專利名稱：用于治療癌癥的咪唑啉酮基氨基嘧啶化合物的制作方法
專利說明用于治療癌癥的咪唑啉酮基氨基嘧啶化合物
背景技術(shù)：
Plk1屬于以已知為polo box結(jié)構(gòu)域的磷酸絲氨酸/蘇氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域為特征的蛋白質(zhì)激酶的小家族。Plk1在細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)上起著中心作用。在眾多功能當(dāng)中，Plk1被認(rèn)為能調(diào)節(jié)有絲分裂的起始、發(fā)展和離去，即當(dāng)癌細(xì)胞分裂時的階段。因此，阻斷癌細(xì)胞中的Plk1可防止它們的分裂或有絲分裂。
已經(jīng)確定了干涉有絲分裂的有效力的抗癌藥劑，如長春花生物堿

紫杉類藥物

和拓樸異構(gòu)酶II抑制劑


是抑制26S蛋白體的抗腫瘤劑。然而，這些藥物對正常的非分裂性細(xì)胞引起相當(dāng)大的副作用。具體地說Plk抑制劑的目標(biāo)針對分裂性細(xì)胞并可能能夠避免不希望有的毒性。
Plk1的抑制劑是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。參見例如WO 06/066172。另外，WO 06/021548公開某些二氫蝶啶酮類似物(例如，BI-2536)作為Plk1的抑制劑。目前，BI-2536處于第II階段臨床試驗中但具有高的清除率(CL＞1000ml/min)并且由于在人體中骨髓抑制作用而受到劑量限制。仍然需要具有改進效力或藥物動力學(xué)性能的抑制Plk1的其它化合物。也理想的是具有能夠口服給藥的Plk1抑制劑。
本發(fā)明提供被認(rèn)為在臨床上可用于通過抑制Plk1來治療癌癥的新型咪唑啉酮基氨基嘧啶化合物。這些化合物中的某些被認(rèn)為具有與在WO 06/066172中公開的化合物相比得到改進的效力。另外，這些化合物中的某些被認(rèn)為具有與BI-2536相比得到改進的藥物動力學(xué)性能。此外，由于所試驗的本發(fā)明化合物的口服生物利用率，可以相信這些化合物中的某些可以口服給藥。
本發(fā)明的概述 本發(fā)明提供通式I的化合物
通式I 其中 R1是氫，羥基，羥甲基，鹵素，甲基，氟甲基，C1-C2烷氧基，氨基，或甲基氨基； R2是氫，鹵素，或氰基； R3是氫或鹵素； 前提條件是，R1、R2和R3中的至少一個是氫；和 R4是氫，鹵素或甲基；或 它的藥物學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明提供了治療在哺乳動物體內(nèi)的選自于非小細(xì)胞肺癌，口咽癌，食道癌，胃癌，黑素瘤，皮膚的表皮樣癌，乳腺癌，卵巢癌，子宮內(nèi)膜癌，結(jié)腸直腸癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，甲狀腺癌，子宮頸癌，胰腺癌，前列腺癌，肝胚細(xì)胞瘤和非霍奇金淋巴瘤癌癥當(dāng)中的癌癥的方法，該方法包括對需要該治療的哺乳動物施用治療有效量的通式I的化合物或它的藥物學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明還提供藥物組合物，它包括通式I的化合物或它的藥物學(xué)上可接受的鹽，和相結(jié)合使用的藥物學(xué)上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
本發(fā)明還提供用于藥物的制備中的通式I的化合物或它的藥物學(xué)上可接受的鹽。另外，本發(fā)明提供了通式I的化合物或它的藥物學(xué)上可接受的鹽，它用于制備治療在哺乳動物體內(nèi)癌癥的藥物，該癌癥選自于非小細(xì)胞肺癌，口咽癌，食道癌，胃癌，黑素瘤，皮膚的表皮樣癌，乳腺癌，卵巢癌，子宮內(nèi)膜癌，結(jié)腸直腸癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，甲狀腺癌，子宮頸癌，胰腺癌，前列腺癌，肝胚細(xì)胞瘤和非霍奇金淋巴瘤癌癥。另外，本發(fā)明提供了適合于治療選自于非小細(xì)胞肺癌，口咽癌，食道癌，胃癌，黑素瘤，皮膚的表皮樣癌，乳腺癌，卵巢癌，子宮內(nèi)膜癌，結(jié)腸直腸癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，甲狀腺癌，子宮頸癌，胰腺癌，前列腺癌，肝胚細(xì)胞瘤和非霍奇金淋巴瘤癌癥當(dāng)中的癌癥的藥物組合物，該組合物包括通式I的化合物或它的藥物學(xué)上可接受的鹽，和相結(jié)合使用的一種或多種藥物學(xué)上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
本發(fā)明還提供以下通式的化合物
其中 R1是氫，羥基，鹵素，甲基，C1-C2烷氧基，氨基，或甲基氨基； R2是氫，鹵素，或氰基； R3是氫或鹵素； R4是氫，鹵素，或甲基； 前提條件是，R1，R2，R3和R4中的至少兩個是氫； R5是氫，鹵素，或甲基；或 它的藥物學(xué)上可接受的鹽。
發(fā)明詳述 在以上通式中使用的一般化學(xué)術(shù)語具有它們通常的意義。例如，術(shù)語“(C1-C2)烷氧基”指甲氧基和乙氧基。術(shù)語“鹵素”指氟，氯，溴和碘。
本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員可以理解，絕大部分或全部的本發(fā)明化合物能夠形成鹽。本發(fā)明的化合物是胺，因此相應(yīng)地與許多無機酸和有機酸中的任何一種進行反應(yīng)，形成藥物學(xué)上可接受的酸加合鹽(acidaddition salts)。此類的藥物學(xué)上可接受的酸加合鹽以及制備它們的常用方法是現(xiàn)有技術(shù)中公知的。參見，例如，P.Stahl等人，HANDBOOK OFPHARMACEUTICAL SALTSPROPERTIES，SELECTION AND USE，(VCHA/Wiley-VCH，2002)；S.M.Berge等人，“Pharmaceutical Salts”，Journal of Pharmaceutical Sciences，Vol 66，No.1，January 1977。
優(yōu)選的是通式I的化合物，其中 a)R1是氫或甲基； b)R2是氫或鹵素； c)R3是氫或鹵素； d)R4是鹵素； e)R4是甲基； f)R4是氫； g)R1是氫，R2是氯，R3是氫，和R4是氫； h)R1是甲基，R2是氫，R3是氟，和R4是氟；和 i)R1是甲基，R2是氫，R3是氟，和R4是甲基； 反應(yīng)路線 本領(lǐng)域中技術(shù)人員將會認(rèn)識到，不是所有的在本發(fā)明化合物中的取代基將能夠容忍用于合成該化合物的某些反應(yīng)條件。這些結(jié)構(gòu)部分可以在合成中的合適時間點上被引入，或根據(jù)需要或按照希望來保護和去保護。本領(lǐng)域中技術(shù)人員會認(rèn)識到，可以在本發(fā)明的化合物的合成中的任何方便的時間點上除去保護基團。引入和除去氮和氧保護基團的方法是現(xiàn)有技術(shù)中公知的；參見，例如，Greene和Wuts，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，3rd Ed.，John Wiley and Sons，New York，Chapter 7(1999)。此外，本領(lǐng)域中技術(shù)人員將會認(rèn)識到，在許多情況下，結(jié)構(gòu)部分引入的順序不是關(guān)鍵的。為了生產(chǎn)本發(fā)明的化合物所需要的步驟的具體順序可以取決于所要合成的具體化合物、起始化合物和取代的結(jié)構(gòu)部分的相對不穩(wěn)定性。
本發(fā)明的化合物能夠通過進行以下所討論的至少兩種方法變型來制備。在以下的反應(yīng)歷程中，除非另有說明，否則全部的取代基都是按照前面所定義，并且合適的試劑是現(xiàn)有技術(shù)中公知的和充分了解的。在反應(yīng)路線2中，Y是鹵素和Z是硼酸。
反應(yīng)路線1
通式(1)的化合物經(jīng)由親核取代反應(yīng)與2-(氨基-乙基)-1，3-二氫-咪唑酮(2)進行反應(yīng)，得到通式(5)的化合物。此類反應(yīng)是在合適的溶劑如正丁醇、二噁烷、N-甲基吡咯烷-2-酮(NMP)等中進行的。一般，這些反應(yīng)是通過使用油浴或微波反應(yīng)器在約120℃-150℃的溫度下進行。這一反應(yīng)的典型的化學(xué)計量是基于通式(3)的化合物和使用約2當(dāng)量的2-(氨基-乙基)-1，3-二氫-咪唑酮。可以使用胺堿類，如三乙基胺，二異丙基乙基胺，等等。
反應(yīng)路線2
通式(3)的化合物與通式(4)的化合物在Suzuki反應(yīng)中通過使用合適的鈀催化劑如四(三苯膦)鈀(O)、[1，1’-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯鈀(II)和類似物，在堿如碳酸鈉、碳酸鉀和類似物的存在下進行反應(yīng)。此類反應(yīng)是在合適的溶劑如THF，二噁烷，水和類似物中進行的。一般，這些反應(yīng)是通過使用油浴或微波反應(yīng)器在約100℃-150℃的溫度下進行。
在任選的步驟中，形成了本發(fā)明的化合物的藥物學(xué)上可接受的鹽類。此類鹽的形成是現(xiàn)有技術(shù)中公知和充分了解的。
將會容易地認(rèn)識到，通式(1)和(3)的化合物能夠通過本領(lǐng)域中眾所周知的和完全了解的程序，由與這里所述的那些方法相類似的方法來容易地制備。例如，通式(1)的化合物是利用如上所述的Suzuki偶聯(lián)方法通過任選取代的吡啶基化合物與任選取代的苯并噻吩基化合物進行偶聯(lián)來制備。所得Suzuki加合物通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法硼酸化(boronylated)，并經(jīng)由如上所述的Suzuki偶聯(lián)方法進一步偶聯(lián)到任選取代的嘧啶鹵化物上。任選取代的苯并噻吩基化合物通過現(xiàn)有技術(shù)中公知的方法進行硼酸化(boronylation)，隨后經(jīng)由親核性芳香取代反應(yīng)讓2-(氨基-乙基)-1，3-二氫-咪唑酮(2)加成到所得硼酸/酯上，來制備通式(3)的化合物。同時還認(rèn)識到，制備通式(1)或(3)的化合物所需要的步驟能夠按照任何順序來進行，這其中包括通式(1)或(3)的部分化合物與通式(2)和/或通式(4)的化合物的反應(yīng)，使得后者進行碳-碳鍵形成、偶聯(lián)反應(yīng)等等，從而得到本發(fā)明的化合物。
本發(fā)明進一步通過下列的實施例和制備例來說明。這些實施例和制備例是僅僅舉例說明性的，無論如何不希望限制本發(fā)明。在實施例和制備例中使用的術(shù)語具有它們的通常意義，除非另外指明。以下的實例化合物通過

第10版來命名。
制備例1 2-苯并[b]噻吩-7-基-4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧雜硼雜環(huán)戊烷 將7-溴-苯并[b]噻吩(426mg，2mmol)，雙(頻哪醇基)二硼(756mg，3mmol)，[1，1’-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯鈀(II)(81mg，0.1mmol)與二氯甲烷的配合物(1∶1)，乙酸鉀(294mg，3mmol)在燒瓶內(nèi)的二甲亞砜(DMSO)(10mL)中摻混。將氮氣鼓泡通入混合物中達(dá)到5分鐘。密封該燒瓶并在油浴中在100℃下加熱4小時。用氯仿/異丙醇(3/1)稀釋該混合物。用飽和氯化鈉水溶液洗滌該溶液。在硫酸鈉上干燥該溶液。在真空中濃縮該溶液，得到深色殘留物。由柱色譜法(從己烷至在己烷中20％乙酸乙酯)提純，獲得無色固體形式的標(biāo)題化合物(342mg，66％)。MS(ES)m/z 261[M+1]+。
制備例2 苯并[b]噻吩-7-硼酸 在裝有機械攪拌器的12L莫頓(Morton)燒瓶中將7-溴苯并[b]噻吩(300g，1.41mmol)和硼酸三異丙酯(403.6g，2.15mmol)在無水四氫呋喃(THF)(4000mL)中摻混，然后在干冰/丙酮浴中在氮氣氛圍中冷卻至-70℃。將正丁基鋰(在己烷中1.6M濃度，714g，1.68mmol)滴加進去，滴加速率要求保持內(nèi)部溫度低于-67.5℃。在添加結(jié)束之后，讓反應(yīng)混合物在這一溫度下攪拌1小時。移走冷卻浴，然后慢慢地添加4L的水。添加濃HCl(75mL)直到溶液的pH是大約pH＝2。讓該淤漿攪拌1小時。添加足夠的5N NaOH水溶液以便調(diào)節(jié)混合物的pH到大約pH＝12。分離兩層和保留水層。用4L的甲基叔丁基醚稀釋有機層，然后用1L的5N NaOH水溶液萃取。分離兩層。合并水層與前面的含水萃取液。水層用附加的甲基叔丁基醚(4L)洗滌。分開兩層并將水層轉(zhuǎn)移至裝有機械攪拌器的12L三頸圓底燒瓶中。用冰-水浴將溶液冷卻至+5℃。慢慢地添加濃HCl，直到溶液的pH是大約pH＝2。攪拌混合物30分鐘，然后過濾出所得固體物。在漏斗上用2L的水漂洗固體物兩次，然后空氣干燥30分鐘。將固體物放入到50℃的真空烘箱中，然后在真空下干燥一夜。經(jīng)過30分鐘用2L的正庚烷將干燥固體制成淤漿來消去黃色。再次過濾出固體物，空氣干燥30分鐘，然后在40℃下真空干燥一夜而獲得白色固體形式的標(biāo)題化合物(188.8g，75％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.86(d，J＝8Hz，1H)，7.49-7.57(m，2H)，7.30-7.39(m，2H)。
制備例3 (6-氟-吡啶-3-基)-氨基甲酸叔丁酯 為100mL三頸圓底燒瓶安裝磁力攪拌器，熱電偶控制加熱夾套，冷凝器，和氮氣氛。加入5-氨基-2-氟-吡啶(5g，44.6mmol)，THF(50mL)，4-二甲基氨基吡啶(549mg，4.5mmol，10mol％)，和二碳酸二叔丁酯(10.7g，49mmol)。加熱混合物至50℃保持4小時。在真空中冷卻和濃縮。將殘留物溶解在二氯甲烷/水中，然后過濾。將濾液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，分離二氯甲烷層。在硫酸鈉上干燥二氯甲烷，過濾和真空濃縮。通過用10％異丙醇/90％二氯甲烷的等濃度混合物洗脫，在硅石上進行色譜分離，得到黃褐色、澄明油形式的標(biāo)題化合物(1.64g，17％)，它在真空干燥之后固化。MS(EI)m/z 261M+。
制備例4 (2-氟-吡啶-3-基)-氨基甲酸叔丁酯 通過使用合適的起始原料基本上根據(jù)(6-氟-吡啶-3-基)-氨基甲酸叔丁酯的制備例來制備標(biāo)題化合物。GCMS(EI)m/z 212M+。
制備例5 N-(4-碘-吡啶-3-基)-2，2-二甲基-丙酰胺 為250mL三頸圓底燒瓶安裝磁力攪拌器，熱電偶，干冰/丙酮浴，氮氣氛圍，和加料漏斗。加入2，2-二甲基-N-吡啶-3-基-丙酰胺(3.0g，16.8mmol)，乙醚(67mL)，四亞甲基二胺(4.68g，6.08mL，40.3mmol)。冷卻反應(yīng)至-78℃。利用玻璃注射器經(jīng)過10分鐘慢慢地添加正丁基鋰(在己烷中2.5M溶液，16.2mL，40.3mmol)。經(jīng)過2小時讓反應(yīng)升至-13℃。冷卻反應(yīng)至-78℃。利用加料漏斗將碘溶液(8.5g，在20mL THF中33.6mmol)添加到反應(yīng)，然后在-68℃下混合2.5小時。通過飽和NH4Cl水溶液(40mL)的添加來淬滅反應(yīng)。用乙酸乙酯(100mL)萃取，然后廢棄水相。用飽和硫代硫酸鈉水溶液(100mL)和飽和氯化鈉水溶液洗滌有機層。在硫酸鈉上干燥有機相，然后過濾。在真空中濃縮，得到棕色油。通過用100％二氯甲烷至70％乙酸乙酯/30％二氯甲烷的梯度洗脫，在硅石(80g)上進行色譜分離，獲得標(biāo)題化合物(1.19g，23％)。MS(ES)m/z 305[M+1]+。
通過使用合適的起始原料基本上根據(jù)N-(4-碘-吡啶-3-基)-2，2-二甲基-丙酰胺的制備方法制備下列化合物。
制備例8 3-甲氧基甲氧基-吡啶 將3-羥基吡啶(7g，74mmol)溶解在THF(20.6mL)和二甲基甲酰胺(34.4mL)中，然后冷卻至-15℃。添加叔丁醇鉀(8.3g，74mmol)，然后在-15℃下攪拌30分鐘。經(jīng)過40分鐘滴加氯甲基甲基醚(5.81mL，77mmol)來處理該混合物。在添加結(jié)束之后，讓混合物在-15℃下攪拌另外1小時。移走冰浴，讓混合物慢慢地升至15℃。將混合物傾倒在飽和氯化鈉水溶液中，然后劇烈攪拌10分鐘。所得溶液用三份的乙酸乙酯萃取。合并有機萃取物并用飽和氯化鈉水溶液洗滌，在硫酸鈉上干燥，過濾，和真空濃縮。所得產(chǎn)物無需進一步提純就可使用。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.42(d，J＝3Hz，1H)，8.28(d，J＝5Hz，1H)，7.37-7.42(m，1H)，7.21-7.27(m，1H)，5.20(s，2H)，3.49(s，3H)。
制備例9 2-氯-5-甲氧基甲氧基-吡啶 將氫化鈉(3.7g，93mmol)懸浮在DMF(50mL)中，然后經(jīng)過45分鐘將2-氯-5-羥基吡啶(10g，77mmol)在DMF(20mL)中所形成的溶液滴加進去。在室溫下攪拌該溶液1.5小時。經(jīng)過45分鐘滴加氯甲基甲基醚(6.6mL，86mmol)。在室溫下攪拌所得混合物達(dá)12小時。用乙酸乙酯，水，和飽和氯化鈉水溶液稀釋該混合物。分離出有機溶液，然后用三份的水、一份的飽和氯化鈉水溶液洗滌，在硫酸鈉上干燥，過濾，和真空濃縮。通過經(jīng)過20分鐘用從己烷至在己烷中30％乙酸乙酯的梯度洗脫，然后在己烷中30％乙酸乙酯的濃度下保持30分鐘，在330g的硅膠上進行柱色譜分離提純粗產(chǎn)物，得到澄明油形式的標(biāo)題化合物(10.8g，81％)。MS(ES)m/z 174.0[M+1]+。
通過使用與用于2-氯-5-甲氧基甲氧基-吡啶的那些方法類似的方法來制備以下中間體。
制備例11 2-氯-4-碘-5-甲氧基甲氧基-吡啶 在-70℃經(jīng)過10分鐘將叔丁基鋰(在戊烷中1.7M，72mL，123mmol)滴加到2-氯-5-甲氧基甲氧基-吡啶(10.8g，62mmol)在THF(300mL)中溶液中。所得溶液在-70℃下攪拌30分鐘。經(jīng)過30分鐘，將碘(23g，92mmol)在THF(150mL)中的溶液滴加進去。所得溶液在-70℃下攪拌1小時。移走冰浴，和讓反應(yīng)升至室溫?；旌衔镉靡宜嵋阴ズ退♂?，然后分離兩相。用兩份的乙酸乙酯萃取水相。合并有機萃取液，然后用兩份的硫代硫酸鈉水溶液，一份的水，一份的飽和氯化鈉水溶液洗滌，在硫酸鈉上干燥，過濾，和真空濃縮。用己烷研磨所得固體物。真空過濾收集固體物，然后用己烷洗滌固體。在真空下干燥該固體，得到棕色固體形式的標(biāo)題化合物(10.8g，58％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.08(s，1H)，7.98(s，1H)，5.43(s，2H)，3.40(s，3H)。
基本上使用2-氯-4-碘-5-甲氧基甲氧基-吡啶的程序來制備以下中間體。
制備例13 6-氯-4-碘-吡啶-3-醇 2-氯-4-碘-5-甲氧基甲氧基-吡啶(8.1g，27mmol)在THF(40mL)中的溶液用3N HCl(61mL)處理。將所得混合物加熱至60℃保持3小時。將混合物冷卻至室溫，然后通過緩慢添加飽和碳酸氫鈉水溶液將pH調(diào)節(jié)到7。混合物用三份的乙酸乙酯萃取。合并有機萃取液，然后在硫酸鈉上干燥，過濾，和真空濃縮，得到棕色固體形式的標(biāo)題化合物(6.8g，98％)，無需進一步提純就可使用。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.04(s，1H)，7.81-7.87(m，2H)。
基本上使用6-氯-4-碘-吡啶-3-醇的程序制備以下中間體。
制備例15 2-氯-5-乙氧基-4-碘-吡啶 6-氯-4-碘-吡啶-3-醇(4.9g，19mmol)和碳酸鉀(8.0g，58mmol)在二甲基甲酰胺(50mL)中的溶液用乙基碘(4.7mL，58mmol)處理。在60℃下加熱3小時。將混合物冷卻至室溫，然后過濾?；旌衔镉靡宜嵋阴ハ♂專缓笥?0％檸檬酸水溶液洗滌。合并水溶液，并用兩個附加份的乙酸乙酯萃取。合并該有機萃取液，然后用三份的水、一份的飽和氯化鈉水溶液洗滌，在硫酸鈉上干燥，過濾，和真空濃縮，得到棕色固體形式的標(biāo)題化合物(5.1g，93％)，它無需進一步提純就可使用。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.00(s，1H)，7.93(s，1H)，4.18(q，J＝7Hz，2H)，1.35(t，J＝7Hz，3H)。
制備例16 4-苯并[b]噻吩-7-基-2-氯-吡啶 在燒瓶中，摻混7-溴-苯并[b]噻吩(1.7g，12mmol)，2-氯-4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧雜硼雜環(huán)戊烷-2-基)-吡啶(1.6g，7mmol)，[1，1’-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯鈀(II)(285mg，0.3mmol)與二氯甲烷(1∶1)的配合物，2-(二叔丁基膦基)聯(lián)苯(63mg，0.2mmol)，碳酸鈉(2M，8mL，16mmol)和THF(20mL)?；旌衔镌?00℃下加熱3小時。用氯仿/異丙醇(3/1)稀釋該混合物。用飽和氯化鈉水溶液洗滌該溶液。在硫酸鈉上干燥。在真空中濃縮該溶液，得到深色殘留物。由柱色譜法(從二氯甲烷至在二氯甲烷中20％THF)提純，獲得黃色固體形式的標(biāo)題化合物(1.14mg，66％)。MS(ES)m/z 246[M+1]+。
使用DMSO，按照與用于4-苯并[b]噻吩-7-基-2-氯-吡啶的那些類似的方法來制備以下化合物。
制備例18 4-苯并[b]噻吩-7-基-2-氟-5-甲基-吡啶 在燒瓶中，摻混2-氟-4-碘-5-甲基-吡啶(355mg，1.5mmol)，2-苯并[b]噻吩-7-基-4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧雜硼雜環(huán)戊烷(282mg，1.8mmol)，[1，1’-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯鈀(II)(61mg，0.07mmol)與二氯甲烷(1∶1)的配合物，2-(二叔丁基膦基)聯(lián)苯(13mg，0.04mmol)，碳酸鈉(2M，1.5mL，3mmol)和THF(10mL)。將混合物在油浴中在100℃下加熱3小時。用氯仿/異丙醇(3/1)稀釋該混合物。用飽和氯化鈉水溶液洗滌該溶液。在硫酸鈉上干燥。在真空中濃縮，得到深色殘留物。由柱色譜法(在己烷中20％乙酸乙酯)提純，獲得黃色油形式的標(biāo)題化合物(300mg，82％)。MS(ES)m/z 244[M+1]+。
使用合適的起始原料，基本上根據(jù)4-苯并[b]噻吩-7-基-2-氟-5-甲基-吡啶的制備方法，制備下列中間體。
制備例24 4-苯并[b]噻吩-7-基-3-甲氧基甲氧基-吡啶 溶液A3-甲氧基甲氧基-吡啶(2.5g，18mmol)在乙醚(90mL)中的溶液于-70℃通過經(jīng)過10分鐘滴加叔丁基鋰(在戊烷中1.7M，10mL，18mmol)來進行處理。將混合物在-70℃下攪拌40分鐘，然后經(jīng)過5分鐘將硼酸三異丙酯(5mL，22mmol)在THF(10mL)中的溶液滴加進去。將混合物在-70℃下攪拌一小時，然后移走冰浴，讓混合物緩慢地升至室溫。
溶液B7-溴-苯并[b]噻吩(3.8g，18mmol)，2-(二叔丁基膦基)聯(lián)苯(268mg，0.90mmol)，[1，1’-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯鈀(II)(732mg，0.90mmol)與二氯甲烷(1∶1)的配合物在1，4-二噁烷(30mL)中的溶液用2M碳酸鈉水溶液(72mL，36mmol)處理。一旦溶液A達(dá)到室溫，加熱溶液至80℃。
通過經(jīng)過10分鐘滴加溶液A來處理溶液B。將合并的溶液加熱至85℃保持5小時。冷卻混合物至室溫，然后用乙酸乙酯和水稀釋。用水和飽和氯化鈉水溶液洗滌有機相，在硫酸鈉上干燥，過濾，和真空濃縮。通過用二氯甲烷至乙酸乙酯的梯度洗脫，在120g硅膠上進行柱色譜分離來提純粗產(chǎn)物，得到含有一些起始3-甲氧基甲氧基-吡啶的標(biāo)題化合物(3.8g)。所得產(chǎn)物無需進一步提純就可使用。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.68(s，1H)，8.42(d，J＝4Hz，1H)，7.88(d，J＝8Hz，1H)，7.33-7.50(m，5H)，5.12(s，2H)，3.36(s，3H)。
制備例25 2-氯-4-[7-(2-氯-吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]-嘧啶 在500mL圓底燒瓶中，在氮氣氛中將4-苯并[b]噻吩-7-基-2-氯-吡啶(13g，53.1mmol)和硼酸三異丙酯(20g，106mmol)在THF(150mL)中的溶液冷卻至-70℃。經(jīng)過30分鐘的時間向冷卻了的溶液中逐漸添加二異丙基胺化鋰(在THF中2M，53mL，106mmol)。將混合物在冷卻浴中連續(xù)攪拌另外1小時。經(jīng)過30分鐘的時間，將混合物逐漸地轉(zhuǎn)移到2，4-二氯-嘧啶(12g，106mmol)，[1，1’-雙(二苯基-膦基)二茂鐵]二氯鈀(II)(2.2g，53mmol)與二氯甲烷(1∶1)的配合物和碳酸鈉(35mL，3M，106mmol)在THF(150mL)中的回流溶液中。回流進行另外1小時。冷卻混合物至室溫，然后用500mL的氯仿/異丙醇(3/1)和200mL的水稀釋。由過濾收集所得固體，貯存該氯仿/異丙醇/水混合物。用二氯甲烷洗滌固體，然后在真空下干燥。分離氯仿/異丙醇/水混合物的各層。用水和飽和氯化鈉水溶液洗滌有機相，在硫酸鈉上干燥和真空濃縮，得到棕色殘留物。由快速柱色譜分析法(在二氯甲烷中10％甲醇)提純殘留物，獲得附加產(chǎn)物。合并這兩個部分，得到標(biāo)題化合物(13g，68％)。MS(ES)m/z 358[M+1]+。
通過使用合適的起始原料，基本上根據(jù)2-氯-4-[7-(2-氯-吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]-嘧啶的制備方法，來制備下列中間體。
制備例39 4-[2-(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)-苯并[b]噻吩-7-基]-吡啶-3-醇 2-氯-5-氟-4-[7-(3-甲氧基甲氧基-吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]-嘧啶(4g，10mmol)在THF(10mL)中的溶液用5N HCl(3mL)處理。在室溫下攪拌混合物達(dá)6小時。真空濃縮反應(yīng)混合物，然后用飽和的碳酸氫鈉水溶液和二氯甲烷稀釋。分離兩層和過濾各層。用二氯甲烷洗滌來自有機相的固體，得到黃褐色固體形式的標(biāo)題化合物(300mg)。用水洗滌來自水層的固體，然后干燥得到黃褐色固體形式的標(biāo)題化合物(300mg)。合并固體物，得到黃褐色固體形式的標(biāo)題化合物(600mg，17％)。MS(ES)m/z 358[M+1]+。
制備例40 2-氯-4-[7-(3-乙氧基-吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]-5-氟-嘧啶 4-[2-(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)-苯并[b]噻吩-7-基]-吡啶-3-醇(100mg，0.28mmol)和碳酸銫(100mg，0.28mmol)在二甲基甲酰胺(1mL)中的溶液用乙基碘(44mg，0.28mmol)處理。在室溫下攪拌混合物達(dá)12小時。混合物用乙酸乙酯稀釋，然后將所得溶液用三份的水、一份的飽和氯化鈉水溶液洗滌，在硫酸鈉上干燥，過濾，和真空濃縮。通過用二氯甲烷至乙酸乙酯的梯度洗脫，在12g硅膠上進行柱色譜分離來提純粗產(chǎn)物，得到棕色固體形式的標(biāo)題化合物(48mg，45％)。MS(ES)m/z 386[M+1]+。
制備例41 2-氯-5-氟-4-[7-(3-甲氧基-吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]-嘧啶 通過使用合適的起始原料，基本上根據(jù)2-氯-4-[7-(3-乙氧基-吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]-5-氟-嘧啶的制備方法來制備標(biāo)題化合物。MS(ES)m/z 372[M+1]+。
制備例42 1-{2-[4-(7-溴-苯并[b]噻吩-2-基)-5-氟-嘧啶-2-基氨基]-乙基}-咪唑啉-2-酮 將1-(2-氨基乙基)-2-咪唑啉酮(100g，774mmol)與4-(7-溴-苯并[b]噻吩-2-基)-2-氯-5-氟-嘧啶(90g，262mmol)摻混在1，4-二噁烷(650mL)中，然后在攪拌下和在氮氣氛圍中加熱至90℃保持3小時。冷卻反應(yīng)至室溫。過濾出固體，然后用水(3×500mL)和乙醚(500mL)洗滌固體。在50℃下真空干燥得到黃色固體形式的標(biāo)題化合物(59.2g，52％)。MS(ES)m/z 436[M+1]+。
通過使用合適的起始原料，基本上根據(jù)1-{2-[4-(7-溴-苯并[b]噻吩-2-基)-5-氟-嘧啶-2-基氨基]-乙基}-咪唑啉-2-酮的制備方法制備下列中間體。
制備例46 5-溴甲基-2-氟-4-碘-吡啶 在燒瓶中，摻混2-氟-4-碘-甲基吡啶(10.0g，42.19mmol)，N-溴琥珀酰亞胺(9.76g，54.85mmol)，2，2’-偶氮二異丁腈(3.46g，21.10mmol)和干CCl4(100mL)。在70℃下和在氮氣氛中加熱16小時。冷卻至室溫。用二氯甲烷稀釋，然后用水和飽和氯化鈉水溶液洗滌。分離各層，在硫酸鎂上干燥有機層。真空濃縮，得到粗產(chǎn)物。由柱色譜法(在己烷中1％至15％乙酸乙酯)提純，獲得標(biāo)題化合物(8.27g，62％)。MS(EI)m/z315M+。
制備例47 1-(2-{5-氟-4-[7-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧雜硼雜環(huán)戊烷-2-基)-苯并[b]噻吩-2-基]-嘧啶-2-基氨基}-乙基)-咪唑啉-2-酮 將1-{2-[4-(7-溴-苯并[b]噻吩-2-基)-5-氟-嘧啶-2-基氨基]-乙基}-咪唑啉-2-酮(5.5g，12.6mmol)，雙(頻哪醇)二硼(3.84g，15.3mmol)，(1，1’-雙(二苯基膦基)-二茂鐵)二氯鈀(II)(1.0g，1.3mmol)，乙酸鉀(2.5g，25mmol)在燒瓶內(nèi)的DMSO(80mL)中進行摻混。將氮氣鼓泡通入混合物中達(dá)到10分鐘。密封該燒瓶并在油浴中在85℃下加熱一夜。用氯仿/異丙醇(3/1)稀釋該混合物。用飽和氯化鈉水溶液洗滌該溶液。在硫酸鈉上干燥它。在真空中濃縮該溶液，得到深色殘留物。由柱色譜分離法(己烷→在己烷中20％乙酸乙酯→在二氯甲烷中10％甲醇)提純殘留物，獲得棕色固體形式的產(chǎn)物(5g，82％)。MS(ES)m/z 484[M+1]+。
制備例48 (6-氟-4-碘-吡啶-3-基)-甲醇 將5-溴甲基-2-氟-4-碘-吡啶(0.9g，2.85mmol)，硝基甲烷(15mL，278mmol)，四氟硼酸銀(721mg，3.7mmol)，和二甲基甲酰胺(5mL)在圓底燒瓶中摻混。在室溫下攪拌混合物一夜。將碳酸鈉(1.81g，17.1mmol)和甲醇(10mL)添加到混合物中。在室溫下攪拌另外4小時。用氯仿稀釋反應(yīng)混合物，然后用水和飽和氯化鈉水溶液洗滌。將有機層與水層分離，并在MgSO4上干燥有機層。在過濾后，真空蒸發(fā)有機溶劑，得到粗產(chǎn)物。由快速柱色譜分離法(用在二氯甲烷中的10％甲醇洗脫)提純粗產(chǎn)物，獲得所需產(chǎn)物(0.6g，83％)。MS(ES)m/z 254[M+1]+。
制備例49 2-氟-5-氟甲基-4-碘-吡啶 在氮氣氛圍中將二乙基氨基硫三氟化物(892mg，4mmol)滴加到在圓底燒瓶中的由(6-氟-4-碘-吡啶-3-基)-甲醇在二氯甲烷(25mL)中所形成的溶液中，然后在O-5℃下添加乙醇(0.3mL)。攪拌混合物3小時。將反應(yīng)混合物傾倒在飽和的碳酸氫鈉溶液中。將產(chǎn)物萃取到氯仿中，然后用水和飽和氯化鈉水溶液洗滌。將有機層與水層分離，并在MgSO4上干燥有機層。在過濾后，真空蒸發(fā)有機溶劑，得到粗產(chǎn)物。由快速柱色譜分離法(在二氯甲烷中的10％甲醇)提純粗產(chǎn)物，獲得標(biāo)題化合物(0.32g，53％)。MS(ES)m/z 256[M+1]+。
實施例 實施例1 1-(2-{4-[7-(2-氯-吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮
將2-氯-4-[7-(2-氯-吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]-嘧啶(9g，25.1mmol)和2-(氨基-乙基)-1，3-二氫-咪唑-酮(6.4g，50.2mmol)在壓力容器內(nèi)的正丁醇(200mL)中摻混。在油浴中在120℃下加熱混合物5小時。用氯仿/異丙醇(3/1)稀釋該混合物。用飽和氯化鈉水溶液洗滌該溶液。在硫酸鈉上干燥它。在真空中濃縮該溶液，得到深色殘留物。由柱色譜法(從二氯甲烷至在二氯甲烷中的10％甲醇)提純，獲得黃色固體形式的標(biāo)題化合物(9g，93％)。MS(ES)m/z 451[M+1]+。
通過使用合適的起始原料，基本上根據(jù)1-(2-{4-[7-(2-氯-吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]嘧啶-2-基氨基}-乙基)-咪唑啉-2-酮的制備方法來制備下列實施例。



實施例12 1-(2-(5-氯-4-(7-(吡啶-4-基)苯并[b]噻吩-2-基)嘧啶-2-基氨基)乙基)咪唑啉-2-酮
將1-{2-[4-(7-溴-苯并[b]噻吩-2-基)-5-氯-嘧啶-2-基氨基]-乙基}-咪唑啉-2-酮(81.6mg，0.18mmol)，吡啶-4-硼酸(36.8mg，0.3mmol)，和碳酸氫鈉(18.1mg，0.2mmol)在水(1mL)和DMSO(1mL)的混合物中摻混。添加四(三苯膦)鈀(O)(10.4mg，0.009mmol)?；旌衔镌?50℃下用磁力攪拌棒攪拌15分鐘。將粗的反應(yīng)混合物傾倒在強陽離子交換(SCX)(10g)柱上。用在甲醇中的2N氨(40mL)洗脫所需產(chǎn)物，然后在減壓下濃縮。由反相色譜分離法(30-90％梯度，在80ml/min流速下11分鐘，在30×100mm，5mm，C18MS

柱上，溶劑A含0.01M碳酸氫銨的水，溶劑B乙腈)提純，獲得標(biāo)題化合物(20.4mg，25.1％)。MS(ES)m/z 451[M+1]+。
實施例13 1-(2-{5-氯-4-[7-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮
在微波管形瓶中，將1-{2-[4-(7-溴-苯并[b]噻吩-2-基)-5-氯-嘧啶-2-基氨基]-乙基}-咪唑啉-2-酮(500mg，1.1mmol)，5-氯-2-氟吡啶-4-硼酸(578mg，3.3mmol)，[1，1’-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯鈀(II)(90mg，0.11mmol)與二氯甲烷(1∶1)的配合物，2-(二叔丁基膦基)聯(lián)苯(20mg，0.066mmol)和碳酸鈉(350mg，3.3mmol)在THF(3mL)和水(1.5mL)中摻混。將氮氣鼓泡通入混合物中達(dá)到5分鐘?；旌衔镌?00℃下加熱10分鐘。在真空中濃縮有機層至干燥。將所得固體物在二氯甲烷/甲醇中制成淤漿，并由柱色譜法(在二氯甲烷中1％2N氨/甲醇溶液至在二氯甲烷中10％2N氨/甲醇溶液)提純，獲得標(biāo)題化合物。為了進一步提純，將產(chǎn)物溶解在DMSO中并由反相柱色譜法(在水(含0.03％HCl)中的50％乙腈至在水(含0.03％HCl)中的95％乙腈)提純，獲得標(biāo)題化合物(146mg，26％)。MS(ES)m/z 503[M+1]+。
通過使用合適的起始原料，基本上根據(jù)1-(2-{5-氯-4-[7-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)苯并[b]噻吩-2-基]-嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮的制備方法來制備以下實施例。



實施例24 4-(2-(2-(2-(2-氧代咪唑烷-1-基)乙基氨基)嘧啶-4-基)苯并[b]噻吩-7-基)-2-氰基吡啶
將1-(2-{4-[7-(2-氯-吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]-嘧啶-2-基氨基}-乙基)-咪唑啉-2-酮(100mg，0.22mmol)，氰化鋅(51mg，0.44mmol)，三(二芐叉基丙酮)二鈀(0)(10mg，0.01mmol)，1，1’-雙(二苯基膦基)-二茂鐵(6mg，0.01mmol)在DMSO(6mL)中摻混。混合物在100℃下加熱4小時。冷卻混合物至室溫，然后填裝在硅石柱中。用在二氯甲烷中的10％甲醇洗脫該柱，獲得黃色油形式的標(biāo)題化合物(0.7g，72％)。MS(ES)m/z 442[M+1]+。
實施例25 1-(2-{4-[7-(3-氨基-吡啶-4-基)苯并[b]噻吩-2-基]-5-氟嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮
將N-{4-[2-(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)-苯并[b]噻吩-7-基]-吡啶-3-基}-2，2-二甲基丙酰胺(330mg，0.75mmol)，2-(氨基-乙基)-1，3-二氫-咪唑啉酮(386mg，3.0mmol)，和1，4-二噁烷(6mL)在封蓋的管形瓶中摻混，并在85℃下加熱4小時。真空濃縮?；旌衔镉枚燃淄楹退♂?。有機溶液用水洗滌。在硫酸鈉上干燥有機溶液。過濾和真空濃縮該溶液，得到深色殘留物。由柱色譜法(從二氯甲烷至在二氯甲烷中的7％甲醇)提純，獲得N-[4-(2-{5-氟-2-[2-(2-氧代-咪唑烷-1-基)-乙基氨基]-嘧啶-4-基}-苯并[b]噻吩-7-基)-吡啶-3-基]-2，2-二甲基丙酰胺。
將酰胺中間體轉(zhuǎn)移至40mL的用隔膜蓋好的管形瓶中。加入磁力攪拌棒，然后將水(20mL)和濃H2SO4(5mL)添加到管形瓶中。將管形瓶在油浴中加熱至90℃保持5小時。冷卻反應(yīng)至室溫，然后流過SCX(10g)柱。用水/甲醇1∶1，然后用100％甲醇，然后用1∶1二氯甲烷/甲醇洗脫，和最后用10％的在甲醇中2M氨水/90％的二氯甲烷洗脫出產(chǎn)物。真空濃縮。用在二氯甲烷中的O％至10％2M氨/甲醇溶液梯度洗脫，在硅石(80g)上進行色譜分離。在真空烘箱中在42℃下干燥2小時，得到金黃色固體形式的標(biāo)題化合物(192.6mg，48％)。MS(ES)m/z 450[M+1]+。
通過使用合適的起始原料，基本上根據(jù)1-(2-{4-[7-(3-氨基-吡啶-4-基)苯并[b]噻吩-2-基]-5-氟嘧啶-2-基氨基}-乙基)咪唑啉-2-酮的制備方法來制備以下實施例。


實施例29 1-(2-{4-[7-(5-氨基-2-氟吡啶-4-基)苯并[b]噻吩-2-基]嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮
將{4-[2-(2-氯-嘧啶-4-基)-苯并[b]噻吩-7-基]-6-氟-吡啶-3-基}-氨基甲酸叔丁酯(813mg，1.77mmol)，2-(氨基-乙基)-1，3-二氫-咪唑-酮(919mg，7.11mmol)，和1，4-二噁烷(22mL)在封蓋的管形瓶中摻混，并在70℃下加熱15小時。真空濃縮?；旌衔镉枚燃淄楹退♂?。有機溶液用水洗滌。在硫酸鈉上干燥有機溶液。過濾和真空濃縮該溶液，得到深色殘留物。由柱色譜法(二氯甲烷至乙酸乙酯)提純，獲得[6-氟-4-(2-{2-[2-(2-氧代-咪唑烷-1-基)-乙基氨基]-嘧啶-4-基}-苯并[b]噻吩-7-基)-吡啶-3-基]-氨基甲酸叔丁酯。
將[6-氟-4-(2-{2-[2-(2-氧代-咪唑烷-1-基)-乙基氨基]-嘧啶-4-基}-苯并[b]噻吩-7-基)-吡啶-3-基]-氨基甲酸叔丁酯溶解在二氯甲烷中，然后通過真空濃縮被吸附到硅膠(10g)上。在高真空下干燥24小時。將硅膠放入圓底燒瓶中，然后在高真空下的同時，在溫度控制的油浴中加熱至98-99℃保持2小時。冷卻至室溫。用10％的在甲醇中7N氨/90％的二氯甲烷從硅膠上萃取產(chǎn)物。真空濃縮。通過用從100％二氯甲烷至7％的在甲醇中的2N氨/93％的二氯甲烷的梯度洗脫，在硅石上進行色譜分離，獲得標(biāo)題化合物(65.2mg，8.2％)。MS(ES)m/z 450[M+1]+。
實施例30 1-(2-{4-[7-(3-氨基-2-氟吡啶-4-基)苯并[b]噻吩-2-基]嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮
使用合適的起始原料，基本上根據(jù)1-(2-{4-[7-(5-氨基-2-氟-吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]-嘧啶-2-基氨基}-乙基)-咪唑啉-2-酮的制備方法制備標(biāo)題化合物。MS(ES)m/z 450[M+1]+。
實施例31 1-(2-{5-氟-4-[7-(2-氟-5-羥甲基-吡啶-4-基)苯并[b]噻吩-2-基]嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮
將1-(2-{5-氟-4-[7-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧雜硼雜環(huán)戊烷-2-基)-苯并[b]噻吩-2-基]-嘧啶-2-基氨基}-乙基)-咪唑啉-2-酮(120mg，0.25mmol)，(6-氟-4-碘-吡啶-3-基)-甲醇(100mg；0.32mmol)，(1，1’-雙(二苯基膦基)二茂鐵)鈀(II)氯化物(10.14mg；0.01mmol)，2-(二叔丁基膦基)聯(lián)苯(2mg，0.01mmol)和碳酸鈉(2M，0.2mL，0.4mmol)在壓力管內(nèi)的5mL的二噁烷中摻混。混合物在油浴中在100℃下加熱一夜。將混合物冷卻至室溫，用氯仿-異丙醇(3/1)稀釋它。用飽和氯化鈉水溶液洗滌有機相，在硫酸鈉上干燥，濃縮它，得到油狀殘留物。由快速柱色譜分離法(用在二氯甲烷中的10％甲醇洗脫)提純粗產(chǎn)物，獲得標(biāo)題化合物(25mg，21％)。MS(ES)m/z 483[M+1]+。
實施例32 1-(2-{5-氟-4-[7-(2-氟-5-(氟甲基)吡啶-4-基)苯并[b]噻吩-2-基]嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮
將1-(2-{5-氟-4-[7-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧雜硼雜環(huán)戊烷-2-基)-苯并[b]噻吩-2-基]-嘧啶-2-基氨基}-乙基)-咪唑啉-2-酮(120mg，248.26μmol)，2-氟-5-氟甲基-4-碘-吡啶(100mg，392.15μmol)，三(二芐叉基丙酮)二鈀(O)(11.37mg，12.41μmol)，三環(huán)己基膦(2.09mg，7.45μmol)，磷酸鉀(105.39mg，496.51μmol)在密封的壓力管內(nèi)的5mL二噁烷中摻混。將混合物在油浴中在100℃下加熱3小時。LC-MS顯示在485處的峰。將混合物冷卻至室溫，用氯仿-異丙醇(3/1)稀釋它。用飽和氯化鈉水溶液洗滌有機溶液，在硫酸鈉上干燥，濃縮它，得到粗產(chǎn)物。由快速色層分離法(在二氯甲烷中的10％甲醇)提純粗產(chǎn)物，獲得目標(biāo)產(chǎn)物(70mg，58.2％)。MS(ES)m/z 485[M+1]+。
分析 已經(jīng)表明Plk1在許多人腫瘤中過分表達(dá)，如在非小細(xì)胞肺癌，口咽癌，食道癌，胃癌，黑素瘤，乳腺癌，卵巢癌，子宮內(nèi)膜癌，結(jié)腸直腸癌，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，乳頭瘤，胰腺癌，前列腺癌，肝胚細(xì)胞瘤和非霍奇金淋巴瘤癌癥中。此外，Plk1表達(dá)在非小細(xì)胞肺癌，口咽癌，食道癌，黑素瘤，結(jié)腸直腸癌，肝胚細(xì)胞瘤和非霍奇金淋巴瘤癌癥中具有預(yù)后意義(Strebhardt，K.and A.Ullrich(2006).Nature ReviewsCancer6(4)321-30)。Plk1磷酸化的底物通過協(xié)調(diào)中心體熟化、進入有絲分裂、姐妹染色單體分離和胞質(zhì)分裂來調(diào)控有絲分裂的進展(Eckerdt and Strebhardt 2006；Strebhardt and Ullrich 2006；van de Weerdt，B.C.and R.H.Medema(2006).Cell Cycle 5(8)853-64)。通過使用抗體注射、顯性負(fù)Plk1的表達(dá)和反義mRNA還原來抑制Plk1功能可以產(chǎn)生單極紡錘體(monopole spindles)和分裂后期停滯，導(dǎo)致在腫瘤細(xì)胞系中有絲分裂細(xì)胞死亡，但是在正常的非轉(zhuǎn)化的原發(fā)細(xì)胞系中的可逆的G2停滯。
另外，已經(jīng)報道Plk可用于棒狀腫瘤的治療，(Morozov A.等人，Clinical Cancer Research.13(16)4721-30，(Aug 15，2007)。
BI-2536在使用HCT116、A549和NCIH460鼠異種移植物的臨床前模型中顯示活性(Raum，A.，P.Garin-Chesa等人(2006).#C191Invivo activity of BI 2536，a potent and selective inhibitor of the mitotickinase PLK1，in a range of cancer xenografts.AACR-NCI-EORTCInternational Conference on ″Molecular Targets and CancerTherapeutics″，Philidelphia，PA)。
下列分析的結(jié)果表明了本發(fā)明的化合物可用作抗癌藥劑的證據(jù)。
Plk1的表達(dá)和提純 人Pl k1cDNA-它可以從若干來源獲得，如Incyte(登錄號NM_005030)-可以在它的一個末端上直接與表達(dá)His6標(biāo)記物(tag)如C-末端FLAG-His6標(biāo)記物的多核苷酸序列相連，并被插入到合適的表達(dá)載體如pFastBacTM載體(Invitrogen)中并轉(zhuǎn)染到合適的體系如桿狀病毒中，后者類似于Yue-Wei Qian等人，Science 282，1701(1998)對于xPlkk1所報道的類型。如果使用病毒表達(dá)體系，則該病毒(例如，攜帶Plk1-Flag-His6標(biāo)記物多核苷酸構(gòu)造段的桿狀病毒)感染到合適的宿主細(xì)胞如Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)物中。當(dāng)足夠量的Plk1-Flag-His6標(biāo)記物融合蛋白已經(jīng)表達(dá)時，例如，在感染后的約46小時，該培養(yǎng)物應(yīng)該用岡田酸(0.1μM)處理足夠的時間(例如3小時)。該Plk1-Flag-His6標(biāo)記物融合蛋白通過使用現(xiàn)有技術(shù)中公知的方法，采用金屬親合性樹脂如TALONTM(Clontech，Catalog#635503)從細(xì)胞團(cell pellets)提純得到。提純的Plk1-Flag-His6標(biāo)記物融合蛋白以小的等分部分在-80℃下被貯存在合適介質(zhì)中，如10mM HEPES，150mM NaCl，0.01％

X-100，1mM二硫蘇糖醇(DTT)，10％甘油，pH 7.5，直到使用為止。提純的Plk1-Flag-His6標(biāo)記物融合蛋白的身份由MALDI(基質(zhì)輔助的激光解吸/電離(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization))證實。
GST-Cdc25C(1-206)的表達(dá)和提純 人Cdc25C cDNA-它可以從任何合適的來源如Incyte(登錄號AY497474)獲得-可以在任何適宜的表達(dá)體系中表達(dá)，在此之后由與Bin Ouyang等人，Oncogene，18，6029-6036(1999)描述的方法類似的眾所周知的方法來進行提純。一種合適的體系包括用pGEX-2T載體(Amersham)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(E.coli BL21)在18℃下的一夜生長，在該載體中已經(jīng)設(shè)計了人Cds25C的cDNA以便用于采用1mM異丙基-β-D-吡喃硫代半乳糖苷的誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)的GST-Cdc25C(1-206)作為Plk1的底物可以由GLUTATHIONE

4B提純，并以小的等分部分在-80℃下在合適的溶液中貯存，如10mM HEPES，100mM NaCl，pH 7.5。
Plk1抑制分析 Plk1激酶反應(yīng)物含有在緩沖液中的Plk1-Flag-His6標(biāo)記融合酶(0.2ng/μL)，該緩沖液含有50mM HEPES，pH 7.3，1.0mM二硫蘇糖醇，5.0μm ATP，10mM MgCl2，0.01％

X-100，0.4μCi 33P-ATP，和0.06μg/μL GST-Cdc25c(1-206)肽。化合物作為在DMSO中的10mM貯備液來提供。化合物在20％DMSO中按1∶3系列稀釋而產(chǎn)生10點濃度響應(yīng)曲線，隨后在反應(yīng)混合物中按1∶5稀釋(20μM至0.001μM最終，4％最終DMSO濃度)，以測定化合物活性。反應(yīng)在室溫下進行60分鐘，然后通過添加60μL的10.0％H3PO4來淬滅。反應(yīng)混合物(85μL)被轉(zhuǎn)移到已用30μL的10.0％H3PO4預(yù)潤濕的96孔磷酸纖維素過濾板中，在室溫下培養(yǎng)20-30分鐘，然后用0.5％H3PO4洗滌三次。干燥這些孔，然后添加40μL的MicroScintTM20(Packard)，然后在Wallac

Jet上計數(shù)。從10點濃度響應(yīng)數(shù)據(jù)得到的百分比抑制值隨后進行分析，例如通過使用ACTIVITY BASETM軟件(IDBS)，采用4-參數(shù)邏輯斯諦方程。從所得曲線擬合計算絕對IC50值。全部的舉例化合物具有低于100nM的IC50，且有3.6的最低顯著性比率(MinimumSignificant Ratio，即MSR)。例如，實施例13具有約23nM的IC50。
pHH3(S10)，有絲分裂細(xì)胞，和DNA含量分析 從美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection，即ATCC)獲得的海拉細(xì)胞以200個細(xì)胞/孔被點在96孔BeckmanDickinson BIOCOATTM板上，并在37℃，5％CO2下在有10％FBS(胎牛血清)的MEM(最低必需培養(yǎng)基，例如GIBCO，產(chǎn)品目錄#11095)中培養(yǎng)24小時。通過在跨越0.5μM-0.0098μM范圍的10點上按劑量向培養(yǎng)基中添加化合物(在0.25％DMSO中)來處理細(xì)胞。在接觸到化合物后的23小時，細(xì)胞例如用PREFERTM固定劑[Anatech LTD.，產(chǎn)品目錄#414]固定30分鐘，然后用在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液中的0.1％

X100進行滲透15分鐘。細(xì)胞用PBS洗滌3次，然后用50μg/mL RNAse消化。一級抗體，磷酸化組蛋白(phosphohistone)H3(UpstateCat#06-570)，在4℃下按照在有1％牛血清清蛋白(BSA)的PBS中的1∶500比率被添加到細(xì)胞中保持一夜。在3次PBS洗滌后，細(xì)胞在室溫下用Alexa488標(biāo)記的二級抗體(Invitrogen Cat#A11008)培養(yǎng)1小時。它們再次用PBS洗滌3次，然后經(jīng)過30分鐘添加15μM碘化丙啶(分子探針Cat#P3566)來染色核。熒光板用ACUMEN EXPLORERTM[激光掃描熒光微板血細(xì)胞計數(shù)器(包括488nm氬離子激光器激發(fā)和多重光電倍增管檢測)，由TTP LABTECH LTD制造]掃描以測量磷酸化組蛋白H3，DNA含量，和由DNA縮合(condensation)測量的有絲分裂細(xì)胞。以細(xì)胞熒光信號為基礎(chǔ)進行圖像分析，以確定不同亞群的細(xì)胞。通過高于閾值的在500-530nm的平均強度確認(rèn)pHH3(S10)陽性細(xì)胞。從碘化丙啶/DNA獲得的在655-705nm處的總強度用于確定個體細(xì)胞(具有2N-4N的DNA含量的細(xì)胞)和在細(xì)胞周期中的亞群(2N細(xì)胞，4N細(xì)胞)。在575-640nm處的峰強度用于確定DNA縮合，后者用作標(biāo)記物來確定在4N細(xì)胞當(dāng)中的有絲分裂細(xì)胞。分析輸出數(shù)據(jù)是各個確定的亞群的百分?jǐn)?shù)，％pHH3，％2N，％4N，％有絲分裂和總細(xì)胞數(shù)。通過使用ACTIVITY BASETM，由曲線擬合到各輸出數(shù)據(jù)的四參數(shù)邏輯斯締(fourparameter logistic)來測定EC50。所得PHH3(s10)、DNA含量和有絲分裂的EC50分別具有2.6、2.4和2.5的MSR。例如，實施例13具有pHH3(s10)EC50＝42nM(n＝2)，DNA含量EC50＝40nM(n＝2)和有絲分裂EC50＝45nM(n＝1)。
抗增殖分析。
化合物對于細(xì)胞增殖的影響作用能夠通過使用現(xiàn)有技術(shù)中公知的細(xì)胞和細(xì)胞增殖方法來測定(Robert C.Squatrito等人，GynecologicalOncology，58，101-105，(1995))。例如，HCT116細(xì)胞-它可以從美國模式培養(yǎng)物保藏所獲得-能夠以～2000個細(xì)胞/孔接種在96孔板中，然后在加濕的CO2培養(yǎng)器中在37℃下放置一夜。在20-24小時培養(yǎng)之后，添加半log系列稀釋的化合物，將這些板送回到培養(yǎng)器中。在合適的暴露時間(例如，72小時)之后，使用眾所周知的方法估算細(xì)胞增殖。在一種方法中，10μL的四唑鎓鹽如Alamar Blue TM被添加到細(xì)胞板中。在染料中的合適暴露之后，測定熒光(530nm激發(fā)，580nm發(fā)射)。所得IC50的MSR為3.1。例如，實施例13具有11nM(n＝3)的IC50。
本發(fā)明的化合物優(yōu)選被配制成通過各種途徑給藥的藥物組合物。最優(yōu)選，此類組合物用于口服。此類藥物組合物和制備它們的方法是本領(lǐng)域中公知的。參見，例如，REMINGTONTHE SCIENCE ANDPRACTICE OF PHARMACY (A.Gennaro等人編著，第19版，MackPublishing Co.，1995)。
通式I的化合物一般在寬的劑量范圍中是有效的。例如，每天的劑量通常是在約0.01-約20mg/kg的體重，更優(yōu)選0.1-20mg/kg的體重的范圍內(nèi)。在一些情況下，低于上述范圍的下限的劑量水平可以是足夠的，而在其它情況下可以使用更大的劑量但也不會引起任何有害的副作用，因此以上劑量范圍無論如何不意在限制本發(fā)明的范圍?？梢岳斫獾氖?，實際上施用的化合物的量是由醫(yī)生根據(jù)相關(guān)的情況決定的，這些情況包括所要治療的病狀，所選擇的給藥途徑，施用的實際化合物，個體患者的年齡、體重和響應(yīng)，以及患者癥狀的嚴(yán)重。
權(quán)利要求
1.以下通式的化合物或它的藥物學(xué)上可接受的鹽
其中
R1是氫，羥基，羥甲基，鹵素，甲基，氟甲基，C1-C2烷氧基，氨基，或甲基氨基；
R2是氫，鹵素，或氰基；
R3是氫或鹵素；
前提條件是，R1、R2和R3中的至少一個是氫；和
R4是氫，鹵素或甲基。
2.權(quán)利要求1的化合物或它的藥物學(xué)上可接受的鹽，其中
R1是氫，羥基，羥甲基，氯，氟，甲基，氟甲基，C1-C2烷氧基，氨基，或甲基氨基；
R2是氫，氟或氰基；
R3是氫，氯，或氟；
前提條件是，R1、R2和R3中的至少一個是氫；和
R4是氫，氯，氟，或甲基。
3.權(quán)利要求1的化合物或它的藥物學(xué)上可接受的鹽，其中
R1是氫或甲基，氟甲基；
R2是氫或氟；
R3是氫，氯，或氟；
前提條件是，R1、R2和R3中的至少一個是氫；和
R4是氫，氯，氟，或甲基。
4.權(quán)利要求1的化合物或該化合物的藥物學(xué)上可接受的鹽，其中R1是鹵素，R2是氫，R3是鹵素，R4是鹵素。
5.選自下列這些中的化合物
1-(2-{4-[7-(2-氯-吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-{5-氟-4-[7-(2-氟-5-甲基吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]-嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-{4-[7-(2-氟-5-甲基吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]-5-甲基嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-{4-[7-(2-氟-5-甲基吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]嘧啶-2-基氨基}-乙基)咪唑啉-2-酮，
1-{2-[5-甲基-4-(7-吡啶-4-基-苯并[b]噻吩-2-基)嘧啶-2-基氨基]-乙基}咪唑啉-2-酮，
1-(2-{5-氯-4-[7-(2-氟-5-甲基吡啶-4-基)苯并[b]噻吩-2-基]-嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮，
1-{2-[5-氟-4-(7-吡啶-4-基-苯并[b]噻吩-2-基)嘧啶-2-基氨基]-乙基}咪唑啉-2-酮，
1-(2-{4-[7-(3-乙氧基吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]-5-氟嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-(5-氟-4-(7-(3-羥基吡啶-4-基)苯并[b]噻吩-2-基)嘧啶-2-基氨基)乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-{4-[7-(2-氯-5-乙氧基吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]-5-氟嘧啶-2-基氨基}-乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-{5-氟-4-[7-(3-甲氧基吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]嘧啶-2-基氨基}-乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-(5-氯-4-(7-(吡啶-4-基)苯并[b]噻吩-2-基)嘧啶-2-基氨基)乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-{5-氯-4-[7-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-{4-[7-(2-氯-吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]-5-氟嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-{5-氯-4-[7-(2-氯-吡啶-4-基)苯并[b]噻吩-2-基]嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-{4-[7-(5-氯-2-氟-吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]-5-氟嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-{4-[7-(2-氯-5-氟吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]-5-氟嘧啶-2-基氨基}-乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-{4-[7-(3-氯-吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]-5-氟嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-{5-氟-4-[7-(3-甲基吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-{4-[7-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]-5-甲基嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-{4-[7-(2，5-二氯吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]-5-氟嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-{5-氟-4-[7-(2-氟吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-{4-[7-(5-氯-2-氟-吡啶-4-基)-苯并[b]噻吩-2-基]嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮，
4-(2-(2-(2-(2-氧代咪唑烷-1-基)乙基氨基)嘧啶-4-基)苯并[b]噻吩-7-基)-2-氰基吡啶，
1-(2-{4-[7-(3-氨基-吡啶-4-基)苯并[b]噻吩-2-基]-5-氟嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-{4-[7-(3-甲基氨基-吡啶-4-基)苯并[b]噻吩-2-基]嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-{4-[7-(3-氨基-吡啶-4-基)苯并[b]噻吩-2-基]-5-甲基嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-{4-[7-(3-氨基-吡啶-4-基)苯并[b]噻吩-2-基]-嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-{4-[7-(5-氨基-2-氟吡啶-4-基)苯并[b]噻吩-2-基]嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-{4-[7-(3-氨基-2-氟吡啶-4-基)苯并[b]噻吩-2-基]嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮，
1-(2-{5-氟-4-[7-(2-氟-5-羥甲基-吡啶-4-基)苯并[b]噻吩-2-基]嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮，和
1-(2-{5-氟-4-[7-(2-氟-5-(氟甲基)吡啶-4-基)苯并[b]噻吩-2-基]嘧啶-2-基氨基}乙基)咪唑啉-2-酮；或
藥物學(xué)上可接受的鹽類。
6.藥物組合物，它包括權(quán)利要求1-5的化合物或它的藥物學(xué)上可接受的鹽，和相結(jié)合使用的藥物學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
7.治療在哺乳動物體內(nèi)的癌癥的方法，該癌癥選自于非小細(xì)胞肺癌，口咽癌，食道癌，胃癌，黑素瘤，皮膚的表皮樣癌，乳腺癌，卵巢癌，子宮內(nèi)膜癌，結(jié)腸直腸癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，甲狀腺癌，子宮頸癌，胰腺癌，前列腺癌，肝胚細(xì)胞瘤和非霍奇金淋巴瘤癌癥，該方法包括對需要該治療的哺乳動物施用有效量的以下通式的化合物或該化合物的藥物學(xué)上可接受的鹽
其中
R1是氫，羥基，羥甲基，鹵素，甲基，氟甲基，C1-C2烷氧基，氨基，或甲基氨基；
R2是氫，鹵素，或氰基；
R3是氫或鹵素；
前提條件是，R1、R2和R3中的至少一個是氫；和
R4是氫，鹵素或甲基。
8.權(quán)利要求1-5中任何一項的化合物或它的藥物學(xué)上可接受的鹽用于藥物的制備中的用途。
9.權(quán)利要求1-5中任何一項的化合物或它的藥物學(xué)上可接受的鹽在制備治療在哺乳動物體內(nèi)癌癥的藥物中的用途，該癌癥選自于非小細(xì)胞肺癌，口咽癌，食道癌，胃癌，黑素瘤，皮膚的表皮樣癌，乳腺癌，卵巢癌，子宮內(nèi)膜癌，結(jié)腸直腸癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，甲狀腺癌，子宮頸癌，胰腺癌，前列腺癌，肝胚細(xì)胞瘤和非霍奇金淋巴瘤癌癥。
全文摘要
本發(fā)明提供被認(rèn)為通過抑制Plk1而具有治療癌癥的臨床用途的新型咪唑啉酮基氨基嘧啶化合物或它的藥物學(xué)上可接受的鹽，其中R1是氫，羥基，羥甲基，鹵素，甲基，氟甲基，C1-C2烷氧基，氨基，或甲基氨基；R2是氫，鹵素，或氰基；R3是氫或鹵素；R4是氫，鹵素或甲基；前提條件是，R1、R2、R3和R4中的至少兩個是氫；和R5是氫，鹵素，或甲基。
文檔編號C07D409/14GK101563342SQ200780047264
公開日2009年10月21日 申請日期2007年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月21日
發(fā)明者李宏宇, H·B·布魯克斯, J·Z·克里奇, J·R·亨里, M·K·斯拉特, 延 王 申請人:伊萊利利公司