專利名稱：：具有抗腫瘤作用的重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其藥物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥工程領(lǐng)域，涉及使用巴斯德畢赤酵母(/^/'p"StoA7力表達(dá)的重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的抗腫瘤用途及其抗腫瘤藥物制劑。
背景技術(shù)：
：靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(ImmunoregulatoryProteinofGWio^fe"附a/mczV/!'w附),由曰本Kino等人1989年從赤靈芝菌絲體提取物中分離和純化的小分子蛋白質(zhì)(KohsukeKinoefa;.,J.Boil.Chem.1989,1:472-478)，命名為LZ-8，并測(cè)定其氨基酸順序和免疫生理活性。蛋白質(zhì)測(cè)序表明LZ-8由110個(gè)氨基酸殘基組成，氨基端乙?；?，分子量為12.4KD，等電點(diǎn)為4.4。靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的主要功能在于它可以促進(jìn)水梢淋巴細(xì)胞和脾臟細(xì)胞的增生，誘，動(dòng)物和人體的巨噬細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素，腫瘤壞死因子和T擾素等)，進(jìn)而防御及消除病原體的侵害，維護(hù)機(jī)體的健康，實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)功能。很多研究表明，LZ-8發(fā)揮抗腫瘤作用主要是通過免疫調(diào)節(jié)途徑實(shí)現(xiàn)。但本發(fā)明的積極效果在于首次公開了重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(RecombinantImmunoregulatoryProteinofG朋odem^L"cW/mw，rLZ-8)通過與腫瘤細(xì)胞膜特異結(jié)合誘導(dǎo)其凋亡來直接殺傷或殺死腫瘤細(xì)胞而發(fā)揮抗腫瘤的用途。在發(fā)揮作用的同時(shí)，不同于化療藥物會(huì)降低白細(xì)胞，rLZ-8會(huì)維持和升高白細(xì)胞，且不影響正常細(xì)胞的作用。惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病，目前尚無特別有效的防治策略。近年來，隨著分子腫瘤學(xué)、分子藥理學(xué)的不斷發(fā)展，以及對(duì)腫瘤本質(zhì)的闡明，大規(guī)模、快速篩選組合化學(xué)、基因工程等先進(jìn)技術(shù)的發(fā)明和應(yīng)用加速了藥物開發(fā)進(jìn)程。用不同方法啟動(dòng)或激活腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制，影響細(xì)胞不同基因表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，減少對(duì)正常細(xì)胞的影響和放化療帶來的副作用，己成為目前腫瘤治療的重要策略。本發(fā)明的重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白不僅在體外能快速高效誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，而且在小鼠腫瘤模型體內(nèi)也能有效殺死腫瘤細(xì)胞，且無明顯毒副作用，并能保持或升高白細(xì)胞的水平，對(duì)應(yīng)用重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白研制抗腫瘤藥物有一定的積極作用。
發(fā)明內(nèi)容1.公開了rLZ-8抗腫瘤作用及升高白細(xì)胞作用。2.殺傷白血病細(xì)胞的藥效學(xué)和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明rLZ-8對(duì)白血病細(xì)胞NB4、K562和HL-60具有很強(qiáng)殺傷作用，流式細(xì)胞儀進(jìn)行的細(xì)胞凋亡檢測(cè)進(jìn)一步證明了rLZ-8誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡。3.溶血實(shí)驗(yàn)、大鼠骨髓像實(shí)驗(yàn)和促紅細(xì)胞凝聚實(shí)驗(yàn)證實(shí)其對(duì)正常細(xì)胞沒有影響。4.荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)表明，rLZ-8可以抑制小鼠艾氏腹水瘤S180和移植性肝癌細(xì)胞H22在體內(nèi)生長。5.蛋白熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明，rLZ-8可以通過與腫瘤細(xì)胞膜特異結(jié)合誘導(dǎo)其凋亡而殺傷或殺死腫瘤細(xì)胞。6.rLZ-8藥物制劑的核心成分含有重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白和任選的藥學(xué)可接受的輔劑。7.rLZ-8藥物制劑可以通過口服和非腸道給藥。說明書圖1rLZ-8對(duì)NB4腫瘤細(xì)胞體外殺傷結(jié)果圖2rLZ-8對(duì)K562腫瘤細(xì)胞體外殺傷結(jié)果圖3rLZ-8誘導(dǎo)K562和NB4細(xì)胞凋亡PI單染檢測(cè)結(jié)果圖4rLZ-8誘導(dǎo)K562和HL60細(xì)胞凋亡AnnexinV/PI雙染檢測(cè)結(jié)果圖5用流式細(xì)胞儀檢測(cè)NB4細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)線粒體膜電位的變化圖6接種S180艾氏腹水瘤細(xì)胞小鼠體重變化(橫軸為時(shí)間(d);縱軸為平均體重(g);曲線符號(hào)-令-代表S180組；-躍-代表S180+rLZ-8組；-矗-代表0<:組)圖7接種H22移植性腫瘤細(xì)胞小鼠體重變化((橫軸為時(shí)間(d);縱軸為平均體重(g);曲線符號(hào)-令-代表H22組；-國-代表H22+rLZ-8組；-矗-代表CK組))圖8FTTC-rLZ-8(lOOng.ml-l)對(duì)大鼠心肌組織的標(biāo)記(暗、明場(chǎng))圖9FTTC-rLZ"8(lOOng.ml-l)對(duì)兔軟骨細(xì)胞的標(biāo)記(暗、明場(chǎng))圖10FTTC-rLZ-8(100ng.ml-l)對(duì)HL60細(xì)胞的標(biāo)記(暗、明場(chǎng))注以上圖l-圖5，Cl代表NB4正常對(duì)照組；P代表AS203陽性藥對(duì)照組；C2代表K562正常對(duì)照組；C3代表HL-60正常對(duì)照組；Rl-R6代表rLZ-8藥物組(濃度由0.78yg*mr、100ug'ml");HI-H6代表rLZ-8藥物組(濃度為3.125Hg'mT、100ug'mr1);11-13代表rLZ-8藥物組(濃度分別為5ug'mr1、10ug'mr1和20ug'ml—1)具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的獲得1.rLZ"8基因人工合成、工程菌構(gòu)建和篩選根據(jù)畢赤酵母遺傳密碼偏愛性，在原有的靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白基因序列的基礎(chǔ)上，重新設(shè)計(jì)編碼了rLZ-8基因進(jìn)行全基因合成，并與酵母a-因子前導(dǎo)肽編碼序列相連成為融合基因，克隆入pMD18-T載體中。將測(cè)序正確的載體線性化，轉(zhuǎn)入酵母基因組中，在MM和MD平板上篩選甲醇利用高效型Mut+菌株。2.rLZ-8工程菌的表達(dá)對(duì)規(guī)模發(fā)酵表達(dá)的溫度、轉(zhuǎn)速、pH值、裝液體積、甲醇添加量等條件進(jìn)行檢測(cè)，確立了酵母工程菌在80L發(fā)酵罐規(guī)模下表達(dá)rLZ-8的工藝條件優(yōu)化方法。根據(jù)rLZ-8的理化特性，設(shè)計(jì)了發(fā)酵培養(yǎng)基的配方。目的蛋白產(chǎn)量約為800mg丄—、3.rLZ-8純化工藝發(fā)酵液分離機(jī)離心—將上清用管式分離機(jī)—超濾—陽離子交換純化柱—AKTA蛋白質(zhì)純化工作站制備目的蛋白—強(qiáng)陰離子交換作用層析—疏水作用純化柱—凝膠過濾層析。44.rLZ"8純度鑒定及分子量測(cè)定利用反相液相色譜對(duì)分離純化的產(chǎn)物進(jìn)行純度分析，rLZ-8純度為>99%。激光飛行質(zhì)譜鑒定重組表達(dá)的rLZ-8分子量為12722。5.rLZ"8高級(jí)空間結(jié)構(gòu)的確定利用懸滴氣相擴(kuò)散法獲得了0.2cmx0.2cmx0.2cm的單晶。硒代晶體在MacChessF2beamline上收集了1.8埃分辨率的晶體衍射數(shù)據(jù)。非硒代母體晶體在MarResearch345dtd像板衍射數(shù)據(jù)收集系統(tǒng)收集了一套1.8埃分辨率的晶體衍射數(shù)據(jù)。重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白rLZ-8亞基的二級(jí)結(jié)構(gòu)由2個(gè)ot-螺旋，7個(gè)P-折疊和一個(gè)無規(guī)則巻曲組成。實(shí)施例2:rLZ-8對(duì)人早幼粒白血病細(xì)胞NB4的殺傷作用1.試劑rLZ-8除菌后用IMDM培養(yǎng)液配制成8個(gè)濃度，分別為0.78嗎'ml—1，1.56嗎'ml—1,3.125嗎mr1，6.25嗎'mr1，12.5嗎.ml1，25ng'mr1,50嗎.ml1，100嗎'mr1。2.實(shí)驗(yàn)方法96孔培養(yǎng)板中，試驗(yàn)孔加NB4腫瘤細(xì)胞0.1ml和rLZ-80.1ml，rLZ-8濃度由低到高；陰性對(duì)照組加NB4腫瘤細(xì)胞和培養(yǎng)液各O.lml;陽性藥物對(duì)照組為三氧化二砷As203;每組作6個(gè)復(fù)孔。置37'C、5免C02培養(yǎng)箱中48h，在細(xì)胞培養(yǎng)終止前4h加入MTT15pl(5mgml"),細(xì)胞培養(yǎng)終止后加入lOOnlO.lmoli;1鹽酸異丙醇，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上570nrn測(cè)OD值。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1和圖1顯示，rLZ-8藥物組在OD5TOnm的光吸收值與NB4正常對(duì)照組比較，有明顯差異，說明rLZ-8在體外對(duì)NB4腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)殺傷作用。表lrLZ-8對(duì)NB4細(xì)胞體外殺傷作用(《±s，n-6)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>各藥物組與NB4正常對(duì)照組比較，*P<0.01實(shí)施例3:rLZ-8對(duì)人慢性髓性白血病細(xì)胞K562的殺傷作用1.試劑rLZ-8除菌后用IMDM培養(yǎng)液配制成6個(gè)濃度，分別為3.125吸ml—1，6.25fig'ml—1,12.5ng.ml1，25嗎mr1，50嗎.ml1，100嗎.ml1。2.實(shí)驗(yàn)方法96孔培養(yǎng)板中，試驗(yàn)孔加K562腫瘤細(xì)胞0.1ml禾卩rLZ-80.1ml，rLZ-8濃度山低到高；陰性對(duì)照組加K562細(xì)胞和培養(yǎng)液各O.lml;陽性藥物三氧化二砷；每組作6個(gè)復(fù)孔。置37°C、5%C02培養(yǎng)箱中48h，在細(xì)胞培養(yǎng)終止前4h加入MTT15pl(5mg'mr1)，細(xì)胞培養(yǎng)終止后加入100pl0.1mol七—1鹽酸異丙醇,在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上570nm測(cè)OD值。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表2和圖2所示，rLZ-8藥物組在OD57。畫的光吸收值與K562正常對(duì)照組比較，有明顯差異，說明rLZ-8在體外對(duì)K562細(xì)胞同樣具有殺傷作用。表2rLZ-8對(duì)K562腫瘤細(xì)胞體外殺傷作用(*±s，n=6)分組劑量(ng'mL-1)OD570nm生長抑制率(％)正常對(duì)照—1.01±0.01—陽性藥對(duì)照組100.22±0.03*78.2rLZ-8組3.1250.66±0.03*34.76.250.58±0.03*42.612.50.52±0.05*48.5250.31±0.02*69.3500.25±0.04*75.21000.19±0.03*81.2各藥物組與K562正常對(duì)照組比較，*P<0.01實(shí)施例4:rLZ-8對(duì)血液腫瘤細(xì)胞凋亡作用的影響1.PI單染流式細(xì)胞儀檢測(cè)1.1儀器和細(xì)胞株熒光顯微鏡，型號(hào)LeicaASLMD、K562、NB4。1.2試劑rLZ-8分別設(shè)高、中、低三個(gè)劑量組，用含2WFCS的IMDM培養(yǎng)液配制成濃度為20嗎.mr11，10ng/ml，5ng.ml1。碘化乙錠(PI)50ng.mr1。1.3實(shí)驗(yàn)分組K562設(shè)為正常對(duì)照組，rLZ-8低劑量組(5嗎'm1—1)、rLZ-8屮劑量組(10昭'm1—1)、rLZ-8高劑量組(20嗎'ml—";NB4設(shè)為正常對(duì)照組，rLZ-8低劑量組(5嗎如1—])、rLZ-8中劑量組(10昭'mr1)、rLZ-8高劑量組(20嗎.mr1)。1.4實(shí)驗(yàn)方法將K562細(xì)胞與NB4細(xì)胞分別加入24孔板，lml/孔，并加入不同濃度rLZ-8，lml/孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置37'C、5呢C02培養(yǎng)箱24h，將每個(gè)濃度組細(xì)胞收集，PBS洗滌2次并調(diào)整細(xì)胞濃度為lxl06/1111，70%冰乙醇固定，置一2(TC過夜。固定后細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入PI(終濃度為50ngTnl")室溫避光孵育10min，1000rmin"離心5min，棄卜.清液用40C^1PBS重懸沉淀。lh之內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。61.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表3和圖3可見，與K562及NB4正常對(duì)照組比較，rLZ-8藥物組細(xì)胞調(diào)亡率均有所提高，可以得出使細(xì)胞凋亡是rLZ-8殺死腫瘤細(xì)胞的途徑之一。表3rLZ-8對(duì)K562及NB4細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)率(％)凋亡率止常對(duì)照組rLZ-8rLZ-8rLZ-8(10ngml1)(20嗎.mr1)K5628.8916.4317.9121.57NB44.069.2327,5138.602.AnnexinV-FITC試劑盒流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡2.1儀器和細(xì)胞株FACSCalibur型流式細(xì)胞儀麵國Becton-Dickinson公司。NB4、HL-60。2.2試劑rLZ-8用含2XFCS的IMDM培養(yǎng)液配制成5嗎'mr1、10嗎'mr1、20嗎'mr1，三氧化二砷(As203)5昭'mr1。AnnexinV-FITC試劑盒結(jié)合緩沖液4x;碘化丙錠溶液(PI)，20嗎'ml—、0.2ml;重組人AnnexinV/FITC，O.lml。2.3實(shí)驗(yàn)分組NB4設(shè)正常對(duì)照組，陽性藥物組(AS2035嗎'mr1)，蛋白低劑量組(5昭'mr1),中劑量組(10嗎'ml—1)、高劑量組(20嗎'mr1》HL-60設(shè)正常對(duì)照組，蛋白低劑量組(5嗎-mr1)、中劑量組(10嗎.mr1)、高劑量組(20嗎'm1—1)。2.4實(shí)驗(yàn)方法將NB4與HL-60細(xì)胞分別加入24孔板，lml/孔，并加入不同濃度rLZ-8，lml/孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置37。C、5%C02培養(yǎng)箱中24小時(shí)，將每個(gè)濃度組細(xì)胞收集，用4"C預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次，用250nl結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為lxl06/ml。取100^1的細(xì)胞懸液于5ml流式管中'，加入5|JAnnexinV/FITC和lOpl20jig'mr1的PI溶液，混勻后于室溫避光孵育15min，在反應(yīng)管中加400plPBS，流式細(xì)胞儀分析。2.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖4及表4可以看出，NB4-rLZ-8組和HL-60-rLZ-8組凋亡率明顯高于其正常對(duì)照組，并且，HL-60-rLZ-8組，隨著rLZ-8濃度的增加，凋亡率亦增加。表4rLZ-8對(duì)NB4及HL-60細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)率(％)凋亡率正常對(duì)照組陽性藥組rLZ-8rLZ-8rLZ-8(5嗎-ml])(10,，)(20嗎-ml1)NB46.123.421.022.334.0HL-600.439.730.550.757.7圖5是用流式細(xì)胞儀檢測(cè)NB4細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)線粒體膜電位的變化，rLZ-8三個(gè)實(shí)驗(yàn)組7與正常組比較，線粒體膜電位均甜移。經(jīng)透射電子顯微鏡觀察rLZ-8誘導(dǎo)發(fā)生凋l^的NB4細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，線粒體形態(tài)呈不規(guī)則變化，并有線粒體腫大現(xiàn)象。實(shí)施例5:rLZ-8的溶血實(shí)驗(yàn)1.試劑rLZ-8用5%葡萄糖溶液配制成lmg'ml—1;血細(xì)胞懸液配制人血4ml，1000r/min離心10min，去上清。將紅細(xì)胞沉淀加入5%葡萄糖溶液約IO倍量，搖勻，H)OOr/min離心20min，去上清，重復(fù)洗滌2—3次，至上清液不顯紅色為止。將所得紅細(xì)胞用5%葡萄糖溶液配成2%的混懸液，供實(shí)驗(yàn)用。2.實(shí)驗(yàn)方法取潔凈的試管28只，進(jìn)行編號(hào)。l一5號(hào)為rLZ-8藥物組，6號(hào)管為陰性對(duì)照組(5%葡萄糖溶液)，7號(hào)管為陽性對(duì)照管(蒸餾水)。共設(shè)4組平行對(duì)照管。依次加入2%紅細(xì)胞懸液、5%葡萄糖或蒸餾水，混勻后，立即置37'C土0.5。C的恒溫箱中溫育。開始每隔15min觀察1次，lh后每隔lh觀察1次，共3小時(shí)。結(jié)束后將各管中的溶液置入干燥離心管中離心，1500r，25min。取上清，在分光光度計(jì)545nm處，以蒸餾水為空白讀取各管OD值，計(jì)算溶血率。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表5可以看出，l一5組rLZ-8藥物組溶血率均小于5X，可以說明未出現(xiàn)溶血反應(yīng)。表5rLZ-8對(duì)人紅細(xì)胞致溶作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(*±s，n=4)試管編號(hào)12345溶血率(％)0.70±0.030.74±0.040.63±0.040.65±0.040.59±0.07實(shí)施例6:rLZ-8對(duì)大鼠骨髓像的影響1.實(shí)驗(yàn)材料Waster大鼠9只，100g左右。rLZ-8用無菌生理鹽水配制。分為60mg'kg—1、30mg'kg—1、15mg'kg—1劑量組。2.實(shí)驗(yàn)方法正常對(duì)照組3只，蛋白低劑量組2只，蛋白中劑量組2只，蛋白高劑量組2只。rLZ-8藥物組大鼠，分別給予不同劑量的rLZ-8尾靜脈注射，1次/日；對(duì)照組給予等量生理鹽水。給藥第七天，取右側(cè)大腿骨髓涂片。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果大鼠骨髓他涂片與正常對(duì)照組比較未見異常。實(shí)施例7:rLZ-8對(duì)人紅細(xì)胞凝聚作用的影響1.試劑A型、B型、0型和AB型血各2ml分別來源于健康志愿者；綿羊紅細(xì)胞(sheepredcell)2ml。將上述紅細(xì)胞1200g'min—1離心10min，棄上清，用5mlPBS洗滌，重復(fù)上述操作3-5次，然后用O.Olmol/LPBS配制成1.5%懸液。rLZ-8用牛理鹽水配置，使其終濃度分別為50嗎'mr1，25ng.ml管1，12.5吸mr1，6.25嗎-mr1，3.13lag.ml1，1.56叫.ml管1，0.78嗎.mr1，0.39pg-ml1，0.20嗎.mr1，O.lO嗎.mr1，0.05嗎.mr1，0.03嗎'mr'。植物凝集素(PHA)配制同上。2.實(shí)驗(yàn)方法將實(shí)驗(yàn)對(duì)象分為rLZ-8各濃度組、陽性藥對(duì)照組，正常對(duì)照組。96孔微量血凝板中加入A型1.5%紅細(xì)胞25^11/孔，冉加入0.2%明膠，75^d/孔。藥物組分別加不同濃度rLZ-8，其終濃度如上所述；陽性藥對(duì)照組PHA25pl/L;正常對(duì)照組PBS25pl/孔。每組設(shè)6個(gè)平行對(duì)照。室溫下振蕩30s，37'C培養(yǎng)箱，l小時(shí)后開始觀察。B型、AB型、0型及綿羊紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法同上。3.試驗(yàn)結(jié)果由表6所示，陽性對(duì)照藥PHA對(duì)人四種紅細(xì)胞及綿羊紅細(xì)胞均具有凝集作用；rLZ-8對(duì)人四種紅細(xì)胞無凝集作用，而在12.5嗎，ml—、5(Vg'mr1濃度時(shí)對(duì)綿羊紅細(xì)胞表現(xiàn)出凝集活性。表6rLZ-8對(duì)人四種型別紅細(xì)胞凝集作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果正_rLZ-8藥物組(ng'ml—1)__分組常^^加502512.56.253.131.560.7S0.390.200.100.050.03__^___A—————————————B—————————————0—————————————AB—————————————綿羊紅細(xì)胞一++++++—————————實(shí)施例8:rLZ-8對(duì)大鼠白細(xì)胞的影響1.實(shí)驗(yàn)材料Waster大鼠18只，lOOg左右。試劑(1)rLZ-8用無菌生理鹽水配制。分為60叫'kg—1、30嗎'kg—1、15嗎'kg—1劑量組。(2)金磊賽強(qiáng)[重組人粒細(xì)胞集落刺激因子注射液(rhG-CSF)]，生產(chǎn)批號(hào)20060403;75嗎/支。用無菌生理鹽水配制成13.5^mr1，0.1ml/只。(3)注射用環(huán)磷酰胺(CP)，生產(chǎn)批號(hào)050216;200mg/支。用無菌生理鹽水配制20mg'ml—1，9O.lml/只，即20mg'kg1。2.實(shí)驗(yàn)方法TH常對(duì)照組，蛋白低劑量組，蛋白高劑量組，蛋白高劑量組，陽性對(duì)照組(金磊賽強(qiáng))。除正常對(duì)照組(給予等量生理鹽水)夕卜，每組大鼠均給予環(huán)磷酰胺尾靜脈注射，20mg，mr1，O.lml/只，連續(xù)3天。于第三天，大鼠尾靜脈取血，送吉林大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，細(xì)胞分析儀檢測(cè)白細(xì)胞數(shù)。造模成功后按上述分組分別給予相應(yīng)劑量rLZ-S及陽性藥(金磊賽強(qiáng))治療，正常對(duì)照組和CP組給予等量生理鹽水，于治療第3天和第7天分別大鼠尾靜脈取血，送吉大一院檢測(cè)白細(xì)胞數(shù)。對(duì)比治療前后白細(xì)胞數(shù)變化，分析藥物療效。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表7可以看出，與CP對(duì)照組比較，在給藥第3天rLZ-8藥物組已明顯升高大鼠白細(xì)胞，差異及其顯著，在給藥第7天基本達(dá)到正常。表7rLZ-8對(duì)白細(xì)胞低下大鼠模型的影響(*±s，n=10)分組給藥前白細(xì)胞數(shù)給藥第3天給藥第7天正常對(duì)照組14.57xl09丄—112.8xl09.L-19.13xl09.L-1CP對(duì)照組(20叱'kg—"4.9xl09.U15.23xl09.L"10.27xl09丄'1金磊賽強(qiáng)(13.5昭'kg—44.37x瓶i;110.83xl09丄—"10.17xl09.i;1rLZ-8(15嗎'kg—"2.93xl09.i;18.8xl09.L-"10.2xl09.L—1rLZ-8pOng'kg-1)2.96x跳L-19.3xl09.L"*12.83xl09.L—1rLZ-8(60嗎-kg—1)4.33xl09丄—18.6xl09.L—"15.5xl09丄—1與CP對(duì)照組比較，*PcO.OI實(shí)施例9:rLZ-8對(duì)小鼠S180艾氏腹水瘤的抑制實(shí)驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)材料小鼠，體重18—22g，雌雄各半，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠艾氏腹水細(xì)胞株S180由本室提供。環(huán)磷酰胺(CTX)，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)06101921。S180腹水瘤及實(shí)體瘤實(shí)驗(yàn)組均分為正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、rLZ-8低劑量治療組(0.25mg.kg勺、rLZ-8中劑量治療組(O.Smg.kg-1),rLZ-8高劑量治療組(lmg.kg—1)。每組10只。2.實(shí)驗(yàn)方法S180皮下抑瘤實(shí)驗(yàn)方法取生長良好的S180細(xì)胞，以適量無菌生理鹽水稀釋成瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)為1(^L—1，每鼠右腋窩皮下接種0.2ml(正常對(duì)照組除外)。接種24h后，給予治療。正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組給予生理鹽水0.2ml，只—、d—1，腹腔注射；陽性對(duì)照組給予環(huán)磷酰胺20mg'kg—\0.2mlv口、—、d—、腹腔注射。rLZ-8治療組分別給予相應(yīng)劑量尾靜脈注射，0.2ml.只—、d—1。連續(xù)10天。分別于給藥前、給藥10d后從小鼠眼眶靜脈叢取血，送檢于吉大一院檢驗(yàn)科測(cè)白細(xì)胞數(shù)。并在停藥次日，頸椎脫臼處死全部小鼠，解剖取出瘤塊，稱瘤重。按下式計(jì)算抑瘤率抑瘤率(％)=(對(duì)照組平均瘤重一實(shí)驗(yàn)組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重><100%S180腹水抑瘤實(shí)驗(yàn)方法取生長良好的S180細(xì)胞，以適量無菌生理鹽水稀釋成瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)為1071—1，每鼠腹腔接種0.2ml(正常對(duì)照組除外)。接種24h后，給予治療。正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組給予生理鹽水0.2mlv口、—、d—1，腹腔注射；陽性對(duì)照組給予環(huán)磷酰胺20mg'kg—1，0.2mh只—1j1，腹腔注射。rLZ-8治療組分別給予相應(yīng)劑量尾靜脈注射，0.2mlv口、—'士。連續(xù)10天。每円稱重，觀察小鼠體重變化程度，作體重增長曲線。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果S180皮下抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表8可以看出，3個(gè)劑量的rLZ-8均能抑制S180的生長，抑瘤率分別為16.8%、25.7%禾口45.5%。rLZ-8治療組瘤重與陰性對(duì)照組比較，均極有顯著差異(P<0.01)。由表9可以看出，給藥前，各組小鼠白細(xì)胞數(shù)均在同一水平上，與陰性對(duì)照組比較無差異(尸>0.05)。治療10天后，陰性對(duì)照組白細(xì)胞數(shù)較正常對(duì)照組高，rLZ-8低劑量組和中劑量組白細(xì)胞數(shù)與陰性對(duì)照組比較無差異(尸>0.05)，高劑量組與正常對(duì)照組比較無差異CP>0.05),陽性對(duì)照組白細(xì)胞數(shù)明顯降低，與正常對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較均有顯著差異(尸<0.01)。表8rLZ-8對(duì)小鼠移植性腫瘤S180的抑制作用(*±s，n:=10)分組劑量(mg'kg力瘤重(g)抑瘤率(％)陰性對(duì)照組—1.01±0.03—CTX組200.35±0.02*65.3rLZ-8低劑量組0.250.84±0.03*16.8rLZ-8中劑量組0.50.75±0.02*25.7rLZ-8高劑量組10.55±0.03*45.5S陰性對(duì)照組比較，*表9/><0.01rLZ-8對(duì)小鼠移植性腫瘤S180白細(xì)胞影響(*±s，n=10)分組齊U量(mg'kg-1)白細(xì)胞數(shù)給藥前給藥10d正常對(duì)照組—9.49±0.279.54±0.33陰性對(duì)照組9.54±0.2510.44±0.34CTX組2(19.56±0.314.41±0.25*rLZ-8低劑量組0.259.48±0.3010.44±0.18**rLZ-8中劑量組0.59.43±0.4410.34±0.31**rLZ-8高劑量組19.49±0.369.55±0.36**與陰性對(duì)照組比較，*尸<0.01;**P>0.05S180腹水抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各組小鼠腹水出現(xiàn)時(shí)間基本一致，陰性對(duì)照組11小鼠體重增長迅速，存活時(shí)間減少。由圖6可見，rLZ-8組小鼠平均體重增K趨勢(shì)比正常組大，但比陰性對(duì)照組比較小。說明rLZ-8能夠在一定程度上抑制小鼠腹腔S180腫瘤細(xì)胞的增長。實(shí)施例10:rLZ-8對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞H22的抑制實(shí)驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)材料小鼠，體重18—22g，雌雄各半，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠肝癌細(xì)胞株H22，由本室提供。環(huán)磷酰胺(CTX),江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)06101921。2.實(shí)驗(yàn)方法H22肝癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組均分為正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、rLZ-8低劑量治療組(0.25mg'kg—1)、rLZ-8中劑量治療組(0.5mg'kg")、rLZ-8高劑量治療組(lmg'kg—1)。每組10只。H22皮下抑瘤實(shí)驗(yàn)方法取生長良好的H22細(xì)胞，以適量無菌生理鹽水稀釋成瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)為107，L—、每鼠右腋窩皮下接種0.2ml(正常對(duì)照組除外)。接種24h后，給予治療。正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組給予生理鹽水0.2ml.只義d—1，腹腔注射；陽性對(duì)照組給予環(huán)磷酰胺20mg'kg、(^mlvTV1,腹腔注射。rLZ-8治療組分別給予相應(yīng)劑量尾靜脈注射，0.2mb只-、d—1。連續(xù)10天。分別于給藥前、給藥10d后從小鼠眼眶靜脈叢取血，送檢于吉大一院檢驗(yàn)科測(cè)白細(xì)胞數(shù)。并在第停藥次日，頸椎脫臼處死全部小鼠，解剖取出瘤塊，稱瘤重。按下式計(jì)算抑瘤率抑瘤率(％)=(對(duì)照組平均瘤重一實(shí)驗(yàn)組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重xlOOXH22腹水抑瘤實(shí)驗(yàn)方法取生長良好的H22細(xì)胞，以適量無菌生理鹽水稀釋成瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)為10入U(xiǎn)1，每鼠腹腔接種0，2ml(正常對(duì)照組除外)。接種24h后，給予治療。正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組給予生理鹽水0.2mr只+d—、腹腔注射；陽性對(duì)照組給予環(huán)磷酰胺20mg'kg'1，0.2mlv口、—、cT1,腹腔注射。rLZ-8治療組分另ij給予相應(yīng)劑量尾靜脈注射，0.2mlv口、-"cT1。連續(xù)10天。每日稱重，觀察小鼠休重變化程度，作體重增長曲線。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果H22皮下抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表10可以看出，3個(gè)劑量的rLZ-8均能抑制S180的生長，抑瘤率分別為16.7%、30.0%、42.5%。rLZ-8治療組瘤重與陰性對(duì)照組比較，均有極顯著差異(P<0.01)。表IOrLZ-8對(duì)小鼠移植性腫瘤H22的抑制作用(*±s，n=10)分組劑量(mg.kg-4瘤重(g)抑瘤率(％)陰性對(duì)照組—1.20±0.02—CTX組200.45±0.02*62.5rLZ-8低劑量組0.251.00±0.03*16.7rLZ-8中劑量組0.50.84±0.02*30.0rLZ-8高劑量組10.69±0.03*42.512與陰性對(duì)照組比較，*/^0.01由表11看出，給藥前，各組小鼠白細(xì)胞數(shù)均在同一水平上，與陰性對(duì)照組比較無差異(尸>0.05)。治療10天后，陰性對(duì)照組白細(xì)胞數(shù)較正常對(duì)照組高，rLZ-8低劑量組和中劑量組白細(xì)胞數(shù)與陰性對(duì)照組比較無差異(尸>0.05)，高劑量組與正常對(duì)照組比較無差異(尸>0.05)，陽性對(duì)照組白細(xì)胞數(shù)明顯降低，與正常對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較均有顯著差異(尸<0.01)。表llrLZ-8對(duì)小鼠移植性腫瘤H22白細(xì)胞影響(*±s,n=10)給藥前給藥10d正常對(duì)照組一9.65±0.289.69±0.26陰性對(duì)照組—9.76±0.3110.49±0.33CTX組209,67±0.434.49±0.21*rLZ-8低劑量組0.259.65±0.3310.53±0.24**rLZ-8中劑量組0.59.65±0.3810.43±0,27**rLZ-8高劑量組19.63±0.419.86±0.27**與陰性對(duì)照組比較，*尸<0.01;**尸>0.05H22腹水抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示rLZ-8組小鼠生存時(shí)間比陰性對(duì)照組延長，陰性對(duì)照組小鼠食欲減退，但體重增L(迅速，活動(dòng)減少。由圖7可見，rLZ-8組小鼠平均體重增長趨勢(shì)比正常組大，但比陰性對(duì)照組比較小。說明rLZ-8能夠在一定程度上抑制小鼠腹腔H22腫瘤細(xì)胞的增長。實(shí)施例11:rLz-8熒光標(biāo)記及其對(duì)正常組織細(xì)胞和H1-60細(xì)胞的影響1.rLz-8的FITC熒光素標(biāo)記(1)試劑與儀器熒光色素(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte，F(xiàn)ITC)，吉爾生化(上海)；二甲基亞砜；碳酸鹽緩沖液(pH89.5)(Na2C034.3g,NaHC038.6g力BddH20至500ml);磷酸鹽緩沖液(PBS);DesaltingHipr印26/10脫鹽柱；AKTApurifier;日立分光光度計(jì)等。(2)實(shí)驗(yàn)方法將純化的rLZ-8(7.5mg.mr'^Oml對(duì)碳酸鹽緩沖液(pH8.3)透析過夜，稱取3.75mgFITC，加入二甲亞砜(DMSO)3.75ml配制成FITC-DMSO溶液。在50ml小燒杯中先放入rLZ-8按FITC-DMSO溶液逐滴加入rLZ-8溶液中，用PBS加至30ml，磁力攪拌器室溫下避光攪拌4h，用DesaltingHiprep26/10脫鹽柱于AKTApurifier系統(tǒng)上除去游離熒光素，75mlPBS洗脫，280nm、495nm檢測(cè)，峰收集。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將制備的FITC-rLZ-8(10倍稀釋)于220nm520nm掃描，夂95=0,445，A28。=0.67，計(jì)算標(biāo)記效率(F/P)為3.80。2.對(duì)大鼠心肌組織的標(biāo)記作用(1)試劑與儀器LeicaCM1850冷凍切片機(jī)；wistar大鼠；熒光顯微鏡80i(Nikon);等滲PBS緩沖液(pH7.2);胎牛血清(FBS，Gibco);FITC-rLZ-8本室制備。(2)實(shí)驗(yàn)方法將大鼠脫頸處死，去心臟，置于冷凍切片機(jī)，待溫度降至-2(TC進(jìn)行切片，將心肌組織切片與PBS配制的FITC-rLZ-8溶液(100ng'mr1)37。C孵育lh后，熒光顯微鏡下觀察，并設(shè)空白對(duì)照組。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果熒光顯微鏡下觀察心肌組織無可見熒光，與空白對(duì)照組無差異，見圖8。3.對(duì)原代培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞的標(biāo)記作用(1)試劑與儀器H本大耳白兔(雄性，2.5kg)4只；手術(shù)器械；0.25免胰酶+0.02。"EDTA;0.2%II型膠原酶；D-Hanks;IMDM培養(yǎng)基(50mg'mr1維生素C、雙抗)；0.025mg.mr1多聚賴胺酸；無菌水(WFI)。(2)實(shí)驗(yàn)方法固定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，空氣栓塞處死，腹正中剝皮暴露四肢，大剪刀剪開肌肉筋膜，由骨干斷開長骨后，小心取下整個(gè)膝、髖和肩部骨，粗略修剪后浸入D-Hanks。將裝有組織的燒杯移進(jìn)入超凈臺(tái)，組織清洗修剪后移入第二杯無菌D-Hanks。組裝手術(shù)刀，用刀片輕輕削下一薄層軟骨，彎鑷移植入6cm培養(yǎng)皿，然后D-Hanks洗三次，棄去大部分D-Hanks，眼科剪剪碎軟骨片至lmm。棄i多余D-Hanks，小勺轉(zhuǎn)移碎骨片至10cm2培養(yǎng)瓶，加胰酶-EDTA消化，37'C、30min;棄去胰酶更換為膠原酶，搖勻后置37。C孵箱，每lh取出振搖5min，經(jīng)4-4,5h，結(jié)束消化。制細(xì)胞懸液并加入3ml含F(xiàn)BS15%的IMDM，以5xl04.mT1接種于培養(yǎng)瓶。細(xì)胞接種于24孔板，每孔0.5ml，設(shè)空白對(duì)照組，以終濃度為0.25嗎'm1—1的FITC-rLZ-80.5ml，37。C孵育lh。將細(xì)胞移入1.5mlEP管離心(lOOOrmin-1，7min)，以等滲PBS洗3次，向EP管中加入O.lmlPBS，重懸細(xì)胞。取懸液于熒光顯微鏡觀察。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果熒光顯微鏡卜'觀察，兔軟骨細(xì)胞形態(tài)完好，無綠色熒光，與對(duì)照組相比無顯著差異。各實(shí)驗(yàn)組照片如圖9所示。4.對(duì)Hl-60細(xì)胞的標(biāo)記作用(1)試劑與儀器熒光顯微鏡80i(Nikon)，IMDM細(xì)胞培養(yǎng)液(Hyclone)，胎牛血清(FBS,Gibco)，F(xiàn)ITC-rLZ-8和等滲PBS緩沖液(pH7.2)本室制備。(2)實(shí)驗(yàn)方法將HL-60以2xl()6接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔0.5ml，以IMDM(2%FBS)培養(yǎng)液配制FITC-rLZ-8為100ng'ml人每孔0.5ml孵育(37°C)，設(shè)空白對(duì)照組、lh實(shí)驗(yàn)組和6h實(shí)驗(yàn)組。分別于lh和6h取出細(xì)胞加入至1.5mlEP管中，1000r'min1離心，棄上清，以PBS清洗3次，洗凈重懸。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10，熒光顯微鏡下觀察，經(jīng)FITC-rLZ-8孵育lh和6h的HL-60細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)，其中6h組細(xì)胞出現(xiàn)凝集，空白對(duì)照組無綠色熒光，與前者具顯著差異。實(shí)施例12:重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白抗腫瘤組合物制劑1.通過上述藥理實(shí)驗(yàn)證明，重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白rLZ-8的抗腫瘤作用和提高白細(xì)胞水平的效果是顯著的，而且無毒副作用，因此?？梢哉J(rèn)為重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白rLZ-8適于藥物使用而且是安全的。2.本發(fā)明的重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白rLZ-8作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用可以通過門服和非腸道給藥。服用的劑量i癥狀、年齡、體重等因素決定。對(duì)成年人來說，口服，每人每劑10-1000mg，每閂數(shù)次；非腸道給藥10-100mg，每日數(shù)次。3.本發(fā)明口服藥包片劑、丸劑膠囊(包括硬膠囊和軟膠囊)，這些劑型包括重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白rLZ-8和至少一種惰性稀釋劑(例如乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮)也可以加入惰性稀釋劑以外的藥物學(xué)上可以接受的添加物如潤滑劑、崩解劑、穩(wěn)定齊U。如果需要，片劑或丸劑可用胃溶或腸溶材料涂敷上一層或一層以上的膜。非腸道用注射劑包括重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白rLZ-8和至少一種惰性水稀釋劑(如注射用蒸餾水、生理鹽水)，也可以將重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白rLZ-8制成凍干粉，使用前將其溶解于惰性水稀釋劑供注射用。(1)制劑例l取重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白rLZ-81000mg，溶于100ml無菌生理鹽水中，混合均勻后，分裝成rLZ-810mg/ml/支濃度的注射液于藥瓶中，密封，滅菌制成產(chǎn)品。其他項(xiàng)目應(yīng)符合中華人民共和國藥典2005年版注射液項(xiàng)下要求。(2)制劑例2取重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白rLZ-8100g，，藥用淀粉0.5kg按公知的膠囊制備技術(shù)和設(shè)備制成膠囊，rlz810mg/粒.其他項(xiàng)目應(yīng)符合中華人民共和國藥典2005年版膠囊項(xiàng)下要求。(3)制劑例3取重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白rLZ-8100g，微晶纖維素560g，無水乳糖380g，硬脂酸鎂200g，按公知的制片技術(shù)和設(shè)備制成片劑，rLZ-810mg/片.其他項(xiàng)目應(yīng)符合中華人民共和國藥典2005年版片劑項(xiàng)下要求。15(4)制劑例4取重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白rLZ-8適量，中華人民共和國藥典2005年口服液項(xiàng)下要求，按公知的制片技術(shù)和設(shè)備制口服液。權(quán)利要求1、一種重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白，具有抗腫瘤和升高白細(xì)胞的作用。2、如權(quán)利要求l所述的重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白，具有和編碼天然靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白基因不同的堿基序列但編碼的氨基酸序列相同，由畢赤酵母重組表達(dá)，純度為99%以上。3、如權(quán)利要求l所述抗腫瘤作用，其特征在于重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白不僅在體外能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而且在小鼠腫瘤模型體內(nèi)也能有效殺死腫瘤細(xì)胞，無明顯毒副作用。4、如權(quán)利要求l所述升高白細(xì)胞作用，其特征在于重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白在直接殺死或殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)不破壞j下常細(xì)胞，并能保持或升高白細(xì)胞的水平。5、如權(quán)利要求3所述的腫瘤細(xì)胞可以是早幼粒白血病細(xì)胞NB4或人慢性髓性白血病細(xì)胞K562或人急性髓系白血病細(xì)胞HL-60或小鼠實(shí)體瘤S180或小鼠肝癌細(xì)胞H22。6、一種重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白藥物制劑，其特征在于該藥物制劑核心成分含有權(quán)利要求1的重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白和任選的藥學(xué)可接受的輔劑。7、如權(quán)利6所述重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白藥物制劑可以通過口服和非腸道給藥，口服藥包括口服液，片劑、丸劑和膠囊；非腸道用包括外用藥和注射劑。全文摘要一種具有抗腫瘤作用的使用畢赤酵母(Pichiapastoris)所表達(dá)的重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(rLZ-8)及其藥物制劑。rLZ-8具有在對(duì)NB4或K562或HL-60或S180或H22細(xì)胞的直接殺死或殺傷而不影響正常細(xì)胞的作用；rLZ-8不僅在體外能快速高效誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，而且在小鼠腫瘤模型體內(nèi)也能有效殺死腫瘤細(xì)胞，無明顯毒副作用，并能保持或升高白細(xì)胞的水平。此外還提供了以rLZ-8作為核心成分的抗腫瘤藥物制劑類型。文檔編號(hào)C07K14/37GK101475632SQ20081005020公開日2009年7月8日申請(qǐng)日期2008年1月3日優(yōu)先權(quán)日2008年1月3日發(fā)明者劉立俠,非孫,梁重陽,許守民申請(qǐng)人:非孫