專利名稱：人纖維蛋白原制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人纖維蛋白原制劑的制備方法。
背景技術(shù)：
人纖維蛋白原是一個分子量為340000、分子長46nm的纖維狀蛋白質(zhì)， 由2964個氨基酸組成，每一分子含6條兩兩相同的肽鍵，分別稱為。鏈、 P鏈、Y鏈，由29個二硫鏈將6條肽鍵交聯(lián)成一個對稱的整體分子，6條 肽鏈的N末端部分集中在中間，它們的C末端對稱地分布在分子兩端。人 纖維蛋白原主要由肝臟實質(zhì)細胞合成，大部分存在血漿中，僅約15%存在 于血管外，正常人血漿含量2.4~4.0g/L，半壽期為96 144小時。貯存穩(wěn)定 性較好，熱穩(wěn)定性差，在56i:可形成不可逆沉淀，生理止血需要量為正常 水平的25%~50%。人纖維蛋白原具有止血凝血功能，已廣泛應(yīng)用于各種先 天性纖維蛋白原減少或缺乏癥；獲得性纖維蛋白原減少癥，如嚴重肝臟損 傷，肝硬化，彌散性血管內(nèi)凝血，產(chǎn)后大出血和因大手術(shù)、外傷或內(nèi)出血 等引起的纖維蛋白原缺乏而造成的凝血障礙；先天性異常纖維蛋白原血癥； 原發(fā)性纖溶癥的治療，其原液生產(chǎn)工藝直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種人纖維蛋白原制劑的制備方法，該方法制備 的人纖維蛋白原質(zhì)量穩(wěn)定，抗熱性和病毒安全性好。 本發(fā)明是這樣來實現(xiàn)的，其制備方法步驟為1、融漿將檢驗后符合《質(zhì)量標準》的原料血漿，在化漿間，先用溫 度低于30。C的75%酒精噴淋，再用溫度低于30。C注射用水沖洗盡酒精并吹 干，然后將原料血漿破袋后輸送到融漿罐，用3(T35。C的水進行夾層循環(huán)融漿，血漿融化后，及時停止水循環(huán)，把血漿溫度控制在0 4。C之間，離心分離冷沉淀，離心過程中出液流速小于2升/分/臺，溫度控制在0 4。C，去除 沉淀后的血漿輸送至反應(yīng)罐進行提取分離。2、 組分I沉淀血漿進入反應(yīng)罐后，計量、啟動攪拌并控制血漿的溫度在0 rC之間，滴定計算需加pH4. 0緩沖液量；控制流速不超過1.0升/ 分鐘加入緩沖液調(diào)節(jié)pH值為6.80 7.20;加-20卩以下的50%酒精至8%，流 速為1.0 1.2升/分，溫度控制在-l -3。C;加完酒精后pH應(yīng)為6.90 7.10進 行離心，離心過程中出液流速小于2升/分/臺，液溫控制在-l -3"C，離心得 組分I沉淀和組分I 8%上清液。上清液用于繼續(xù)分離白蛋白、免疫球蛋白 及其它產(chǎn)品，組分I沉淀進行下步工序。3、 組分II沉淀稱出組分I沉淀重量A，根據(jù)沉淀的重量配制一定體 積沉淀溶解液A。溶解液A的配制為1.4%檸檬酸三鈉，0.9%氯化鈉、1.1% 的蔗糖混合，加入注射用水溶解后，攪拌均勻，并用5%HCI調(diào)節(jié)pH值為 7. 00 7.10，溫度控制在35~37°C 。將沉淀粉碎后加入10倍沉淀重量35~37 'C的溶解液A，在35 37'C的條件下攪拌溶解約0. 5小時。連接板框濾器，安裝K700濾板，安裝后用溶解液A平衡濾器，平衡20 分鐘后，開始過濾溶解液，過濾時保持流速為1.5 2.0升/分鐘。過濾結(jié)束 后，計量濾液體積。根據(jù)濾液的體積，配制一定體積的含lP/。Tween80， 3.3%磷酸三丁酯 (TNBP) S/D溶液，溫度30。C以下，按濾液體積，以每升濾液加100ml比 例，在攪拌下以0. 5升/分的速度加入濾液中，使濾液最終Tween80為1. P/。、 TNBP為0.33。/。，并在水浴24 26i:的條件下緩慢攪拌保溫6小時，以有效滅活脂包膜病毒。保溫結(jié)束后，把濾液轉(zhuǎn)移至冷操作間，用冷媒將溶液的溫 度降至0 rC之間，加入-20°C以下的50%酒精至8%，加入時，流速為0. 4~0.6升/分，并維持溶解液的溫度為-l -3i:之間。加完后繼續(xù)攪拌30分鐘，測 定pH值應(yīng)為7.00~7.10。連接離心機間的管道，開始離心?？刂齐x心出液 的流速為2.5~3.0升/分冶、出液溫度為-l -3。C，離心結(jié)束后，稱了沉淀重4、 組分m沉淀根據(jù)沉淀的重量B配制一定體積沉淀溶解液B。溶解 液B的配制為1.4%檸檬酸三納，0.9%氯化鈉混合，加入注射用水溶解后， 攪拌均勻，并用5%HCI調(diào)節(jié)pH值為7. 00~7.10，溫度控制在35 37°C ，將沉 淀粉碎后加入10倍沉淀重量35 37°C的溶解液B，在35~37°C的條件下攪拌 溶解半小時。連接板框濾器，安裝EK濾板，安裝后用溶解液B平衡濾器，平衡20 分鐘后，開始過濾溶解液，過濾時保持流速為1.5 2.0升/分鐘。過濾結(jié)束 后，計量濾液體積。把濾液轉(zhuǎn)移至冷操作間，用冷媒將溶液的溫度降至t) rc之間，加入-20。C以下的50%酒精至8%，加入時，流速為0. 4 0.6升/分，并維持溶液的溫 度為-l -3T:之間。加完后繼續(xù)攪拌30分鐘，測定pH值應(yīng)為7.00 7.10。連 接離心機間的管道，開始離心。控制離心出液的流速為2.5~3.0升/分/臺、 出液溫度為-l 3。C，離心結(jié)束后，稱出沉淀重量C。5、 原液制取根據(jù)沉淀重量C配制一定體積溶解液C。溶解液C的配 制為1.55%擰檬酸三鈉、0.85%氯化鈉、4.5%的精氨酸鹽酸鹽混合，加入 注射用水溶解后，攪拌均勻，并用5%HCI調(diào)節(jié)pH值為6.90 7.10，溫度控 制在35 37°C 。將沉淀粉碎后加入4. 5 5.5倍沉淀重量35 37°C的溶解液C， 在35 37。C的條件下攪拌溶解約0.5小時，然后在99.5土5。C溫度下，保溫 30分鐘以滅活非脂包膜病毒。連接板框濾器，安裝EK濾板，安裝后用溶解液C平衡濾器，平衡20分鐘后，開始過濾溶解液，過濾時保持流速成為1.5 2.0升/分鐘。過濾結(jié) 束后，計量濾液體積。取過濾液測定蛋白含量。根據(jù)測定的蛋白含量，用溶解液(3調(diào)節(jié)蛋白濃度為2.5 3.5%，檸檬酸 三鈉含量為1.55±0.05%，氯化鈉含量為0.85±0.05%，精氨酸鹽酸鹽含量 為4. 5±1%，用5。/。HCI調(diào)節(jié)pH值為7. 0±0. 2。本發(fā)明的優(yōu)點是用該工藝生產(chǎn)出的人纖維蛋白原質(zhì)量穩(wěn)定，提高人 纖維蛋白原病毒安全性，在原有的S/D法滅活病毒工藝的基礎(chǔ)上，增加99. 5 土0.5。C保溫30分鐘的干熱滅活病毒工藝，以滅活非脂包膜病毒。為了提 高纖維蛋白原抗熱性，加入4.5%的精氨酸鹽酸鹽替代蔗糖作為穩(wěn)定劑，其 注射使用的安全性毋庸置置疑，尤其制品中加入的鹽酸精氨酸量甚微。
具體實施方式
本發(fā)明的制備方法步驟為-1、 融漿將檢驗后符合《質(zhì)量標準》的原料血漿，在化漿間，先用溫 度低于3(TC的75%酒精噴淋，再用溫度低于3(TC注射用水沖洗盡酒精并吹 干，然后將原料血漿破袋后輸送到融漿罐，用30 35。C的水進行夾層循環(huán)融 漿，血漿融化后，及時停止水循環(huán)，把血漿溫度控制在o 4r之間，離心分 離冷沉淀，離心過程中出液流速小于2升/分/臺，溫度控制在0 4。C，去除 沉淀后的血漿輸送至反應(yīng)罐進行提取分離。2、 組分I沉淀血漿進入反應(yīng)罐后，計量、啟動攪拌并控制血漿的溫 度在0 rC之間，滴定計算需加pH4. 0緩沖液量；控制流速不超過1. 0升/ 分鐘加入緩沖液調(diào)節(jié)pH值為6. 80 7.20;力[]-20°(:以下的50%酒精至8%，流 速為1. 0-1.2升/分，溫度控制在-l -3。C;加完酒精后pH應(yīng)為6.90 7.10進 行離心，離心過程中出液流速小于2升/分/臺，液溫控制在-l一3"C，離心得 組分I沉淀和組分I 8%上清液。上清液用于繼續(xù)分離白蛋白、免疫球蛋白及其它產(chǎn)品，組分I進行下步工序。3、 組分II沉淀稱出組分I沉淀重量A，根據(jù)沉淀的重量配制一定體積沉淀溶解液A。溶解液A的配制為1.4%擰檬酸三鈉，0.9%氯化鈉、1.1% 的蔗糖混合，加入注射用水溶解后，攪拌均勻，并用5%HCI調(diào)節(jié)pH值為 7. 00~7.10，溫度控制在35~37°C 。將沉淀粉碎后加入10倍沉淀重量35~37 °。的溶解液A，在35 37"C的條件下攪拌溶解約0. 5小時。連接板框濾器，安裝K700濾板，安裝后用溶解液A平衡濾器，平衡20 分鐘后，開始過濾溶解液，過濾時保持流速為1.5 2.0升/分鐘。過濾結(jié)束 后，計量濾液體積。根據(jù)濾液的體積，配制一定體積的含11。/。Tween80， 3.3%磷酸三丁酯 (TNBP) S/D溶液，溫度30。C以下，按濾液體積，以每升濾液加100ml比 例，在攪拌下以0. 5升/分的速度加入濾液中，使濾液最終Tween80為1. 1%、 TNBP為0.33。/c)，并在水浴24 26"的條件下緩慢攪拌保溫6小時，以有效滅 活脂包膜病毒。保溫結(jié)束后，把濾液轉(zhuǎn)移至冷操作間，用冷媒將溶液的溫 度降至0-rC之間，加入-20。C以下的50%酒精至8%，加入時，流速為0. 4 0.6 升/分，并維持溶解液的溫度為-1 -3°(:之間。加完后繼續(xù)攪拌30分鐘，測 定pH值應(yīng)為7.00~7.10。連接離心機間的管道，開始離心?？刂齐x心出液 的流速為2.5~3.0升/分冶、出液溫度為-l -3'C，離心結(jié)束后，稱了沉淀重4、 組分III沉淀根據(jù)沉淀的重量B配制一定體積沉淀溶解液B。溶解 液B的配制為1.4%擰檬酸三納，0.9%氯化鈉混合，加入注射用水溶解后， 攪拌均勻，并用5%HCI調(diào)節(jié)pH值為7. 00~7.10，溫度控制在35~37°C，將沉 淀粉碎后加入10倍沉淀重量35 37"C的溶解液B，在35 37'C的條件下攪拌 溶解半小時。連接板框濾器，安裝EK濾板，安裝后用溶解液B平衡濾器，平衡20 分鐘后，開始過濾溶解液，過濾時保持流速為1.5~2.0升/分鐘。過濾結(jié)束 后，計量濾液體積。把濾液轉(zhuǎn)移至冷操作間，用冷媒將溶液的溫度降至0 rc之間，加入-20。C以下的50%酒精至8%，加入時，流速為0.4 0.6升/分，并維持溶液的溫 度為-l -3"C之間。加完后繼續(xù)攪拌30分鐘，測定pH值應(yīng)為7.00 7.10。連 接離心機間的管道，開始離心?？刂齐x心出液的流速為2.5~3.0升/分/臺、 出液溫度為-l 3。C，離心結(jié)束后，稱出沉淀重量C。5、原液制取根據(jù)沉淀重量C配制一定體積溶解液C。溶解液C的配 制為1.55%檸檬酸三鈉、0.85%氯化鈉、4.5%的精氨酸鹽酸鹽混合，加入 注射用水溶解后，攪拌均勻，并用5%HCI調(diào)節(jié)pH值為6.90 7.10，溫度控 制在35~37°C。將沉淀粉碎后加入4. 5~5.5倍沉淀重量35 37。C的溶解液C， 在35 37r的條件下攪拌溶解約0.5小時，然后在99.5士5。C溫度下，保溫 30分鐘以滅活非脂包膜病毒。連接板框濾器，安裝EK濾板，安裝后用溶解液C平衡濾器，平衡20 分鐘后，開始過濾溶解液，過濾時保持流速成為1.5 2.0升/分鐘。過濾結(jié) 束后，計量濾液體積。取過濾液測定蛋白含量。根據(jù)測定的蛋白含量，用溶解液(3調(diào)節(jié)蛋白濃度為2.5 3.5%，檸檬酸 三鈉含量為1.55±0.05%，氯化鈉含量為0.85±0.05%，精氨酸鹽酸鹽含量 為4. 5±1%，用596HCI調(diào)節(jié)pH值為7. 0±0. 2。
權(quán)利要求
1、一種人纖維蛋白原制劑的制備方法，其特征是制備方法步驟為(1)融漿將原料血漿，先用溫度低于30℃的75％酒精噴淋，再用溫度低于30℃注射用水沖洗盡酒精并吹干，然后將原料血漿破袋后輸送到融漿罐，用30～35℃的水進行夾層循環(huán)融漿，血漿融化后，及時停止水循環(huán)，把血漿溫度控制在0～4℃之間，離心分離沉淀，去除沉淀后的血漿輸送至反應(yīng)罐進行提取分離；(2)組分I沉淀血漿進入反應(yīng)罐后，計量、啟動攪拌并控制血漿的溫度在0～1℃之間，滴加緩沖液；控制流速不超過1.0升/分鐘，調(diào)節(jié)pH值為6.80～7.20；加-20℃以下的50％酒精至8％，流速為1.0～1.2升/分，溫度控制在-1～-3℃；加完酒精后進行離心，離心得組分I沉淀和組分I 8％上清液，組分I沉淀進行下步工序；(3)組分II沉淀稱出組分I沉淀重量A，根據(jù)沉淀的重量配制沉淀溶解液A，將沉淀粉碎后加入10倍沉淀重量的溶解液A，在35～37℃的條件下攪拌溶解約0.5小時，用板框濾器過濾溶解液，過濾時保持流速為1.5～2.0升/分鐘，根據(jù)濾液的體積，配制含11％Tween80，3.3％磷酸三丁酯的溶液，溫度30℃以下，按濾液體積，以每升濾液加100ml比例，在攪拌下以0.5升/分的速度加入濾液中，并在水浴24～26℃的條件下緩慢攪拌保溫6小時，以有效滅活脂包膜病毒，保溫結(jié)束后，把濾液轉(zhuǎn)移至冷操作間，將溶液的溫度降至0～1℃之間，繼續(xù)攪拌30分鐘，測定pH值為7.00～7.10，連接離心機離心，控制離心出液的流速為2.5～3.0升/分/臺、出液溫度為-1～-3℃，離心結(jié)束后，稱取沉淀重量B；(4)組分III沉淀根據(jù)沉淀的重量B配制沉淀溶解液B，將沉淀粉碎后加入10倍沉淀重量的溶解液B，在35～37℃的條件下攪拌溶解半小時，連接板框濾器過濾溶解液，把濾液轉(zhuǎn)移至冷操作間，將溶液的溫度降至0～1℃之間，加入-20℃以下的50％酒精至8％，加完后繼續(xù)攪拌30分鐘，測定pH值為7.00～7.10，開始離心，控制離心出液的流速為2.5～3.0升/分/臺、出液溫度為-1～3℃，離心結(jié)束后，稱出沉淀重量C；(5)原液制取根據(jù)沉淀重量C配制溶解液C，將沉淀粉碎后加入4.5～5.5倍重量溶解液C，在35～37℃的條件下攪拌溶解約0.5小時，然后在99.5±5℃溫度下，保溫30分鐘以滅活非脂包膜病毒，過濾溶解液，取過濾液測定蛋白含量，根據(jù)測定的蛋白含量，用溶解液C調(diào)節(jié)蛋白濃度為2.5～3.5％，檸檬酸三鈉含量為1.55±0.05％，氯化鈉含量為0.85±0.05％，精氨酸鹽酸鹽含量為4.5±1％，用5％HCI調(diào)節(jié)pH值為7.0±0.2。
2、 如權(quán)利要求l所述的人纖維蛋白原制劑的制備方法，其特征是溶解 液A的配制方法為1.4。/。檸檬酸三鈉，0.9°/。氯化鈉、1.1%的蔗糖混合，加 入注射用水溶解后，攪拌均勻，并用5%HCI調(diào)節(jié)pH值為7. 00 7.10，在35 37 。C的條件下攪拌溶解0. 5小時。
3、 如權(quán)利要求l所述的人纖維蛋白原制劑的制備方法，其特征是溶解 液B的配制方法為1.4%檸檬酸三納，0.9%氯化鈉混合，加入注射用水溶 解后，攪拌均勻，并用5。/。HCI調(diào)節(jié)pH值為7.00 7.10，在35 37。C的條件下 攪拌溶解半小時。
4、 如權(quán)利要求l所述的人纖維蛋白原制劑的制備方法，其特征是溶解 液C的配制方法為1.55%檸檬酸三鈉、0.85%氯化鈉、4.5%的精氨酸鹽酸 鹽混合，加入注射用水溶解后，攪拌均勻，并用5%HCI調(diào)節(jié)pH值為 6.90~7.10，溫度控制在35 37X:。
全文摘要
一種人纖維蛋白原制劑的制備方法，其特征是制備方法步驟為(1)融漿；(2)組分I沉淀；(3)組分II沉淀；(4)組分III沉淀；(5)原液制取。本發(fā)明的優(yōu)點是用該工藝生產(chǎn)出的人纖維蛋白原質(zhì)量穩(wěn)定，提高人纖維蛋白原病毒安全性，在原有的S/D法滅活病毒工藝的基礎(chǔ)上，增加99.5±0.5℃保溫30分鐘的干熱滅活病毒工藝，以滅活非脂包膜病毒。
文檔編號C07K14/435GK101229367SQ20081004674
公開日2008年7月30日 申請日期2008年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月21日
發(fā)明者梁小明 申請人:江西博雅生物制藥股份有限公司