專利名稱：一種從螺旋藻中分離純化高純度藻膽蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離純化高純度藻膽蛋白的方法，特別是涉及一種從 螺旋藻中分離純化高純度藻膽蛋白的方法。
背景技術(shù)：
藻藍(lán)蛋白、變藻藍(lán)蛋白是一種很好的純天然色素，有鮮艷的顏色，可 用作食物色素，也可用于化妝品工業(yè)，不會造成人為傷害，是理想的安全 的添加劑，同時，藻藍(lán)蛋白、變藻藍(lán)蛋白也是活性物質(zhì)，均具有穩(wěn)定的熒 光現(xiàn)象和產(chǎn)生自由基作用，可以作為抗體熒光標(biāo)記物質(zhì)以替代合成熒光物 質(zhì)，因而，已有生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白和變藻藍(lán)蛋白熒光標(biāo)記免疫抗體試劑，用于 醫(yī)學(xué)疾病臨床分子診斷和生命科學(xué)分子檢測，除了用于熒光檢測外，近年 來，根據(jù)藻藍(lán)蛋白、變藻藍(lán)蛋白吸收光譜的特征和產(chǎn)生自由基特點，藻藍(lán) 蛋白、變藻藍(lán)蛋白均可作為光敏劑，在光動力學(xué)治療腫瘤方面的前景不斷 被越來越多的人看好，它以高效、無毒、副作用小等優(yōu)點，被認(rèn)為是光動 力學(xué)治療法中一種非常有前景的光敏劑，在光學(xué)信息存儲與處理，快速光電 探測、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等方面具有潛在的應(yīng)用前景。目前，已可從數(shù)種海藻 中提取藻膽蛋白，但高純度的藻膽蛋白價格十分昂貴，且價格還在迅速上 漲。
關(guān)于藻膽蛋白提取純化方面，雖然研究較多，且大多數(shù)是從螺旋藻中 提取藻藍(lán)蛋白，但有的工藝簡單，所取蛋白純度極低，有的工藝過于復(fù)雜， 且易使蛋白變性，不適合大量提取，有的涉及到了超濾法，極易使溶質(zhì)粘 附和沉積于膜表面上，造成嚴(yán)重的濃度極化和堵塞，還有些在提取過程中， 要添加食用穩(wěn)定劑、糖類、無機(jī)鹽類、P H調(diào)節(jié)劑等， 一般只能制得藥品
3級(A615nm/A28()nm>2)的藻藍(lán)蛋白，用低滲的辦法制備藻類的抽提物，通 過兩次離子交換層析才使藻藍(lán)蛋白純度達(dá)到試劑級(A615nm / A28Qnm〉4)。 正是由于上述這些分離技術(shù)存在的這些缺陷，使得制得的藻膽蛋白純度低， 得率亦不高，以使高純度藻膽蛋白的價格高昂，最后，大大影響了高純度 藻膽蛋白的廣泛應(yīng)用，因此，降低藻膽蛋白純化成本是關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要提供一種從螺旋藻中分離純化高純度藻膽蛋白的方 法，它不但能有效地從螺旋藻中提取高純度藻膽蛋白，而且，工藝簡單， 成本低廉，得率較高。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明的一種從螺旋藻中分離純化高純 度藻膽蛋白的方法是在溫度為4"C條件下進(jìn)行以下各步驟取螺旋藻，先 進(jìn)行超聲波破碎螺旋藻體，超聲時間10分鐘，超聲波破碎以間隙破碎方式 進(jìn)行，再高速離心30分鐘得到螺旋藻最初提取液；接著將上述所提取溶液 加硫酸銨至40 %飽和度，中速離心15分鐘后取上清液，繼續(xù)加硫酸銨至 50%飽和度，中速離心15分鐘后取沉淀；再接著將沉淀用極低濃度磷酸鹽 緩沖液溶解后高速離心30分鐘，所得上清液用低孔徑微孔濾膜過濾，濾液 脫鹽，脫鹽液上羥基磷灰石柱；最后用0.040 M至0.060 M的磷酸鹽緩沖 液(pH7. 0，含lmmol/L EDTA)將藻藍(lán)蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集； 用0. 10 M至0. 12 M的磷酸鹽緩沖液(pH7.0，含lramol/L EDTA)將變藻 藍(lán)蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集；所得到的藻藍(lán)蛋白吸收光譜純度 達(dá)到4- 6 (A615nm/A280nra)，變藻藍(lán)蛋白吸收光譜純度達(dá)到4 - 6 (A652nm
/ A280nm)。
所述的高速離心為15000轉(zhuǎn)/分，所述的中速離心為10000轉(zhuǎn)/分。所 述的極低濃度磷酸鹽緩沖液為0. 001 M磷酸鹽緩沖液(pH7.0，含lmmol/LEDTA)。所述的低孔徑微孔濾膜為0. 22 u m微孔濾膜。
由于本發(fā)明以螺旋藻為材料，通過超生波破碎方法、硫酸銨多次鹽析 方法、柱層析方法等方法提取和純化藻膽蛋白，因此，具有以下優(yōu)點
1、 采用超聲波破碎藻體，克服了低滲法降低得率的缺點；
2、 采用兩次硫酸銨鹽析法，既使得藻類中的脂肪和多糖在初提階段就 已全部除去，防止了初提物中殘渣和粘性多糖堵塞層析柱，又在不明顯降 低產(chǎn)率的情況下顯著提高了粗提液的純度，減輕了后期純化的壓力；
3、 一次過柱就可得到高純度的藻膽蛋白，解決了大規(guī)模提取純化藻膽 蛋白的瓶頸；
4、 一次過柱就可得到兩種藻膽蛋白(藻藍(lán)蛋白、變藻藍(lán)蛋白)；
5、 在所有海藻中以螺旋藻的藻藍(lán)蛋白和變藻藍(lán)蛋白含量最為豐富，以 此為原料最合適不過；
6、 所用材料硫酸銨價格便宜，羥基磷灰石可重復(fù)使用，再生方便；
7、 成本低，如果不包括勞動力成本，初步估算僅為同類產(chǎn)品的四十至 五十分之一；
8、得率高，可以達(dá)到0.5%左右，是目前常用的藻膽蛋白分離方法的10 倍以上。
具體實施例方式
以下將對本發(fā)明的一種從螺旋藻中分離純化高純度藻膽蛋白的方法的 實施例作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
本實施例中所用的材料為螺旋藻，具體步驟如下 (1)、用0.05 M磷酸鹽緩沖液(pH7.0，含lramol/L EDTA)以物液比 (g/ml) l:8浸泡新鮮螺旋藻體，在溫度為4'C條件下，進(jìn)行超聲破碎，超 聲時間10分鐘，超聲波破碎以間隙破碎方式進(jìn)行，以免溫升超過4X:以上，再高速離心(15000轉(zhuǎn)/分，30分鐘)得到螺旋藻最初提取液；
(2) 、在溫度為4。C條件下，將上述所提取溶液加硫酸銨至40 %飽和 度，中速離心(10000轉(zhuǎn)/分，15分鐘)后取上清液，繼續(xù)加硫酸銨至50% 飽和度，中速離心(10000轉(zhuǎn)/分，15分鐘)后取沉淀；
(3) 、在溫度為4。C條件下，將沉淀用0.001M磷酸鹽緩沖液(pH7.0， 含lmmol/L EDTA)溶解后高速離心(15000轉(zhuǎn)/分，30分鐘)，所得上清液 用0.22um微孔濾膜過濾，濾液脫鹽，脫鹽液上羥基磷灰石柱；
(4) 、在溫度為4。C條件下，用0.040 M至0.060 M的磷酸鹽緩沖液 (pH7.0，含lmmol/L EDTA)將藻藍(lán)蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集；
(5) 、在溫度為4"條件下，用0. 10 M至0. 12 M的磷酸鹽緩沖液 (pH7. 0，含l腿ol/L EDTA)將變藻藍(lán)蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集；
最后，得到的藻藍(lán)蛋白吸收光譜純度達(dá)到4- 6 (A615nm/A280nm)，變藻藍(lán)
蛋白吸收光譜純度達(dá)到4 — 6 (A652nm/A280nm)。
權(quán)利要求
1、一種從螺旋藻中分離純化高純度藻膽蛋白的方法，其特征在于該方法在溫度為4℃條件下進(jìn)行以下各步驟取螺旋藻，先超聲波破碎螺旋藻體，超聲時間10分鐘，超聲波破碎以間隙破碎方式進(jìn)行，再高速離心30分鐘得到螺旋藻最初提取液；接著將上述所提取溶液加硫酸銨至40％飽和度，中速離心15分鐘后取上清液，繼續(xù)加硫酸銨至50％飽和度，中速離心15分鐘后取沉淀；再接著將沉淀用極低濃度磷酸鹽緩沖液溶解后高速離心30分鐘，所得上清液用低孔徑微孔濾膜過濾，濾液脫鹽，脫鹽液上羥基磷灰石柱；最后用0.040M至0.060M的磷酸鹽緩沖液(pH7.0，含1mmol/LEDTA)將藻藍(lán)蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集；用0.10M至0.12M的磷酸鹽緩沖液(pH7.0，含1mmol/L EDTA)將變藻藍(lán)蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集；所得到的藻藍(lán)蛋白吸收光譜純度達(dá)到4-6(A615nm/A280nm)，變藻藍(lán)蛋白吸收光譜純度達(dá)到4-6(A652nm/A280nm)。
2、 一種從螺旋藻中分離純化高純度藻膽蛋白的方法，其特征在于所述 的高速離心為15000轉(zhuǎn)/分，所述的中速離心為10000轉(zhuǎn)/分。
3、 一種從螺旋藻中分離純化高純度藻膽蛋白的方法，其特征在于所述 的極低濃度磷酸鹽緩沖液為0.001 M磷酸鹽緩沖液(pH7,0，含lmmolZL EDTA)。
4、 一種從螺旋藻中分離純化高純度藻膽蛋白的方法，其特征在于所述 的低孔徑微孔濾膜為0. 22 p m微孔濾膜。
全文摘要
一種從螺旋藻中分離純化高純度藻膽蛋白的方法。其特征該方法在溫度為4℃條件下進(jìn)行以下各步驟取螺旋藻，先進(jìn)行超聲波破碎螺旋藻體，超聲時間10分鐘，間隙破碎，再高速離心30分鐘得螺旋藻最初提取液；接著將上述所提取溶液加硫酸銨至40％飽和度，中速離心15分鐘后取上清液，繼續(xù)加硫酸銨至50％飽和度，中速離心15分鐘后取沉淀；再接著將沉淀用極低濃度磷酸鹽緩沖液溶解后高速離心30分鐘，所得上清液用低孔徑微孔濾膜過濾，濾液脫鹽，脫鹽液上羥基磷灰石柱；最后用0.040M至0.060M的磷酸鹽緩沖液(pH7.0，含1mmol/L EDTA)將藻藍(lán)蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集；用0.10M至0.12M的磷酸鹽緩沖液(pH7.0，含1mmol/L EDTA)將變藻藍(lán)蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集。
文檔編號C07K1/14GK101519425SQ20081003387
公開日2009年9月2日 申請日期2008年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月26日
發(fā)明者何培民, 銘 周, 晨 李, 李春霞, 蔡春爾 申請人:上海水產(chǎn)大學(xué)