫條件下或在輕微干旱條件下培育的植物中改良產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，所述方法包括增加編碼III類TPP多肽的核酸在植物中表達(dá)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，改良的產(chǎn)量相關(guān)性狀通過下列中一種或多種的增加表示每林植物的種子總數(shù)、每林植物的飽滿種子數(shù)和每#物的種子重量。優(yōu)選地，這些增加在非脅迫條件下生長(zhǎng)的植物中發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明方法有利地適用于任何植物。如本文中所用的術(shù)語(yǔ)"植物"包含整株植物、植物的祖先及后代和植物部分，包括種子、枝條、莖、葉、根(包括塊莖)、花和組織及器官，其中每種所提及對(duì)象包含目的基因/核酸。術(shù)語(yǔ)，，植物"也包含植物細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚、分生組織區(qū)、配子體、孢子體、花粉和小孢子，同樣每種提及的對(duì)象包含目的基因/核酸。特別用于本發(fā)明方法中的植物包括屬于植物界(Viridiplantae)超家族的全部植物，尤其單子葉植物和雙子葉植物，包括選自以下的伺用或伺料豆類、觀賞植物、糧食作物、樹或灌木槭樹屬物種(Acerspp.)、獼猴杉匕屬物種(Actinidiaspp.)、秋葵屬物種(Abelmoschusspp.)、水草屬物種(Agropyronspp.)、'蔥屬物種(Alliumspp.)、莧屬物種(Amaranthusspp.)、鳳梨(Ananascomosus)、番蒸枝屬物種(Annonaspp.)、芹菜(Apiumgraveolens)、落花生屬物種(Arachisspp.)、木波羅屬物種(Artocarpusspp.)、石刁柏(Asparagusofficinalis),燕麥屬物種(Avenaspp.)(例如燕麥(Avenasativa)、野，麥(Avenafatua)、》匕贊^^麥(Avenabyzantina)、Avenafatuavar.sativa、雜種燕麥(Avenahybrida)、陽(yáng)桃(Averrhoacarambola)、冬瓜(Benincasahispida)、巴西栗(Bertholletiaexcelsea)、甜菜(Betavulgaris)、蕓苜屬物種(Brassicaspp.)(例如歐洲油菜(Brassicanapus)、蕪青物種(Brassicarapassp.)[卡諾拉油菜、油菜(oilseedrape)、蔓青(turniprape)])、Cadabafarinosa、茶(Camelliasinensis),美人蕉、(Cannaindica)、辣4權(quán)屬物種(Capsicumspp.)、Carexdata、番木瓜(Caricapapaya)、大果假虎刺(Carissamacrocarpa)、山核^&屬物種(Caryaspp.)、紅花(Carthamustinctorius)、栗屬物種(Castaneaspp.)、苦苣(Cichoriumendivia)、樟屬物種(Cinnamomumspp.)、西瓜(Citrulluslanatus)、才甘橘屬物種(Citrusspp.)、椰子屬物種(Cocosspp.)、咖啡屬物種(Coffeaspp.)、芋頭(Colocasiaesculenta)、非洲梧桐屬物種(Colaspp.)、蕪荽(Coriandrumsativum)、榛屬物種(Corylusspp.)、山楂屬物種(Crataegusspp.)、番紅花(Crocussativus)、南瓜屬物種(Cucurbitaspp.)、香瓜種(Cucumisspp.)、菜薊屬物種(Cynaraspp.)、胡蘿卜(Daucuscarota)、山馬鰉屬物種(Desmodiumspp.)、龍目艮(Dimocarpuslongan)、薯蕷屬物種(Dioscoreaspp.)、柿樹屬物種(Diospyrosspp.)、稗屬物種(Echinochloaspp,)、油棕屬(Elaeis)(例如油棕(Elaeisguineensis)、美洲油棕Elads(oleifera))、糝子(Eleusinecoracana)、枇杷(Eriobotryajaponica)、紅仔果(Eugeniauniflora)、蕎麥屬物種(Fagopyrumspp.)、水青岡屬物種(Fagusspp.)、無花果(Ficuscarica)、金桔屬物種(Fortunellaspp.)、草莓屬物種(Fragariaspp.)、4艮杏(Ginkgobiloba)、大豆屬(Glydnespp.)(例如大豆、大豆(Sojahispida)或大豆(Sojamax))、陸地棉(Gossypiumhirstum)、向日葵屬(Helianthusspp.)(例如向日葵(Helianthusannuus))、長(zhǎng)管萱草(Hemerocallisfulva)、木槿屬物種(Hibiscusspp.)、大麥屬(Hordeumspp.)(例長(zhǎng)口大麥(Hordeumvulgare))、甘薯(lpomoeabatatas)、核書^屬物種(Juglansspp.)、萵苣(Lactucasativa)、山黧豆屬物種(Lathyrusspp.)、兵豆(Lensculinaris)、亞麻(Linumusitatisshnum)、荔才支(Litchichinensis)、百樂M艮屬物種(Lotusspp.)、棱角絲瓜(Luffaacutangula)、羽扇豆屬物種(Lupinusspp.)、Luzulasylvatica、番茄屬(Lycopersiconspp.)(例A。番茄(Lycopersiconesculentum、Lycopersiconlycopersicum、Lycopersiconpyriforme))、硬皮豆屬物種(Macrotylomaspp.)、蘋果屬物種(Malusspp.)、凹緣金虎尾(Malpighiaemarginata)、牛油果(Mammeaamericana)、芒果(Mangiferaindica)、木薯屬物種(Manihotspp.)、人心果(Manilkarazapota)、苜蓿(Medicagosativa)、草木樨屬物種(Melilotusspp.)、薄荷屬物種(Menthaspp.)、芒屬物種(Miscanthusspp.)、苦瓜屬物種(Momordicaspp.)、黑桑(Morusnigra)、芭蕉屬物種(Musaspp.)、煙草屬物種(Nicotianaspp.)、木犀欖屬物種(Oleaspp.)、仙人掌屬物種(Opuntiaspp.)、鳥足豆屬物種(Ornithopusspp.)、稻屬(Oryzaspp,)(例如稻、闊葉稻(Oryzalatifolia))、稷(Panicummiliaceum)、雞蛋果(Passifloraedulis)、歐防風(fēng)(Pastinacasativa)、釋梨屬物種(Perseaspp.)、芽茱(Petroselinumcrispum)、菜豆屬物種(Phaseolusspp.)、刺葵屬物種(Phoenixspp.)、酸漿屬物種(Physalisspp.)、；^屬物種(Pinusspp.)、阿月渾子(Pistaciavera)、豌豆屬物種(Pisumspp.)、早熟禾屬物種(Poaspp.)、楊屬物種(Populusspp.)、牧豆草屬物種(Prosopisspp.)、李屬物種(Prunusspp.)、番石榴屬物種(Psidiumspp.)、石榴(Punicagranatum)、西洋梨(Pyruscommunis)、櫟屬物種(Quercusspp.)、蘿卜(Raphanussativus)、波葉大黃(Rheumrhabarbarum)、茶薦子屬物種(Ribesspp.)、蓖麻(Ricinuscommunis)、懸鉤子屬物種(Rubusspp.)、甘蔗屬物種(Sacchammspp.)、接骨木屬物種(Sambucusspp.)、黑麥(Secalecereale)、胡麻屬物種(Sesamumspp.)、白芥屬物種(Sinapissp.)、茄屬(Solamimspp.)(侈'H口馬鈴薯(Solanumtuberosum)、紅癡(Solanumintegrifolium)或番慕(Solanumlycopersicum))、兩色蜀黍(Sorghumbicolor)、菠菜屬物種(Spinadaspp.)、蒲桃屬物種(Syzygiumspp.)、萬(wàn)壽菊屬物種(Tagetesspp.)、酸豆(Tamarindusindica)、可可樹(Theobromacacao)、車軸草屬物種(Trifoliumspp.)、Triticosecalerimpaui、小麥屬(Triticumspp.)(例長(zhǎng)口普通小麥(Triticumaestivum)、石更粒小麥(Triticumdurum)、圓柱小麥(Triticumturgidum)、Triticumhybernum、馬卡小麥(Triticummacha)、普通小麥(Triticumsativum)或普通小麥(Triticumvulgare))、小金蓮花(Tropaeolumminus)、金蓮花(Tropaeolummajus)、越桔屬物種(Vacciniumspp.)、野碗豆屬物種(Viciaspp.)、豇豆屬物種(Vignaspp.)、香堇(VioIaodorata)、葡萄屬物種(Vitisspp.)、玉蜀黍、Zizaniapalustris、參屬物種(Ziziphusspp.)等等。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，植物是作物植物。作物植物的實(shí)例包括大豆、向日葵、卡諾拉油菜(eanola)、苜蓿、油菜(rapeseed)、棉花、番茄、馬鈴薯和煙草。還優(yōu)選地，植物是單子葉植物。單子葉植物的實(shí)例包括甘蔗。更優(yōu)選地，植物是谷物。谷物的實(shí)例包括稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、高粱和燕麥。本發(fā)明還包括本文所述的編碼III類TPP蛋白質(zhì)的核酸的用途和這些III類TPP蛋白質(zhì)用于改良植物產(chǎn)量相關(guān)性狀的用途。本文所述的編碼III類TPP蛋白質(zhì)的核酸或III類TPP蛋白質(zhì)本身可以用于育種程序中，其中鑒定到可以遺傳地與III類TPP編碼基因連接的DNA標(biāo)記。所述的核酸序列/基因、或III類TPP蛋白質(zhì)本身可以用來定義分子標(biāo)記。這種DNA或蛋白質(zhì)標(biāo)記隨后可以在育種程序中用來選擇在本發(fā)明方法中具有如上文定義的改良的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物。編碼III類TPP蛋白質(zhì)的核酸或基因的等位變體也可以用于標(biāo)記輔助的育種程序中。這種育種程序有時(shí)需要通過使用例如EMS誘變法對(duì)植物進(jìn)行誘變處理而引入等位基因變異；備選地，該程序可以從非人為引起的所謂"自然，，起源的一組等位變體開始。隨后進(jìn)行等位變體的鑒定，例如通過PCR法。此后是用于選擇所討論及導(dǎo)致增加產(chǎn)量的序列的優(yōu)異等位變體的步驟。一般通過監(jiān)測(cè)含有所討論序列的不同等位變體的植物的生長(zhǎng)性能而實(shí)施選擇。可以在溫室中或田間監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)性能。其他任逸步驟包括將鑒定了優(yōu)異等位變體的植物與另一種植物雜交。這可以用來例如產(chǎn)生目標(biāo)表型特征的組合。編碼III類TPP蛋白質(zhì)的核酸也可以用作探針以便對(duì)基因進(jìn)行遺傳作圖或物理作圖，所述探針作為所述基因的一部分及與這些基因關(guān)聯(lián)的性狀的標(biāo)記。此類信息可以用于植物育種中，以便開發(fā)具有目的表型的林系。編碼III類TPP蛋白質(zhì)的核酸的這種用途僅需要具有至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核,列。編碼III類TPP蛋白質(zhì)的核酸可以用作限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記。限制性消化的植物基因組DNA的Southern印跡(SambrookJ，F(xiàn)ritschEF和ManiatisT(1989)MolecularCloning,ALaboratoryManual)可以用編碼III類TPP蛋白質(zhì)的核酸探測(cè)。產(chǎn)生的結(jié)合圖式隨后可以使用計(jì)算枳4呈序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics1:174-181)進(jìn)行遺傳分析以構(gòu)建遺傳圖。此外，該核酸可以用來探測(cè)含有經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶處理的一組個(gè)體的基因組DNA的Southern印跡，其中所迷的一組個(gè)體代表具有確定的遺傳雜交的親代和后代。DNA多態(tài)性的分離被標(biāo)出并用來計(jì)算III類TPP蛋白質(zhì)的核酸在使用這個(gè)群體先前所獲得的遺傳圖中的位置(Botstein等(1980)Am.丄Hum.Genet.32:314-331)。在Bernatzky和Tanksley(1986)PlantMol.Biol.Reporter4:37-41中描述了植物基因衍生的探針的產(chǎn)生和其在遺傳作圖中的用途。眾多出版物描述了使用以上所提及的方法學(xué)或其改良方法對(duì)特定cDNA克隆的遺傳作圖。例如，F(xiàn)2互交群、回交群、隨機(jī)交配群、鄰近純合系和其他個(gè)體群體可以用于作圖。此類方法學(xué)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。所述核酸探針也可以用于物理作圖(即序列在物理圖上的排列；見Hoheisel等在Non-mammalianGenomicAnalyasis:APracticalGuide,Academicpress1996，第319-346頁(yè)及其中引用的參考文獻(xiàn))。在另一實(shí)施方案中，核酸探針可以在直接熒光原位雜交(FISH)作圖法(Trask(1991)TrendsGenet.7:149-154)中使用。盡管當(dāng)前的FISH作圖法支持使用大型克隆(幾個(gè)kb至幾百個(gè)kb;見Laan等(1995)GenomeRes.5:13-20),然而靈敏度的改善可以允許使用更短探針進(jìn)行FISH作圖用于遺傳作圖及物理作圖的多種基于核酸擴(kuò)增的方法可以使用所述核酸序列而實(shí)施。實(shí)例可見于文中的"定義"部分。實(shí)例包括等位基因特異性擴(kuò)增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11:95-96)、PCR擴(kuò)增片段的多態(tài)性(CAPS;Sheffield等，(1993)Genomics16:325-332)、等位基因特異性連接(Landegren等，(1988)Science241:1077-1080)、核苷酸延伸反應(yīng)(Sokolov(1990)NucleicAcidRes.18:3671)、放射雜交作圖(Walter等，(1997)Nat.Genet.7:22-28)和Happy作圖(Dear和Cook，(1989)NucleicAcidRes.17:6795-6807)。為實(shí)施這些方法，使用核酸序列設(shè)計(jì)和產(chǎn)生用于擴(kuò)增反應(yīng)或引物延伸反應(yīng)的引物對(duì)。這類引物的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。使用基于PCR的遺傳作圖的方法，可能需要鑒定跨越相應(yīng)于本發(fā)明核酸序列區(qū)域作圖的親本之間DNA序列的差異。然而，這對(duì)作圖方法通常不是必要的。本發(fā)明方法產(chǎn)生如前文所述的具有增加的種子產(chǎn)量的植物。這些性狀也可以與經(jīng)濟(jì)上有利的其他性狀組合，如產(chǎn)量增強(qiáng)性狀、對(duì)其他非生物和生物脅迫的耐受性、調(diào)節(jié)多種構(gòu)造性特征和/或生物化學(xué)特征和/或生理學(xué)特征的性狀。附圖描述本發(fā)明現(xiàn)在將參考下列附圖進(jìn)行描述，其中圖l是in類TPP多肽中存在的結(jié)構(gòu)元件的示意圖。示出的特征性元件的位置海藻糖礴酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域、磷酸酶BOXA和BOXB，以及絲氨酸富含結(jié)構(gòu)域。圖2是實(shí)施例2所述的TPS/TPP多肽的序列比對(duì)和系統(tǒng)樹。圖2A顯示TPS/TPP多肽的系統(tǒng)樹。橢圓圏出的進(jìn)化支含有I類TPS蛋白質(zhì)和II類TPS蛋白質(zhì)。III類TPP蛋白質(zhì)(長(zhǎng)方形框中)不聚蔟于I類和II類TPS組。圖2B顯示植物來源的III類TPP多肽的比對(duì)。海藻糖磷酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域的區(qū)域以黑體突出顯示。絲氨酸富含(結(jié)構(gòu)域)和磷酸酶A和B框用長(zhǎng)方形框突出顯示。圖2C顯示非植物來源的III類TPP多肽的系統(tǒng)樹。圖2D非植物來源的III類TPP多肽的比對(duì)。圖3是III類TPP多肽中發(fā)現(xiàn)的海藻糖磷酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域的比對(duì)。圖4顯示HPLC測(cè)定的TPP活性。第一張圖，圖4A的對(duì)應(yīng)對(duì)照樣品pGEX，第二張圖，圖4B對(duì)應(yīng)TPPI樣品。圖5是顯示對(duì)照樣品、pGEX和TPP樣品HPLC測(cè)定的TPP定量活性的柱形圖。圖6顯示擬南芥I11類TPP多肽對(duì)酵母菌林YSH448(tps2A)生長(zhǎng)缺陷的互補(bǔ)性。圖6A中的照片對(duì)應(yīng)30'C的點(diǎn)滴測(cè)試(dropassay)的平板，顯示在非限制性溫度下所有的菌林均是活的。圖6B顯示37'C下的平板，其顯示在只有限制性溫度37X:下只有III類TPP多肽轉(zhuǎn)化的菌株生長(zhǎng)良好。圖6C顯示39'C下點(diǎn)滴測(cè)試的平板。圖7用于增加稻中在GOS2啟動(dòng)子控制下的擬南芥III類TPP蛋白質(zhì)編碼核^Ji的雙元載體。圖8序列表。實(shí)施例本發(fā)明現(xiàn)在將參考僅作為說明的下列實(shí)施例加以描述。下列實(shí)施例不意圖徹底定義或限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1:鑒定SEQIDNO:1和SEQIDNO:2相關(guān)的序列使用數(shù)據(jù)庫(kù)序列搜索工具，如基本局部比對(duì)工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410;和Altschul等(1997)NucleicAcidsRes.25:3389-3402)在國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中所維護(hù)的那些序列內(nèi)鑒定到與SEQIDNO:1相關(guān)的(全長(zhǎng)cDNA、EST或基因組)序列和/或與SEQIDNO:2相關(guān)的蛋白質(zhì)序列。該程序用來通過核酸序列或多肽序列與序列數(shù)據(jù)庫(kù)比較并通過計(jì)算匹配的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性而找到序列間具有局部相似性的區(qū)域。對(duì)SEQIDNO:1所編碼的多肽4吏用TBLASTN算法，采用默認(rèn)設(shè)置和過濾以忽略低復(fù)雜性序列抵消。分析的結(jié)果通過配對(duì)性比較顯示，并根據(jù)幾率評(píng)分(E-值)排序，其中該評(píng)分反映特定比對(duì)結(jié)果因偶然而發(fā)生的概率(E-值越低，命中的顯著性越高)。除了E-值外，比較還通過同一性百分?jǐn)?shù)進(jìn)行記分。同一性百分?jǐn)?shù)指兩個(gè)所比較核酸(或多肽)序列之間在特定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的相同核苷酸(或M酸)數(shù)目。在一些情況下，可以調(diào)整默認(rèn)參數(shù)以調(diào)節(jié)搜索法的嚴(yán)格性。表A提供與SEQIDNO:1所示的核酸序列和SEQIDNO:2所示的蛋白質(zhì)序列相關(guān)的核酸和蛋白質(zhì)序列的列表。表A:用于本發(fā)明方法中的與SEQIDNO:1所示核酸序列相關(guān)的核^列，及對(duì)應(yīng)的推導(dǎo)多肽。對(duì)于每個(gè)序列，給出蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的核酸的數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)。__<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>NA.沒有申請(qǐng)。未在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)。nt:核普酸序列PROT:蛋白質(zhì)序列實(shí)施例2:III類TPP多肽序列的比對(duì)使用來自VectorNTI(Invitrogen)的AlignX程序(其基于普遍使用的漸進(jìn)比對(duì)的聚類算法(Clustalalgorithm)(Thompson等，(1997)NucleicAcidsRes25:4876-4882;Chenna等，(2003)NucleicAcidsRes31:3497-3500))進(jìn)行III類TPP多肽序列的比對(duì)?？墒褂绵徑泳垲愃惴?gòu)建系統(tǒng)樹，采用默認(rèn)值(空位開放罰分的缺省值為10，空位延伸罰分的缺省值為0.1，選擇的權(quán)重矩陣是Blosum62(如果比對(duì)多肽))。實(shí)施例3:計(jì)算可用于實(shí)施本發(fā)明方法的多肽序列之間的全局百分比同一性(globalpercentageidentity)使用可在本領(lǐng)域內(nèi)獲得的方法中的一個(gè)方法MatGAT(矩陣全局比對(duì)工具(MatrixGlobalAlignmentTool))軟件(BMCBioinformatics.20034:29.MatGAT:^使用蛋白質(zhì)或DNA序列而產(chǎn)生相似性/同一性矩陣的應(yīng)用，CampanellaJJ，BitinckaL,SmalleyJ;由LedionBitincka托管的軟件)，確定實(shí)施例的1表A中所給出的一些全長(zhǎng)多肽序列之間的全局相似性和同一性百分比。MatGAT軟件無需對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)比對(duì)，即可產(chǎn)生DNA或蛋白質(zhì)序列的相似性/同一性矩陣。該程序利用Myers和Miller全局比對(duì)算法(空位開放罰分為12，而空位延伸罰分為2)進(jìn)行一系列的兩兩比對(duì)，利用Blosum62(對(duì)于多肽而言)計(jì)算相似性和同一性，然后將結(jié)果排列成if巨離矩陣。序列相似性示于對(duì)角線下半部，而序列同一性示于對(duì)角線上半部。比較所用的參數(shù)有記分矩陣Blosum62首個(gè)空位12延伸空位2全局相似性和同一性的軟件分析結(jié)果分別示于表B中的對(duì)角線下方和對(duì)角線上方。SEQIDNO:2與表B1所示的旁系同源蛋白質(zhì)的之間的全局相似性大于48%同一性。SEQIDNO:2與表B2和B3給出的植物同源序列的相似性大于40%同一性(雙子葉來源植物的蛋白質(zhì))和大于45%同一性(單子葉來源植物的蛋白質(zhì))。表B:全長(zhǎng)多肽序列范圍的全局相似性和同一性的MatGAT結(jié)果。表B1:擬南芥III類TPP多肽的旁系同源物之間的全局相似性和同一性。<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>實(shí)施例4:鑒定III類TPP多肽中包含的結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)家族、結(jié)構(gòu)域和位點(diǎn)整合資源(IntegratedResourceofProteinFamilies,DomainsandSites(InterPro))數(shù)據(jù)庫(kù)是進(jìn)行基于文本以及序列的搜索常用的標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)的整合界面。InterPro數(shù)據(jù)庫(kù)將這些數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合起息，以獲得蛋白質(zhì)標(biāo)簽。合作數(shù)據(jù)庫(kù)包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。Interpro由位于英國(guó)的歐洲生物信息學(xué)研究所(EuropeanBioinformaticsInstitute)托管。SEQIDNO:14所示多肽序列的InterPro掃描結(jié)果示于表C。表C:SEQIDNO:14所示多肽序列的InterPro掃描結(jié)果數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)登錄名稱結(jié)構(gòu)域的同源區(qū)TIGRFAMsTIGR01484HAD-SF-IIB:HAD-水解酶超家族119-332PfamPF02358海藻糖磷酸磷酸酶121-354TIGRFAMsTIGR00685T6PP:海藻糖4酸酶115-365實(shí)施例5:海藻糖磷酸磷酸酶活性的體外活性測(cè)定擬南芥III類TPP多肽對(duì)應(yīng)的AtTPPI同種型的編碼區(qū)克隆進(jìn)入pGEX-4T-l(Pharmacia)質(zhì)粒，所迷質(zhì)粒設(shè)計(jì)為產(chǎn)生GST-融合蛋白。該栽體引入大腸桿菌。純化在大腸桿菌菌林BL21中產(chǎn)生的表達(dá)的重組蛋白質(zhì)，且通過HPLC測(cè)定TPP活性。在大腸桿菌中表達(dá)用pGEX-GST構(gòu)建體轉(zhuǎn)化超級(jí)感受態(tài)大腸桿菌菌林BL21StarTM(DE3)OneShot(Invitrogen)細(xì)胞，且在LuriaBertani(LB)培養(yǎng)基+氨芐青霉素(Amp)平板上37'C培養(yǎng)過夜。收集菌落并轉(zhuǎn)入加0mlLB+Amp，37。C震蕩培養(yǎng)4小時(shí)，然后加入異丙基-P-硫代半乳糖苷(IPTG，0.3mM終濃度)誘導(dǎo)表達(dá)。隨后在30。C下進(jìn)行另一個(gè)培養(yǎng)期4小時(shí)。4。C離心(30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分鐘)收集細(xì)胞并重懸于5ml水冷的lx磷酸緩沖液溶液(PBS)(140mMNaCl;2.7mMKC1;10mMNa2HP04;1.8mMKH2P04;pH7.3)，等分于5個(gè)冷的螺口試管。4'C離心(5分鐘，6000轉(zhuǎn)/分鐘)后，在液氮中冷凍沉淀并儲(chǔ)存在-8ox:。蛋白質(zhì)純化細(xì)胞用5mli水冷的裂解緩沖液(lxPBS;0.4%Triton、2mMMgCl2、lmMEDTA、2mM二石危蘇糖醇(DTT)、0.2mg/ml溶菌酶和1片EDTA蛋白酶抑制劑混合物(Roche)/10ml裂解緩沖液)洗滌一次，在水上孵育15分鐘，并用15秒脈沖的超聲波(sonication)超聲處理(SartoriusLabsonicP)。裂解物在4。C下12，000g離心澄清。上清部分與200pi谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠小珠(AmershamBiosciences)混合，所述小珠已用洗滌緩沖液預(yù)平衡(lxPBS;0.1。/。Triton、2mMMgCl2、1mMEDTA、1mMDTT),并在滾筒(rollerdrum)中4'C孵育1小時(shí)。4X:離心(1分鐘，1800轉(zhuǎn)/分鐘)收集小珠，用1ml冰冷的洗滌緩沖液洗滌5次，并在進(jìn)行TPP活性測(cè)定之前儲(chǔ)存在-20。C。TPP活性測(cè)定海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)活性通過測(cè)定在蛋白質(zhì)樣品中加入海藻糖-6-磷酸(T6P)之后產(chǎn)生的海藻糖(T)檢測(cè)。樣品加入含TW的150|il測(cè)試緩沖液(2mMT6P、2mMMgCI2、10有效霉素A和45mMTris-HC,pH7.5)或不含T6P的150pl測(cè)試緩沖液(2mMMgCl2、10juM有效霹素A和45mMTris-HCl，pH7.5)。37。C孵育1-1.5小時(shí)后，離心(IO分鐘，1，200g)收集小珠，并將上清和T標(biāo)準(zhǔn)稀釋液注射入HPLC。通過Bradford方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。圖4所示的結(jié)果顯示TPPI具有海藻糖-6-磷酸磷酸酶活性。實(shí)施例6:海藻糖磷酸磷酸酶的體內(nèi)活性測(cè)定SEQIDNO:2所示酶的活性以及具有SEQIDNO:10、12、16、18、20、22、24、26和28所示的序列的其旁系同源物蛋白質(zhì)的活性根據(jù)Vogel等，1998描述的方法(進(jìn)行小的改動(dòng))，通過酵母tps2突變體的功能性<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>實(shí)施例7:克隆SEQIDNO:1所示的核酸序列除非另外聲明，重組DNA技術(shù)根據(jù)(Sambrook(2001)MolecularCloning:alaboratorymanual,第三版ColdSpringHarborLaboratoryPress,CSH，NewYork)中或Ausubel等(1994)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols第1和2巻中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。用于植物分子工作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法在由BIOSScientificPublicationsLtd(UK)和BlackwellScientificPublications(UK)出版的R.D.D.Croy的PlantMolecularBiologyLabfax(1993)中描迷。擬南芥III類TPP基因通過PCR，使用擬南芥幼苗cDNA文庫(kù)(lnvitrogen，Paisley,英國(guó))作為模板而擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增所用的引物是-prm05451(SEQIDNO:99，引物；有義，起始密碼子是黑體，AttBl位點(diǎn)是斜體5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgactaaccagaatgtcatc-3')和pnn05452(SEQID隱100，引物2;反義，互補(bǔ)，AttB2位點(diǎn)是斜體5'-卿,cac卿acaagfaaagfC咖fifftgtaattatgttgcatgtctt-3':),其包括用于Gateway重組的AttB位點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用HifiTaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR。擴(kuò)增預(yù)期長(zhǎng)度的PCR片段，并也使用標(biāo)準(zhǔn)方法予以純化。隨后實(shí)施Gateway方法的第一步驟，即BP反應(yīng)，在此期間PCR片段與pDONR201質(zhì)粒發(fā)生體內(nèi)重組以產(chǎn)生根據(jù)Gateway命名的"i^A克隆"，pEC—III類TPP。質(zhì)粒pDONR201作為Gateway⑧技術(shù)的構(gòu)成部分從Invitrogen購(gòu)買。實(shí)施例8:使用如SEQIDNO:l所示的核酸序列構(gòu)建表達(dá)載體進(jìn)入克隆pEC—III類TPP隨后在LR反應(yīng)中與用于稻轉(zhuǎn)化的目的栽體一起使用。這種栽體在T-DNA邊界內(nèi)含有作為功能性元件的植物選擇性標(biāo)記；可篩選標(biāo)記表達(dá)盒和意圖與已經(jīng)克隆于所述進(jìn)入克隆內(nèi)的目的核酸序列發(fā)生LR體內(nèi)重組的Gateway盒。用于組成型表達(dá)的稻GOS2啟動(dòng)子(SEQIDNO:98)位于這種Gateway盒的上游。在LR重組步驟后，產(chǎn)生的表達(dá)載體PXC_III類TPP(圖7)根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌林LBA4044中。實(shí)施例9:植物轉(zhuǎn)化稻轉(zhuǎn)化含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌用來轉(zhuǎn)化稻植物。將稻的日本栽培品種Nipponbare的成熟干燥種子脫殼。通過在70%乙醇中溫育一分鐘，隨后在2%HgC12中30分鐘，隨后用無菌蒸餾水洗滌6次15分鐘而實(shí)施消毒。消毒的種子隨后在含有2，4-D的培養(yǎng)基(愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基)上萌發(fā)。在黑暗中溫育4周后，將盾片衍生的胚發(fā)生性愈傷組織切下并在同一種培養(yǎng)基上增殖。2周后，愈傷組織通過在同一種培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)另外2周而繁殖或增殖。胚發(fā)生性愈傷組織片在新鮮培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)3日，之后共培育(以增強(qiáng)細(xì)胞分裂活性)。含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌林LBA4404用于共培育。農(nóng)桿菌接種在含有適宜抗生素的AB培養(yǎng)基上并在28。C培養(yǎng)3日。隨后將細(xì)菌收集并重懸在液體共培育培養(yǎng)基中至密度(OD600)約1。將混懸液f^轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)亞并將愈傷組織在該混懸液內(nèi)浸泡15分鐘。愈傷組織組織隨后在濾紙上吸干并轉(zhuǎn)移至固化的共培育培養(yǎng)基上并且在黑暗中于25。C溫育3日。共培育的愈傷組織在黑暗中于28。C在選擇劑存在下于含有2，4-D的培養(yǎng)基上培育4周。在此時(shí)段期間，形成迅速生長(zhǎng)的抗性愈傷組織島。在這種材料轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基并在光線下溫育后，胚發(fā)生潛力釋放并且苗在隨后4-5周發(fā)育。將苗從愈傷組織中切下并且在含有植物生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上溫育2-3周，其中將苗從所述的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移至土壤。硬化的苗在高濕度和短日照下于溫室中培育。一個(gè)構(gòu)建體產(chǎn)生大約35個(gè)獨(dú)立T0稻轉(zhuǎn)化體。將原代轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移至溫室。在定量PCR分析以驗(yàn)證T-DNA插入物的拷貝數(shù)后，僅保留表現(xiàn)選擇劑耐受性的單拷貝轉(zhuǎn)基因植物用于收獲Tl種子。種子隨后在移植后3-5月收獲。本方法以超過50%的比率產(chǎn)生單一基因座轉(zhuǎn)化體(Aldemita和Hodgesl996,Chan等1993，Hiei等1994)。玉米轉(zhuǎn)化玉米的轉(zhuǎn)化根據(jù)對(duì)Ishida等(1996.NatureBiotech14745-50)描述方法的改良方法進(jìn)行。在玉米中的轉(zhuǎn)化是基因型依賴的并且僅特定的基因型可操作用于轉(zhuǎn)化和再生。近交系A(chǔ)188(明尼蘇達(dá)大學(xué))或以A188作為親本的雜種是用于轉(zhuǎn)化的供體材料的良好來源，但是其他基因型也可以成功地使用。玉米穗從玉米植物中在授粉后大約11日(DAP)收獲，此時(shí)不成熟胚的長(zhǎng)度是大約1至1.2mm。不成熟胚與含有表達(dá)栽體的根癌農(nóng)桿菌共培育并且轉(zhuǎn)基因植物通過器官發(fā)生而恢復(fù)。切下的胚在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上、隨后在玉米再生培養(yǎng)基上培育，其中所迷的再生培養(yǎng)基含有選擇劑(例如咪唑啉酮，但可以使用多種選擇標(biāo)記)。培養(yǎng)板在25。C于光照下培養(yǎng)2-3周，或直至苗發(fā)育。將綠色苗從每個(gè)胚轉(zhuǎn)移至玉米生根培養(yǎng)基并在25。C培養(yǎng)2-3周，直至根發(fā)育。將生根的苗移植至溫室的土壤中。^現(xiàn)選擇劑耐受的并含有單拷貝的T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生Tl種子。小麥轉(zhuǎn)化小麥的轉(zhuǎn)化用Ishida等Ishida等(1996)NatureBiotech14(6):745-50描述的方法進(jìn)行。通常在轉(zhuǎn)化中使用(可從墨西哥CIMMYT獲得的)栽培品種Bobwhite。不成熟胚與含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌共培育并且轉(zhuǎn)基因植物通過器官發(fā)生而恢復(fù)。在與農(nóng)桿菌溫育后，胚在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上、隨后在再生培養(yǎng)基上體外培育，其中所述的再生培養(yǎng)基含有選擇劑(例如咪唑啉酮，但可以使用多種選擇標(biāo)記)。培養(yǎng)平板在25。C于光照下培養(yǎng)2-3周，或直至苗發(fā)育。將綠色苗從每個(gè)胚轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基并在25匸培養(yǎng)2-3周，直至根發(fā)育。將生根的苗移植至溫室的土壤中。從表現(xiàn)選擇劑耐受的并含有單拷貝的T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生Tl種子。大豆轉(zhuǎn)化才艮據(jù)對(duì)TexasA&M美國(guó)專利5，164，310中所述方法的改良方法轉(zhuǎn)化大豆。幾個(gè)商業(yè)大豆品種對(duì)于通過這種方法的轉(zhuǎn)化是可行的。栽培品種Jack(從Illinois種子基金會(huì)可獲得)通常用于轉(zhuǎn)化。對(duì)大豆種子消毒以便體外播種。從7日齡幼苗中切下下胚軸、胚根和一片子葉。進(jìn)一步培育上胚軸和余下的子葉以發(fā)育腋生節(jié)。將這些腋生節(jié)切下并與含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌溫育。在共培育處理之后，將外植體洗滌并轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基。將再生的苗切下并置于苗伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上。將長(zhǎng)度不超過lcm的苗置于生根培養(yǎng)基上直至根發(fā)育。將生根的苗移植至溫室的土壤中。從表現(xiàn)選擇劑耐受的并含有單拷貝T、DNA插入物的植物中產(chǎn)生T1種子。油菜/卡諾拉油菜轉(zhuǎn)化使用5-6日齡幼苗的子葉柄和下胚軸作為用于組織培養(yǎng)的外植體并且根據(jù)Babic等(1998'PlantCellRep17:183-188)轉(zhuǎn)化。商業(yè)栽培品種Westar(AgricultureCanada)是用于轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)品種，但是也可以使用其他品種。對(duì)卡諾拉油菜種子作表面消毒以便體外播種。從體外幼苗中切下具有附著子葉的子葉柄外植體，并以(含有表達(dá)載體的)農(nóng)桿菌通過葉柄外植體的切口端浸入細(xì)菌混懸液而接種。外植體隨后在含有3mg/1BAP、3%蔗糖、0.7。/o植物瓊脂(Phytagar)的MSBAP-3培養(yǎng)基上在23°C，16小時(shí)光照下培養(yǎng)2天。在與農(nóng)桿菌共培育2日后，將葉柄外^t體轉(zhuǎn)移至含有的3mg/!BAP、頭孢噢肟、羧爺青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培養(yǎng)基上持續(xù)7日，并且隨后在含頭孢噻肟、羧千青霉素或特美汀和選擇劑的MSBAP-3培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至苗再生。當(dāng)苗具有5-10mm長(zhǎng)度時(shí)，將苗切下并轉(zhuǎn)移至苗伸長(zhǎng)培養(yǎng)基(含0.5mg/1BAP的MSBAP-0.5)。將長(zhǎng)度大約2cm的苗轉(zhuǎn)移至用于根誘導(dǎo)的生根培養(yǎng)基(MSO)。將生根的苗移植至溫室的土壤中。M現(xiàn)選擇劑耐受性并含有單拷貝T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生Tl種子。苜蓿轉(zhuǎn)化苜蓿的再生性克隆使用(MeKersie等，1999PlantPhysiol119:839-847)的方法加以轉(zhuǎn)化。苜蓿的再生和轉(zhuǎn)化是基因型依賴性的并且因而需要再生植物。已經(jīng)描迷了獲得再生性植物的方法。例如，這些再生性植物可以選自栽培品種Rangelander(AgricultureCanada)或如BrownDCW與AAtanassov(1985.PlantCellTissueCulture4:111-112)描述的任何其他商業(yè)苜蓿品種。備選地，RA3品種(威斯康星大學(xué))已經(jīng)被選擇用于組織培養(yǎng)中(Walker等，1978AmJBot65:654-659)。將葉柄外植體與含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌C58C1pMP卯(McKersie等，1999PlantPhysiol119:839—847)或LBA4404的過夜培養(yǎng)物共培育。外植體在黑暗中在含有288mg/LPro、53mg/L辟u代脯氨酸、4.35g/LK2S04和100jim乙酰丁香酮的SH誘導(dǎo)培養(yǎng)基上共培育3天.外植體在半濃縮Murashige-Skoog培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962)中洗滌并平板接種在不含乙酰丁香酮而含有合適逸擇劑和合適抗生素以抑止農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的相同SH誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。在數(shù)周后，將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移至不含生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、不含抗生素而含有50g/L蔗糖的BOi2Y發(fā)育培養(yǎng)基中。體細(xì)胞胚隨后在半濃縮Murashige-Skoog培養(yǎng)基上萌發(fā)。將生根的幼苗移植至花缽內(nèi)并且在溫室中培育。從表現(xiàn)選擇劑耐受性并含有單拷貝T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生Tl種子。棉花轉(zhuǎn)化根據(jù)US5,159,135中描述的方法，使用根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterhimtumefaciens)轉(zhuǎn)化棉花。棉籽在次氯酸鈉溶液中表面消毒20分鐘，并用含500|ng/ml頭孢氨噢的蒸餾水洗滌。然后將棉籽轉(zhuǎn)移至含有50照/ml苯菌靈(benomyl)的SH-培養(yǎng)基中萌發(fā)。取出4-6天齡幼苗的下胚軸，切成0.5厘米的小塊，并置于0.8。/。瓊脂上。用農(nóng)桿菌懸液(大約108個(gè)細(xì)胞每毫升，由轉(zhuǎn)化有目的基因和合適的選擇標(biāo)記的過夜培養(yǎng)物稀釋得到)接種下胚軸外植體。室溫和光照下3天后將組織轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基(1.6g/l脫乙酰吉蘭糖膠)，所述培養(yǎng)基具有具有Murashige和Skoog鹽以及維生素B5(Gamborg等，Exp.CellRes.50:151-158(1968))，0.1mg/12，4-D、0.1mg/16-糠氨基嘌呤(6陽(yáng)furfurylaminopurine)，750pg/mlMgCl2,以及為了殺死殘留的細(xì)菌的50-100將/ml頭孢氨遂和400-500pg/inl羥芐西林。2-3個(gè)月(每4-6周繼代培養(yǎng)一次)后分離各個(gè)細(xì)胞系，并為了組織擴(kuò)增而進(jìn)一步培養(yǎng)在選擇性培養(yǎng)基上(30°C，16小時(shí)的光周期)。轉(zhuǎn)化的組織隨后進(jìn)一步培養(yǎng)在非選擇性培養(yǎng)基上2-3個(gè)月，以產(chǎn)生體細(xì)胞胚。至少4毫米長(zhǎng)的外觀健康的胚轉(zhuǎn)移至具有細(xì)絰石中的SH培養(yǎng)基的試管中，所迷培養(yǎng)基補(bǔ)充有0.1mg/1吲哚乙酸、6糠氨基嘌呤和赤霉烯酸。胚在30X:，16小時(shí)的光周期下培養(yǎng)，且2-3葉期的小植株轉(zhuǎn)移到具有蛭石和營(yíng)養(yǎng)物的花缽中。植物硬化并^移到溫室中進(jìn)一步培育。實(shí)施例10:表型評(píng)價(jià)方法10.1評(píng)價(jià)準(zhǔn)備產(chǎn)生大約35個(gè)獨(dú)立的TO稻轉(zhuǎn)化體。原代轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移至溫室用于生長(zhǎng)和收獲T1種子。留下5個(gè)事件，其中所述事件的T1后代對(duì)轉(zhuǎn)基因的存在/不存在以3:1比例分離。對(duì)于這些事件中的每一事件，通過和缺少轉(zhuǎn)基因的大約10林T1幼i苗(失效合子)。轉(zhuǎn)基因植物和對(duì)應(yīng)的失效合子在隨機(jī)位置上并排培育。溫室條件是短日照(12小時(shí)光照)，在光線下28。C和在黑暗中22。C以及相對(duì)濕度70%。按照Tl代相同的評(píng)估方法(但是每個(gè)事件具有更多的個(gè)體)對(duì)4個(gè)Tl事件的T2代進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)估。從播種期到成熟期，植物多次通過數(shù)碼成像箱。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上對(duì)每林植物從至少6個(gè)不同的角度獲取數(shù)碼圖像(2048xl536像素，1千6百萬(wàn)色)。干旱篩選在正常條件下在花盆土中培養(yǎng)來自T2種子的植物，直到進(jìn)入抽穗期。然后將其轉(zhuǎn)移到"干燥"區(qū)域，停止灌溉。向隨機(jī)選擇的花盆中插入濕度探測(cè)儀，以監(jiān)測(cè)土壤水含量(SWC)。當(dāng)SWC低于一定的閾值時(shí)，自動(dòng)向植物持續(xù)加水，直到達(dá)到正常水平。然后將植物再次重新轉(zhuǎn)移回正常M下。其余的栽培(植物成熟、種子收獲)與不在非生物脅迫條件下培養(yǎng)的植物相同。詳細(xì)記錄正常條件下培養(yǎng)的生長(zhǎng)和產(chǎn)量參數(shù)。氮利用率篩選在除營(yíng)養(yǎng)液以外正常的條件下在花盆土中培養(yǎng)來自T2種子的稻植物。從植物移植到成熟一直用特定的營(yíng)養(yǎng)液對(duì)花盆澆水，所述營(yíng)養(yǎng)液的氮(N)含量降低，通常比正常(對(duì)照)植物低7到8倍。其余的栽培(植物成熟、種子收獲)與不在非生物脅迫條件下培養(yǎng)的植物相同。詳細(xì)記錄正常條件下培養(yǎng)的生長(zhǎng)和產(chǎn)量參數(shù)。10.2統(tǒng)計(jì)分析F檢驗(yàn)利用雙因素ANOVA(方差分析)作為統(tǒng)計(jì)模型，對(duì)植物表型特征進(jìn)行全面評(píng)估。對(duì)用本發(fā)明基因轉(zhuǎn)化的所有植林的所有事件的所有測(cè)量參數(shù)進(jìn)行F檢驗(yàn)。進(jìn)行F檢驗(yàn)以檢查基因?qū)λ修D(zhuǎn)化事件的效應(yīng)，并檢驗(yàn)基因的總體效應(yīng)，亦稱為"整體基因效應(yīng)"。真實(shí)整體基因效應(yīng)的顯著性閾值設(shè)置為F檢驗(yàn)的5。/。概率水平。如果顯著性F檢驗(yàn)值指向某基因效應(yīng)，這意味著不僅僅A^因的存在或定位引^型上的差異。10.3測(cè)量的參數(shù)生物量相關(guān)參數(shù)的測(cè)量從播種期到成熟期，植物多次通過數(shù)碼成像箱。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上對(duì)每林植物從至少6個(gè)不同的角度獲取數(shù)碼圖像(2048xl536像素，1千6百萬(wàn)色)。植物地上面積(或者說葉生物量)通過計(jì)數(shù)區(qū)別于背景的地上植物部分?jǐn)?shù)碼圖像的像素總數(shù)而確定。此值取同一時(shí)間點(diǎn)從不同的角度拍攝的照片的平均值，并通過校準(zhǔn)轉(zhuǎn)換為以平方毫米表示的物理表面值(physicalsurfacevalue)。實(shí)驗(yàn)表明通過這種方法測(cè)量的地上植物面積與植物地上部分的生物量相關(guān)。地上面積在植物達(dá)到其最大葉生物量的時(shí)間點(diǎn)測(cè)量的面積。植物早期萌發(fā)勢(shì)從萌發(fā)后三周的植物(幼苗)地上面積估測(cè)。根生物量的增加表達(dá)為根總生物量(測(cè)量為根指數(shù)生長(zhǎng)期中觀察到的最大根生物量)的增加；或者表達(dá)為根/冠比(root/shootindex)(測(cè)量為根和莖活躍生長(zhǎng)期時(shí)才艮質(zhì)量與莖質(zhì)量的比率)的增加。種子相關(guān)Wt的測(cè)量收獲成熟的初級(jí)圓錐花序、計(jì)數(shù)、裝袋、貼上條形碼標(biāo)記，然后在烤箱中于37。C干燥三天。隨后將圓錐花序脫粒，收集并計(jì)數(shù)所有的種子。使用鼓風(fēng)裝置將飽滿谷殼和空殼分開。棄去空殼，再次計(jì)數(shù)剩下的部分。在分析天平上稱重飽滿的谷殼。通過計(jì)數(shù)在分離步驟之后剩下的飽滿谷殼數(shù)確定飽滿種子的數(shù)目。通過稱量所有從植物中收獲的飽滿谷殼來測(cè)量種子總產(chǎn)量。通過計(jì)數(shù)從植物收獲的谷殼的數(shù)目測(cè)量每林植物的種子總數(shù)。從計(jì)數(shù)的飽滿種子數(shù)目和它們的總重推斷得出千粒重(TKW)。收獲指數(shù)在本發(fā)明中定義為種子總產(chǎn)量和地上面積(mm"之間的比值，再乘以因子106。每個(gè)圓錐花序的花總數(shù)在本發(fā)明中定義為種子總數(shù)與成熟初級(jí)圓錐花序數(shù)之間的比率。種子飽滿率在本發(fā)明中定義為飽滿種子數(shù)占種子總數(shù)的比例(以％表示)。實(shí)施例ll:轉(zhuǎn)基因植物的表型評(píng)價(jià)結(jié)果表E中給出了在GOS2啟動(dòng)子控制下表達(dá)核,列SEQIDNO:l的轉(zhuǎn)基因稻植物的評(píng)價(jià)結(jié)果。還顯示轉(zhuǎn)基因植物和對(duì)應(yīng)的失效合子之間的差異百分?jǐn)?shù)，來自F檢驗(yàn)的P值低于0.05。與對(duì)照植物(在這種情況下，失效合子)相比，種子總產(chǎn)量、飽滿種子數(shù)、種子飽滿率和收獲指數(shù)在表達(dá)核酸序列SEQIDNO:l的轉(zhuǎn)基因植物中顯著增加。表E:在GOS2啟動(dòng)子控制下表達(dá)核酸序列SEQIDNO:l的轉(zhuǎn)基因稻植物的評(píng)價(jià)結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>在GOS2啟動(dòng)子控制下表達(dá)核酸序列SEQIDNO:l的轉(zhuǎn)基因稻植物也進(jìn)行干旱篩選，與相應(yīng)的對(duì)照植物相比，下列參數(shù)增加，標(biāo)記有*的參數(shù)來自F檢驗(yàn)的P值低于0.05。*種子總產(chǎn)量(相對(duì)于對(duì)照植物增加11%)、*飽滿種子數(shù)(相對(duì)于對(duì)照植物增加10%)、*收獲指數(shù)(相對(duì)于對(duì)照植物增加11%)、飽滿率(相對(duì)于對(duì)照植物增加8%)。表F:在GOS2啟動(dòng)子控制下表達(dá)核酸序列SEQIDNO:l的轉(zhuǎn)基因稻植物(經(jīng)歷氮利用率篩選)的評(píng)價(jià)結(jié)果。與相應(yīng)的對(duì)照植物相比，經(jīng)歷氮利用率篩選的植物顯示如下表描述的參數(shù)的增加。<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>表G:在HMG啟動(dòng)子(高速泳動(dòng)族)控制下表達(dá)核酸序列SEQIDNO:l的轉(zhuǎn)基因稻植物(經(jīng)歷氮篩選)的評(píng)價(jià)結(jié)果。與相應(yīng)的對(duì)照植物相比，經(jīng)歷氮利用率篩選的植物顯示如下表描述的參數(shù)的增加。<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>權(quán)利要求1.相對(duì)于對(duì)照植物增加植物種子產(chǎn)量的方法，其包括調(diào)節(jié)III類海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)多肽的編碼核酸在植物中的表達(dá)。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述調(diào)節(jié)表達(dá)通過T-DNA激活標(biāo)注、TILLING、位點(diǎn)定向誘變、定向進(jìn)化或同源重組中的一種或多種實(shí)現(xiàn)。3.權(quán)利要求l的方法，其中所述調(diào)節(jié)表達(dá)通過在植物中引入和表達(dá)編碼III類TPP多肽的核酸實(shí)現(xiàn)。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述III類TPP多肽包含(i)按照遞增的優(yōu)選順序，與SEQIDNO:93或SEQIDNO:94具有至少50%、55%、60。/o、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或100%的#^酸序列同一性的海藻糖磷酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域；(ii)按照遞增的優(yōu)選順序，與SEQIDNO:95具有至少50。/。、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或100%序列同一性的絲氨酸富含結(jié)構(gòu)域。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述海藻糖磷酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域包含(i)按照遞增的優(yōu)選順序，與SEQIDNO:96具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或100%的序列同一性的磷酸酶才匡A;和/或(ii)按照遞增的優(yōu)選順序，與SEQH)NO:97具有至少500/。、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、卯％、95%、98%或100%序列同一性的磷酸酶框B。6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼III類TPP蛋白質(zhì)的核酸由表A中給出的任一核酸SEQIDNO或其部分表示，或者是能夠與表A中給出的任一核酸SEQIDNO雜交的序列。7.權(quán)利要求l-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述核^列編碼表A中給出的任一III類TPP多肽，或編碼表A中給出的任意SEQIDNO的直向同源物或旁系同源物。8.權(quán)利要求l-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述增加的種子產(chǎn)量是下列一種或多種(i)每^Mi物增加的種子數(shù)；(ii)每抹植物增加的飽滿種子數(shù)；(iii)每沐tt物增加的種子重量。9.權(quán)利要求3-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸序列與組成型啟動(dòng)子有效連接，優(yōu)選與GOS2啟動(dòng)子有效連接。10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼III類TPP蛋白質(zhì)的核i^A植物來源，優(yōu)選來自雙子葉植物，更優(yōu)選來自十字花科，進(jìn)一步優(yōu)選來自擬南芥屬，最優(yōu)選來自擬南芥。11.通過權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法獲得的植物，或其包含種子的部分，其中所述植物或其部分包含編碼III類TPP蛋白質(zhì)的重組核酸。12.分離的核酸分子，其包含(i)SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127或SEQIDNO:129所示的核酸；(ii)(i)中給出的任一SEQIDNO的互補(bǔ)物；(iii)編碼III類TPP蛋白質(zhì)的核酸，所述III類TPP蛋白質(zhì)按照遞增的優(yōu)選順序，與SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128或SEQIDNO:130給出的任一#^斷列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；(iv)在嚴(yán)格條件下能夠與上面(i)、(ii)或(iii)中給出的任一核酸雜交的核酸。13.分離的多肽，其包含(i)SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQID勵(lì)8、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128或SEQIDNO:130中任一個(gè)所示的M,列；(ii)按照遞增的優(yōu)選順序，與SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128或SEQIDNO:130給出的任一^J^餅列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的氨基酸序列；(iii)上面(i)或(ii)中給出的任意M^^列的衍生物。14.構(gòu)建體，其包含(a)編碼III類TPP多肽的核酸；(b)—個(gè)或多個(gè)能夠驅(qū)動(dòng)(a)的核酸序列表達(dá)的調(diào)控序列；和任選的(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。15.權(quán)利要求14的構(gòu)建體，其中所述核酸包含權(quán)利要求12的分離的多核苷酸分子。16.權(quán)利要求14的構(gòu)建體，其中所述一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列至少是組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選是GOS2啟動(dòng)子。17.權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)的構(gòu)建體的用途，其用于制備相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的種子產(chǎn)量的植物。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述增加的種子產(chǎn)量是下列一種或多種(i)每沐ti物增加的種子數(shù)；(ii)每,物增加的飽滿種子數(shù)；(iii)每a物增加的種子(總)重量。19.植物、植物部分或植物細(xì)胞，其由權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。20.用于制備具有增加的種子產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(i)在植物中引入并表達(dá)編碼III類TPP蛋白質(zhì)的核酸；和(ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。21.具有增加的種子產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物，或來自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，所述增加的種子產(chǎn)量因編碼III類TPP蛋白質(zhì)的核酸增加的表達(dá)而產(chǎn)生。22.權(quán)利要求11、19或21中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物，或來自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述植物是作物植物、單子葉植物或谷物，例如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、高粱和燕麥。23.權(quán)利要求22的植物的可收獲部分，其中所述可收獲部分優(yōu)選是種子。24.來自權(quán)利要求22的植物和/或權(quán)利要求23的植物的可收獲部分的產(chǎn)物。25.編碼III類TPP蛋白質(zhì)的核酸的用途，其用于相對(duì)于對(duì)照植物增加植物種子產(chǎn)量。26.權(quán)利要求25的用途，其中所述增加的種子產(chǎn)量是下列一種或多種(i)每,物增加的種子數(shù)；(ii)每椒&物增加的飽滿種子數(shù)；(iii)每^^i物增加的種子(總)重量。全文摘要本發(fā)明涉及通過在植物中調(diào)節(jié)編碼III類海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)多肽的核酸的表達(dá)而改良植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀(尤其是增加種子產(chǎn)量)的方法。本發(fā)明還涉及具有III類TPP多肽編碼核酸序列改變的表達(dá)的植物，其中所述植物相對(duì)于對(duì)照植物具有改良的產(chǎn)量相關(guān)性狀。本發(fā)明還涉及新的III類TPP核酸和多肽序列。本發(fā)明還提供用于本發(fā)明方法中的核酸和多肽序列，以及包含此類核酸的構(gòu)建體。文檔編號(hào)C07K14/415GK101595222SQ200780046387公開日2009年12月2日申請(qǐng)日期2007年12月13日優(yōu)先權(quán)日2006年12月15日發(fā)明者A·I·桑茲莫林納羅,F·羅蘭,J·泰弗萊恩,L·范德斯蒂內(nèi),M·拉蒙,P·范迪克申請(qǐng)人:克羅普迪塞恩股份有限公司