專利名稱::從中藥菝葜中提取柚皮素的方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及一種從中藥菝葜中提取柚皮素的方法及應(yīng)用。技術(shù)背景糖尿病并發(fā)癥多由長期的高血糖、高血脂、血液高凝、高粘、內(nèi)分泌失調(diào)引起。常見的并發(fā)癥有糖尿病酮癥酸中毒、非酮癥性高滲性昏迷、糖尿病乳酸性酸中毒、糖尿病性心臟病、糖尿病性腦血管病變、糖尿病性肢端壞疽、糖尿病性神經(jīng)病變、糖尿病性腎病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變,以及糖尿病引起的多種感染,其中,又以糖尿病大血管病變和微血管病變最為常見。這些并發(fā)癥通常比糖尿病本身更嚴重,導(dǎo)致某些疾病發(fā)病率和死亡率明顯增加。目前認為糖尿病并發(fā)癥與以下因素有關(guān)(l)胰島素的絕對或相對缺乏胰島素抵抗是糖尿病發(fā)病前的主要病理生理表現(xiàn)。最常見的原因是受體缺陷,這一機制在糖尿病發(fā)病中起了非常重要的作用,致使骨骼肌和脂肪組織攝取葡萄糖障礙,肝糖輸出增加,發(fā)生NIDDM高血糖,(2)血漿游離脂肪酸(FFA)增高近來的證據(jù)表明,在人類高濃度的血漿游離脂肪酸通過抑制肌肉內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)運活性而產(chǎn)生胰島素抵抗。另外游離脂肪酸水平的慢性升高對胰島P細胞功能也有損害——稱為"脂毒性"——從而進一步加重了高血糖,(3)肌醇代謝異常和多元醇代謝途徑增強大量證據(jù)表明,當(dāng)體內(nèi)血糖超過一定數(shù)量而形成高血糖時,醛糖還原酶被活化而使山梨醇的形成亢進。山梨醇的蓄集一方面會引起滲透壓上升,產(chǎn)生組織(血管、神經(jīng)、腎、視網(wǎng)膜、晶狀體等)水腫,導(dǎo)致基質(zhì)變化而發(fā)生并發(fā)癥,另一方面,可使其他具有滲透活性的物質(zhì)如肌醇等代償性耗竭,致使神經(jīng)傳遞速度下降,從而導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。而醛糖還原酶抑制劑則可恢復(fù)神經(jīng)傳導(dǎo)速度,防止視網(wǎng)膜組織中蛋白異常滲透,減輕腎輸入小動脈擴張,使腎小球濾過率恢復(fù)正常等。
發(fā)明內(nèi)容-本發(fā)明的目的之一在于提供一種從中藥菝葜中提取柚皮素的方法。本發(fā)明的目的之二在于提供柚皮素在制備抑制醛糖還原酶活性藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之三在于提供柚皮素在制備抑制a-葡萄糖苷酶活性藥物中的應(yīng)用。中藥菝葜(RhizomaSmilacinus,RS)為百合科植物菝葜(5iw7a;fL.)的千燥根莖,具活血化瘀,清熱利濕,強筋壯骨,消腫毒,祛風(fēng)濕,利小便,補氣活血等功效,為一常用中藥,味甘性平溫,無毒,藥價低廉,具多種生物活性,對多種疾病有獨特療效。菝葜煎劑對實驗性糖尿病小鼠的血糖有明顯的抑制作用,小鼠灌胃菝葜煎劑連續(xù)3天或6天,能顯著對抗腎上腺素和葡萄糖引起的小鼠血糖升高,降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖濃度,明顯增加肝糖元含量等(馬世平,衛(wèi)敏,郭健,等.菝葜對小鼠血糖和肝糖元的影響[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志,1998,15(5):5-7)。柚皮素是一種廣泛存在于植物和中藥中的黃酮類化合物,藥理研究顯示柚皮素具有抗炎、止咳祛痰、抗氧化、降血脂、清除自由基、抗腫瘤等作用。為達到上述目的,本發(fā)明采用如下技術(shù)方案;一種從中藥菝葜中提取柚皮素的方法,其特征在于該方法的具體步驟為a)將菝葜浸沒在70%的乙醇中,浸出液濃縮后得浸膏,將該浸膏懸浮在蒸餾水中后,用石油醚萃取脫脂,脫脂后的水相再用乙酸乙酯萃??;b)將乙酸乙酯相用200-300目硅膠柱層析分離,流動相為乙酸乙酯和甲醇按9:1的體積比的混合液,根據(jù)薄層層析的結(jié)果收集前沿段的洗脫液,濃縮后再用200-300目硅膠柱層析分離,用氯仿和甲醇按(1004):1的體積比的混合液進行梯度洗脫,根據(jù)薄層層析的結(jié)果收集前沿段的洗脫液,濃縮后析出沉淀物;該沉淀物再用氯仿和甲醇按9:l的體積比的混合液洗脫,洗脫后再用甲醇重結(jié)晶,即得到白色針狀晶體純的柚皮素。中藥菝葜提取物柚皮素在制備抑制醛糖還原酶活性藥物中的應(yīng)用。中藥菝葜提取物柚皮素在制備抑制a-葡萄糖苷酶活性藥物中的應(yīng)用。采用本發(fā)明方法從從中藥菝葜中提取出純的黃酮類化合物3(S)-5,7,4'-三羥基二氫黃酮,即柚皮素,該化合物具有醛糖還原酶和a-葡萄糖苷酶兩個酶的抑制活性,針對兩個與糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的酶靶,起到調(diào)控小腸對葡萄糖吸收和防治糖尿病并發(fā)癥的作用。相比傳統(tǒng)中藥制劑,由于純化后單體的結(jié)構(gòu)明確,效果顯著,有利于質(zhì)量控制和中藥現(xiàn)代化進程;進一步可通過對該化合物的化學(xué)修飾等,深入研究糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展機理,從而開發(fā)新一代抗糖尿病及其并發(fā)癥藥物。圖1為菝葜提取物柚皮素的HPLC檢測結(jié)果。圖2為菝葜提取物柚皮素對a-葡萄糖苷酶活性的影響。圖3為菝葜提取物柚皮素對醛糖還原酶活性的影響。具體實施方式實施例一單體的分離提取和純化稱取1000g菝葜經(jīng)7(F。乙醇浸提,得浸膏78.32g,后經(jīng)石油醚、乙酸乙酯依次萃取,乙酸乙酯相31.26g,將乙酸乙酯相上200-300目硅膠柱進行正相層析,流動相為乙酸乙酯一甲醇(9:1),分部收集,200mL/瓶,計收集28瓶,將其中4-12號瓶合并濃縮,再上200-300目硅膠柱(4.5X50cm),流動相氯仿一甲醇(100:1)到氯仿一甲醇(4:1)梯度洗脫,分部收集,200mL/瓶,收集16瓶,12,13瓶濃縮后,析出沉淀物。沉淀物視純度可進行單梯度柱層析,參考洗脫系統(tǒng)為氯仿一甲醇(9:1)。視薄層層析結(jié)合紫外分析結(jié)果,可進行甲醇重結(jié)晶。1000g菝葜經(jīng)過分離純化得到固體0.96g,得率為0.096%。該部位純度經(jīng)HPLC鑒定,峰面積為99.5%,接近單體,參見圖l和表l。表l柚皮素的HPLC數(shù)據(jù)(280nm)峰序保留時間(min)峰面積mAU承s峰面積%12.8823700.01723.17226550.122434.52573710.339847.3833560.0164510.053215872199.5044Totals:2169482100實施例二單體的結(jié)構(gòu)鑒定白色針狀晶體(甲醇)。溶于甲醇,乙醇。分子量為272,分子式C!孔2(k。ESI—MS歷/&273[M-H]+。'H醒R(CD30D)S:7.36(2H,d,J=8.5,C2,-H,C6,-H),6.82(2H,d,J=2.7,9.4,C3,—H,C5,—H),5.98(1H'd,J=2.1'C6—H),5.35(1H,dd,J=3.0,13.5,C2—H),3.05(1H,d,J=14.5,C3—H。),2.78(lH,dd,J=3,0,14.6,C3-He)。13C醒R(CD30D)S:79.1(C-2),42.6(C-3),196.3(C_4),164.1(C-5),127.6(C-6),167.1(C-7),94.8(C-8),163.5(C-9),101.9(010),129.7(C-2,),115.0(C-3,),157.6(C-4,),115.0(C-5,),127.6(C_6,)。綜上所述,化合物為3(S)-5,7,4,-三羥基二氫黃酮,即柚皮素Naringenin,Nar)。實施例三單體對a-葡萄糖苷酶的抑制活性在試管中依次加入O.76mLp朋.8的磷酸鉀緩沖液,20yLlmg/mL還原型谷胱甘肽,10uL0.0167U/mLa-葡萄糖苷酶,37。C保溫10min后,加入10uL0.116MPNPG,在400nm波長下掃描6min記錄吸光度的變化。a-葡萄糖苷酶活力單位定義在pH6.8,溫度為37。C的條件下,在400nm下,每分鐘吸光度值上升O.l為一個活力單位。依次加入磷酸鉀緩沖液、20uLlmg/mL還原型谷胱甘肽、10yL0.0167U/mLa-葡萄糖苷酶、和一定量抑制劑溶液(lmg/mL,用磷酸鉀緩沖液配制),37。C保溫10min后,加入10uL0.116MPNPG,在400nm波長下掃描6min記錄吸光度的變化,總反應(yīng)體系為0.8mL。a-葡萄糖苷酶抑制劑活力單位定義在pH6.8,溫度為37'C的條件下,使一個酶活力單位喪失活性為一個抑制劑活力單位。參見圖2,當(dāng)加入10uL濃度為lmg/mL的Nar量時,對a-葡萄糖苷酶抑制率即已達到29.8%,當(dāng)體積為40uL時,抑制率可達45.5M,表明該成分對a-葡萄糖苷酶具有一定的抑制活性。對照組生理鹽水無抑制活性。實施例四單體對醛糖還原酶的抑制活性在0.8mL磷酸鉀緩沖液(pH6.5)中加入40uL0.4M硫酸鋰,40uL10mM還原型輔酶II溶液和80pL醛糖還原酶提取液,37'C下保溫4min,再加入40uL10mMDL-甘油醛溶液,在340下掃描記錄吸光度6rain的變化。醛糖還原酶活力單位定義在pH6.8,溫度為37。C的條件下,在340nm下每分鐘吸光度值下降0.01為一個活力單位。在一定量磷酸鉀緩沖液(pH6.5)中加入40uL0.4M硫酸鋰,40uL10mM還原型輔酶n溶液,一定量抑制劑溶液(lmg/mL,用磷酸鉀緩沖液配制)和80PL醛糖還原酶提取液,37。C下保溫4min,再加入40yLlOmMDL-甘油醛溶液,總反應(yīng)體系為lmL,在340nm下掃描記錄吸光度6min的變化。醛糖還原酶抑制劑活力單位定義:在pH6.5,溫度為37'C的條件下,使一個酶活力單位喪失活性為一個抑制劑活力單位。抑制劑的比活力用U/mg抑制劑來表示,即每rag抑制劑所具有的抑制活力。參見圖3,當(dāng)加入4pL濃度為lmg/mL的成分時,對醛糖還原酶的抑制率為34.2%,當(dāng)加入8uL時,抑制率為90.1%,如加入10uL時,抑制率可達到100%,表明其對醛糖還原酶有強的抑制活性。對照組生理鹽水無抑制活性。實施例五單體一次給藥對正常小鼠血糖含量的影響取正常小鼠60只,隨機分為6組,每組10只,分別灌胃生理鹽水(PB)、拜糖平(陽性對照)、不同劑量的柚皮素(Nar)。禁食4h后眼睚靜脈叢取血,葡萄糖氧化酶法測定血糖值(fastingseruraglucose,FSG)。結(jié)果參見表2,120mg/kg劑量組能明顯降低正常小鼠血糖含量,再加大劑量對正常小鼠血糖含量沒有明顯變化。Tab.2—次給藥對正常小鼠血糖含量的影響(n=10)GroupDose(mg/kg)FSG(,1/L)Normal—10.OO土O.44Acarbose1007.45±0.63**409.54±0.58*Nar809.17±0.46*1208.55±0.93**1608.68±0.54**K0.05,**P〈0.01vsNormal實施例六單體連續(xù)給藥對正常小鼠血糖含量的影響取正常小鼠50只,隨機分為5組,分別灌胃生理鹽水、拜糖平、Nar,連續(xù)8d。末次給藥后禁食4h,眼底取血測定血槳血糖濃度。參見表3,Nar多次給藥對正常小鼠的血糖含量有較顯著的影響。Tab.3多次給藥對正常小鼠血糖含量的影響(n=10)Group_Dose(mg/kg)_FSG(mmol/UNormal^10.00±0.44Acarbose1005.89±0.74**805.98±2.31*Nar1207.62±1.92*__^2__6.99±1.57''P<0.05'**P〈0.01vsPB實施例七對四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影響四氧嘧啶糖尿病小鼠50只,分為5組(另一組為正常小鼠10只),分別灌胃生理鹽水、拜糖平及Nar,連續(xù)8d。末次灌胃后禁食4h,取血測定血漿血糖濃度。參見表4,其降血糖效果接近市售降糖藥物拜糖平。Tab.4Nar對四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖含量的影響(n=10)nDoseFSG(mmol/UHypoglycemic<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例八對四氧嘧啶小鼠肝糖原含量的影響四氧嘧啶糖尿病小鼠40只,分為5組(另一組為正常小鼠8只),連續(xù)給藥灌喂8d(模型組給生理鹽水),末次給藥30min后處死動物,取肝臟測定肝糖原含量。參見表5,Nar能提高肝臟糖原的含量,效果遜于市售降糖藥物拜糖平。Tab.5Nar對四氧嘧啶小鼠肝糖原含量的影響(n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例九對四氧嘧啶小鼠體內(nèi)酶活的影響四氧嘧啶糖尿病小鼠連續(xù)灌喂給藥8d,末次給藥后禁食4h,處死小鼠,取其晶狀體和小腸,測定酶活。該成分對四氧嘧啶小鼠晶狀體醛糖還原酶活力有降低的作用。要好于市售降糖藥物拜糖蘋和格華止。參見表6。Tab.6Nar對四氧噴啶小鼠晶狀體醛糖還原酶活性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>拜糖蘋組80.094±0.018**格華止組80.084±0.019**Nar試驗組__^__0.062±0.031**與生理鹽水組比較*P〈0.05,**P<0.01同時其對四氧噴啶小鼠小腸a-葡萄糖苷酶活力也有一定降低的作用,但效果不明顯。參見表7表6Nar對四氧嘧啶小鼠小腸a-葡萄糖苷酶活性的影響組別小鼠數(shù)量6分鐘內(nèi)吸光度上升值正常小鼠空白組80.081±0.020**生理鹽水組80.113±0.014四氧嘧啶糖尿病小鼠拜糖蘋組80.089±0.017*Nar試驗組80.092±0.024與生理鹽水組比較:*P<0.05,**P〈0.0權(quán)利要求1.一種從中藥菝葜中提取柚皮素的方法,其特征在于該方法的具體步驟為a.將菝葜浸沒在70%的乙醇中,浸出液濃縮后得浸膏,將該浸膏懸浮在蒸餾水中后,用石油醚萃取脫脂,脫脂后的水相再用乙酸乙酯萃?。籦.將乙酸乙酯相用200-300目硅膠柱層析分離,流動相為乙酸乙酯和甲醇按9∶1的體積比的混合液,根據(jù)薄層層析的結(jié)果收集前沿段的洗脫液,濃縮后再用200-300目硅膠柱層析分離,用氯仿和甲醇按(100~4)∶1的體積比的混合液進行梯度洗脫,根據(jù)薄層層析的結(jié)果收集前沿段的洗脫液,濃縮后析出沉淀物;該沉淀物再用氯仿和甲醇按9∶1的體積比的混合液洗脫后,再用甲醇重結(jié)晶,即得到白色針狀晶體柚皮素。2.中藥菝葜提取物柚皮素在制備抑制醛糖還原酶活性藥物中的應(yīng)用。3.中藥菝葜提取物柚皮素在制備抑制a-葡萄糖苷酶活性藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種從中藥菝葜中提取柚皮素的方法及應(yīng)用。該方法的具體步驟為將中藥菝葜粉碎,用70%乙醇冷浸,浸出液濃縮得浸膏,混懸于蒸餾水中,用石油醚萃取脫脂,脫脂后的水相再用乙酸乙酯萃取。將乙酸乙酯相上硅膠柱進行層析,用乙酸乙酯-甲醇系統(tǒng)(9∶1)進行洗脫,洗脫液分部收集,最前沿段合并濃縮,上硅膠柱用氯仿∶甲醇梯度洗脫,分部收集,濃縮后析出沉淀物。反復(fù)過柱,甲醇重結(jié)晶后,得到白色針狀晶體。本發(fā)明方法從中藥菝葜中提取出純的黃酮類化合物3(S)-5,7,4’-三羥基二氫黃酮,即柚皮素,該化合物具有醛糖還原酶和α-葡萄糖苷酶兩個酶的抑制活性,起到調(diào)控小腸對葡萄糖吸收和防治糖尿病并發(fā)癥的作用。由于純化后單體的結(jié)構(gòu)明確,效果顯著,有利于質(zhì)量控制和中藥現(xiàn)代化進程;進一步可通過對該化合物的化學(xué)修飾等,深入研究糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展機理,從而開發(fā)新一代抗糖尿病及其并發(fā)癥藥物。文檔編號C07D311/00GK101265251SQ20081003639公開日2008年9月17日申請日期2008年4月21日優(yōu)先權(quán)日2008年4月21日發(fā)明者堃施,殷建偉,沈忠明,沈莉娟申請人:上海大學(xué)