專利名稱：：從頭孢克洛萘酚復(fù)合物中提純頭孢克洛的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體的說(shuō)，涉及一種從頭孢克洛萘酚復(fù)合物中提純頭孢克洛的方法。
背景技術(shù)：
：頭孢克洛(Cefaclor)是一種半合成的第二代頭孢類抗生素，對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌有較強(qiáng)的抗菌活性，具有高效、廣譜和較強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性，是目前臨床治療細(xì)菌感染的重要藥物之一。頭孢克洛從二十世紀(jì)七十年代成功上市以來(lái)，作為高效、廣譜和良好的臨床安全性的抗生素，一直受到人們推崇，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示-x=l,2COOH酶法合成頭孢菌素是目前新興的合成頭孢菌素類抗生素的"綠色工藝"，專利WO/2006/069984描述，通過(guò)D-苯基甘氨酰胺或D-苯甘氨酸酯，尤其是D-苯甘氨酸酯進(jìn)行7-氨基-3-氯-去乙酰氧基-頭孢菌酸(7ACCA)的(酶促)去乙?；苽漕^孢克洛的方法。根據(jù)WO/1999/031109，為了獲得高轉(zhuǎn)化率與易于回收的頭孢克洛，采用萘酚為絡(luò)合劑，形成頭孢克洛沉淀是一個(gè)好的方法，采用酶法-絡(luò)合合成頭孢克洛的工藝，不僅可以提高轉(zhuǎn)化率，同時(shí)為簡(jiǎn)化后續(xù)下游的分離提供了可能性。實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，要提高頭孢克洛的轉(zhuǎn)化率，需要加大底物D-苯甘氨酸酯的比例，通常D-苯甘氨酸酯與7-ACCA的比例要大于1，甚至達(dá)到2:1的情況。因此，絡(luò)合后的頭孢克洛沉淀一般含有相對(duì)大量的苯甘氨酸和7-ACCA及一定量的苯甘氨酸酯或D-苯基甘氨酰胺。在實(shí)踐中，絡(luò)合后的頭孢克洛通常含有占頭孢克洛重量2-4%的苯甘氨酸，尤其是在為了盡可能多的獲得頭孢克洛萘酚復(fù)合物沉淀的情況下，苯甘氨酸甚至可以占到頭孢克汔重量的近5%，同時(shí)獲得的頭孢克洛中含有占總重量0.6%-1%的7-ACCA。在已知合成頭孢克洛方法中(如US56085055;US5693790;WO9931109),頭孢克洛成品均在含水溶液中經(jīng)反應(yīng)結(jié)晶制得。然而實(shí)踐證明，從酶促反應(yīng)后頭孢克洛萘酚復(fù)合物中通過(guò)結(jié)晶方法獲得的頭孢克洛通常含有高于頭孢克洛重量0.5%的苯甘氨酸，和高于頭孢克洛重量0.3%的7-ACCA，獲得的頭孢克洛不符合市售頭孢克洛原料藥的標(biāo)準(zhǔn)(中國(guó)藥典2005年版)。采用介質(zhì)吸附的方法，例如活性碳吸附法(CN1179425A)，可以除去抗生素中的雜質(zhì)。但是實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，活性碳同樣會(huì)吸附抗生素，因而會(huì)顯著影響頭孢克洛的得率。因此，有必要提供一種新的純化反應(yīng)器酶法合成的頭孢克洛的方法，以降低終產(chǎn)物中雜質(zhì)的含量，獲得頭孢克洛含量符合市售頭孢克洛原料藥標(biāo)準(zhǔn)的頭孢克洛產(chǎn)品，同時(shí)，對(duì)頭孢克洛的得率沒(méi)有明顯影響。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，提供一種純化反應(yīng)器酶法合成的頭孢克洛的方法，以降低終產(chǎn)物中雜質(zhì)的含量，獲得頭孢克洛含量符合市售頭孢克洛原料藥標(biāo)準(zhǔn)的頭孢克洛產(chǎn)品。本發(fā)明提供的方法，包括以下步驟A)水洗頭孢克洛萘酚復(fù)合物，然后以有機(jī)溶劑萃取水相中的雜質(zhì)，收集水相；B)調(diào)節(jié)水相溶液的pH值至1—2，然后上大孔吸附樹(shù)脂吸附；c)待吸附完全后，使用低碳有機(jī)溶劑-水混合液作為流動(dòng)相洗脫頭孢克洛，收集洗脫液。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述步驟A中用于萃取雜質(zhì)的有機(jī)溶劑為醋酸丁酯。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述步驟A中所述有機(jī)溶劑萃取雜質(zhì)的步驟重復(fù)多次。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述低碳有機(jī)溶劑-水混合液為甲醇-水混合液、乙腈-水混合液、丙酮-水混合液或異丙醇-水混合液；優(yōu)選為甲醇-水混合液或異丙醇-水混合液。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述大孔吸附樹(shù)脂為聚苯乙烯吸附樹(shù)脂及其衍生樹(shù)脂；優(yōu)選的，所述聚苯乙烯吸附樹(shù)脂及其衍生樹(shù)脂為Hz816吸附樹(shù)脂或AmberliteXAD-4吸附樹(shù)脂。綜上所述，采用本發(fā)明的純化方法，可以從頭孢克洛萘酚復(fù)合物中獲得高純度的頭孢克洛，且雜質(zhì)含量低，符合《藥典》的標(biāo)準(zhǔn)，可以直接作為市售原料藥。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。除非特別說(shuō)明，以下實(shí)施例中所使用的百分比(％)均為重量百分比。在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，頭孢克洛中有關(guān)物質(zhì)，參考中國(guó)藥典2005年版中的方法,釆用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)，具體如下液相色譜檢測(cè)所用的色譜柱為Agilent公司的ZORBAXSB-C18色譜柱；以0.78%磷酸二氫鈉溶液(以磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.0)為流動(dòng)相A，以0.78%磷酸二氫鈉溶液(pH4.0)-乙腈(55:45)為流動(dòng)相B;流速為每分鐘1.0ml，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm;檢測(cè)溫度為25°C。取供試品溶液20pl，注入液相色譜儀，梯度洗脫，030分鐘，流動(dòng)相B的比例從5%增加至25%;45分鐘時(shí)，流動(dòng)相B的比例增加至100%，維持5分鐘，51分鐘時(shí)，流動(dòng)相A的比例增加至95X，維持10分鐘，記錄色譜圖。在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，頭孢克洛的含量，參考中國(guó)藥典2005年版中的方法，采用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)，具體如下液相色譜檢測(cè)所用的色譜柱為Agilent公司的ZORBAXSB-C18色譜柱；以0.78%磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.4)-乙腈(92:8)為流動(dòng)相；流速為每分鐘1.0ml;檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm;檢測(cè)溫度為25°C。取供試品溶液20pl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。實(shí)施例1、制備頭孢克洛萘酚復(fù)合物參考WO2006/069984的方法，制備獲得頭孢克洛萘酚復(fù)合物，具體如下稱取7-氨基-3-氯-去乙酰氧基-頭孢菌酸(7-ACCA)19.15g，加去離子水約500ml，滴加氨水完全溶解7-ACCA，以硫酸緩慢調(diào)節(jié)pH到6.4。稱取D-苯甘氨酸甲酯(PGME)33.62g，加少量水使完全溶解后，將PGME加入7-ACCA溶液中，混合均勻，加入磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH為6.4,加去離子水至1000ml。連接原位分離反應(yīng)器各管路，控制反應(yīng)器溫度為20°C。隨后將約75%的上述底物溶液加入反應(yīng)瓶中，約25%的底物溶液加入絡(luò)合瓶中。然后，向反應(yīng)瓶中加20.8g(約4000IU)的固定化青霉素?；?IPA750)，而絡(luò)合瓶中加1-萘酚17.3g，隨后開(kāi)始反應(yīng)。3h后停止反應(yīng)，從絡(luò)合瓶中過(guò)濾獲得頭孢克洛萘酚復(fù)合物約45g。實(shí)施例2、從頭孢克洛萘酚復(fù)合物提純頭孢克洛2.1、頭孢克洛萘酚復(fù)合物的溶解及初步純化用總量為400—450毫升的水，分多次洗滌頭孢克洛萘酚復(fù)合物，收集洗滌液，用硫酸或鹽酸調(diào)節(jié)pH值至約1.5，然后加入等體積的醋酸丁酯，攪拌1小時(shí)。靜置15—30分鐘，待分層后，收集水相，保存醋酸丁酯相。再次向水相中加入等體積的醋酸丁酯，調(diào)節(jié)pH值至約1.5，攪拌1小時(shí)，靜置分層后，收集水相，保存醋酸丁酯相。合并醋酸丁酯相，加入100—150毫升水，調(diào)節(jié)pH值至約1.5。攪拌1小時(shí)，靜置分層后，收集水相，合并水相，并檢測(cè)水相中頭孢克洛及主要雜質(zhì)的含量。檢測(cè)結(jié)果顯示，在水相中含有約32g頭孢克洛(純度為93.2%);其中含有4.52%的苯甘氨酸；0.92%的7-ACCA;0.21%的苯甘氨酸甲酯。2.2、大孔吸附樹(shù)脂純化將初步純化的1000毫升級(jí)的頭孢克洛及雜質(zhì)的混合水溶液調(diào)節(jié)pH值至l一2，如表1所示分別加入裝有大孔吸附樹(shù)脂的層析柱，待吸附完全后，以l一2倍樹(shù)脂體積的水沖洗樹(shù)脂，然后，分別使用表1所示的洗脫液進(jìn)行洗脫，在采用約一倍樹(shù)脂體積洗脫液洗脫后，紫外檢測(cè)器顯示頭孢克洛開(kāi)始從吸附樹(shù)脂上洗脫下來(lái)，此時(shí)收集洗脫液。表l、大孔吸附樹(shù)脂純化<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注Hz816吸附樹(shù)脂購(gòu)自上海華震科技有限公司；AmberliteXAD-4吸附樹(shù)脂購(gòu)自美國(guó)羅門哈斯公司。檢測(cè)洗脫液中頭孢克洛及主要雜質(zhì)的含量，并計(jì)算頭孢克洛的得率，結(jié)果如表2所示。表2、洗脫液中頭孢克洛的純度及主要雜質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表1和表2的結(jié)果可見(jiàn)，相對(duì)于樹(shù)脂處理前，使用上述4種有機(jī)溶劑-水混合液進(jìn)行洗脫后，獲得的洗脫液中，頭孢克洛的得率均達(dá)到90%以上，且純度均超過(guò)99%，而在主要的雜質(zhì)中，苯甘氨酸含量降低了約lO—ll倍，7-ACCA含量降低了約5倍，苯甘氨酸甲酯含量降低了約3倍。實(shí)施例3、結(jié)晶經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂純化后的頭孢克洛洗脫液，分別于35—45t:之間減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮后加入等體積的異丙醇攪拌，4'C冷卻，并緩慢滴加氨水至溶液開(kāi)始出現(xiàn)渾濁，攪拌1小時(shí)后，用氨水調(diào)節(jié)pH值至4，攪拌均勻，結(jié)晶干燥后得頭孢克洛水合物固體，同時(shí)，以步驟2.1獲得的頭孢克洛及雜質(zhì)的混合水溶液進(jìn)行結(jié)晶作為對(duì)照。分別檢測(cè)上述獲得的頭孢克洛水合物晶體獲得的固體中頭孢克洛的純度及各主要雜質(zhì)的含量，結(jié)果如表3所示。表3、晶體中頭孢克洛的純度及主要雜質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表3的結(jié)果可見(jiàn)，對(duì)照的樣品中頭孢克洛純度為98.3%，苯甘氨酸含量0.93%,7-ACCA含量0.3lX，苯甘氨酸甲酯0.08%，不符合市售頭孢克洛原料藥標(biāo)準(zhǔn)；而經(jīng)過(guò)大孔吸附樹(shù)脂純化后，樣品中頭孢克洛的純度達(dá)到99.4—99.5%;苯甘氨酸的含量降至0.18—0.22%;7陽(yáng)ACCA的含量降至0.02—0.022%;苯甘氨酸甲酯的含量降至0.006—0.008%，同時(shí)，按照藥典中測(cè)定頭孢克洛的含量的方法檢測(cè)結(jié)晶后的晶體頭孢克洛的含量，結(jié)果顯示，上述純化后的溶液的結(jié)晶晶體中頭孢克洛的含量均高于95%，符合市售頭孢克洛原料藥標(biāo)準(zhǔn)。綜上所述，采用本發(fā)明的純化方法，可以從頭孢克洛萘酚復(fù)合物中獲得高純度的頭孢克洛，且雜質(zhì)含量低，符合《藥典》的標(biāo)準(zhǔn)，可以直接作為市售原料藥。權(quán)利要求1、一種從頭孢克洛萘酚復(fù)合物中提純頭孢克洛的方法，其特征在于包括以下步驟A)水洗頭孢克洛萘酚復(fù)合物，然后以有機(jī)溶劑萃取水相中的雜質(zhì)，收集水相；B)調(diào)節(jié)水相溶液的pH值至1-2，然后上大孔吸附樹(shù)脂吸附；C)待吸附完全后，使用低碳有機(jī)溶劑-水混合液作為流動(dòng)相洗脫頭孢克洛，收集洗脫液。2、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，步驟A中用于萃取雜質(zhì)的有機(jī)溶劑為醋酸丁酯。3、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，步驟A中所述有機(jī)溶劑萃取雜質(zhì)的步驟重復(fù)多次。4、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔吸附樹(shù)脂為聚苯乙烯吸附樹(shù)脂及其衍生樹(shù)脂。，5、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述大孔吸附樹(shù)脂為Hz816吸附樹(shù)脂或AmberliteXAD-4吸附樹(shù)脂。6、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述低碳有機(jī)溶劑-水混合液為甲醇-水混合液、乙腈-水混合液、丙酮-水混合液或異丙醇-水混合液。7、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述甲醇-水混合液為體積比1:1的甲醇-水混合液。8、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述異丙醇-水混合液為1:1的異丙醇-水混合液。9、如權(quán)利要求1一8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，還包括對(duì)洗脫液進(jìn)行結(jié)晶獲得頭孢克洛晶體的步驟。全文摘要本發(fā)明提供了一種從頭孢克洛萘酚復(fù)合物中提純頭孢克洛的方法，本發(fā)明提供的方法包括以下步驟A)水洗頭孢克洛萘酚復(fù)合物，然后以有機(jī)溶劑萃取水相中的雜質(zhì)，收集水相；B)調(diào)節(jié)水相溶液的pH值至1-2，然后上大孔吸附樹(shù)脂吸附；C)待吸附完全后，使用低碳有機(jī)溶劑-水混合液作為流動(dòng)相洗脫頭孢克洛，收集洗脫液。采用本發(fā)明的純化方法，可以從頭孢克洛萘酚復(fù)合物中獲得高純度的頭孢克洛，且雜質(zhì)含量低，符合《藥典》的標(biāo)準(zhǔn)，可以直接作為市售原料藥。文檔編號(hào)C07D501/12GK101314605SQ20081003889公開(kāi)日2008年12月3日申請(qǐng)日期2008年6月12日優(yōu)先權(quán)日2008年6月12日發(fā)明者林金萍,許偉欽,魏東芝申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)