專利名稱：：Foxp3肽疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：相關(guān)申請的交叉引用本申請要求享受分別于2007年1月3日和2007年3月22日遞交的美國臨時專利申請No.60/878,615和美國臨時專利申請No.60/896,472的權(quán)益，并通過才是述并入它們的全部內(nèi)容。本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地，涉及癌癥治療領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及Foxp3肽，它們可以極其有效地用作癌癥疫苗，并涉及用于治療和預(yù)防腫瘤的藥物。
背景技術(shù)：
：已經(jīng)證明，CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTLs)可以識別來源于MHCI類分子上呈遞的腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)的表位肽，然后殺死腫瘤細(xì)胞。自從MAGE家族作為第一個TAA實例被發(fā)現(xiàn)以來，利用免疫學(xué)方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多其他的TAAs(BoonT,IntJCancer54:177-80,1993;BoonTetal.,JExpMed183:725-9,1996;vanderBruggenPetal"Science254:1643-7，1991;BrichardVetal.，JExpMed178:489-95，1993;KawakamiYetal"JExpMed180:347-52,1994)，并且其中一些作為免疫治療的靶標(biāo)現(xiàn)已處于臨床開發(fā)階IS:。可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈并且特異的抗腫瘤免疫應(yīng)答的新TAA的鑒定，為進(jìn)一步開發(fā)各類癌癥中的肽疫苗接種的臨床應(yīng)用策略提供了保證(HarrisCC,JNatlCancerInst88:1442-5,1996;ButterfieldLHetal,,CancerRes59:3134-42，1999;VissersJLMetal"CancerRes59:5554-9,1999;VanderBurgSHetal"JImmunol156:3308-14,1996;TanakaFetal.，CancerRes57:4465-8,1997;FujieTetal"IntJCancer80:169-72，1999;KikuchiMetal"IntJCancer81:459-66,1999;OisoMetal.，IntJCancer81:387-94,1999)。已經(jīng)進(jìn)行了各種類型的抗原特異性免疫治療，然而，迄今為止，就腫瘤的顯著退縮這一點而言，所獲得的臨床功效甚低(RosenbergSAetal.,NatMed10:909-15，2004)。一個主要的原因是，來自晚期癌癥患者的胂瘤浸潤4JImmunol136:1899-907,1986)。這種由腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制是對腫瘤抗原應(yīng)答不良(YoungRCetal.,AmJMed52:63-8,1972),T細(xì)胞增殖不足(AlexanderJPetal.，CancerRes53:1380-7，1993)，細(xì)胞因子產(chǎn)生減少(HoriguchiSetal.，CancerRes59:2950-6,1999)，和T細(xì)月包和天然殺傷細(xì)月包的信號傳導(dǎo)缺陷(KonoKetal.，ClinCancerRes11:1825-8,1996，KiesslingRetal.,CancerImmunolI腿腳ther48:353-62,1999)的原因。為了提高免疫治療的臨床功效，重要的是克服腫瘤所誘導(dǎo)的免疫抑制因子的影響。免疫耐受以及針對自身免疫的保護(hù)作用是由多種中.樞和外周性的機(jī)制造成的，包括胸腺中自反應(yīng)T細(xì)胞的克隆刪除，和在外周遇到自身抗原時無反應(yīng)性的誘導(dǎo)。最近人們已經(jīng)闡明，以共表達(dá)CD4和CD25標(biāo)志為特征的調(diào)節(jié)T細(xì)胞(T-regs)是一類功能上獨特的T細(xì)胞群體，它們發(fā)揮維持免疫內(nèi)平4軒(immunehomeostasis)的作用(SakaguchiSetal.，JImmunol.155:1151-64,1995，DieckmannDetal.,JExpMed193:1303-10,2001)。T-reg細(xì)胞是抑制各類免疫應(yīng)答的主要參與者之一(MiescherSetal.，JImmunol136:1899-907,1986;YoungRCetal.,AmJMed52:63-72,1972;AlexanderJPetal"CancerRes53:1380-7,1997;HoriguchiSetal"CancerRes59:2950-6,1999;KonoKetal.,ClinCancerRes11:1825-8，1996;KiesslingRetal.，CancerImmunolImmunother48:353-62，1999)。盡管對于T-reg的產(chǎn)生和功能至關(guān)重要的分子相互作用和信號途徑尚不完全清楚，但是T-reg需要由Foxp3基因(GenBank登錄號No.NM—014009;SEQIDNOl)編碼的叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子(forkheadtranscriptionfactor)scurfin(Foxp3;SEQIDN02)，該因子控制它們的發(fā)育和調(diào)節(jié)性質(zhì)(FontenotJDetal.，NatImmunol4:330-6,2003,HoriSetal"Science299:1057-61,2003,KhattriRetal.，NatImmunol4:304-6，2003)。進(jìn)一步，用經(jīng)Foxp3mRNA轉(zhuǎn)染的樹突細(xì)胞對小鼠進(jìn)行疫苗接種可引發(fā)Foxp3特異的CTL應(yīng)答(SmitaNetal.，CancerRes.Janl;67(l):371-80，2007)。因此，F(xiàn)oxp3可作為癌癥免疫治療的靶標(biāo)，而且，F(xiàn)oxp3編碼的蛋白的部分肽可以作為被CTL識別的抗原。發(fā)明概要為了提高免疫治療的臨床功效，重要的是克服被腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制因子。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)T-reg細(xì)胞是抑制各種類型免疫應(yīng)答的主要參與者之一。因此，開發(fā)出靶向Foxp3表達(dá)性T-reg的疫苗，以克服T-reg誘導(dǎo)的免疫抑制，是非常重要的。本發(fā)明是基于，至少部分地基于，從Foxp3的基因產(chǎn)物中鑒定了可引發(fā)特異針對相應(yīng)Foxp3肽或表位的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTLs)表位肽。用來自Foxp3的結(jié)合HLA-A*24和HLA-A*02的候選肽刺激健康供體的外周血單核細(xì)胞(PBMC)。已經(jīng)證明，這些肽是HLA-A24或HLA-A02限制性表位肽，可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈而特異的針對表達(dá)Foxp3的T-reg的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)免疫抑制的方法，這些方法包括施用本發(fā)明Foxp3多肽的步驟。施用Foxp3多肽可誘導(dǎo)例如細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的抗免疫抑制作用(也就是逆轉(zhuǎn)或?qū)姑庖咭种?。因此，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)抗免疫抑制的方法，這些方法包括施用Foxp3多肽的步驟，并提供了包含F(xiàn)oxp3多肽的用于調(diào)節(jié)免疫抑制的藥劑。在一個方面中，本發(fā)明提供了肽，所述肽包含選自下組的氨基酸序列或由其組成SEQIDNO:3-5，7-9,12,15-19，22,24,27-30,37,67或74。在另一個方面中，本發(fā)明提供了具有細(xì)胞毒T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽，其中該肽包含選自下組的氨基酸序列或由其組成(a)SEQIDNO:3-5,7-9,12,17，67或74;和(b)SEQIDNO:3-5,7-9，12,17,67或74，其中替換或添加了1個、2個或數(shù)個氨基酸。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了具有細(xì)胞毒T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽，其中該肽包含選自下組的氨基酸序列(a)SEQIDNO:15-19，22,24,27-30，或37,，(b)SEQIDNO:15-19，22，24，27-30,或37,其中替換或添加了1個、2個或數(shù)個氨基酸。關(guān)于實施方案，在一些實施方案中，自N端起的第二個氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸。在一些實施方案中，C端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸。在一些實施方案中，自N端起的第二個氨基酸是亮氨酸或曱硫氨酸。在一些實施方案中，C端氨基酸是95，97或98的氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供了組合物，其包含本發(fā)明的Foxp3肽或編碼本發(fā)明Foxp3肽的多核苷酸，和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。在一些實施方案中，該組合物纟皮配制成作為疫苗施用。組合物可以包括一種本發(fā)明的肽，或多種不同的本發(fā)明的Foxp3肽。這些組合物可用于抑制T-reg細(xì)胞，例如抑制T-reg細(xì)力包的增殖或阻遏其功6匕在一些實施方案中，所述組合物包含一種或多種這樣的Foxp3肽，它們可在HLA抗原是HLA-A24的受試者中引發(fā)抑制T-reg細(xì)胞的免疫應(yīng)答。在一些實施方案中，所述組合物包含一種或多種這樣的Foxp3肽，它們可在HLA抗原是HLA-A02的受試者中引發(fā)抑制T-reg細(xì)胞的免疫應(yīng)答。在另一個方面中，本發(fā)明提供了這樣的組合物，它們包含編碼本發(fā)明的Foxp3肽的多核苷酸。在一些實施方案中，該組合物包括編碼多個本發(fā)明Foxp3肽的多個(例如兩個或更多個)多核苷酸。在一些實施方案中，該組合物包含編碼多個本發(fā)明Foxp3肽的多核苷酸。在一些實施方案中，該組合物包含其它具有誘導(dǎo)針對癌性細(xì)胞的細(xì)胞毒T細(xì)胞的能力的肽，或者編碼所述其它肽的其它多核苦酸。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供一種外來體(exosome),其表面上呈遞包含HLA抗原和本發(fā)明Foxp3肽的復(fù)合物。在一些實施方案中，所述HLA抗原選自下組HLA-A24,HLA-A2402，HLA-A02和HLA-A0201。在一個相關(guān)的方面中，本發(fā)明提供用于治療癌癥(例如減少腫瘤細(xì)胞生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡)的方法，所述方法是通過向個體施用Foxp3肽或編碼Foxp3肽的多核苷酸。在另一個方面中，本發(fā)明提供誘導(dǎo)具有高的細(xì)胞毒T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細(xì)胞的方法，所述方法是通過施用本發(fā)明的Foxp3肽或編碼Foxp3肽的多核苦酸。在另一個方面中，本發(fā)明提供誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞的方法，所述方法是通過施用本發(fā)明的Foxp3肽或編碼Foxp3肽的多核苷酸。在一個相關(guān)方面中，本發(fā)明提供了一種分離的細(xì)胞毒T細(xì)胞，其是被本發(fā)明Foxp3肽-漆導(dǎo)的。在另一個方面中，本發(fā)明提供了一種抗原呈遞細(xì)胞，其包含HLA抗原與本發(fā)明的Foxp3肽之間形成的復(fù)合物。在一些實施方案中，該抗原呈遞細(xì)胞是分離的。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)受試者中T-reg細(xì)胞的方法，包括向受試者施用疫苗，該疫苗包含本發(fā)明的Foxp3肽或該肽的免疫活性片段，或者編碼該肽的多核芬酸。在本發(fā)明方法的實施中，受試者或患者可以是人。應(yīng)當(dāng)理解，無論是前述的發(fā)明概要還是下文的詳細(xì)說明都是例示性的實施方案，對本發(fā)明或本發(fā)明的其他變化實施方案不構(gòu)成限制。附圖簡述圖1顯示的照片顯示了對用來源于Foxp3的肽誘導(dǎo)后的CTL進(jìn)行的IFN-gammaELISPOT測定的結(jié)果。在圖1A中，如下編號的孔中的CTL:用Foxp3-A24-9-363(SEQIDNO3)刺激的2號和7號孑L，用Foxp3-A24-9-366(SEQIDNO7)刺激的1號孔和6號孔，用Foxp3-A24-9-190(SEQIDNO9)刺激的5號孔，用Foxp3-A24-10-87(SEQIDNO67)和Foxp3-A24-10-60(SEQIDN074)刺激的7號孔，與對照相比，顯示出強(qiáng)烈的IFN-gamma產(chǎn)生。在圖1B中，如下編號的孔中的CTL:用Foxp3-A24-9-207(SEQIDNO4)刺激的4號孔，用Foxp3-A24-9-332(SEQIDNO5)刺激的6號孔，用Foxp3-A24-9-337(SEQIDNO8)刺激的6號孔，和用Foxp3畫A24國l0-114(SEQIDNO12)刺激的1號孔，與對照相比，顯示出強(qiáng)烈的IFN-gamma產(chǎn)生。圖2顯示的照片顯示了對用來源于Foxp3的肽誘導(dǎo)后的CTL進(jìn)行的IFN-gammaELISPOT測定的結(jié)果。在圖2A中，如下編號的孔中的CTL:用Foxp3-A2-9-390(SEQIDNO15)刺激的2號孔，用Foxp3-A2-9-69(SEQIDNO16)刺激的2號孔，用Foxp3-A2-9-252(SEQIDNO17)刺激的6號孔，用Foxp3-A2-10-359(SEQIDNO22)刺激的4號孔，用Foxp3-A2-263(SEQIDNO24)剌激的7號孑L，和用Foxp3-A2-10-94(SEQIDNO27)刺激的2號孔和5號孔，與對照相比，顯示出強(qiáng)烈的IFN-gamma產(chǎn)生。在圖2B中，如下編號的孔中的CTL:用Foxp3-A2-l0-233(SEQIDNO28)刺激的全部孔，用Foxp3-A2-10-152(SEQIDNO29)刺激的6號孔和7號孔，用Foxp3-A2-10-77(SEQIDNO30)刺激的5號孔，和用Foxp3隱A2-10-246(SEQIDNO37)和用Foxp3-A2-10-94(SEQIDNO27)刺激的1號孑L，與對照相比，顯示出強(qiáng)烈的IFN-gamma產(chǎn)生。在圖2C中，如下編號的孔中的CTL:用Foxp3-A2-9-390(SEQIDNO15)刺激的1號，2號，4號，5號，7號，9號，11號孔和12號孔，用Foxp3-A2-9-304(SEQIDNO19)刺激的5號孔和11號孔，用Foxp3-A2-9-68(SEQIDNO7)刺激的7號孔，和用Foxp3-A2-9-252(SEQIDNO17)刺激的12號孔，與對照相比，顯示出強(qiáng)烈的IFN-gamma產(chǎn)生。圖3顯示，對陽性孔中的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增并執(zhí)行IFN-gammaELISA測定。在圖3A,B和C中，與對照(實方形)相比，用Foxp3-A02-9-390(SEQIDNO:15)刺激的CTL系(實菱形)顯示強(qiáng)烈的IFN-gamma產(chǎn)生。在圖3D中，與對照(實方形)相比，用Foxp3-A02-9-252(SEQIDNO:17)處理的CTL系(實菱形)顯示強(qiáng)烈的IFN-gamma產(chǎn)生。在圖3E中，與對照(實方形)相比，用Foxp3-A24-10-60(SEQIDNO:74)處理的CTL系(實菱形)顯示強(qiáng)烈的IFN-gamma產(chǎn)生。在圖3F中，與對照(實方形)相比，用Foxp3-A02-10-94(SEQIDNO:27)處理的CTL系(實菱形)顯示強(qiáng)烈的IFN-gamma產(chǎn)生。在圖3G中，與對照(實方形)相比，用Foxp3-A24-10-87(SEQIDNO:67)處理的CTL系(實菱形)顯示強(qiáng)烈的IFN-gamma產(chǎn)生。特異CTL活性。在圖4A和B中，用Foxp3-A02-9-390(SEQIDNO:15)和Foxp3-A02-9-252(SEQIDNO:17)生成的CTL系針對用Foxp3和HLA-A02二者轉(zhuǎn)染的293T顯示出高度的特異CTL活性。而另一方面，它針對對照沒有顯示出顯著的特異CTL活性。在圖4C中，用Foxp3-A02-9-252(SEQIDNO:17)生成的CTL系針對用Foxp3和HLA-A24二者轉(zhuǎn)染的293T顯示高度的特異CTL活性。另一方面，它針對對照沒有顯示出顯著的特異CTL活性。[圖5]圖5顯示了Foxp3-252一h和Foxp3-252_m肽的體內(nèi)免疫原性測定。將IFA偶聯(lián)肽或僅IFA在第0天和第7天皮下注射到BALB/c小鼠體內(nèi)。在第14天，收集經(jīng)接種小鼠的脾細(xì)胞，并用作應(yīng)答(responder)細(xì)胞。經(jīng)相應(yīng)肽(空心方形)沖擊或沒有用肽(實心方形)沖擊過的lx104RLmalel細(xì)胞用作刺激(stimulator)細(xì)胞，用于IFN-gammaELISPOT測定。用Foxp3-252一h(A)和Foxp3-252—m(B)對5只小鼠(M1-M5)進(jìn)行接種，對3只小鼠(N1-N3)進(jìn)行沒有任何肽的IFA注射，作為每個測定的對照。圖6顯示了用Foxp3表位肽進(jìn)行疫苗接種的體內(nèi)抗腫瘤效果。在第0天，將lxl()S個4Tl乳腺癌細(xì)胞系注射到BALB/c小鼠體內(nèi)。在第3和10天，注射與Foxp3-252—h(-空心圓-),Foxp3-252—m(-實心方塊-)偶聯(lián)的IFA或者沒有偶聯(lián)肽(-實心三角形-)的IFA。作為正常腫瘤生長對照，在本測定中還制備了沒有接種疫苗的小鼠(-x-)。用Foxp3表位肽進(jìn)行接種觀察到了顯著的腫瘤生長抑制差異。*，P<0.01;**，P<0.005。圖7顯示了Foxp3-9-252取代物對HLA分子的親和性的測定。在圖7A中，用Foxp3-9-252-WT誘導(dǎo)的CTL識別在HLA-A2分子上呈遞Foxp3-9-252-9V肽的細(xì)胞。進(jìn)行IFN-gammaELISPOT測定，分別使用經(jīng)Foxp3-9-252-WT肽誘導(dǎo)的CTL系作為應(yīng)答細(xì)胞，經(jīng)Foxp3-9-252-WT或Foxp3-9-252-9V肽沖擊的T2細(xì)胞作為刺激細(xì)胞。制備未經(jīng)肽沖擊的T2細(xì)胞作為對照。在圖7B中，F(xiàn)oxp3-9-252-9V和Foxp3-9-252-WT顯示相似的對HLA-A2分子的親和性。進(jìn)行IFN-gammaELISPOT測定，分別使用經(jīng)Foxp3-9-252-WT肽誘導(dǎo)的CTL系作為應(yīng)答細(xì)胞(lx105個細(xì)胞/孔)和經(jīng)Foxp3-9-252-WT(-實心圓-),Foxp3-9-252-9V(-空心圓-)或HIV-A02(-實心三角形-)肽沖擊的T2細(xì)胞作為剌激細(xì)胞(lxl(^個細(xì)胞/孔)。制備未經(jīng)肽沖擊的T2細(xì)胞作為對照。在每種肽和肽濃度下，刺激細(xì)胞的肽沖擊在37攝氏度下進(jìn)行2小時。在圖7C中，CTL可以被靶向HLA-A2分子的Foxp3-9-252取代物的刺激所誘導(dǎo)。針對所有靶向HLA-A2分子的取代肽的CTL是根據(jù)"材料和方法，，中描述的方法產(chǎn)生的。用Foxp3-9-252-3M刺激的3號和7號孔，用Foxp3-9-252-3L刺激的7號孔，和用Foxp3-9-252-9V刺激的8號孔中的細(xì)胞與對照相比顯示了IFN-gamma產(chǎn)生。在圖7D中，用Foxp3-9-252-9V產(chǎn)生的CTL可識別涂布有Foxp3-9-252-WT肽的刺激細(xì)胞。用Foxp3-9-252-9V肽i秀導(dǎo)的CTL系:故用作應(yīng)答細(xì)胞。與Foxp3-9-252-9V(-實心圓-)或與Foxp3-9-252-WT(-空心圓-)肽溫育過的T2細(xì)胞，或沒有用肽(-空心方形-)溫育過的T2細(xì)胞在本測定中用作刺激細(xì)胞(^104個細(xì)胞/孔)。發(fā)明詳細(xì)說明I.定義除非特別指出，否則本文使用的詞語"一個(或一種)"、"某個(或某種)"和"該"是指"至少一個(或至少一種)"。術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。這些術(shù)語適用于這樣的氨基酸聚合物，其中一個或多個氨基酸殘基是經(jīng)修飾的殘基或者是非天然存在的殘基，例如相應(yīng)的天然存在氨基酸的人工化學(xué)模擬物，也適用于天然存在的氨基酸聚合物。本文使用的術(shù)語"氨基酸"是指天然存在的和合成的氨基酸，以及與天然存在氨基酸相似地發(fā)揮功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是那些由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及那些翻譯后在細(xì)胞內(nèi)被修飾的氨基酸(例如羥脯氨酸、y-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸)。短語"氨基酸類似物"是指具有和天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)(a碳與一個氫原子、一個羧基、一個氨基和一個R基結(jié)合)，但具有經(jīng)修飾的R基或者經(jīng)修飾的骨架的化合物(例如高絲氨酸、正亮氨酸、曱硫氨酸亞砜、曱硫氨酸曱基锍)。短語"氨基酸模擬物"是指具有與一般氨基酸不同的結(jié)構(gòu)但相似的功能的化學(xué)化合物。在本文中，氨基酸用其眾所周知的三字母符號或者IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會推薦的單字母符號表示。在本文中，除非特別指出，術(shù)語"基因"、"多核苷酸"、"核苷酸"和"核酸，，可互換使用，并且與氨基酸類似，可以用它們普遍接受的單字母編碼表示。除非另外定義，否則本文使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的意思與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所公知的意思相同。當(dāng)存在矛盾時，以本專利說明書包括定義為準(zhǔn)。II.肽為了證明來自Foxp3的肽可以發(fā)揮被細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTLs)所識別的抗原的功能，在本發(fā)明中，對由Foxp3亞序列構(gòu)成的肽進(jìn)行了分析，看它們是否是被世界上常見的HLA等位基因——HLA-A24或HLA-A02——限制的4元原表4立(DateYetal.,TissueAntigens47:93-101,1996;KondoAetal.,JImmunol155:4307-12,1995;KuboRTetal.，JImmunol152:3913-24,1994)。，利用關(guān)于它們對HLA-A24和HLA-A02的結(jié)合親和性的信息鑒定出由Foxp3亞序列組成的HLA-A24和HLA-A02結(jié)合肽的候選物。在用載有這些肽的樹突細(xì)胞(DCs)體外刺激T細(xì)胞之后，用如下的肽成功地建立了CTL:.Foxp3陽A24-9-363(SEQIDNO3),Foxp3-A24-9-366(SEQIDNO7),Foxp3-A24-9-190(SEQIDNO9),Foxp3-A24-9畫207(SEQIDNO4),Foxp3-A24-9-332(SEQIDNO5),Foxp3-A24-9-337(SEQIDNO8),Foxp3-A24-10-114(SEQIDNO12),Foxp3-A2國9匿390(SEQIDNO15)，F(xiàn)oxp3-A2-9-69(SEQIDNO16)，F(xiàn)oxp3-A2-9-252(SEQIDNO17),Foxp3陽A2-10畫359(SEQIDNO22),Foxp3-A2-10-263(SEQIDNO24),Foxp3-A2-10-94(SEQIDNO27)，F(xiàn)oxp3-A2-10-233(SEQIDNO28)，F(xiàn)oxp3-A2-10-152(SEQIDNO29)，F(xiàn)oxp3-A2-10-77(SEQIDNO30)，F(xiàn)oxp3-A2-10-246(SEQIDNO37),Foxp3畫A2-9畫68(SEQIDNO18)，F(xiàn)oxp3-A2-9-304(SEQIDNO19)，F(xiàn)oxp3-A24-10-87(SEQIDNO67)和Foxp3-A24-10-60(SEQIDNO74)。建立的這些CTL針對經(jīng)肽沖擊的把細(xì)胞顯示出強(qiáng)烈而特異的CTL活性。這些結(jié)果與如下的結(jié)論一致，即Foxp3是被CTL識別的抗原，并且Foxp3-A24-9-363(SEQIDNO3)，F(xiàn)oxp3-A24-9-366(SEQIDNO7),Foxp3-A24-9-190(SEQIDNO9),Foxp3-A24-9-207(SEQIDNO4),Foxp3-A24-9-332(SEQIDNO5)，F(xiàn)oxp3-A24-9-337(SEQIDNO8),Foxp3-A24-10-114(SEQIDNO12),Foxp3-A2-9-390(SEQIDNO15),Foxp3-A2-9-69(SEQIDNO16),Foxp3-A2-9-252(SEQIDNO17)，F(xiàn)oxp3-A2-10-359(SEQIDNO22)，F(xiàn)oxp3-A2-10-263(SEQIDNO24),Foxp3-A2-10-94(SEQIDNO27)，F(xiàn)oxp3-A2善233(SEQIDNO28)，F(xiàn)oxp3-A2-10-152(SEQIDNO29),Foxp3-A2-10-77(SEQIDNO30),Foxp3-A2-10-246(SEQIDNO37),Foxp3-A2-9-68(SEQIDNO18),Foxp3-A2-9-304(SEQIDNO19),Foxp3-A24-10-87(SEQIDNO67)和Foxp3-A24-10-60(SEQIDNO74)是被HLA-A24和HLA-A2限制的表位肽。因為Foxp3在大多數(shù)癌癥患者中表達(dá)，并且與由胂瘤所致免疫抑制因子(immunosuppressivefactorsduetotumors)所i秀導(dǎo)的免疫才中制有關(guān),所以Foxp3是用于免疫治療的良好靶標(biāo)，用于提高針對癌癥的抗原特異性免疫治療的臨床功效。因此，本發(fā)明提供了九肽(由9個氨基酸殘基構(gòu)成的肽)和十肽(由10個氨基酸殘基構(gòu)成的肽)。本發(fā)明的Foxp3肽結(jié)合HLA分子，并誘導(dǎo)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTLs)中的細(xì)胞毒活性。更具體地，本發(fā)明提供了由選自SEQIDNO:3-5，7-9,12,15-19,22,24，27-30，37,67或74的氨基酸序列所組成的肽。一般地，現(xiàn)在可以在互聯(lián)網(wǎng)上獲得軟件程序，例如ParkerKC.etal,JImmunol.1994Janl;152(l):163-75中描述的程序，用于通過計算機(jī)(insilico)計算各種肽與HLA抗原之間的結(jié)合親和性。與HLA抗原的結(jié)合親和性可以在體外測量，例如在下列文獻(xiàn)中描述的ParkerKC.etal,JImmunol.1994Jan1;152(1):163陽75.;NukayaI.etal,IntJCancer.1999Jan5;80(l):92-7.;K畫shimaK，etal.((2001)Blood.;98(6):1872-81.;JournalofImmunologicalMethods,1995,185:181-190.;ProteinScience,2000,9:1838-1846)。而且，本發(fā)明的Foxp3肽在保留其CTL誘導(dǎo)能力的前提下可以在兩側(cè)具有額外的氨基酸殘基。這些具有CTL誘導(dǎo)能力的肽可以少于大約40個氨基酸，例如少于大約20個氨基酸，例如少于大約15個氨基酸。位于由選自SEQIDNO:3-5,7-9,12，15-19，22,24，27-30，37,67和74的氨基酸序列組成的肽之兩側(cè)的氨基酸序列不受限制，可以由任何類型的氨基酸組成，只要其不抑制所述肽的CTL誘導(dǎo)能力即可。因此，本發(fā)明還提供了具有CTL誘導(dǎo)能力的肽，其包括選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:3-5,7-9，12，15-19，22,24，27-30,37，67和74。一般知道，對蛋白質(zhì)中的一個或多個氨基酸進(jìn)行修飾不會影響蛋白質(zhì)的功能，或者在某些情況下，甚至?xí)岣咴嫉鞍踪|(zhì)的期望功能。實際上，經(jīng)過修飾的肽(也就是，由通過向原始參考序列替換或添加1個、2個或數(shù)個氨基酸殘基進(jìn)行修飾而得到的氨基酸序列組成的肽)已知可以保持原始肽的生物活性(Marketal.,ProcNatlAcadSciUSA81:5662-6，1984;ZollerandSmith,NucleicAcidsRes10:6487-500,1982;Dalbadie腸McFarlandetal"ProcNatlAcadSciUSA79:6409-13,1982)。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，本發(fā)明具有CTL誘導(dǎo)能力的肽可以由如下的氨基酸構(gòu)成，其包含氨基酸序列SEQIDNO:3-5，7-9,12，15-19，22，24,27-30,37,67或74，其中添加和/或替換了一個或數(shù)個氨基酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)識到，向一個氨基酸序列進(jìn)行個別的添加或替換以改變單個氨基酸或少部分的氨基酸，其結(jié)果仍然會保留原始氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)；因此被稱作"保守替換"或"保守修飾"，其中蛋白質(zhì)的改變可產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)?？商峁┕δ苌舷嗨瓢被岬谋Ｊ靥鎿Q表是本領(lǐng)域眾所周知的。氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)的實例由疏水性氨基酸(A，I，L，M,F,P,W，Y,V),親水性氨基酸(R,D，N，C,E,Q，QH,K，S，T),和具有如下共同功能基團(tuán)或特征的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(G，A，V，L，I，P);含羥基的側(cè)鏈(S,T,Y);含硫原子的側(cè)鏈(C，M);含羧酸和酰胺的側(cè)鏈(D，N,E,Q);含堿基的側(cè)鏈(R，K,H);和含芳香基的側(cè)鏈(H，F(xiàn),Y,W)。此外，如下8組中，每組包含的各個氨基酸彼此是構(gòu)成保守替換的1)丙氨酸(A),甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D),谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R),賴氨酸(K);5)異亮氨酸(I),亮氨酸(L)，曱硫氨酸(M)，纈氨酸(V);6)苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y),色氨酸(W);7)絲氨酸(S),蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)，曱硫氨酸(M)(見例如Creighton,Proteins(1984)).這些經(jīng)過保守修飾的肽也被看作是本發(fā)明的肽。然而，本發(fā)明的肽不僅限于此，可以包括非保守修飾，只要肽保留CTL誘導(dǎo)能力即可。而且，經(jīng)過修飾的肽不排除CTL誘導(dǎo)性肽的多態(tài)性變異體、種間同源物和Foxp3的等位基因(alleles)?？梢詢H對少數(shù)(例如1個，2個或數(shù)個)或少部分的氨基酸殘基進(jìn)行修飾(添加或替換)，同時仍然保留必要的CTL誘導(dǎo)能力(即CTL激活)。這里，術(shù)語"數(shù)個"是指5個或者更少，或者例如3個或者更少。被修飾的氨基酸殘基的百分比可以是SEQIDNO:3-5,7-9，12，15-19,22,24,27-30,37,67和74的整個氨基酸序列的20%或者更少，例如15%或10%或者更少，例如1-5%。與已鑒定序列的整體具有至少95%，96%,97%,98%,99%的氨基酸序列同一性的Foxp3肽也是本發(fā)明意圖的。序列同一性可以用本領(lǐng)域已知的任何算法來測算，例如可以可在美國國立生物信息中心訪問的BLAST(萬維網(wǎng)i也i止為ncbi,nlm.nih.gov/blast/Blastcgi)。對本發(fā)明肽的同源性(即序列同一性)分析Foxp3陽A24-9畫363(SEQIDNO3),Foxp3-A24-9-366(SEQIDNO7),Foxp3-A24-9-190(SEQIDNO9)，F(xiàn)oxp3陽A24畫9-207(SEQIDNO4),Foxp3-A24-9-332(SEQIDNO5),Foxp3-A24-9-337(SEQIDNO8),Foxp3-A24-l0-114(SEQIDNO12)，F(xiàn)oxp3-A2-9-390(SEQIDNO15)，F(xiàn)oxp3-A2-9-69(SEQIDNO16),Foxp3-A2-9-252(SEQIDNO17),Foxp3-A2-10-359(SEQIDNO22),Foxp3-A2-10-263(SEQIDNO24),Foxp3-A2-10-94(SEQIDNO27),Foxp3-A2-10-233(SEQIDNO28),Foxp3-A2-10-152(SEQIDNO29)，F(xiàn)oxp3-A2-10-77(SEQIDNO30)，F(xiàn)oxp3-A2-10-246(SEQIDNO37)，F(xiàn)oxp3-A2-9-68(SEQIDNO18),Foxp3-A2-9-304(SEQIDNO19),Foxp3-A24-10-87(SEQIDNO67)和Foxp3-A24-10-60(SEQIDNO74)表明它們與來源于任何其他已知的人基因產(chǎn)物的肽都不具有顯著的同源性。這降低了在用于免疫治療時發(fā)生未知或不良的免疫應(yīng)答的可能性。當(dāng)用于免疫治療時，本發(fā)明的肽將作為與HLA抗原的復(fù)合物被呈遞在細(xì)胞或外來體的表面上。因此，選擇除了它們的CTL誘導(dǎo)能力之外，還具有高的HLA結(jié)合親和性的肽。而且，肽可以通過替換、添加氨基酸殘基等進(jìn)行修飾，以實現(xiàn)更高的結(jié)合親和性。除了自然展示的肽之外，因為通過與HLA抗原結(jié)合展示的肽序列的規(guī)則性(即一致性)是已知的(JImmunol152:3913,1994;I畫unogenetics41:178,1995;JImmunol155:4307,1994),所以HLA-A24結(jié)合親和性的肽，可以將其自N端起第二個氨基酸替換為苯丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸，也可以使用C端氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸替換的肽。另一方面，自N端起第二個氨基酸被替換為亮氨酸或曱硫氨酸并且其中C端氨基酸被替換為纈氨酸或亮氨酸的肽，可以用作具有高HLA-A02結(jié)合親和性的肽。替換不僅可以在末端氨基酸進(jìn)行，還可以在肽的潛在TCR識別位置進(jìn)行。Zaremba等證明，CAP1肽中的氨基酸替換可等同于或者好于原始肽(CancerRes.57,4570-4577，1997)。例如，經(jīng)過替換的肽包含SEQIDNO:95，97或98的氨基酸序列。而且，也可以向肽的N和/或C端添加l-2個氨基酸。這種經(jīng)過然而，當(dāng)肽序列與具有不同功能的內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分相同時，可能會誘發(fā)副作用，例如自身免疫紊亂或針對特定物質(zhì)的過敏癥狀。因此，可以用可獲得的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性檢索，以避免、減少或最小化肽序列與另一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列匹配的情況。當(dāng)通過同源性檢索明確了不存在與目標(biāo)肽相差1個或2個氨基酸的其他肽時，即可對目標(biāo)肽進(jìn)行修飾，以增加與HLA抗原的結(jié)合親和性，和/或增加CTL誘導(dǎo)能力，而沒有任何副作用的危險。上文描述的與HLA抗原具有高結(jié)合親和性的肽將是非常有效的。還可以對以是否存在高結(jié)合親和性作為指標(biāo)而選出的候選肽檢查其CTL誘導(dǎo)能力的實際存在。這里，短語"CTL誘導(dǎo)能力"表示肽在被呈遞到抗原呈遞細(xì)胞上時誘導(dǎo)CTL的能力。進(jìn)一步，"CTL誘導(dǎo)能力"包括肽誘導(dǎo)CTL激活、CTL增殖和增加IFN-gamma產(chǎn)生的能力。CTL誘導(dǎo)能力的確認(rèn)可以通過誘導(dǎo)攜帶人MHC抗原的抗原呈遞細(xì)胞(例如B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞)，或者更具體地，來源于人外周血單核白細(xì)胞的樹突細(xì)胞，并且在用肽刺激后，與CD8陽性細(xì)胞混合，然后測量由針對靶細(xì)胞的CTL所產(chǎn)生和釋放的IFN-gamma。作為反應(yīng)系統(tǒng)，可以使用已產(chǎn)生的可以表達(dá)人HLA抗原的轉(zhuǎn)基因動物(例如在下列文獻(xiàn)中介紹的BenMohamedL,KrishnanR，LongmateJ，AugeC，LowL，PrimusJ,DiamondDJ,HumImmunol61(8):764-79，2000Aug,RelatedArticles,Books,LinkoutInductionofCTLresponsebyaminimalepitopevaccineinHLAA*0201/DR1transgenicmice:dependenceonHLAclassIIrestrictedT(H)response),例如，靶細(xì)胞可用51Cr等進(jìn)行》文射性標(biāo)記，細(xì)胞毒活性可以由從耙細(xì)胞釋放的放射性計算出來?；蛘撸梢酝ㄟ^測量在攜帶有固定化肽的抗原呈遞細(xì)胞的存在下由CTL產(chǎn)生和釋放的IFN-gamma,并4吏用抗IFN-gamma單克隆抗體對培養(yǎng)基上的抑制區(qū)進(jìn)行可視化，來進(jìn)行檢驗。作為檢驗如上所述的肽CTL誘導(dǎo)能力的結(jié)果，具有高HLA抗原結(jié)合親和性的肽不一定具有高誘導(dǎo)能力。而且，從包含如SEQIDNO:3-5，7-9，12,15-19，22,24,27-30,37,67或74所示的氨基酸序列的肽中選出的九肽或十肽除了具有高的HLA抗原結(jié)合親和性，還顯示出特別高的CTL誘導(dǎo)能力。除了對本發(fā)明肽的上述修飾之外，本發(fā)明的肽可以進(jìn)一步與其他物質(zhì)連接，只要它們保留CTL誘導(dǎo)能力即可?？梢允褂玫奈镔|(zhì)包括肽、月旨、糖和糖鏈、乙?；?、天然和合成聚合物等。肽可以含有修飾，例如糖基化、側(cè)鏈氧化、或磷酸化；只要該修飾不破壞本文所述的肽的生物活性即可?？梢赃M(jìn)行這些類型的修飾來提供額外的功能(例如靶向功能和遞送功能)或者使多肽穩(wěn)定。例如，本領(lǐng)域已知，為了增加多肽的體內(nèi)穩(wěn)定性，可引入特別有用的各種D氨基酸、氨基酸模擬物或非天然氨基酸；本發(fā)明的多肽也可采用該構(gòu)思。多肽的穩(wěn)定性可以用多種方式來測試。例如，肽酶和各種生物介質(zhì)，例如人血漿和血清，已被用于檢測穩(wěn)定性(見例如Verhoefetal.,EurJDrugMetabPha廳cokin11:291-302,1986)。III.肽的制備本發(fā)明的肽可以用眾所周知的技術(shù)加以制備。例如，可以通過合成方式，利用重組DNA技術(shù)或化學(xué)合成方法來制備肽。本發(fā)明的肽可以個別地合成，或者可以合成為包含兩個或更多個肽(例如兩個或更多個Foxp3肽或一個Foxp3肽與一個非Foxp3肽)的較長多肽。可以對肽加以分離，即純化，而使其基本上不含其他天然存在的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)及其片段，例如至少大約70%、80%或90%純化。本發(fā)明的肽可以根據(jù)所選的氨基酸序列通過化學(xué)合成獲得。例如，可用于合成的傳統(tǒng)肽合成方法包括(i)PeptideSynthesis,Interscience,NewYork,1966;(ii)TheProteins,Vol.2,AcademicPress,NewYork,1976;(iii)PeptideSynthesis(曰文)，MaruzenCo.,1975;(iv)BasicsandExperimentofPeptideSynthesis(曰本),MaruzenCo"1985;(v)DevelopmentofPharmaceuticals(secondvolume)(曰本)，Vol.14(peptidesynthesis),Hirokawa，1991;(vi)W099/67288;和(vii)BaranyG.&MerrifieldR.B.，PeptidesVol.2，"SolidPhasePeptideSynthesis",AcademicPress,NewYork,1980，100-118。或者，本發(fā)明的肽可以用任何已知的用于產(chǎn)生肽的遺傳工程方法獲得(例如，MorrisonJ.(1977)J.Bacteriology132:349-51;Clark-Curtiss&Curtiss(1983)MethodsinEnzymology(eds.Wuetal.)101:347-62)。例如，首先，制備合適的載體，其具有以可表達(dá)形式編碼目標(biāo)肽的多核苷酸(例如，處于相應(yīng)啟動子序列調(diào)節(jié)序列的下游)，并將其轉(zhuǎn)移到合適的宿主細(xì)胞。然后培養(yǎng)宿主細(xì)胞，產(chǎn)生目的肽。肽還可以采用體外翻譯系統(tǒng)在體外產(chǎn)生。IV.多核苷酸本發(fā)明提供了多核苷酸，其編碼任何一種前述的本發(fā)明肽。這包括來自天然存在的Foxp3基因的多核苷酸，和具有其經(jīng)過保守修飾的核苷酸序列的那些多核苷酸。在這里，短語"保守修飾的核苷酸序列，，是指編碼相同或基本上相同氨基酸序列的序列。由于遺傳密碼的簡并性，任何給定的蛋白質(zhì)被大量功能相同的核酸所編碼。例如，密碼子GCA，GCC，GCG和GCU均編碼氨基酸丙氨酸。因此，在每一個被密碼子規(guī)定為丙氨酸的位置，可以該密碼子改變成任何所述的相應(yīng)密碼子，而不會改變所編碼的多肽。這樣的核酸變異是"沉默變異，，，是保守修飾的變異中的一種。本文中，每一個編碼肽的核酸序列也說明了該核酸的每一種可能的沉默變異。技術(shù)人員會認(rèn)識到，核酸中的每一個密碼子(除了下面二者以外AUG,其一般僅是曱硫氨酸的密碼子；TGG,其一般僅是色氨酸的密碼子)均可被修飾，以產(chǎn)生功能相同的分子。因此，在每個公開的序列中默示地說明了編碼肽的核酸的每一種沉默變異。本發(fā)明的多核苷酸可以由DNA、RNA及其衍生物構(gòu)成。DNA合適地由堿基，例如A、T、C和G構(gòu)成。在RNA中，T被U替換。本發(fā)明的Foxp3多核苷酸可以編碼多個本發(fā)明的Foxp3肽，它們之間存在或者不存在間插的(intervening)氨基酸序列。例如，間插氨基酸序列可以提供該多核苷酸或所翻譯的肽的剪切位點(例如酶識別序列)。而且，多核苷酸可以是重組多核苷酸，其包括表達(dá)肽所需的調(diào)節(jié)序列。一般地，這些重組多核苦酸可以通過傳統(tǒng)的重組技術(shù)，使用例如聚合酶和核酸內(nèi)切酶，對多核苷酸進(jìn)行操作，來加以制備。重組和化學(xué)合成技術(shù)均可用于產(chǎn)生本發(fā)明的多核苦酸。例如，可以通過插入到在轉(zhuǎn)染到感受態(tài)細(xì)胞中時可以表達(dá)的合適載體中來產(chǎn)生多核苷酸。或者，多核苷酸可以用PCR技術(shù)或者在合適的宿主中表達(dá)進(jìn)行擴(kuò)增(見例如Sambrooketal.,《分子克隆實-瞼室手冊》(MolecularCloning:ALaboratoryManual),ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,1989)。或者，多核苦酸可以用固相技術(shù)加以合成，例如在下列文獻(xiàn)中介紹的BeaucageS丄.&IyerR.P"Tetrahedron48:2223-311,1992;Matthesetal.,EMBOJ3:801-5,1984。V.藥劑因為Foxp3已經(jīng)被鑒定是調(diào)節(jié)性T(T-reg)細(xì)胞(此類細(xì)胞執(zhí)行維持免疫動態(tài)平衡的功能)的分子，所以本發(fā)明的Foxp3肽或編碼Foxp3肽的多核苷酸可以用于調(diào)節(jié)T-reg細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了一種用于調(diào)節(jié)T-reg細(xì)胞的藥劑，其包括一種或多種本發(fā)明的肽，或者編碼這些肽的多核苷酸，作為活性成分。本文中，"調(diào)節(jié)"(regulating)T-reg細(xì)胞表示體內(nèi)修飾T-reg細(xì)胞的狀態(tài)，例如通過抑制T-reg細(xì)胞的增殖或阻遏其功能。T-reg細(xì)胞被認(rèn)為是各類免疫應(yīng)答的抑制的主要參與者，本文中"阻遏T-reg細(xì)胞的功能"是指降低T-reg細(xì)胞的阻遏免疫應(yīng)答的能力。特別地，T-reg細(xì)胞在外周發(fā)揮作用，被稱作外周耐受(MiescherSetal"JImmunol136:1899-907，1986;YoungRCetal"AmJMed52:63-72,1972;AlexanderJPetal.,CancerRes53:1380-7，1997;HoriguchiSetal"CancerRes59:2950-6,1999;KonoKetal"ClinCancerRes11:1825-8，1996;KiesslingRetal"CancerImmunolI腿腸ther48:353-62,1999;FontenotJDetal.，NatImmunol4:330-6,2003,HoriSetal.，Science299:1057-61,2003;KhattriRetal"NatImmunol4:304-6，2003)。T-reg細(xì)月包在例如癌癥患者體內(nèi)提供免疫抑制效果。因此，本發(fā)明Foxp3肽(其在T-reg細(xì)胞中過表達(dá))或編碼該Foxp3肽的多核苷酸可以用作治療癌癥的藥劑(例如疫苗)。在本發(fā)明中，短語"疫苗"(也稱作免疫原性組合物)是指這樣的物質(zhì)，其在被接種到動物體內(nèi)時，具有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫或調(diào)節(jié)T-reg的免疫的功能。本發(fā)明的藥劑可用于治療和/或預(yù)防受試者體內(nèi)的癌癥，所述受試者例如人和任何其他哺乳動物，包括但不限于，小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、貓、狗、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴、狒狒和黑猩猩，特別是商業(yè)上重要的動物或家畜。根據(jù)本發(fā)明，包含SEQIDNO:3-5，7-9,12，15-19,22，24,27-30,37，67或74的氨基酸序列的多肽是HLA-A24或HLA-A02限制性表位肽，能夠誘導(dǎo)針對Foxp3表達(dá)性T-reg細(xì)胞的強(qiáng)烈而特異的免疫應(yīng)答。因此，本藥劑意圖施用于HLA抗原是HLA-A24或HLA-A02的受試者。有待于用本發(fā)明的藥劑治療的癌癥沒有限制，包括所有在受試者體內(nèi)Foxp3表達(dá)的種類的癌癥。癌癥的實例包括乳腺癌、AML、膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜異位、食道癌、胃癌、彌散型胃癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、小細(xì)胞肺癌、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。如果需要，由Foxp3肽或編碼Foxp3肽的多核苷酸構(gòu)成的本發(fā)明的藥劑可選地包含其他治療性物質(zhì)作為活性成分，只要該物質(zhì)不抑制目的肽的T-reg細(xì)胞調(diào)節(jié)作用即可。例如，制劑可以包含抗炎劑、止痛劑、化療劑等。藥劑本身除了包含其他的治療性物質(zhì)之外，本發(fā)明的藥劑還可以和一種或多種其他的藥理學(xué)作用劑順次地或同時地施用。藥物和藥理學(xué)作用劑的量取決于，例如，所用的藥理學(xué)作用劑類型，所治療的疾病，和給藥的日程方案和途徑。-應(yīng)當(dāng)理解，除了本文中特別提到的成分之外，本發(fā)明的藥劑可以包括與所討論的制劑類型有關(guān)的在本領(lǐng)域中常規(guī)使用的其他作用劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，本藥劑可以包含在產(chǎn)品和試劑盒中，所述產(chǎn)品和試劑盒含有對于要治療的疾病狀況(例如癌癥)的治療有用的材料。該產(chǎn)品可以包括具有標(biāo)簽的任何本發(fā)明藥劑的容器。該容器可以用多種材料制成，例如玻璃或塑料。容器上的標(biāo)簽應(yīng)當(dāng)指明該制劑是用于治療或預(yù)防疾病的一種或多種狀況。該標(biāo)簽還應(yīng)標(biāo)明用藥說明等。除了上述的容器之外，包含本發(fā)明藥劑的試劑盒還可以任選地包含第二容器，其容納藥物可接受的稀釋劑。還可以進(jìn)一步包括其他從商業(yè)和用戶角度看可取的材料，包括其他的緩沖劑、稀釋劑、過濾器、針頭、注射器和具有使用說明的包裝說明書。如果期望的話，藥物組合物可以置于包(pack)或配藥器(dispenserdevice)中提供，所述包或配藥器可以包含一個或多個含有活性成分的單位劑型。所述包可以包括，例如，金屬或塑料箔(foil)，例如發(fā)泡包。該包裝或配藥器可以通過給藥說明書實現(xiàn)。(1)含有肽作為活性成分的藥劑如果需要的話，本發(fā)明的肽可以作為經(jīng)傳統(tǒng)制劑方法配制過的藥劑直接施用。在這些情況下，除了本發(fā)明的肽之外，還可以視情況包括載體、賦形劑和其他通常用于藥物的物質(zhì)，沒有特殊的限制。這些載體的實例有滅菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)液等。而且，藥劑可以根據(jù)需要包含穩(wěn)定劑、懸浮劑、防腐劑、表面活性劑等。本發(fā)明的藥劑可用于治療和/或預(yù)防癌癥，特別是調(diào)節(jié)T-reg細(xì)胞。本發(fā)明的肽可以制備為包含兩種或多種本發(fā)明的Foxp3肽的組合，用于在體內(nèi)誘導(dǎo)CTL。這些Foxp3肽可以是雞尾酒混合物(cocktail)或者可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將它們彼此偶聯(lián)。例如，可將這些Foxp3肽表達(dá)成單個多肽序列。組合中的肽可以是相同的也可以是不同的。通過施用該發(fā)明的Foxp3肽，這些肽以高密度呈遞在抗原呈遞細(xì)胞的HLA抗原上，然后誘導(dǎo)出特異性地對被展示肽與HLA抗原之間形成的復(fù)合物起反應(yīng)的CTL?；蛘?，從用本發(fā)明肽刺激的受試者體內(nèi)取出樹突細(xì)胞，從而獲得在細(xì)胞表面上固定有本發(fā)明Foxp3肽的抗原呈遞細(xì)胞；通過將載有Foxp3肽的樹突細(xì)胞重新施用到受試者體內(nèi)來誘導(dǎo)CTL，結(jié)果，可以增加針對靶細(xì)胞的攻擊性。包含本發(fā)明的Foxp3肽作為活性成分的用于調(diào)節(jié)T-reg細(xì)胞的藥劑任選地可以包含佐劑，以便有效地建立細(xì)^(免疫；或者可以將它們與其他活性成分一起施用，并且它們可以配制成顆粒來施用。佐劑是指這樣的化合物，其在和具有免疫原性的蛋白質(zhì)一起(或順次)施用時，可以提高針對該蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答?？梢允褂玫淖魟┌ㄔ谖墨I(xiàn)中介紹的佐劑(ClinMicrobiolRev7:277-89,1994)。佐劑實例包括磷酸鋁、氫氧化鋁、明礬、霍亂毒素、沙門氏菌毒素等，但不僅限于此。而且，可以方便地使用脂質(zhì)體劑型，F(xiàn)oxp3肽與幾mcm直徑的球珠結(jié)合的顆粒劑型，和脂質(zhì)與肽結(jié)合的劑型。在一些實施方案中，本發(fā)明的藥劑包括可初始化(prime)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的成分。脂質(zhì)已被確認(rèn)為是能夠在體內(nèi)針對病毒抗原初始化CTL的作用劑。例如，可以將棕櫚酸殘基附接到賴氨酸殘基的s-和a-氨基，然后連接到本發(fā)明的肽上。脂質(zhì)化的肽隨后或是直接在膠束或顆粒中施用，或者摻入到脂質(zhì)體中施用，或者在佐劑中乳化后施用。作為CTL應(yīng)答的脂質(zhì)初始化的另一個實例，大腸桿菌脂蛋白，例如三棕櫚酰-S-甘油酰半胱氨酰絲氨酰-絲氨酸(P3CSS)，在共價附接到合適的肽后，可以用來初始化CTL(見例如Deresetal.，Nature342:561，1989)。給藥方法可以是口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等，并可以使用系統(tǒng)給藥或者在目標(biāo)部位的附近局部給藥。給藥的執(zhí)行可以是單次給藥或者通過多次給藥進(jìn)行增強(qiáng)(boost)。本發(fā)明肽的劑量可以根據(jù)所治療的疾病、患者的年齡、體重、給藥方法等進(jìn)行合適的調(diào)節(jié)，一般為0.001mg-1000mg，例如0.001mg-1000mg，例如0.1mg-10mg，并可以/人每幾天纟合藥1次到每幾個月給藥l次。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以恰當(dāng)?shù)剡x擇合適的劑量。(2)含有多核苷酸作為活性成分的藥劑本發(fā)明的藥劑還可以包含處于可表達(dá)形式的編碼本文公開的Foxp3肽的核酸。本文中，短語"處于可表達(dá)的形式，，是指多核芬酸在引入到細(xì)胞內(nèi)后，將被體內(nèi)表達(dá)成可誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的多肽。在一個實施方案中，目標(biāo)多核苷酸的核酸序列包括在靶細(xì)胞中表達(dá)該多核苷酸所必需的調(diào)節(jié)元件。多核苷酸可以被配備成可以穩(wěn)定地插入到靶細(xì)胞的基因組內(nèi)(關(guān)于同源重組盒式載體的介紹見例如ThomasKR&CapecchiMR,Cell51:503-12,1987)。見例如Wolffetal.，Science247:1465-8,1990;美國專利5,580,859;5,589,466;5,804,566;5,739,118;5,736,524;5,679,647;和WO98/04720?；贒NA的遞送技術(shù)的實例包括"棵DNA"、輔助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介導(dǎo)的)遞送、陽離子脂質(zhì)復(fù)合物、和顆粒介導(dǎo)的("基因槍")或壓力介導(dǎo)的遞送(見例如美國專利No.5,922,687)。本發(fā)明的肽還可以用病毒或細(xì)菌載體表達(dá)。表達(dá)載體的實例包括減毒的病毒宿主，例如痘苗(vaccinia)或禽痘(fowlpox)。這種方法涉及^f吏用例如牛痘病毒作為載體，表達(dá)編碼該肽的核苷酸序列。一旦引入到宿主內(nèi)，重組的痘苗病毒表達(dá)免疫原性肽，借此引發(fā)免疫應(yīng)答。免疫方案中有用的痘苗載體和方法在下列文獻(xiàn)中有介紹，例如美國專利4,722,848。另一種載體是BCG(卡介苗)。BCG載體在Stoveretal.，Nature351:456-60，1991中有介紹。很多其他的可用于治療性給藥或免疫的載體，例如腺病毒和腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)載體、脫毒的炭疽毒素載體等，是容易想到的。見例如Shataetal.，MolMedToday6:66-71,2000;Shedlocketal.JLeukocBiol68:793-806,2000;Hippetal"InVivo14:571-85,2000。將多核苷酸輸送到患者體內(nèi)可以是直接的，在此情況下患者被直接暴露于攜帶多核苷酸的載體，或者是間接的，在此情況下首先在體外用目的多核苷酸對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后將細(xì)胞移植到患者體內(nèi)。這兩種方法被分別稱作體內(nèi)或回體基因治療。關(guān)于基因治療方法的一般綜述，見Goldspieletal.，ClinicalPharmacy12:23488-505,1993;WuandWu，Biotherapy3:87-95，1991;Tolstoshev，AnnRevPharmacolToxicol33:573-96，1993;Mulligan,Science260:926-32，1993;Morgan&Anderson,AnnRevBiochem62:191-217,1993;TrendsinBiotechnology11(5):155-215，1993?？梢允褂玫脑谥亟MDNA技術(shù)中普遍知道的方法在下面文獻(xiàn)中有介紹Ausubel等編輯的《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，JohnWiley&Sons,NY,1993;和Krieger《GeneTransferandExpression,ALaboratoryManual》，StocktonPress,NY,1990。給藥方法可以是口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等，還可以使用系統(tǒng)給藥或?qū)δ繕?biāo)部位附近局部給藥。給藥可以通過單次給藥來進(jìn)行，或者通過多次給藥來加強(qiáng)。至于在合適載體內(nèi)或者用編碼本發(fā)明肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)的多核苷酸的劑量，可以根據(jù)持治療的疾病、患者的年齡、體重、給藥方法等進(jìn)行合適的調(diào)節(jié)，一般為0.001mg-1000mg，例如0.001mg-1000mg，例如0.1mg-10mg,并可以從每幾天給藥1次到每幾個月給藥1次。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以恰當(dāng)?shù)剡x擇合適的劑量。(3)外來體或者，本發(fā)明提供稱作外來體的細(xì)胞內(nèi)嚢泡，其在表面上呈遞在本發(fā)明肽與HLA抗原之間形成的復(fù)合物。外來體的制備可以通過，例如，使用在已公開的國際公告日文翻譯特表平11-510507和特表2000-512161中詳細(xì)描述的方法，并可以用從作為治療和/或預(yù)防的對象的受試者獲得的抗原呈遞細(xì)胞加以制備。與本發(fā)明的肽相似，本發(fā)明的外來體可以作為疫苗進(jìn)行預(yù)防注射。所用的HLA抗原類型必須與需要治療和/或預(yù)防的受試者的HLA抗原類型相匹配。例如，對于日本人，HLA-A24，特別是HLA-A2402,通常是合適的。關(guān)于HLA抗原，使用在日本人和白人中高表達(dá)的A-24或A-02型有利于獲得有效的結(jié)果。且使用包括A-2402和A-0201在內(nèi)的亞型是有用的。通常，在臨床上，預(yù)先對需要治療的患者的HLA抗原類型進(jìn)行檢查，這樣可以合適地選擇對該抗原具有高水平結(jié)合親和性，或具有通過抗原呈遞誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)的能力的肽。而且，為了獲得顯示高結(jié)合親和性和CTL誘導(dǎo)能力的肽，可以在天然存在的Foxp3部分肽的氨基酸序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行1個、2個或數(shù)個氨基酸的替換或添加。(4)抗原呈遞細(xì)胞本發(fā)明還提供抗原呈遞細(xì)胞(APC)，該細(xì)胞在其表面上呈遞在HLA抗原與本發(fā)明肽之間形成的復(fù)合物。通過與本發(fā)明的肽或編碼本發(fā)明的肽的核苷酸接觸獲得的APC可以從治療和/或預(yù)防的目標(biāo)受試者制備，而且可以單獨或與其他藥物(包括本發(fā)明的肽、外來體或細(xì)胞毒T細(xì)胞)組合而作為疫苗施用。APC不僅限于任何類型的細(xì)胞，包括樹突細(xì)胞(DC)、朗格漢斯(Langerhas)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、和激活的T細(xì)胞，所有這些都已知可以在細(xì)胞表面上呈遞蛋白質(zhì)抗原，從而被淋巴細(xì)胞識別。因為DC是APC中具有最強(qiáng)CTL誘導(dǎo)作用的代表性APC，所以DC作為本發(fā)明的APC特別有用。例如，APC可以通過從外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)樹突細(xì)胞，然后使它們與本發(fā)明的肽在體外、回體或在體內(nèi)進(jìn)行接觸(刺激)來獲得。當(dāng)將本發(fā)明的肽施用于受試者時，在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)出具有固定在其上面的本發(fā)明的肽的APC。"誘導(dǎo)APC"包括使細(xì)胞與本發(fā)明的肽或者編碼本發(fā)明肽的核苦酸接觸(刺激)，從而在該細(xì)胞表面上呈遞在HLA抗原和本發(fā)明的肽之間形成的復(fù)合物?；蛘?，在將本發(fā)明肽固定在APC之后，APC可以作為疫苗施用給受試者。例如，回體施用可以包括如下步驟a:從受試者收集APC;和b:使步驟a的APC與肽接觸。通過步驟b獲得的APC可以作為疫苗施用給受試者。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，APC具有高水平的CTL誘導(dǎo)能力。這些具有高水平細(xì)胞毒T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的APC可以通過包括在體外將包含編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸的基因轉(zhuǎn)移到APC的步驟的方法來制備。所導(dǎo)入的基因可以是DNA或RNA的形式。關(guān)于導(dǎo)入方法，沒有特殊限制，本領(lǐng)域常用的各種方法，包括脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、電穿孔和磷酸4丐方法，都可使用。更具體地，可以按照下列文獻(xiàn)中的描述來進(jìn)行CancerRes56:5672-7,1996;JImmunol161:5607-13,1998;JExpMed184:465-72,1996;已公開的國際7^布日文翻譯特表2000-509281。通過將基因轉(zhuǎn)移到APC內(nèi)，基因在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯等，然后所得的蛋白質(zhì)^皮MHCI類分子或II類分子加工，并通過呈遞途徑呈遞部分肽。(5)細(xì)胞毒T細(xì)胞就針對任一種本發(fā)明的Foxp3肽被誘導(dǎo)的細(xì)胞毒T細(xì)胞而言，認(rèn)為它們可以在體內(nèi)強(qiáng)化耙向T-reg細(xì)胞的免疫系統(tǒng)，因此可以與肽類似地用作疫苗。因此，本發(fā)明提供被任何本發(fā)明的肽誘導(dǎo)的、分離的細(xì)胞毒T細(xì)胞。這些細(xì)胞毒T細(xì)胞可以通過(l)向受試者施用本發(fā)明的肽，或者(2)在體外使源自受試者的APC和CD8陽性細(xì)胞，或者外周血單核白細(xì)胞與本發(fā)明的肽接觸(刺激)，來獲得。對于被呈遞本發(fā)明肽的APC的刺激所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒T細(xì)胞，其可以來自治療和/或預(yù)防的目標(biāo)受試者，并可以獨自或者與其他包括本發(fā)明肽的藥物或用于調(diào)節(jié)效果的外來體組合施用。所獲得的細(xì)胞毒T細(xì)胞特異地作用于呈遞本發(fā)明肽(例如與用于誘導(dǎo)肽的相同的肽)的靶細(xì)胞。靶細(xì)胞可以是內(nèi)源表達(dá)Foxp3的細(xì)胞，或者是被Foxp3基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，此外，由于這些肽的剌激而在細(xì)胞表面上呈遞本發(fā)明肽的細(xì)胞，也可以成為攻擊的靶標(biāo)。(6)TCR本發(fā)明還提供了一種包括編碼能夠形成T細(xì)胞受體(TCR)的亞基的多肽的核酸的組合物，并提供了其使用方法。TCR亞基具有形成TCR的能力，TCR為T細(xì)胞提供針對呈遞本發(fā)明肽的細(xì)胞的特異性。通過使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，可以鑒定作為用本發(fā)明的一種或多種肽誘導(dǎo)的CTL的TCR亞基的a-和卩-鏈的核酸(W02007/032255和Morganetal.,JImmunol,171,3288(2003))。衍生的TCR優(yōu)先以高親和性結(jié)合展示Foxp3肽的耙細(xì)胞，并任選地在體內(nèi)和體外介導(dǎo)針對呈遞Foxp3肽的靶細(xì)胞的高效殺傷?？梢詫⒕幋aTCR亞基的核酸摻入到合適的載體例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體內(nèi)。這些載體是本領(lǐng)域眾所周知的。核酸或包含它們的載體可以被有用地轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞內(nèi)，該T細(xì)胞優(yōu)選地來自患者。有利地，本發(fā)明提供了即時可用的(off-the-shelf)組合物，其允許快速地修飾患者自身的T細(xì)胞(或其他哺乳動物的T細(xì)胞)，從而快速而容易地產(chǎn)生具有優(yōu)異T-reg細(xì)胞殺傷性質(zhì)的修飾T細(xì)胞。另外，本發(fā)明提供通過用編碼與本發(fā)明Foxp3肽結(jié)合的TCR亞基多肽的核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)化而制備的CTL。經(jīng)轉(zhuǎn)化的CTL能夠在體內(nèi)歸巢于(fomingto)T-reg細(xì)胞，并用眾所周知的體外培養(yǎng)方法進(jìn)行擴(kuò)增(例如Kawakamietal.,JImmunol.,142，3452-3461(1989))?？梢允褂帽景l(fā)明的T細(xì)月包形成免疫組合物，用于治療或預(yù)防需要治療或保護(hù)的患者的癌癥(W02006/031221)。VI.使用Foxp3肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的Foxp3肽和編碼Foxp3肽的多核苷酸可用于誘導(dǎo)APC和CTL。Foxp3肽和多核苷酸可以和任何其他化合物組合使用，只要該化合物不抑制其CTL誘導(dǎo)能力即可。因此，任何前述的本發(fā)明的藥劑均可用于下文提到的本發(fā)明的方法。(1)誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞(APC)的方法因此本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的肽或編碼這些肽的多核苷酸誘導(dǎo)APC的方法。APC的誘導(dǎo)可以如上文條目"V-(4)抗原呈遞細(xì)胞"中所述進(jìn)行。本發(fā)明還提供了用于誘導(dǎo)具有高水平的細(xì)胞毒T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的APC的方法，該誘導(dǎo)在上文條目"V-(4)抗原呈遞細(xì)胞"中有討論?；蛘撸鶕?jù)本發(fā)明，選自包含SEQIDNO:3-5,7-9，12，15-19,22，24,27-30，37，67或74的氨基酸序列的肽中的Foxp3肽或編碼這些Foxp3肽的多核苷酸用于制造包含抗原呈遞細(xì)胞的藥物組合物的用途。進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了選自包含SEQIDNO:3-5,7-9,12,15-19,22,24,27-30,37，67或74的氨基酸序列的肽中的Foxp3肽或編碼這些Foxp3肽的多核苷酸，用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞。(0096)(2)誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞的方法而且，本發(fā)明還4是供了使用本發(fā)明的Foxp3肽或編碼這些Foxp3肽的多核苷酸誘導(dǎo)CTL的方法。當(dāng)將本發(fā)明的Foxp3肽施用于受試者時，在受試者身體內(nèi)誘導(dǎo)CTL,靶向T-reg細(xì)胞的免疫系統(tǒng)的強(qiáng)度被提高。或者，它們可以用于回體治療方法，其中將來自受試者的APC和CD8陽性細(xì)胞或者外周血單核白細(xì)胞在體外與本發(fā)明的肽接觸(刺激)，誘導(dǎo)CTL之后，將細(xì)胞返回給受試者。例如，該方法可以包括如下步驟a:從受試者收集APC，b:使步驟a的APC與肽接觸，c:將步驟b的APC與CD8+T細(xì)胞混合，并共培養(yǎng)以誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞，和d:從步驟c的共培養(yǎng)物中收集CD8+T細(xì)胞。通過步驟d獲得的具有細(xì)胞毒活性的CD8+T細(xì)胞可以作為疫苗施用于受試者。在上面步驟c中與CD8+T細(xì)胞混合的APC還可以根據(jù)在上文條目"V-(4)抗原呈遞細(xì)胞"中詳細(xì)說明的方法加以制備，即通過將編碼本發(fā)明肽的基因轉(zhuǎn)移到APC中；但并不僅限于此，任何能夠有效地將本發(fā)明的肽呈遞給T細(xì)胞的APC或外來體均可用于本方法?；蛘?，根據(jù)本發(fā)明，從包含SEQIDNO:3-5,7-9,12,15-19,22,24，27-30，37，67或74的氨基酸序列的肽中選擇的Foxp3肽或編碼這些Foxp3肽的多核苷酸用于制造包含CTL的藥物組合物的用途。進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了從包含SEQIDNO:3-5,7-9,12，15-19，22,24,27-30，37,67或74的氨基酸序列的肽中選擇的Foxp3肽或編碼這些Foxp3肽的多核苷酸，用于誘導(dǎo)CTL。(3)調(diào)節(jié)免疫抑制如上面討論的，本發(fā)明的肽、多核苷酸、外來體、APC和CTL可以用作疫苗來調(diào)節(jié)(即抑制)T-reg細(xì)胞。因為T-reg被認(rèn)為是抑制各種類型的免疫應(yīng)答，特別是CTL細(xì)胞毒活性的主要參與者之一，所以本發(fā)明肽、多核苷酸、外來體、APC和CTLs的能力提示它們還可以用于對抗免疫抑制，特別是對抗CTL細(xì)胞毒活性的免疫抑制。因此，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)T-reg細(xì)胞的方法，以及調(diào)節(jié)(即對抗)免疫抑制的方法，所述方法包括向需要的受試者施用本發(fā)明的肽、多核苷酸、外來體、APC和CTL的步驟。而且，本發(fā)明還提供了從包含SEQIDNO:3-5，7-9,12，15-19，22，24，27-30,37,67或74的氨基酸序列的肽中選擇的Foxp3肽或編碼這些Foxp3肽的多核苷酸在制造用于調(diào)節(jié)免疫抑制的免疫原性組合物方面的用途?；蛘?，本發(fā)明還涉及從包含SEQIDNO:3-5，7-9,12，15-19,22,24，27-30,37，67或74的氨基酸序列的肽中選擇的Foxp3肽或編碼這些Foxp3肽的多核苷酸，用于調(diào)節(jié)免疫抑制。這里，"調(diào)節(jié)免疫抑制"意味著本發(fā)明的肽、多核苷酸、外來體、APC和CTL的施用在體內(nèi)造成任何類型的變化。在一些實施方案中，由本發(fā)明的肽、多核苷酸、外來體、APC和CTL造成的變化是免疫抑制狀態(tài)水平的降低(免疫抑制的抑制或?qū)?，也就是說，抗免疫抑制(anti-immunosuppression)的誘導(dǎo)。因此，本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)抗免疫抑制的方法，所述方法包括向需要的受試者施用本發(fā)明的肽、多核苷酸、外來體、APC或CTL的步驟。一般地，抗免疫抑制包括的免疫應(yīng)答如下-誘導(dǎo)針對表達(dá)Foxp3的T-regs的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，-誘導(dǎo)識別表達(dá)Foxp3的T-regs的抗體，和-誘導(dǎo)抗T-regs細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此，如果某種蛋白質(zhì)在接種到動物體內(nèi)時可誘導(dǎo)這些應(yīng)答的任何一種，則判定該蛋白質(zhì)具有誘導(dǎo)抗免疫抑制的效應(yīng)。受蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的抗免疫抑制可以通過觀察宿主免疫系統(tǒng)針對該蛋白質(zhì)的體內(nèi)或體外應(yīng)答來進(jìn)行檢測。例如，用于檢測細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)(即活化)的方法是眾所周知的。具體地，已知進(jìn)入活體內(nèi)的外來物質(zhì)在抗原呈遞細(xì)胞(APC)的作用下被呈遞給T細(xì)胞和B細(xì)胞。以抗原特異方式應(yīng)答被APC所呈遞的抗原的T細(xì)胞在抗原的刺激下分化成細(xì)胞毒T細(xì)胞(或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞；CTL)，然后增殖(這稱作T細(xì)胞的活化)。因此，特定肽的CTL誘導(dǎo)可以這樣來加以評估通過APC將該肽呈遞給T細(xì)胞，并檢測CTL的誘導(dǎo)(即，增殖、IFN-gamma產(chǎn)生和細(xì)胞毒活性)。而且，APC具有活化CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨p藍(lán)細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞和NK細(xì)胞的作用。因為CD4+T細(xì)胞對于抗腫瘤免疫也是重要的，可以用這些細(xì)胞的活化效應(yīng)作為指標(biāo)來評估肽的抗腫瘤免疫誘導(dǎo)作用。使用樹突細(xì)胞(DC)作為APC來評估誘導(dǎo)CTL的作用的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。根據(jù)本方法，最初使測試肽與DC接觸，然后使該DC與T細(xì)胞接觸。在與DC接觸后，若檢測到具有針對表達(dá)(即在HLA分子上呈遞)目標(biāo)肽的細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的T細(xì)胞，則顯示該測試肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞的活性。CTL針對T-regs的活性可以用例如510"-標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞的裂解作為指標(biāo)進(jìn)行檢測?；蛘撸褂?&胸苷攝取活性或LDH(乳糖脫氫酶)釋放作為指標(biāo)來評估T-regs破壞程度的方法也是眾所周知的，并可以在本發(fā)明中使用。除了DC之外，還可以使用外周血單個核細(xì)胞(PBMC)作為APC。有報道稱通過在GM-CSF和IL-4的存在下培養(yǎng)PBMC可提高CTL的誘導(dǎo)。類似地，已證明通過在鑰孔蟲威血藍(lán)蛋白(KLH)和IL-7的存在下培養(yǎng)PBMC可以誘導(dǎo)CTL。通過這些方法被確認(rèn)具有CTL誘導(dǎo)活性的測試肽，是具有DC活化作用和隨后的CTL誘導(dǎo)活性的肽。因此，可誘導(dǎo)針對腫瘤細(xì)胞的CTL的Foxp3肽可以用作針對T-regs的疫苗。而且，通過與Foxp3肽接觸而獲得了誘導(dǎo)針對T-regs的CTL的能力的APC也可用作針對T-regs的疫苗。而且，藉由APC呈遞肽抗原而獲得了細(xì)胞毒性的CTL也可用作針對T-regs的疫苗。這些利用由APC和CTL介導(dǎo)的免疫來調(diào)節(jié)T-regs的方法#:稱作細(xì)胞免疫治療，并且包含在本發(fā)明之內(nèi)。一般地，當(dāng)使用多肽進(jìn)行細(xì)胞免疫治療時，已知可以通過組合多種具有不同結(jié)構(gòu)的肽并使它們與DC接觸，可提高CTL誘導(dǎo)的功效。因此，在用蛋白質(zhì)片段刺激DC時，使用多種類型的片段的混合物是有利的?；蛘?，肽誘導(dǎo)的抗免疫抑制可以通過觀察針對T-regs的抗體產(chǎn)生的誘-導(dǎo)來確認(rèn)。例如，當(dāng)在用某種肽免疫過的個體(例如人患者、實驗動物)體內(nèi)誘導(dǎo)出針對該肽的抗體時，并且當(dāng)T-reg細(xì)胞被那些抗體抑制時，就可以確定該肽具有誘導(dǎo)抗免疫抑制的能力?？姑庖咭种瓶梢酝ㄟ^施用本發(fā)明的疫苗加以誘導(dǎo)，并且該誘導(dǎo)使得免疫抑制的消除成為可能。這些效果可以是統(tǒng)計上顯著的。例如，在觀察中，在5%或者更低的顯著度水平，其中將針對T-regs的疫苗的調(diào)節(jié)作用與沒有施用疫苗的對照相比較。例如，可以使用Student'st-test，Mann-WhitneyU-test或ANOVA進(jìn)4于統(tǒng)計分析。當(dāng)使用APC或CTL作為本發(fā)明疫苗時，例如可以通過回體方法調(diào)節(jié)(即抑制)T-regs。更具體地，收集接受治療或預(yù)防的受試者的PBMC，使細(xì)胞以回體方式與多肽接觸，在APC或CTL誘導(dǎo)之后，可將細(xì)胞施用于受試者。APC的誘導(dǎo)還可以通過以回體方式將編碼多肽的載體引入到PBMC中來實現(xiàn)。在體外誘導(dǎo)的APC或CTL在施用前可以進(jìn)行克隆。通過克隆和培養(yǎng)具有高的靶細(xì)胞破壞活性的細(xì)胞，可以更有效地執(zhí)行細(xì)胞免疫治療。而且，免疫治療，還可以用于其他個體中相似類型疾病的的細(xì)胞免疫治療。除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)用語均具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員所普遍知曉的意思。盡管可以使用與在本文中介紹的相似或等價的方法和材料本發(fā)明的實施或測試，但在下文中介紹了合適的方法和材料。本文通過引用并入在本文提到的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容。在出現(xiàn)矛盾的情況下，以本專利申請包括定義為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實施例只是例證性的，不含限制意義。下面的實施例是提供用于示例說明本發(fā)明，以及幫助技術(shù)人員制作和使用本發(fā)明。這些實施例沒有任何限制本發(fā)明范圍的意思。實施例材泮+和方法細(xì)胞系A(chǔ)24LCL細(xì)胞(HLA-A24/24)、T2細(xì)胞(HLA-A02/02)、人B類淋巴母細(xì)胞、293T和COS7購自于ATCC。Foxp3衍生肽的候選物篩選用結(jié)合預(yù)測沖欠件"BIMAS"(http:〃bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken—parker—comboform)預(yù)測從Foxp3衍生的可以和HLA-A*2402和HLA-A*0201分子結(jié)合的九聚體和十聚體肽，算法如ParkerKC,etal.((1994)JImmunol.;152(l):163畫75,)和KuzushimaK,etal.((2001)Blood.;98(6):l872-8l.)所述。這些肽由Sigma(Sapporo，Japan)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)固相合成方法合成，并通過反相HPLC純化。肽的純度(>90%)和身份分別用分析HPLC和質(zhì)譜分析確定。肽以20mg/ml溶解在二甲基亞砜(DMSO)中，并保存于-80攝氏度。體外CTL誘導(dǎo)在HLA上的肽的CTL應(yīng)答。DC在體外產(chǎn)生，方法如別處所述(HoriguchiS.etal.CancerRes.59:2950-6)。具體地，用Ficoll-Plaque(Pharmacia);容液/人正常志愿者(HLA-A*2402和/或HLA-八*0201)分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，通過粘附到塑料組織培養(yǎng)盤(BectonDickinson)對其進(jìn)行分離，從而富集其中的單核細(xì)胞組分。將富集了單核細(xì)胞的群體在1000U/mlGM-CSF(R&D31System)和1000U/mlIL-4(R&DSystem)的存在下在含有2%熱滅活的自體同源血清(AS)的AIM-V培養(yǎng)基(Invitrogen)中培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后，在3mcg/mlbeta2-微球蛋白的存在下，在20攝氏度的AIM-V培養(yǎng)基中用20mcg/ml的合成肽沖擊4小時。然后用絲裂霉素C(MMC)(30mcg/ml30mins)使這些經(jīng)肽沖擊的DC失活，并以1:20的比例與自體同源CD8+T細(xì)胞混合，這些CD8+T細(xì)胞是通過用CD8陽性分離試劑盒(Dynal)進(jìn)行陽性篩選而獲得的。將這些培養(yǎng)物置于48孔培養(yǎng)板(Corning)中，每孔含有1.5x104個經(jīng)過肽沖擊的DC,3xl()5個CD8+T細(xì)胞和10ng/mlIL-7(R&DSystem),處于0.5mlAIM-V/2%AS中。3天后，向這些培養(yǎng)物添加IL-2(CHIRON)至終濃度為20IU/ml。在第7和14天，用經(jīng)過肽沖擊的自體同源DC進(jìn)一步對T細(xì)胞進(jìn)行再刺激。每一次DC的制備均采用與上述相同的程序。在第21天，經(jīng)過3輪肽刺激后，對針對經(jīng)過肽沖擊的A24LCL細(xì)胞或T2細(xì)胞的CTL活性進(jìn)行測試。CTL擴(kuò)增程序使用與下列文獻(xiàn)中報道的相似的方法Riddell,etal.(Walteretal.，NEnglJMed333(16):1038-44,1995;Riddelletal,,NatMed2(2):216-23,1996Feb)在培養(yǎng)基中擴(kuò)增CTL。將總共5x10"個CTL與兩種用MMC滅活的人B-類淋巴母細(xì)胞系一起在40ng/ml的抗-CD3單克隆抗體(Pharmingen)的存在下重新懸浮在25mlAIM-V/5%AS中。開始培養(yǎng)l天之后，向培養(yǎng)物中添加120IU/mlIL-2。在第5、8和11天，向培養(yǎng)物添加含有30IU/mlIL-2的新鮮AIM-V/5%AS。特異CTL活性為了檢驗特異的CTL活性，進(jìn)行了IFN-gammaELISPOT測定和IFN-gammaELISA。簡而言之，制備經(jīng)肽沖擊的A24-LCL、T2細(xì)胞(lx104/孑L)或內(nèi)源表達(dá)Foxp3和HLA分子的細(xì)胞，作為刺激細(xì)胞。使用在48孔板中培養(yǎng)的CTL系作為應(yīng)答細(xì)胞。IFN-gammaELISPOT測定和IFN-gammaELISA根據(jù)制造商的程序進(jìn)行。表位肽在BALB/c小鼠體內(nèi)的免疫原性為了初始化肽特異的CTL,使用100mcl疫苗混合物進(jìn)行免疫，該疫苗混合物含有每只小鼠50mclHLA-A24限制性肽和50mclIFA。疫苗在第0天皮下注射到小鼠的右脅進(jìn)行第一次免疫，在第7天注射到左脅進(jìn)行第二次免疫。在第14天，使用來自接種的小鼠的脾細(xì)胞作為應(yīng)答細(xì)胞，使用經(jīng)過或者未經(jīng)肽沖擊的RLmalel細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，進(jìn)行IFN-gammaEUSPOT觀'J定。體內(nèi)抗腫瘤歲文應(yīng)在第0天，將4T1細(xì)胞(lxl05/小鼠)皮下注射到BALB/c小鼠的右脅。在第3和10天，用hFoxp3-252(KLSAMQAHL:SEQIDNO:17)或mFoxp3-252(KLGAMQAHL:SEQIDNO:88)IFA-偶聯(lián)的肽進(jìn)行疫苗接種。Foxp3-9-252替換物對HLA分子的親和性的測定實施IFN-gammaELISA測定來檢查經(jīng)替換的肽與HLA-A2分子的親和性。用Foxp3-9-252-WT(KLSAMQAHL:SEQIDNO:17)肽誘導(dǎo)的CTL作為應(yīng)答細(xì)胞，通過在37攝氏度與Foxp3-9-252-WT、Foxp3-9-252-9V(KLSAMQAHV:SEQIDNO:95)和HIV-A02(SLYNTYATL)肽溫育2小時來制備T2細(xì)胞，作為刺激細(xì)胞。用寬濃度范圍(10-l()4mcg/ml)的每種肽對T2細(xì)胞進(jìn)行肽沖擊。結(jié)果來源于Foxp3的HLA-A24和HLA-A2結(jié)合肽的預(yù)測表1、2和3按照預(yù)測高結(jié)合親和性的得分次序顯示了Foxp3蛋白的HLA-A*2402結(jié)合肽或HLA-A*0201結(jié)合肽?？偣策x擇了60種具有潛在HLA-A24結(jié)合活性的肽和26種具有潛在HLA-A2結(jié)合活性的肽。33<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>開始位置表示自Foxp3N端起的氨基酸數(shù)目。結(jié)合得分源于在"材料和方法"中介紹的"BIMAS"。Foxp3衍生的HLA-A2402結(jié)合性10聚體肽<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>開始位置表示自Foxp3N端起的氨基酸數(shù)目。結(jié)合得分源于在"材料和方法"中介紹的"BIMAS"。[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>開始位置表示自Foxp3N端起的氨基酸數(shù)目。結(jié)合得分源于在"材料和方法"中介紹的"BIMAS"。使用預(yù)測的HLA-A2402限制性肽對T細(xì)胞進(jìn)行刺激根據(jù)上文"材料和方法"中描述的方法生成針對來源于Foxp3蛋白的肽的CTL。在IFN-gammaELISPOT測定中顯示可檢測的特異CTL活性的所得CTL顯示在圖1A和圖1B中。在圖1A中，如下孔編號中的細(xì)胞用Foxp3-A24-9-363刺激的孔編號2號和7號孔，用Foxp3-A24-9-366刺激的1號孔和6號孔，用Foxp3-A24-9-190刺激的5號孔，用Foxp3-A24-10-87刺激的7號孔，和用Foxp3-A24-10-60刺激的7號孔，與對照相比顯示了強(qiáng)烈的IFN-gamma產(chǎn)生。在圖IB中，如下孔編號中的細(xì)胞用Foxp3-A24-9-207刺激的4號孔，用Foxp3-A24-9-332刺激的6號孔，用Foxp3-A24-9-337刺激的6號孔，和用Foxp3-A24-10-114刺激的1號孔，與對照相比顯示了強(qiáng)烈的IFN-gamma產(chǎn)生。使用預(yù)測的HLA-A0201限制性肽對T細(xì)胞進(jìn)行刺激在進(jìn)行IFN-gammaELISPOT測定時顯示可檢測的特異CTL活性的所得CTL顯示于圖2A、圖2B和圖2C中。在圖2A中，如下孔編號中的細(xì)胞用Foxp3-A2-9-3卯刺激的2號孔，用Foxp3-A2-9-69刺激的2號孔，用Foxp3-A2-9-252刺激的6號孔，用Foxp3-A2-10-359刺激的4號孔，用Foxp3-A2-263刺激的7號孑L，和用Foxp3-A2-10-94刺激的2號孔和5號孑L,與對照相比顯示了強(qiáng)烈的IFN-gamma產(chǎn)生。在圖2B中，如下孔編號中的細(xì)胞用Foxp3-A2-10-233刺激的所有孔，用Foxp3-A2-10-152刺激的6號和7號孔，用Foxp3-A2-10-77刺激的5號孔，用Foxp3-A2-10-246和用Foxp3-A2-10-94刺激的1號孑L，與對照相比顯示了強(qiáng)烈的IFN-gamma產(chǎn)生。在圖2C中，如下孔編號中的細(xì)胞用Foxp3-A2-9-390刺激的1、2、4、5、7、9、11和12號孔，用Foxp3-A2-9-304刺激的5號和11號孔，用Foxp3-A2-9-68刺激的7號孔，和用Foxp3-A2-9-252刺激的12號孔，與對照相比顯示了強(qiáng)烈的IFN-gamma產(chǎn)生。從Foxp3特異性肽建立CTL系對陽性孔中的這些細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，并進(jìn)行IFN-gammaELISA測定。在圖3A、B、C中，用Foxp3-A02-9-390(SEQIDNO:15)刺激的CTL系，與對照相比顯示了強(qiáng)烈的IFN-gamma產(chǎn)生。在圖3D中，用Foxp3-A02-9-252(SEQIDNO:17)刺激的CTL系與對照相比顯示了強(qiáng)烈的IFN-gamma產(chǎn)生。在圖3E中，用Foxp3-A24-10-60(SEQIDNO:75)刺激的CTL系，與對照相比顯示了強(qiáng)烈的IFN-gamma產(chǎn)生。在圖3F中，用Foxp3-A02-10-94(SEQIDNO:27)刺激的CTL系，與對照相比顯示了強(qiáng)烈的IFN-gamma產(chǎn)生。在圖3G中，用Foxp3-A24-10-87(SEQIDNO:68)刺激的CTL系，與對照相比顯示了強(qiáng)烈的IFN-gamma產(chǎn)生。針對內(nèi)源表達(dá)Foxp3和HLA-A*2402或HLA-A*0201的靶細(xì)胞的特異CTL活性對于所建立的從這些肽產(chǎn)生的CTL克隆，檢查其識別內(nèi)源表達(dá)Foxp3和HLA-A*24或02的把細(xì)胞的能力。使用對Foxp3-A02-9-390(SEQIDNO:15)和Foxp3-A02-9-252(SEQIDNO:17)生成的CTL系作為效應(yīng)細(xì)胞，對針對同時轉(zhuǎn)染了全長Foxp3基因和HLA-A*24或02分子的293T(它是內(nèi)源表達(dá)Foxp3和HLA-A*24或02的靶細(xì)胞的特異性模型)的特異性CTL活性進(jìn)行了4企測。在圖4A和圖4B中，用Foxp3-A02-9-390(SEQIDNO:15)和Foxp3-A02-9-252(SEQIDNO:17)生成的CTL系針對同時被Foxp3和HLA-A02轉(zhuǎn)染的293T顯示出高度特異的CTL活性。另一方面，其對于對照則沒有顯示出顯著的特異性CTL活性。這清楚地表明，F(xiàn)oxp3-A02-9-390和Foxp3-A02-9-252與HLA-A02和/或24分子一起被自然地表達(dá)到耙細(xì)胞的表面，并識別CTL。而且，這些肽是表位肽，可用作靶定表達(dá)Foxp3的T-regs的疫苗。Foxp3-A24-9-252肽在BALB/c小鼠中的免疫原性為了評估Foxp3-9-252肽對BALB/c小鼠的免疫原性，分別用人Foxp3-9畫252肽(Foxp3畫252一h;KLSAMQAHL)和小鼠Foxp3-9畫252肽(Foxp3-252—m;KLGAMQAHL)(SEQIDNO:89)進(jìn)行免疫。在第二次注射肽之后，通過IFN-gammaELISPOT測定來確定肽特異的CTL活性(圖5)。從收集自用肽接種的小鼠的脾細(xì)胞，在與用相應(yīng)肽沖擊過的剌激細(xì)胞共培養(yǎng)的孔中4全測到了強(qiáng)烈的IFN-gamma產(chǎn)生，而在對照孔中則沒有顯示IFN-gamma產(chǎn)生。在圖6A中，在5只小鼠中的3只(M3，M4和M5)中檢測到Foxp3-252—h肽特異性的CTL應(yīng)答，而在僅用IFA接種的對照小鼠(N1N3)中則沒有。在圖6B中，在5只小鼠中的1只(M1)中檢測到Foxp3-252—m肽特異的CTL應(yīng)答，而在僅用IFA接種的對照小鼠(N1N3)中則沒有。這些數(shù)據(jù)表明，用Foxp3-252—h或Foxp3-252—m肽的每一種進(jìn)行肽接種均可在體內(nèi)誘導(dǎo)出針對經(jīng)肽沖擊靶細(xì)胞的CTL。38Foxp3表位肽疫苗接種的抗腫瘤效應(yīng)為了檢驗靶向Foxp3的肽接種的抗腫瘤效應(yīng)，嘗試了使用4T1腫瘤細(xì)胞和BALB/c小鼠的體內(nèi)治療設(shè)定。在第0天，將4T1乳腺癌細(xì)胞皮下注射到BALB/c小鼠中，在腫瘤攻擊后的第3和第10天，對這些小鼠進(jìn)行接種。結(jié)果，與對照小鼠相比，用Foxp3-252—h或Foxp3-252—m肽接種的BALB/c小鼠體內(nèi)的腫瘤生長顯著降低(圖6)?？紤]到統(tǒng)計分析，其顯示了用Foxp3表位肽進(jìn)行接種的小鼠體內(nèi)的肺瘤生長抑制的顯著性差異。Foxp3表位肽的氨基酸替換在前述結(jié)果中，F(xiàn)oxp3-9-252肽(SEQIDNO17)被鑒定為同時被HLA-A*2402和HLA-A*0201限制的表位肽。為了提高Foxp3-9-252肽的免疫原性，選擇單個或數(shù)個氨基酸替換，以獲得比天然Foxp3-9-252肽Foxp3-9-252-WT(KLSAMQAHL)(SEQIDNO17)更高的對HLA-A*2402和HLA-A*0201分子的結(jié)合親和性；Foxp3-9-252(SEQIDNO17)中氨基酸替換的結(jié)合得分用BIMAS軟件產(chǎn)生。表4顯示了Foxp3-9-252來源的替換肽的氨基酸序列及其對HLA-A*2402和HLA-A*0201分子的結(jié)合得分。肽的結(jié)合得分用BIMAS軟件產(chǎn)生。合成了6或9種替換物，總共15種肽，其預(yù)測具有比野生型更高的對HLA-A24或HLA-A2分子的結(jié)合親和性(表4)。Foxp3-9-252(SEQIDNO17)中^J^酸替換對HLA-A*2402或0201分子的結(jié)合得分<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>然后，本發(fā)明人檢查了用這些替換物進(jìn)行過肽沖擊的刺激細(xì)胞是否被用Foxp3-9-252-WT肽產(chǎn)生的CTL所識別。結(jié)果，被Foxp3-9-252-WT肽誘導(dǎo)的CTL產(chǎn)生了針對Foxp3-9-252-9V(KLSAMQAHV)(SEQIDNO95)沖擊過T2細(xì)胞的IFN-gamma,同樣也產(chǎn)生了針對經(jīng)Foxp3-9-252-WT肽沖擊的T2細(xì)胞的IFN-gamma(圖7A)。因為從針對沒有用任何肽沖擊過的刺激細(xì)胞的CTL中沒有檢測到IFN-gamma的產(chǎn)生，所以表明，用Foxp3-9-252-WT肽產(chǎn)生的CTL不但可識別HLA-A2分子上呈遞的Foxp3-9-252-WT，還可識別HLA-A2分子上呈遞的Foxp3-9-252-9V肽。而且，為了評估Foxp3-9-252-9V肽是否具有比Foxp3-9-252-WT肽更高的對HLA-A2分子的親和性，用以寬泛濃度范圍(10-l(rVncg/ml)的這些肽沖擊過的刺激細(xì)胞確定CTL活性。結(jié)果，與分別用Foxp3-9-252-WT或Foxp3-9-252-9V肽沖擊過的刺激細(xì)胞共培養(yǎng)的CTL產(chǎn)生了相似的IFN-gamma(圖7B)。從這些數(shù)據(jù)顯示，呈遞在HLA-A*0201分子上的Foxp3-9-252-9V肽可以被用Foxp3-9-252-WT肽建立的CTL識別。另一方面，本發(fā)明人嘗試使用包括Foxp3-9-252-9V肽的所有HLA-A*0201限制性替換物來誘導(dǎo)CTL。結(jié)果，用Foxp3-9-252-3M(KLMAMQAHL)(SEQIDNO97)，F(xiàn)oxp3-9-252畫3L(KLLAMQAHL)(SEQIDNO98)或Foxp3-9_252-9V肽刺激產(chǎn)生了CTL(圖7C)。如下孔編號中的細(xì)胞用Foxp3-9-252-3M刺激的3號和7號孑L,用Foxp3-9-252-3L剌激的7號孑L,和用Foxp3-9-252-9V刺激的8號孑L，與對照相比顯示了肽依賴的IFN-gamma產(chǎn)生。通過體外擴(kuò)增建立了受Foxp3-9-252-9V剌激誘導(dǎo)的CTL系之后，使用經(jīng)Foxp3-9-252-WT或Foxp3-9-252-9V沖擊過的刺激細(xì)胞確定了CTL活性。結(jié)果，通過Foxp3-9-252-9V刺激而誘導(dǎo)的CTL識別了用Foxp3-9-252-WT沖擊過的刺激細(xì)胞，與Foxp3-9-252-9V沖擊的相同的效果相同(圖7D)。這些結(jié)果強(qiáng)烈顯示，F(xiàn)oxp3-9-252-9V肽可以和Foxp3-9-252-WT肽同樣地誘導(dǎo)Foxp3特異性CTL。抗原肽的同源性分析用下列肽的刺激CTL:FOXp3-A24-9-363(SEQIDNO3),FOXp3-A24國9-366(SEQIDNO7),FOXp3-A24-9-190(SEQIDNO9),FOXp3-A24-9-207(SEQIDNO4),FOXp3-A24畫9畫332(SEQIDNO5),FOXp3_A24-9-337(SEQIDNO8),FOXp3-A24-10-114(SEQIDNO12)FOXp3-A2-9-390(SEQIDNO15)，F(xiàn)OXp3-A2-9-69(SEQIDNO16)，F(xiàn)OXp3-A2-9-252(SEQIDNO17),FOXp3-A2-10-359(SEQIDNO22),FOXp3-A2-10-263(SEQIDNO24),FOXp3-A2-10-94(SEQIDNO27)，F(xiàn)OXp3-A2-10-233(SEQIDNO28),FOXp3-A2-10-152(SEQIDNO29)，F(xiàn)OXp3-A2-10-77(SEQIDNO30)，F(xiàn)OXp3-A2-10-246(SEQIDNO37),FOXp3-A2-9-68(SEQIDNO18)，F(xiàn)OXp3-A2-9-304(SEQIDNO19)Foxp3-A24-10-87(SEQIDNO67)和Foxp3-A24-10-60(SEQIDN074)顯示了顯著而特異的CTL活性。這可能意味著，如下的序列FOXp3-A24-9-363(SEQIDNO3)，F(xiàn)OXp3-A24-9-366(SEQIDNO7),FOXp3-A24-9-190(SEQIDNO9),FOXp3-A24-9-207(SEQIDNO4),FOXp3-A24-9-332(SEQIDNO5)，F(xiàn)OXp3-A24畫9-337(SEQIDNO8),FOXp3-A24-10畫114(SEQIDNO12)，F(xiàn)OXp3-A2-9-390(SEQIDNO15),FOXp3-A2-9-69(SEQIDNO16)，F(xiàn)OXp3-A2畫9-252(SEQIDNO17),FOXp3-A2-10-359(SEQIDNO22),FOXp3-A2畫10-263(SEQIDNO24),FOXp3-A2-10-94(SEQIDNO27),FOXp3-A2-l0-233(SEQIDNO28)，F(xiàn)OXp3-A2-10-152(SEQIDNO29),FOXp3-A2-10-77(SEQIDNO30),FOXp3-A2-10-246(SEQIDNO37)，F(xiàn)OXp3-A2-9-68(SEQIDNO18)，F(xiàn)OXp3-A2-9-304(SEQIDNO19)Foxp3-A24-10-87(SEQIDNO67)和Foxp3-A24-10-60(SEQIDNO74)與其他已知可以敏化人免疫系統(tǒng)的分子的衍生肽同源。為了排除這一可能性，以這些肽序列作為檢索子(queries)42使用BLAST算法(http:〃ww.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示沒有具有顯著同源性的序列。這些結(jié)果表明，如下序列FOXp3畫A24-9-363(SEQIDNO3),FOXp3-A24-9-366(SEQIDNO7),FOXp3畫A24-9畫190(SEQIDNO9),FOXp3-A24-9-207(SEQIDNO4)，F(xiàn)OXp3-A24-9-332(SEQIDNO5),FOXp3-A24-9-337(SEQIDNO8),FOXp3-A24-10-114(SEQIDNO12),FOXp3-A2-9-390(SEQIDNO15)，F(xiàn)OXp3-A2-9-69(SEQIDNO16)，F(xiàn)OXp3-A2隱9畫252(SEQIDNO17),FOXp3畫A2-10畫359(SEQIDNO22),FOXp3-A2-10-263(SEQIDNO24),FOXp3-A2畫10-94(SEQIDNO27),FOXp3畫A2-10-233(SEQIDNO28),FOXp3-A2-10-152(SEQIDNO29),FOXp3-A2畫10陽77(SEQIDNO30),FOXp3-A2-10-246(SEQIDNO37)，F(xiàn)OXp3-A2-9-68(SEQIDNO18),FOXp3-A2-9-304(SEQIDNO19)Foxp3-A24-10-87(SEQIDNO67)和Foxp3-A24-10-60(SEQIDNO74)是獨特的，據(jù)我們所知，它們引起針對任何非相關(guān)分子的不希望的免疫應(yīng)答的可能性微乎其微。綜上所述，F(xiàn)oxp3是一種對于靶向T-reg細(xì)胞有用的抗原，使用這些表位肽的疫苗對于免疫治療可能是有用的。討論從圖6的數(shù)據(jù)，用每種hFoxp3-252和mFoxp3-252肽進(jìn)行接種可以在體內(nèi)誘導(dǎo)表位特異性的CTL。這表明這兩種Foxp3表位肽均可誘導(dǎo)針對表達(dá)Foxp3和相應(yīng)主要組織相容性復(fù)合物分子的靶細(xì)胞的CTL。換言之，我們認(rèn)為這些CTL可能能夠識別調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(T-regs)。為了評價這一假說，利用BALB/c小鼠檢查了用這些Foxp3表位肽進(jìn)行接種的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。在分別用hFoxp3-252和mFoxp3-252肽接種的小鼠體內(nèi)顯示出明顯的抗腫瘤效應(yīng)。這些結(jié)果強(qiáng)烈暗示，通過阻遏T-regs進(jìn)入局部腫瘤^:環(huán)境可以抑制腫瘤生長，甚至不需要用任何TAA表位肽進(jìn)行疫苗接種。本發(fā)明人認(rèn)為，當(dāng)體內(nèi)存在腫瘤時會誘導(dǎo)出針對肺瘤細(xì)胞的CTL，然而，來自腫瘤細(xì)胞的一些免疫抑制因子也會"i秀導(dǎo)T-reg,T-reg抑制抗腫瘤效應(yīng)細(xì)^^的功能。用Foxp3表位肽進(jìn)行接種可以通過殺死或抑制T-reg而消除免疫抑制狀肽，所以在沒有用TAA表位肽進(jìn)行接種或者用強(qiáng)佐劑對整個免疫系統(tǒng)進(jìn)行刺激的情況下，顯示出了抗腫瘤效應(yīng)。另夕卜，在圖5和圖6中，與mFoxp3-252肽(KLGAMQAHL)(SEQIDNO88)相比，hFoxp3-252肽(KLSAMQAHL)(SEQIDNO17)的接種可以誘導(dǎo)更高的CTL和抗腫瘤效應(yīng)。根據(jù)這些結(jié)果可以認(rèn)為，與mFoxp3-252肽的接種相比，hFoxp3-252肽的接種可能有效避免了免疫耐受。換言之，因為hFoxp3-252的氨基酸序列與mFoxp3-252在第3位不同，所以hFoxp3-252肽在體內(nèi)被看作"非自身抗原"，從而能有效地誘導(dǎo)針對T-reg的CTL。綜上所述，表明Foxp3可以作為癌癥免疫治療的新靶標(biāo)。而且，這些結(jié)果強(qiáng)烈支持這樣的結(jié)論，即使用Foxp3表位肽進(jìn)行接種可以抑制T-reg的功能，而且應(yīng)當(dāng)可用于多種類型癌細(xì)胞的癌癥免疫治療。權(quán)利要求1.一種肽，其由SEQIDNO3-5、7-9、12、15-19、22、24、27-30、37、67或74的氨基酸序列組成。2.—種具有細(xì)胞毒T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽，其中該肽包含選自下組的氨基酸序列(a)SEQIDNO:3-5、7隱9、12、17、67或74，和(b)SEQIDNO:3-5、7-9、12、17、67或74，其中替換或添加了1個、2個或數(shù)個氨基酸。3.權(quán)利要求2的肽，其中自N端起第二個氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸。4.權(quán)利要求2或3的肽，其中C端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸。5.—種具有細(xì)胞毒T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽，其中該肽包含選自下組的氨基酸序列(a)SEQIDNO:15-19、22、24、27-30或37，和(b)SEQIDNO:15-19、22、24、27-30或37,其中替換或添加了1個、2個或數(shù)個氨基酸。6.權(quán)利要求5的肽，其中自N端起第二個氨基酸是亮氨酸或曱硫氨酸。7.權(quán)利要求5或6的肽，其中C端氨基酸是纈氨酸或亮氨酸。8.權(quán)利要求2或5的肽，其中被替換的肽包含SEQIDNO:95、97或98的氨基酸序列。9.用于調(diào)節(jié)T-reg細(xì)胞的藥劑，其包含權(quán)利要求1-7中任一項的一種或多種肽，或編碼所述肽的多核苷酸。10.權(quán)利要求9的藥劑，其意圖用于抑制T-reg細(xì)胞的增殖。11.權(quán)利要求9的藥劑，其意圖施用于HLA抗原為HLA-A24的受試者。12.權(quán)利要求9的藥劑，其意圖施用于HLA抗原為HLA-A02的受試者。13.權(quán)利要求9的藥劑，其意圖用于抑制T-reg細(xì)胞的功能。14.權(quán)利要求9的藥劑，其意圖用于治療癌癥。15.權(quán)利要求14的藥劑，其是疫苗。16.權(quán)利要求15的藥劑，其除了包含權(quán)利要求2、5的肽或編碼該肽的多核苷酸之外，還包含具有誘導(dǎo)針對癌性細(xì)胞的細(xì)胞毒T細(xì)胞的能力的其它肽，或者編碼所述其它肽的其它多核苦酸。17.—種外來體，所述外來體在其表面上呈遞包含HLA抗原和權(quán)利要求2或5的肽的復(fù)合物。18.權(quán)利要求14的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A24。19.權(quán)利要求14的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A2402。20.權(quán)利要求14的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A02。21.權(quán)利要求14的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A0201。22.通過施用權(quán)利要求2、5的肽或編碼該肽的多核苷酸來誘導(dǎo)具有高的細(xì)胞毒T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細(xì)胞的方法。23.通過施用權(quán)利要求2、5的肽或編碼該肽的多核苷酸來誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)^^的方法。24.—種誘導(dǎo)權(quán)利要求19的具有高細(xì)胞毒T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細(xì)胞的方法，其中該方法包括向抗原呈遞細(xì)胞轉(zhuǎn)移包含編碼權(quán)利要求2或5的肽的多核苷酸的基因。25.—種分離的細(xì)胞毒T細(xì)胞，其是被權(quán)利要求2的肽誘導(dǎo)的。26.—種抗原呈遞細(xì)胞，其包含HLA抗原與權(quán)利要求2或5的肽之間形成的復(fù)合物。27.權(quán)利要求25的抗原呈遞細(xì)胞，其是通過權(quán)利要求21的方法誘導(dǎo)的。28.—種調(diào)節(jié)受試者體內(nèi)T-reg細(xì)胞的方法，包括向所述受試者施用疫苗，所述疫苗包含權(quán)利要求2的肽或該肽的免疫活性片段，或編碼該肽的多核苷酸。全文摘要本發(fā)明提供了Foxp3肽，其包含SEQIDNO3-5，7-9，12，15-19，22，24，27-30，37，67或74的氨基酸序列，并提供了如下的Foxp3肽，其包含上述的氨基酸序列并且其中替換或添加了1個、2個或數(shù)個氨基酸，并具有細(xì)胞毒T細(xì)胞誘導(dǎo)能力(inducibility)，本發(fā)明還提供了包含這些Foxp3肽的用于調(diào)控調(diào)節(jié)T細(xì)胞的藥物。本發(fā)明的Foxp3肽可以用作疫苗。文檔編號C07K7/06GK101641369SQ20078005197公開日2010年2月3日申請日期2007年12月26日優(yōu)先權(quán)日2007年1月3日發(fā)明者大澤龍司,角田卓也申請人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司