專利名稱：鯊魚蛋白降壓肽及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從鯊魚肉的酶解產(chǎn)物中分離純化出的具有新的氨基酸序列的降壓 肽及其制備方法與應(yīng)用，屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景由食物蛋白經(jīng)過部分酶解所得的短肽越來越引起食物學(xué)家的重視。這些短肽具有 各種活性，比如提高免疫力，提高營養(yǎng)吸收率，抗高血壓活性。具有這些活性的蛋 白已經(jīng)從食物蛋白酶解物中純化出來，這些肽在蛋白質(zhì)序列內(nèi)是沒有活性的，只有通 過酶解或食物加工從蛋白中釋放出來才具有活性。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)是一種能夠催化血管緊張素1轉(zhuǎn)化成血管緊張素2的羧 肽酶，能夠?qū)е卵獕荷?，因此抑制ACE活性，可以導(dǎo)致血液中的血管緊張素2的濃 度降低，從而導(dǎo)致血壓降低。雖然人工合成的ACE抑制劑具有明顯的降血壓效果，但 是副作用太大，因此現(xiàn)在必須找到更安全、新穎、高效的治療高血壓的藥物?，F(xiàn)在從 不同的蛋白中通過不同的酶進(jìn)行酶解，在其酶解物中發(fā)現(xiàn)了許多ACE抑制短肽，這些 蛋白資源包括牛奶蛋白、大豆蛋白、雞蛋蛋白、雞肉蛋白、海洋魚類蛋白、藻類等， 到現(xiàn)在為止已有兩百多種具有ACE抑制活性的酶解活性肽被報(bào)道，但是現(xiàn)在報(bào)道的 ACE抑制短肽主要來源于陸地蛋白的酶解物，來源于海洋蛋白酶解物的報(bào)道較少，因 此，今后，海洋生物蛋白酶解物將成為今后篩選新的ACE抑制肽的重要來源。鯊魚本身對外界致癌物質(zhì)和微生物、病毒等具有極強(qiáng)的免疫力，鯊魚抗癌防病的 機(jī)理一直尚未研究清楚。目前對鯊魚的研究和應(yīng)用只限于鯊魚魚肝油和鯊魚軟骨提取 物，但是鯊魚魚肝油和鯊魚軟骨僅僅只是鯊魚身體的一小部分，對除了鯊魚魚肝油和 鯊魚軟骨之外的大部分鯊魚材料的研究和應(yīng)用尚停留在初級階段。鯊魚蛋白用于酶解 分離降高血壓肽的好原料。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鯊魚蛋白降壓肽及其制備方法與應(yīng)用。一種鯊魚蛋白降壓肽，其特征在于，是如下短肽之一或組合Cys-Phe 肽1,Glu-Tyr 肽2，Phe-Glu 肽3。本發(fā)明所述的鯊魚蛋白降壓肽具有較高的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制活性， 為白色粉末狀，易溶于水，其中，Cys-Phe降壓肽的ICso值0.523 mg/ml對應(yīng)為 1.96pM， Glu-Tyr降壓肽的ICso值0.824 mg/ml對應(yīng)為2.68pM， Phe-Glu降壓肽的IC50 值0.426mg/ml對應(yīng)為1.45 uM。本發(fā)明上述鯊魚蛋白降壓肽的制備方法，包括酶解鯊魚蛋白制備酶解液、從酶解液中分離純化降壓肽和降壓肽的序列測定。具體步驟如下 (一)酶解鯊魚蛋白制備酶解液按鮮重稱取鯊魚肉45 50重量份原料，打漿，然后加入45 50重量份的蛋白酶 制劑，調(diào)pH值到6.8 7.3，溫度45 5(TC，攪拌酶解5.5小時(shí)，酶解完畢后，離 心，取上清液，即得酶解液。(二) 從酶解液中分離純化降壓肽用3000Da的超濾膜將酶解液超濾，將超濾小于3000Da的超濾液過Sephadex G-15 柱(1.6X80cm, medium Pharmacia),用蛋白核酸檢測儀，在214畫處進(jìn)行檢測，根據(jù) 從色譜柱分離得到的色譜峰分別收集，收集的洗脫液凍干稱重后，測定ACE抑制活 性，將抑制活性高的組分多次收集，然后進(jìn)一步用高壓液相色譜分離；PDA檢測器檢 測波長為220nm，然后根據(jù)所得的肽的譜圖將肽峰分別收集濃縮，測定ACE抑制活 性，得到具有高的ACE抑制活力的肽。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的高壓液相色譜柱為反相C18柱。(三) 降壓肽的序列測定將分離純化得到的具有高的ACE抑制活力的肽，用氨基酸自動(dòng)測序儀測定氨基酸 組成，再通過液質(zhì)連用儀(PE SC正X API 4000 LC/MS-MS systems, Applied Biosystems， USA),分析肽的分子量和肽段的分布，然后進(jìn)行肽的氨基酸序列分析。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的肽的氨基酸序列分析是將肽用6N的HC1在115°C全水解 22小時(shí)，通過氨基酸自動(dòng)測序儀進(jìn)行測定。優(yōu)選的，所述的(一)酶解鯊魚蛋白制備酶解液的步驟中的蛋白酶制劑通過如下方 法制得，所述組份的量均為重量份 (1)液體種子制備培養(yǎng)基餅粉2~3份、玉米粉2~3份、麩皮1~1.5份、Na2HP04 0.4 0.5份、 KH2PO4 0.03 0.04份、水100份，滅菌，冷卻，接種枯草芽孢桿菌SM98011 (5ac/腸. SwWfc SM98011)的茄子瓶菌種的菌懸液5 10份，通風(fēng)攪拌，培養(yǎng)15~18小時(shí)，作 為液體種子待用。、 (2)液體深層發(fā)酵制備蛋白酶制劑培養(yǎng)基豆餅粉3 3. 5份、玉米粉3. 5 5. 0份、麩皮2. 0 2. 5份、Na2HP04 0. 4 0. 5份、KH2P04 0. 03 0. 04份、水100份，滅菌，接種上述步驟(1)的液體種 子，接種量為培養(yǎng)基重量的5 7%，通風(fēng)攪拌，控溫，發(fā)酵37 40小時(shí)，得蛋白酶制 劑，酶活為4000U/ml。該步驟(2)的培養(yǎng)基中還可加入豆油0.3 0.35重量份作消泡 劑。所述的(二)從酶解液中分離純化降壓肽步驟中測定肽的ACE抑制活性方法可用傳 統(tǒng)方法如分光光度法或高壓液相色譜法，也可用毛細(xì)管電泳法。優(yōu)選的，毛細(xì)管電泳法 具體步驟如下將10 y 1含有ImM底物Hip-His-Leu和0. 8mU的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的系列 樣品反應(yīng)液分別和若干10u 1的0. 03 40mg/ml酶解液混合為若干組樣品。所述系列 樣品反應(yīng)液和酶解液都用100 mM的硼酸緩沖液(包含0.3M NaCl， pH 8.3)配制。反 應(yīng)液在37。C反應(yīng)30 min，然后用0. 1%三氟乙酸TFA (10yl)中止反應(yīng)。血管緊張 素轉(zhuǎn)化酶抑制反應(yīng)產(chǎn)物直接在毛細(xì)管電泳儀上進(jìn)行檢測。毛細(xì)管電泳儀為BeckmanCoulter P/ACE MDQ (Fullerton， CA)裝置，配備有PDA (photodiode array)檢測 器，數(shù)據(jù)采集、分析、系統(tǒng)控制用P/ACE MDQ軟件，該軟件來自Beckman Coulter (Fullerton, CA)。中止反應(yīng)后的混合物樣品直接用毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測，上樣壓力為 lpsi，時(shí)間為5秒，電泳電壓20kV，紫外吸收為228mn，電泳時(shí)間5分鐘，電泳緩沖 液為20mM的硼酸緩沖液(pH 9.18)。每測定一個(gè)樣品之后用緩沖液沖洗毛細(xì)管1分 鐘。底物和產(chǎn)物馬尿酸分別在2.5分鐘和3.5分鐘出峰，根據(jù)上述軟件計(jì)算馬尿酸的 峰面積。ACE抑制活性的計(jì)算(IC5。值的計(jì)算) 馬尿酸配制成不同濃度0. 2mM， 0. 4mM， 0. 6mM， 0. 8mM, 1. 0mM, 1. 2mM， 2mM, 4mM, 6mM， 通過毛細(xì)管電泳測定其峰面積與馬尿酸濃度的線性關(guān)系。 峰面積KXChip+N ACE活力(umol/min卜VXChip + t V:反應(yīng)體積，t:反應(yīng)時(shí)間，K:根據(jù)峰面積和馬尿酸濃度求出的曲線常數(shù)， Chip:馬尿酸濃度，N:馬尿酸濃度曲線與Y軸的交點(diǎn)。通過血管緊張素轉(zhuǎn)化酶作用，不含任何抑制肽，從底物Hip-His-Leu釋放出來的 馬尿酸HA的量被定義為100% ACE活力。抑制50%的ACE活力的海洋蛋白酶解產(chǎn)物 的量被定義為酶解產(chǎn)物的抑制活力。IC5。值的計(jì)算采用線性對數(shù)法，以Log (ACE活力 /(l-ACE活力))對Log (水解產(chǎn)物濃度mg/ml)作圖，所得直線與X軸的交點(diǎn)對應(yīng)的 值為M, 1()M為酶解產(chǎn)物抑制ACE活力的ICs。值。上述反應(yīng)試劑和實(shí)驗(yàn)操作，如未作特別說明的，均為本領(lǐng)域常規(guī)反應(yīng)試劑及實(shí)驗(yàn) 操作。本發(fā)明鯊魚蛋白降壓肽在制備降壓藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明鯊魚蛋白降壓肽具有較 高的ACE抑制活性，降血壓效果好。本發(fā)明所得的短肽產(chǎn)品干燥處理后為白色粉末， 易溶于水，可用于制備降壓藥物。本發(fā)明的優(yōu)良效果在于將陸地微生物酶工程技術(shù)應(yīng)用于鯊魚的深層次開發(fā)利用。 具體體現(xiàn)在7、用鯊魚作為酶解原料么從酶解液通過色譜方法分離純化具有降血壓 功能的肽義用ACE反應(yīng)來檢測各步產(chǎn)物的降壓活性么并對得到的具有新序列的具 有較高ACE抑制活力的肽，IC50值分別為1.96pM， 2.68pM和1.45pM。


圖1是實(shí)施例1步驟(3)經(jīng)過3000Da的膜超濾的鯊魚酶解液經(jīng)過Sephadex G-15柱分離的色譜圖。圖2是Sephadex G-15柱分離的D組分樣品在高壓液相的反相C18柱上分離得到 的色譜峰。圖3、圖4和圖5分別是C18柱上分離得到的色譜峰中的e、 h、 q號樣品的ICs。 值的線性對數(shù)圖，證明e、 h、 q號樣品是具有高的ACE抑制活力的純肽，它們分別是 分離純化的3條肽Cys-Phe, GIu-Tyr禾B Phe-Glu。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合說明書附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但不限于此。實(shí)施例l.從鯊魚酶解物中分離純化得到三條肽Cys-Phe、 Glu-Tyr和Phe-Glu。(1) 蛋白酶制劑的制備種子培養(yǎng)基以重量份牛肉膏0.3份、蛋白胨1份、瓊脂2份、NaCl 0.5份為培 養(yǎng)基，水98份，pH為7. 1，滅菌，劃線接枯草芽孢桿菌SM98011 Sw6,/fc SM懇1)菌種，30。C培養(yǎng)，培養(yǎng)20小時(shí)。發(fā)酵培養(yǎng)基豆餅粉3份、玉米粉2份、麩皮1份、Na2HP04 0.4份、KH2P04 0.04份、水100份，加豆油0.3份作消泡劑。120。C滅菌30分鐘，冷卻后，接上種子 的菌懸液10份，150升發(fā)酵罐中，裝樣量70升，于3(TC下，通風(fēng)量(V風(fēng)/ V液'時(shí) 間)l: 0.6，攪拌330轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)36小時(shí)。此時(shí)pH7.0。(2) 酶解短肽的制備首先稱取50份(鮮重)的鯊魚肉，打漿。然后加入50份(液體重量)的蛋白酶 制劑，調(diào)pH值到7.2， 5CTC，攪拌酶解5小時(shí)，酶解完畢，5000rpm離心，上清為酶 解短肽液。(3) 降壓肽的分離純化將上清液用3000Da的膜超濾，然后將超濾液上Sephadex G-15柱，分離得到6個(gè) 峰，分別收集，測定ACE抑制活力，得到第D號峰具有較高的ACE抑制活力(見圖1) ，反復(fù)收集，上高壓液相色譜，將D號樣品進(jìn)一步分離，得到17個(gè)色譜峰(見圖2) ，其中有3個(gè)峰具有較高的ACE抑制活力，這3個(gè)峰對應(yīng)的肽分別為Cys-Phe， Glu-Tyr禾Q Phe-Glu。(4) 降壓肽的序列測定將步驟(3)得到的具有較高ACE抑制活力3個(gè)純肽用6N的HC1全水解，用氨基 酸自動(dòng)測序儀測定氨基酸組成，然后用液質(zhì)連用儀分析3條肽的分子量和肽段的分布， 分析出3條肽的氨基酸序列為Cys-Phe, Glu-Tyr和Phe-Glu。毛細(xì)管電泳法測定IC50 值分別為為1.96, 2.68和1.45 )iM。如圖3,圖4和圖5所示。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)具有酶 解ACE抑制肽的ICs。值為0. 2u M-600線ICs。值越小,說明對ACE的抑制作用越強(qiáng)， 降血壓效果越好。由此證明，從鯊魚酶解物中分離純化的三條肽具有較高的ACE抑制活 性。本實(shí)施例所得的短肽產(chǎn)品干燥處理后為白色粉末，易溶于水。 實(shí)施例2:如實(shí)施例1所述，所不同的是原料鯊魚的用量不一樣，取45份(鮮 重)的鯊魚肉，打漿。然后加入50份(液體重量)的蛋白酶制劑。本發(fā)明的短肽具有較高的ACE抑制活性，因?yàn)楸景l(fā)明的三條肽均為二肽，因此， 在消化道內(nèi)，很難被進(jìn)一步的酶解，可被直接吸收利用，因此，推測在體內(nèi)也會(huì)發(fā)揮 較好的降血壓活性。本發(fā)明的特點(diǎn)在于集酶工程技術(shù)和肽純化鑒定技術(shù)于一體，對 對鯊魚至今未被有效利用的蛋白部分進(jìn)行了深入的開發(fā)利用，發(fā)現(xiàn)了有新的氨基酸序 列組成的ACE抑制肽并保證了在體內(nèi)的功能性，為以后降壓藥物的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種鯊魚蛋白降壓肽，其特征在于，是如下短肽之一或組合Cys-Phe肽1，Glu-Tyr肽2，Phe-Glu肽3。
2. 如權(quán)利要求1所述的鯊魚蛋白降壓肽，其特征在于,所述的鯊魚蛋白降壓肽具 有較高的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性，為白色粉末狀，易溶于水，其中，Cys-Phe降 壓肽的IC5o值為0.523 mg/ml對應(yīng)為1.96|xM， Glu-Tyr降壓肽的ICso值為0.824 mg/ml 對應(yīng)為2.68pM， Phe-Glu降壓肽的ICso值為0.426mg/ml對應(yīng)為1.45 ^M。
3. —種權(quán)利要求l所述的鯊魚蛋白降壓肽的制備方法，具體步驟如下(1) 酶解鯊魚蛋白制備酶解液按鮮重稱取鯊魚肉45 50重量份原料，打漿，然后加入45 50重量份的蛋白酶 制劑，調(diào)pH值到6.8 7.3，溫度45 5(TC，攪拌酶解5.5小時(shí)，酶解完畢后，離 心，取上清液，即得酶解液；(2) 從酶解液中分離純化降壓肽用3000Da的超濾膜將酶解液超濾，將超濾小于3000Da的超濾液過Sephadex G-15 柱(1.6X80cm， medium Pharmacia),用蛋白核酸檢測儀，在214nm處進(jìn)行檢測，根據(jù) 從色譜柱分離得到的色譜峰分別收集，收集的洗脫液凍干稱重后，測定ACE抑制活 性，將抑制活性高的組分多次收集，然后進(jìn)一步用高壓液相色譜分離；PDA檢測器檢 測波長為220nm,然后根據(jù)所得的肽的譜圖將肽峰分別收集濃縮，測定ACE抑制活 性，得到具有高的ACE抑制活力的肽；(3) 降壓肽的序列測定將分離純化得到的具有高的ACE抑制活力的肽，用氨基酸自動(dòng)測序儀測定氨基酸 組成，再通過液質(zhì)連用儀(PE SC正X API 4000 LC/MS-MS systems, Applied Biosystems, USA),分析肽的分子量和肽段的分布，然后進(jìn)行肽的氨基酸序列分析。
4. 如權(quán)利要求3所述的鯊魚蛋白降壓肽的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所 用高壓液相色譜柱為反相C18柱。
5. 如權(quán)利要求3所述的鯊魚蛋白降壓肽的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述 的肽的氨基酸序列分析是將肽用6N的HC1在115°C全水解22小時(shí)，通過氨基酸自動(dòng)測 序儀進(jìn)行測定。
6. 如權(quán)利要求3所述的鯊魚蛋白降壓肽的制備方法，其特征在于，步驟(1)中的所述的蛋白酶制劑通過如下方法制得，均為重量份 液體種子制備培養(yǎng)基餅粉2~3份、玉米粉2~3份、麩皮1~1.5份、Na2HP04 0.4~0.5份、 KH2P04 0.03~0.04份、水100份，滅菌，冷卻，接種枯草芽孢桿菌SM98011 (脂〃肌 SM98011)的茄子瓶菌種的菌懸液5~10份，通風(fēng)攪拌，培養(yǎng)15~18小時(shí)，作 為液體種子待用；液體深層發(fā)酵制備蛋白酶制劑培養(yǎng)基豆餅粉3 3. 5份、玉米粉3. 5 5.0份、麩皮2.0 2. 5份、Na2HP04 0.4 0.5份、KH2P04 0.03 0.04份、水100份，滅菌，接種上述的液體種子，接種量 為培養(yǎng)基重量的5 7%，通風(fēng)攪拌，控溫，發(fā)酵37 40小時(shí)，得蛋白酶制劑。
7. 如權(quán)利要求6所述的鯊魚蛋白降壓肽的制備方法，其特征在于，所述蛋白酶制 劑的制備步驟中的培養(yǎng)基中加豆油0. 3 0. 35重量份作消泡劑。
8. 如權(quán)利要求3所述的鯊魚蛋白降壓肽的制備方法，其特征在于，所述步驟(2) 中測定肽的ACE抑制活性方法是毛細(xì)管電泳法。
9. 權(quán)利要求1所述的鯊魚蛋白降壓肽在制備降壓藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
鯊魚蛋白降壓肽及其制備方法與應(yīng)用，屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。從鯊魚的蛋白酶解產(chǎn)物中分離純化出新的具有兩個(gè)氨基酸的降壓肽，具有較高的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制活性。制備步驟包括酶解鯊魚蛋白制備酶解液、從酶解液中分離純化降壓肽和降壓肽的序列測定。本發(fā)明降壓肽可應(yīng)用于制備降壓藥物。本發(fā)明將微生物酶工程技術(shù)應(yīng)用于鯊魚的深層次開發(fā)利用，得到的具有新序列短肽，具有高的ACE抑制活力。
文檔編號C07K5/065GK101240016SQ20081001440
公開日2008年8月13日 申請日期2008年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月28日
發(fā)明者何海倫, 昊 吳, 周百成, 張玉忠, 陳秀蘭 申請人:山東大學(xué)