專利名稱：一種雞傳染性支氣管炎病毒膜蛋白基因及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雞傳染性支氣管炎病毒膜蛋白基 因及其克隆方法。
背景技術(shù)：
雞傳染性支氣管炎(Infectious Bronchitis，IB)是由傳染性支氣管炎病毒 (Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病，主 要侵害雞的呼吸、消化和泌尿生殖系統(tǒng)，造成蛋雞產(chǎn)蛋數(shù)量減少，蛋的品質(zhì)下 降；雛雞由于呼吸道或腎臟感染而大批死亡。另外，該病還可引起雞的增重和 飼料報(bào)酬下降，給養(yǎng)禽業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，成為阻礙世界養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的 最主要的傳染性疾病之一。
IBV是冠狀病毒科、冠狀病毒屬的代表種，外有囊膜，呈中等多形性球狀 或橢圓形的病毒粒子，表面有桿狀突起。其基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA， 全長(zhǎng)約27.6 kb。 IBV在復(fù)制過程中產(chǎn)生6種mRNA (mRNA1 6)，共編碼4種 結(jié)構(gòu)蛋白纖突蛋白(S)、小膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)。 S蛋白 位于病毒粒子表面，由等摩爾的SI和S2兩部分組成，S蛋白上有病毒主要保 護(hù)性抗原表位，其中的S1蛋白部分可激發(fā)中和抗體、血凝抑制抗體，與病毒的 組織嗜性有關(guān)，同時(shí)也是IBV基因組中變異最大的部分，所以國(guó)內(nèi)外的學(xué)者， 長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)IBV的研究大多都集中在S1基因上，而對(duì)膜蛋白的研究甚少，更缺 乏系統(tǒng)、深入的科學(xué)數(shù)據(jù)。
M蛋白由mRNA4編碼，約占病毒總蛋白的40%，由224 225個(gè)氨基酸組成， 其大部分位于囊膜內(nèi)，僅有N端糖基化的小部分暴露于雙層脂質(zhì)外面，M蛋 白膜外部分的親水端含有多個(gè)糖基化位點(diǎn)，對(duì)病毒的傳染性具有決定性的 作用，它與病毒的復(fù)制、抗感染、誘導(dǎo)白細(xì)胞產(chǎn)生a-干擾素等有關(guān)。M基因 是保守性較高的基因，國(guó)外學(xué)者Jia等(Jia W, Naqi S A. Sequence analysis of gene 3, gene 4 and gene 5 of avian infectious bronchitis virus srtain CU-T2[J]. Gene, 1997, 189(2): 189-193.)在fF究IBV的一個(gè)自然重組的新變異株CU-T2時(shí)發(fā)現(xiàn)，其M蛋白 與其他IBV的同源性僅有85.8n/。 88.8n/。，而國(guó)內(nèi)的研究表明不同毒株IBVM基因 的核苷酸同源性可達(dá)83% 100%(楊帆，王紅寧，李春，等.禽傳染性支氣管炎病毒四川 分離株M基因的克隆及真核表達(dá)載體構(gòu)建[J].四川畜牧獸醫(yī)，2003， 30(154): 23-26.任乾廖 明，曹偉勝，等.雞傳染性支氣管炎病毒中國(guó)地方分離株膜蛋白基因的克隆及序列分析[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2006， 42(8): 3-6.)。目前為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)雞傳染性支氣管炎病毒膜蛋白基 因的研究尚無(wú)定論，因而，對(duì)雞傳染性支氣管炎病毒膜蛋白基因的系統(tǒng)、深入 研究，從分子水平上揭示IBV的流行與變異規(guī)律，對(duì)預(yù)防和控制IB在我國(guó)的發(fā)生 和流行顯得十分必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種雞傳染性支氣管炎病毒膜蛋白基因；本發(fā)明的另 一目的是提供一種雞傳染性支氣管炎病毒膜蛋白基因的克隆方法。 本發(fā)明的技術(shù)方案
本發(fā)明的雞傳染性支氣管炎病毒膜蛋白基因，該基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.l所示。
本發(fā)明的雞傳染性支氣管炎病毒膜蛋白基因，該基因的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。
雞傳染性支氣管炎病毒膜蛋白基因的克隆方法，選取雞傳染性支氣管炎病 毒HN99株，以5' -CGGAATTCAGTTTCCTAAGAACGGTTGGAA-3'為上游 引物，以5' -CCCAAGCTTCTCTCTACACGCACACATTTAT-3'為下游引物， 通過RT-PCR的方法擴(kuò)增出雞傳染性支氣管炎病毒HN99株膜蛋白基因全長(zhǎng)片 段，PCR的擴(kuò)增條件為95 。C預(yù)變性5min， 94 。C變性45 s， 53 。C退火45s， 72 。C延伸2min， 35個(gè)循環(huán)；72 。C延伸10min， 4 'C結(jié)束反應(yīng)；然后將膜蛋白 基因全長(zhǎng)片段與Pdml8—T載體連接。
本發(fā)明的有益效果雞傳染性支氣管炎病毒HN99株膜蛋白基因的全基因 序列及其氨基酸序列的主要結(jié)構(gòu)特征是首次測(cè)定；IBV HN99株M基因全序列 為669個(gè)核苷酸，編碼222個(gè)氨基酸殘基的M蛋白，與國(guó)際公認(rèn)的M基因的長(zhǎng) 度為224 225個(gè)氨基酸殘基有所不同；IBVHN99株M基因的分子遺傳變異規(guī) 律及其編碼的膜蛋白上的抗原表位的發(fā)現(xiàn)，對(duì)于傳染性支氣管炎基因工程抗原 與基因工程疫苗的研制與應(yīng)用，具有重要意義。


圖1是IBV HN99株M基因的RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，M: DNA分子量標(biāo) 準(zhǔn)；1,2,3,4: IBVHN99株M基因的RT-PCR產(chǎn)物。
圖2是pMD18-T-M重組質(zhì)粒的雙酶切和PCR鑒定，M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1,2: pMD18-T-M的PCR產(chǎn)物。
圖3是IBV HN99株M基因核苷酸序列與其他11個(gè)參考毒株的同源性比較。
圖4是IBV HN99株M基因推導(dǎo)的氨基酸序列與其他11個(gè)參考毒株的同源 性比較。
4圖5是IBVHN99株M基因與其他參考毒株的核苷酸序列比較。
圖6是IBVHN99株與其他參考毒株的M蛋白序列比較。
圖7是IBVHN99株與參考株M基因遺傳進(jìn)化樹。
圖8是IBV HN99株與參考株M蛋白遺傳進(jìn)化樹。
圖9是IBVHN99株M蛋白與參考株表面可能性比較。
圖10是IBVHN99株M蛋白與參考株親水性比較。
圖11是IBVHN99株M蛋白與參考株抗原指數(shù)比較。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明。 1材料 1.1毒株
IBV-HN99株，該毒株已申請(qǐng)中國(guó)專利(專利申請(qǐng)?zhí)栁粸?00610018065.4)， 并于2008年1月9號(hào)公開。 1.2 SPF雞胚
9 11日齡SPF雞胚由中牧股份實(shí)業(yè)有限公司鄭州生物藥廠提供。 1.3載體與菌株
克隆載體pMD18-T為TaKaRa公司產(chǎn)品；大腸桿菌TOP10購(gòu)自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)
分子病毒學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。 1.4工具酶與試劑
所用限制酶均購(gòu)自TaKaRa公司；Trizol RNA提取試劑盒為Invitrogen公司 產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Reverse Transcription System為T0Y0B0公司產(chǎn)品；DNA快 速回收試劑盒購(gòu)自上海申能博彩生物工程有限公司；質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖匈?gòu)自上 海中科開瑞生物芯片科技股份有限公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技 術(shù)有限公司。IPTG (異丙基硫代-P-D-半乳糖苷)、X-gal (5-溴-4-氯-3』引哚-|3-0-半乳糖苷)、dNTP、 DEPC (焦磷酸二乙酯)、EB (溴化乙錠)為大連寶生物公 司產(chǎn)品。
1.5引物
參照GenBank中己發(fā)表的IBV M基因序列，采用弓I物設(shè)計(jì)軟件Prime Premier 5.0設(shè)計(jì)一對(duì)引物，在上、下游分別加入5co/ I 、 //z"dni酶切位點(diǎn)，兩段引物的 序列為
上游引物 5 '-CGGAATTC AGTTTCCTAAGAACGGTTGGAA-3' 下游引物 5'-CCCAAGCTTCTCTCTACACGCACACATTTAT-3'
引物由上海生物工程公司合成。1.6 IBV參考毒株名稱及GeneBank登錄號(hào)
IBVM基因的參考毒株H52、 Cal99、 H120、 GDS14、 EP3、 Gray、 LX4、 BJ、 M41、 Beaudette、 SAIB20; GenBank登錄號(hào)分別為AF286185、 AY514485、 AY028295、 AY646283、DQ001338、 AF363607、 AY851295 、 AY319651 、 AF286184、 M95169、 AY302749。
1.7培養(yǎng)基的配制及常用溶液的配制
大腸桿菌完全培養(yǎng)基LB:將10 g蛋白胨、5 g酵母粉、10 gNaCl溶解在750 mL雙蒸水中，調(diào)整pH值至7.0，固體培養(yǎng)基另加入15g瓊脂粉，加水定容至1 L， 15磅滅菌處理20min備用。
大腸桿菌選擇培養(yǎng)基LB:當(dāng)加熱溶解的滅菌LB培養(yǎng)基溫度降到大約50°C 時(shí)，向其中按60mg/L濃度加入氨芐青霉素(Amp)。
磷酸鹽緩沖溶液(PBS): 8 gNaCl， 0.2 gKCl， 1.44 gK2HP04， 0.24 gKH2P04， HCl調(diào)pH值至7.4，加水定容至1L， 15磅20min滅菌處理后備用。
TE緩沖液10 mmol/L Tris.Cl， 1 mmol/L EDTA， pH8.0。
2 M Tris-HCl (pH 8.8); 1 M Tris誦HCl (pH 6.8); 10%SDS; 10%甘油；平衡 酚-氯仿(25:24); 75%乙醇。
小量堿裂解法制備質(zhì)粒所用溶液
溶液I : 50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)， 10 mmol/L EDTA
(pH8.0)， 8磅滅菌15min后置于4"C備用。
溶液II: 0.2mol/LNaOH， 1% SDS，使用時(shí)新鮮配制。
溶液III: 5mol/L乙酸鉀60mL，濃乙酸11.5mL， ddH20 28.5mL。
無(wú)DNA酶的RNA酶溶液將胰RNA酶(RNA酶A)溶于10 mmol/L
Tris-HCl (pH7.5)、 15mmol/LNaCl中，配成10mg/mL的濃度，于100 。C加熱
15min，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于一2(TC備用。 瓊脂糖凝膠電泳所用溶液
50x電泳緩沖液TAE貯存液242 g Tris-base， 57.1 mL冰乙酸，100 mL 0.5 mol/LEDTA混合溶于雙蒸水中調(diào)節(jié)pH值到8.0，定容至1 L。 lxTAE使用液將上述TAE濃貯存液用雙蒸水稀釋50倍。 6x溴酚藍(lán)指示劑0.25%溴酚藍(lán)，40%蔗糖。
溴化乙錠(EB，核酸染色劑，10mg/mL):在1000 mL水中加入10 g溴化乙 錠，使之充分溶解，于室溫保存在棕色瓶中。
200 mmol/L的IPTG:用超純水溶解IPTG，配制成200 mmol/L的水溶液， 過濾除菌，分裝于1.5mLEppendorf管中，貯存于一20°C。20 mg/mL的X-gal:用二甲基甲酰胺溶解X-gal，配制成20 mg/mL的水溶 液，分裝于1.5mLEppendorf管中，用鋁箔封裹避光，貯存于一20。C。 1.8主要儀器
離子水生成儀；PCR儀；高速低溫離心機(jī)；臺(tái)式離心機(jī)；紫外可見光光度 儀3000型；紫外分析儀97500型；超凈工作臺(tái)；空氣浴振蕩器HZQ-C;微波爐； 致冰機(jī)；電泳儀；微量移液器；電子天平；干烤箱；恒溫培養(yǎng)箱；冰箱。
2方法
2.1 IBV增殖與RNA的提取
將HN99株病毒液分別經(jīng)一定比例稀釋，接種10日齡SPF雞胚，37'C培養(yǎng) 36 h后(棄去24h內(nèi)的死胚)，無(wú)菌收集尿囊液，4°C 5 000 r/min離心30 min， 取上清，再以27 000r/min離心2h，用吸管輕輕吸出上清棄去，管底留下大約1 mL，吹打，混勻。取該超離病毒液500 ^L,加Trizol試劑500 jjL，劇烈震蕩1 min，室溫靜置5min;加200nL三氯甲烷，震蕩混勻30s，靜置10min; 4 °C 12 000r/min離心15min，取上清液(約500 ^L)加等量體積異丙醇混勻，靜置10 min; 4 °C 12 000 r/min離心10 min，棄上清；加入1 mL 75%乙醇，溫和振蕩混 勻，懸浮沉淀；4 。C 7,500 r/min離心5 min，棄上清，室溫干燥10min;用20^iL DEPC水懸浮沉淀。立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄或置一20 t:保存?zhèn)溆谩?br> 2.2 RT-PCR擴(kuò)增IBV HN99株M基因片段 2.2.1逆轉(zhuǎn)錄(RT)
按照Reverse Transcription System試劑盒說(shuō)明書，以特異性下游引物為引物 合成cDNA第一鏈。反應(yīng)體系如表l，依次將以下試劑加入經(jīng)DEPC水處理并 滅菌過的PCR反應(yīng)管中
表l RT反應(yīng)體系組成
RNase Free H206 foL
5 xRT Buffer4jjL
lOmmol/LdNTP2 (aL
RNase inhibitor1
特異性下游引物1
Rev6r Tm Ac61
Total RNA5 joL
總體積20 nL
反應(yīng)參數(shù)為
42 。C 60min95 。C 5min
4 。C 5 min
將反應(yīng)后的產(chǎn)物瞬間離心，立即進(jìn)行PCR或儲(chǔ)存于一20 °C。 2.2.2 PCR擴(kuò)增
以cDNA第一鏈為模板，按照以下反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行目的基因的擴(kuò)
增
表2 PCR反應(yīng)體系組成
cDNA第一鏈5
上游引物0.8
下游引物0.8
10xPCR Buffer2 |iL
10mmol/LdN丁P0.4 )iL
Taq DNA0.2
RNase Free H2010.8
總體積20|iL
反應(yīng)參數(shù)為95。C預(yù)變性5min， 94'C變性45s， 53。C退火45s， 72。C延 伸2min， 35個(gè)循環(huán)；72 'C延伸10min， 4 。C結(jié)束反應(yīng)。取15 ^LPCR產(chǎn)物于1.2% 瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，并觀察結(jié)果。
2.3PCR產(chǎn)物的回收、純化與克隆
2.3.1 PCR產(chǎn)物的回收
將以上PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，用紫外燈觀察電泳結(jié)果，當(dāng)要回收 的DNA帶與引物帶完全分離時(shí)，停止電泳，在紫外燈下用刀片切下含有欲回收 帶的凝膠，用凝膠回收純化試劑盒回收目的片段。
2.3.2 PCR產(chǎn)物的純化
參照DNA快速回收試劑盒說(shuō)明書的操作步驟進(jìn)行純化。
2.3.3 PCR產(chǎn)物的克隆
將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接。連接體系如表3: 表3 PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接體系組成
純化后的PCR產(chǎn)物
pMD18-T載體
ddH203|iL
總反應(yīng)體積5pL連接反應(yīng)液16"C水浴放置過夜后，存于一2(TC備用。 2.4轉(zhuǎn)化
用氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并按常規(guī)方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化ToplO 感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白斑，篩選陽(yáng)性克隆。 2.5重組質(zhì)粒pMD18-T-M(HN99)的提取 參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》采用小量堿裂解法提取質(zhì)粒。 2.6陽(yáng)性重組子的PCR及雙酶切鑒定
2.6.1 PCR反應(yīng)以提取的質(zhì)粒DNA為模板，按照以下反應(yīng)體系(表4) 和反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行目的基因的檢測(cè)
表4 PCR反應(yīng)體系組成
質(zhì)粒DNA0.1
上游引物0.5 jiL
下游引物0.5 |iL
10xPCR Buffer
10mmol/LdNTP0.4
Taq DNA0.2 nL
RNase Free H2016早
總體積20 pL
反應(yīng)參數(shù)為95。C預(yù)變性5min， 94。C變性45s， 53。C退火45s， 72 。C延 伸2min， 35個(gè)循環(huán)；72 。C延伸10min， 4 。C結(jié)束反應(yīng)。取15 )oLPCR產(chǎn)物于1.2% 瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，并觀察結(jié)果。
2.6.2酶切鑒定
用￡coi I 、歷'"d III對(duì)所提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切，酶切體系如表5:
表5酶切體系組成
質(zhì)粒DNA2 |iL
五cM r0.5 nL
歷"d III0.5 nL
10xbufferV
ddH2013 jiL
總反應(yīng)體積20 pL
以上酶切反應(yīng)條件均為37匸，反應(yīng)時(shí)間3h。酶切產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠 電泳進(jìn)行結(jié)果分析。
92.7M基因測(cè)序
將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒pMD18-T-M(HN99)送上海生物工程有限公司進(jìn) 行DNA序列測(cè)定。 2.8遺傳變異分析
對(duì)M基因測(cè)序結(jié)果用Blast和DNAStar軟件分析與GenBank中其它IBV
參考毒株M基因的核苷酸及其編碼的氨基酸進(jìn)行同源性比較；作進(jìn)化分析，繪 制遺傳進(jìn)化樹；并對(duì)其抗原性及疏水性進(jìn)行分析。 3結(jié)果
3.1HN99株、W株M基因的擴(kuò)增
采用本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的特異性引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，.得到了長(zhǎng)度約0.7kb的 片段，與預(yù)期結(jié)果相符(圖l)。 3.2重組質(zhì)粒pMD18-T-M鑒定
由圖2可知，重組質(zhì)粒pMD18-T-M(HN99)經(jīng)特異引物PCR擴(kuò)增出669 bp 的片斷，與預(yù)期結(jié)果一致；pMD18-T-M(HN99)經(jīng)5"wHl 、歷'"d III酶切出2 692 bp和669bp的條帶，與預(yù)期的M基因片段大小相符，表明目的基因已正確插入 克隆載體(圖2)。
3.3 IBV-HN99 M基因的核苷酸序列測(cè)定
選擇酶切和PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒，由上海生物工程公司對(duì)其進(jìn)行了 正反兩個(gè)方向的序列測(cè)定，結(jié)果顯示,HN99株M基因的全序列為669個(gè)核苷酸， 編碼M蛋白222個(gè)氨基酸殘基。
3.4 IBV不同毒株M基因的同源性分析
將HN99株與GenBank中其它11個(gè)毒株的M基因進(jìn)行核苷酸與氨基酸的 同源性分析，結(jié)果表明，HN99株與GDS14、 M41、 Gray、 H52、 BJ等毒株的M 基因核苷酸同源性為87.0% 90.3%，其中與BJ的同源性最高，為90.3%，與 GDS14的同源性最低，為87.0%(圖3); HN99株M基因編碼的氨基酸與其他 IBV毒株的氨基酸同源性為89.7% 94.2%,其中與BJ的同源性最高，為94.2%， 與SAIB的同源性最低，為89.7%(圖4)。
3.5 IBV HN99株M基因的遺傳變異分析
3.5.1 IBVHN99株與參考株M基因的核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列比較 結(jié)果表明，HN99株與GDS14、 M41、 Gray、 H52、 BJ、 LX4等毒株相比， 點(diǎn)突變較多，突變位點(diǎn)散在分布遍及整個(gè)ORF,HN99株存在堿基的插入和缺失， 在3 14位的核苷酸有12個(gè)堿基缺失，在20 22位的核苷酸有3個(gè)堿基插入 (圖5); HN99株M蛋白突變主要發(fā)生在前12位氨基酸，在2位缺失一個(gè)氨基酸，在4 5位缺失2個(gè)氨基酸，在10 12位有3個(gè)氨基酸連續(xù)突變，其他位 點(diǎn)的氨基酸變異為點(diǎn)突變(圖6)。
3.5.2 IBV HN99株M基因進(jìn)化分析
根據(jù)IBVHN99株M基因的核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸的差異性，將HN99株與 國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的ll個(gè)毒株建立遺傳進(jìn)化樹。結(jié)果表明，HN99株、BJ株、W株與 其他參考株屬于不同的分支，親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)(圖7、圖8)。
3.5.3 IBVHN99株M蛋白抗原性分析(抗原指數(shù)、親水性、抗原表位預(yù)測(cè)) 采用DNAStar生物軟件對(duì)IBV HN99株及主要參考株BJ、 H120 M蛋白抗
原指數(shù)、親水性及表面抗原位點(diǎn)進(jìn)行分析，抗原指數(shù)分析表明HN99株M蛋白 的抗原指數(shù)在39 43、 100 107、 111 116、 158 165、 171 177、 185 195、 203 211位的氨基酸處較高(圖9);親水性分析表明HN99株M蛋白在21 37、 45 68、 74 94位的氨基酸處為疏水區(qū)，是M蛋白的3個(gè)跨膜區(qū)(圖10); 表面抗原位點(diǎn)分析表明HN99株M蛋白在39 40、 171 176、 183 193位氨基 酸處含有3個(gè)潛在抗原位點(diǎn)(圖ll)。<110>河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120> —種雞傳染性支氣管炎病毒膜蛋白基因及其克隆方法
<160> 2
<170>DNAstar.
<210> 1 <211>669 <212>DNA <213>雞(Chicken)
<220>
<221> met_peptide <222> (3)...(14) (20,21,22)
<400> 1
Atggaaaatt gcactcttaa cactcagcag gcagctgagc ttttcaagga atacaactta 60 tttataaccg cattcctgtt gtttctcact atactacttc agtatggtta tgcaactagg 120 agtcggctca tctatatagt gaaaatgata gtgttgtggt gcttttggcc cctcaacatt 180 gcaataggtg taatttcatg tatataccca ccaaatacag gaggtcttgt cgcagcgata 240 atacttactg tatttgcgtg tctttctttt gttggttatt ggatccagag tttcagactc 300 tttaagcggt gtaggtcttg gtgggccttt aaccctgaga gcaatgccgt gggttcaata 360 ctccttacaa atggtcagca atgtaacttt gctatagaga gtgtgccaat ggtactatct 420 cctattatta agaatgccat tctttattgc gaaggccagt ggcttgctaa atgtgaacca 480 gatcacttgc ctaaagatat atttgtttgc acacctgata ggcgtaatat ctatcgtatg 540 gtgcagaaat acactggtga ccaaagcgga aacaagaaga gatttgctac gtttgtctat 600 gctaaacagt cagtagatac tggcgagcta gaaagtgtag caacaggagg aaataacctt 660 tacacataa 669<210> 2 <211> 222 <212> PRT <213>雞(Chicken)
<220>
<221> CARBOHYD <222>(2,4，5，10，"，12)
<400> 2
Met Glu Asn Cys Thr Leu Asn Thr Gin Gin Ala Ala Glu Leu Phe
5 10 15
Lys Glu Try Asn Leu Phe lie Thr Ala Phe Leu Leu Phe Leu Thr
20 25 30
lieLeu Leu Gin Try Gly Try Ala Thr Arg Ser Arg Leu lie Try
35 40 45
IkVal Lys Met lie Val Leu Tip Cys Phe Trp Pro Leu Asn He
50 55 60
Ala He GlyVal He Ser Cys HeTry Pro Pro Asn Thr Gly Gly
65 70 75
Leu Val Ala Ala He HeLeu Thr Val Phe Ala CysLeu Ser Phe
80 85 90 Val Gly Try Trp lie Gin Ser Phe Arg Leu Phe Lys Arg Cys Arg
95 100 105
Ser Trp Trp Ala Phe Asn Pro Glu Ser Asn Ala Val Gly Ser Ik
110 115 120
Leu Leu Thr Asn Gly Gin Gin Cys Asn Phe Ak lie Glu Ser Val
125 130 135
Pro Met Val Leu Ser Prolielie Lys Asn Ala lie Leu Try Cys
140 145 150
Glu Gly Gin Trp Leu Ala Lys Cys Glu Pro Asp His Leu Pro Lys
155 160 165
Asp IJe Phe Val Cys Thr Pro Asp Arg Arg Asn lie TryArg Met
170 175 180
Val Gin Lys Try Thr Gly Asp Gin Ser Gly Asn Lys Lys Arg Phe
185 190 195
Ala Thr Phe Val Try Ala Lys Gin Ser Val Asp Thr Gly Glu Leu
200 205 210
Glu Ser Val Ala Thr Gly Gly Asn Asn Leu Try Thr.
215 220
1權(quán)利要求
1.一種雞傳染性支氣管炎病毒膜蛋白基因，其特征在于該基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2. —種雞傳染性支氣管炎病毒膜蛋白基因，其特征在于該基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.如權(quán)利要求1所述的雞傳染性支氣管炎病毒膜蛋白基因的克隆方法，其特征在于選取雞傳染性支氣管炎病毒HN99株，以5 '-CGGAATTCAGTTTCCTAAGAACGGTTGGAA-3 '為上游弓|物，以5 '-CCCAAGCTTCTCTCTACACGCACACATTTAT-3'為下游弓|物，通過RT-PCR的方法擴(kuò)增出雞傳染性支氣管炎病毒HN99株膜蛋白基因全長(zhǎng)片段，PCR的擴(kuò)增條件為95 。C預(yù)變性5min， 94 "C變性45s， 53 。C退火45s， 72 "C延伸2min， 35個(gè)循環(huán)；72 "C延伸10min， 4匸結(jié)束反應(yīng)；然后將膜蛋白基因全長(zhǎng)片段與pMD18—T載體連接。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雞傳染性支氣管炎病毒膜蛋白基因，該基因全序列為669個(gè)核苷酸，編碼222個(gè)氨基酸殘基的M蛋白；雞傳染性支氣管炎病毒膜蛋白基因的分子遺傳變異規(guī)律及其編碼的膜蛋白上的抗原表位的發(fā)現(xiàn)，對(duì)于傳染性支氣管炎基因工程抗原與基因工程疫苗的研制與應(yīng)用，具有重要意義。本發(fā)明還公開了該基因的克隆方法。以5′-CGGAATTCAGTTTCCTAAGAACGGTTGGAA-3′為上游引物，以5′-CCCAAGCTTCTCTCTACACGCACACATTTAT-3′為下游引物，通過RT-PCR的方法擴(kuò)增出雞傳染性支氣管炎病毒HN99株膜蛋白基因全長(zhǎng)片段。
文檔編號(hào)C07K14/005GK101560518SQ20081004955
公開日2009年10月21日 申請(qǐng)日期2008年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月15日
發(fā)明者仝宗喜, 維 原, 安森亞, 沛 崔, 崔保安, 張君濤, 張志平, 張惠茹, 張淑霞, 朱翠娟, 李小波, 李玉峰, 杜恩岐, 楊明凡, 白延杰, 董海聚, 叢 賀, 賀秀媛, 鄧立新, 陳紅英 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)