專利名稱：：與pkr激酶結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程與生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及利用噬菌體展示技^1選能與PKR激酶結(jié)構(gòu)域(PKIU)特異性結(jié)合的多月級其應(yīng)用。背景駄PKR是一種由干擾素i秀導(dǎo)的,于雙鏈RNA的蛋白激酶，是^+亥翻i^始因子elF2a激酶家族成員之一。它是一種有551個(gè)氨基酸組成的絲氨酸一蘇氨酸激酶，而近其臓究也發(fā)現(xiàn)欺有酪氨酸激酶的活性[Su，Q.eta丄Tyrosinephosphorylationactsasamolecularswitchtofull—scaleactivationoftheeIF2aRNA-d印endentproteinkinase.2006.PNAS]。結(jié)構(gòu)上，主要包括2個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域N端與RNA結(jié)合的調(diào)節(jié)性結(jié)構(gòu)域和C端的催化結(jié)構(gòu)域。PKR在干媳誘導(dǎo)的抗病毒防御應(yīng)答中發(fā)揮主要的作用，被認(rèn)為是IFN誘導(dǎo)的最具有特征性的抗病毒路徑。PKR也可能是治療多種神經(jīng)退行性病變的藥物靶標(biāo)[Peel，AlysonL.PKRActivationinNeurodegenerativeDisease]。其中，阿爾茨海默癥(AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，H神經(jīng)纖維絲纏結(jié)和神經(jīng)細(xì)胞死亡，理變化為病理特征。P—淀粉秀導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡中半胱天冬歐a印ase從PKR的A印251切掉PKR的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，釋放出組成型激活的elF2a激酶結(jié)構(gòu)域從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞蛋白合成的抑制[MlL0:."a丄Activationofcaspase-8intheAlzheimer'sdiseasebrain.2001.NeurobiolDis.]。以PKRcat作為靶蛋白，抑制劑可以用于開發(fā)延緩M癡呆病中神經(jīng)細(xì)胞的死亡，緩解和治療^P癡呆的藥物。在過去的10年間，多肽療法對醫(yī)藥行說，被認(rèn)為是一項(xiàng)很有前途的新開發(fā)。，范圍內(nèi)有600—700種多肽正處于開發(fā)階段。其中，在細(xì)胞信號ffig各的基lf鵬開究和藥物研發(fā)方面，激酶多肽類抑制劑已成為一個(gè)非常輸途的領(lǐng)域。例如，多肽PKI抑制PKA的激酶活性I細(xì)于研究人淋巴細(xì)胞的調(diào)亡通路[Zhang，B.eta丄RaclinhibitsapoptosisinhumanlymphomacellsbystimulatingBadphosphorylationonSer-75.2004.Mol.Cell.Biol.]。豆蔻酰基化蛋白激歐的抑制肽在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平都能夠牛寺異的抑制PKC的活性。[Spyridopoulos，I."a丄DivergenceofangiogenicandvascularpermeabilitysignalingbyVEGFinhibitionofproteinkinaseCsuppressesVEGF_inducedangiogenesisbutpromotesVEGF-induced,NO~dependentvascularpermeability.2002.Aterioscler.Thromb.Vase.Biol.]。盡管PKR激酶結(jié)構(gòu)^S老年癡呆等疾病中發(fā)揮作用，但目前絲簾KR抑制劑和PKR多肽鄉(xiāng)帝擠啲報(bào)道。多肽藥物設(shè)計(jì)中，禾,噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)構(gòu)建不同容量的隨機(jī)肽庫，從這些月褲中快速篩選出活性多肽，并鑒定其結(jié)構(gòu)，可以簡便決速地獲得與耙好具有強(qiáng)親和力和特異性的小肽或新型蛋白，這翻太段可以作為f離藥物進(jìn)行開發(fā)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是,一種育,與PKR激酶結(jié)構(gòu)JI^異性結(jié)合的多形汲其應(yīng)用。PKR是神經(jīng)細(xì)胞凋亡相，病，如^^癡呆癥藥物開發(fā)的新耙點(diǎn)。本發(fā)明應(yīng)用12肽噬菌體展示文庫對Pl進(jìn)行五輪篩選，獲得了能與Pl賴異性結(jié)合的12肽，并且該12肽宮^1I制PKR^的激酶活性。本發(fā)明應(yīng)用噬菌體展示文庫對神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白PKRcat進(jìn)行篩選，獲得了一，異性結(jié)合PKIU的12肽，其氨基M)^列如下Asp-Tyr-Met-Ser-Thr-Leu-Phe國Met-Ala-His-Gln-Thr。戰(zhàn)多肽，該夠與PKR激酶結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，并且f,制PKR^磷酸化elF2a的能力，IC5o約為250nM。戶誠的多肽可以用于抑制PKILt激酶活性?？梢詰?yīng)用于開發(fā)PKRcat抑制劑。本發(fā)明掛共的與PKR激酶結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的多肽的篩選和鑒定步驟如下*^1^人？^進(jìn)行五輪篩選，獲得與PKR結(jié)合的重組噬菌體；ELISA法檢測噬菌體與PKR^的結(jié)合；單克隆噬菌體的分離制備；,體基因組單鏈DNA的提取和獲得寡月，列；多肽固相合成，競爭ELISA檢測多肽與PKH的結(jié)合；應(yīng)用體外生物化學(xué)方法研究12月樹PKIU激酶活性的影響。本發(fā)明的有益皿是本發(fā)明12肽倉嫩特異性的與PKIU結(jié)合^P制Plt的激酶活性，可應(yīng)用于Plt抑制劑的藥物設(shè)計(jì)。圖l.是免疫印跡法(WesternBlot)檢測純化PKR^的激酶活性，圖2.是噬菌體展示中每輪的噬菌體數(shù)，以空L作為對照，圖3.是ELISA法檢測篩選得至啲噬菌體和原噬菌體庫與Plt和空孔的結(jié)合，圖4.是ELISA法檢測10個(gè)噬菌,克隆與Plt及空孔的結(jié)合，圖5.是競爭ELISA法檢測合成12肽與PKIU的結(jié)合，圖6.是體外酶學(xué)方纟at測合成12月樹PKILt激酶活性的影響。實(shí)施例l:重組Pl的^J^艦活性的初步研究1.離Pl質(zhì)粒的構(gòu)建利用已有的pET28a-PKRf鎌，下面的PCR弓嫩和Pfu聚合酶PCR擴(kuò)增PKR^:正向引物5'-CATGCCATGGGCGACATGAAAGAAACAAAGTATACTG-3'反向弓l物5'-GGCTCTCGAGACATGTGTGTCGTTCATTTTTCTC-3'禾,NcoI/XhoI消化擴(kuò)增DNA片段，并且克KA質(zhì)粒pET28a(Novagen)。將這樣構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pET28a-PKR^并且導(dǎo)入大腸桿菌BL21。重組質(zhì)粒pET28a-Plt允許在成熟的Plt的N彩浠具有另夕卜個(gè)甲基硫氨,凝口在C具有另外6個(gè)組氨酸的重組PKIU的皿。2.魏Pl的純化①.齡有pET28a-Plt的BL21于5mLLB培養(yǎng)基(50ng/ml卡那霉素)，37°C，250rpm搖菌過夜。②.1:50的比例轉(zhuǎn)接到4個(gè)大瓶中(^250mLLB培養(yǎng)基，50ug/ml卡那霉素)，37°C，250rpm搖菌2小時(shí)。加入300uMIPTG，27°C，250rpm，過夜誘導(dǎo)。③.將誘導(dǎo)過夜的菌液10000rpm，離心15倂中。用LysisBuffer(20mMTris-HCl，500rnMNaCl，pH7.5)重懸沉淀，10000rpm，離心15射中。.用40raLLysisBuffer重懸所有沉淀，加入PMSF蛋白,制劑至終濃度為lraM，在冰浴中超聲破碎(功率300W，超聲5s，停15s,90循環(huán))。將液12000rpm，15射中離心兩次。將離心后的上清與4mLNi樹脂4。C結(jié)合lh。⑥.在蛋白與樹脂結(jié)合的同時(shí),清洗蛋白純化儀:先用清水清洗B，，,洗A管置(5mL/辦中)；再用ElutionBuffer(20rnMTris-HCl，500rnMNaCl，250mM咪唑，pH7.5)清洗BM(0.5mL/併中)；最后用LysisBuffer清洗AM(0.5mL/併中)。⑦.將結(jié)合蛋白的樹脂離心，棄上清，裝柱，連軒AKTAprimeplus蛋白純化儀(通用電氣)。用LysisBuffer漂洗Beads,洗下一降寺異結(jié)合的蛋白。用ElutionBuffer梯度洗脫目的蛋白。⑧.根據(jù)蛋白峰的隨，收集相應(yīng)管的》m液，跑SDS-聚丙烯翻安鵬電泳(SDS-PAGE),考馬斯賠她銜正。3.PKRcat激酶活性的初步分析反應(yīng)體系為40uL:①.將50ng純化PKILt加入置于冰上試管中，其終濃度為25nM。②.混合底物純化的elF2a，ATP，5XBufferA(lOOmMTris-HCl，200mMKC1，lOmMMgCl2)和雙蒸水使反應(yīng)液中含終濃度為20mMTris-HCl，40mMKCl，2mMMgCl2，500nMelF2a，IOOpMATP，以此混合液啟始反應(yīng)。③.以^)混合液啟始反應(yīng)，30。C7K浴準(zhǔn)確反應(yīng)10辦中。力口8pL6XLoadingBuffer終止鵬。.9(TC沸水中煮5射中。樣品7轉(zhuǎn)[]至室溫，'M離心機(jī)短暫離心(15s)。⑤.上樣，進(jìn)行SDS—PAGE電泳。⑥.WesternBlot法檢測elF2a的磷酸化狀態(tài)。方法如下lOOmA，電轉(zhuǎn)移1.5小時(shí)。用3%的月劃旨牛^^寸閉膜，室溫?fù)u床輕搖l小時(shí)。加入第一抗體(磷酸化elF2a抗體，兔源，Invitrogen)，室溫?fù)u床輕搖l小時(shí)。1XTBST(含O.1%Tween附BS，pH7.4)鵬3次，每次5分鐘。與第二抗體反應(yīng)(HRP偶聯(lián)羊抗兔二抗，SantaCruzBiotechnology),室^M,M40^Ht。lXTBSTi^莫3次，每次5射中。去離子7K洗5^H中。力口化學(xué)發(fā)艦物(ECL)曝光。曝光弓破經(jīng)繊成像系統(tǒng)ChemidocXRSSystem(Bio-Rad)定量。StripeBuffer(7M鹽麵，10mMDTT)處鵬30倂中。去離子水^3次，每次5併中。用3%的腳旨牛^^寸閉膜，室溫?fù)u床輕搖l小時(shí)。力口入第一抗體(anti-elF2aantibody,兔源，SantaCruzBiotechnology),室溫?fù)u床輕搖l小時(shí)。1XTBST(含0.1。/。Tween附BS，pH7.4)ftt3次，每次5併中。與第二抗體反應(yīng)(HRP偶聯(lián)羊抗兔二抗，SantaCruzBiotechnology),室溫?fù)u床輕^40分鐘。1XTBST鵬次，每次5併中。去離子ZK洗5併中。加化學(xué)發(fā)艦物(ECL)曝光。曝光鵬經(jīng);鵬成像系統(tǒng)ChemidocXRSSystem(Bio-Rad)定量。eIF2a磷酸化離二磷酸化elF2a曝光弓膨全elF2a曝光鵬。結(jié)果從1L菌液中純化出48呢的PI屋白，酶活分析表明純化蛋白具有激酶活性，倉,酸化elF2a;而對照組未加APlelF2a未被磷酸化(圖l)。實(shí)施例2:纟SiE輪篩選獲得能與PKRcat特異性結(jié)合的重組噬菌體1.第一纖選與睞①.用NaHC03溶液,PKIU蛋白至100pg/mL的溶液，要求NaHC03的終濃度為0.1M。加100|iL該溶液到96孔板的一個(gè)孔中，4。C包Mil夜。②.力口150^親賴羊配制的含0.5%(w/v)BSA的TBS(BTBS)溶液到上步包被蛋白的孔中，室溫?fù)u擺平臺方j(luò)ffil小時(shí)。③.與此同時(shí)，將噬菌恢10"pfU)加到100nLBTBS中，加到一個(gè)空L中，室溫?fù)u擺平臺方爐1小時(shí)，目的是將可以與ELISA板非特異性結(jié)合的噬菌,收掉。.倒掉蛋白/BTBS溶液，用200)iLTBST(含0.1%Tween的TBS，pH7.4)洗6遍，注意每次都不要讓孔干了。最后一次洗完后，將先前與板吸鵬的噬菌柳TBS溶鵬移到這個(gè)孔中。室溫?fù)u擺平臺方^gl小時(shí)。⑤.倒掉噬菌^/BTBS溶液，用200(iLTBST洗10遍。⑥.；tal00|oL0.2MGlySine^結(jié)合的噬菌體,室溫?fù)u擺平臺驢8辦中，立即轉(zhuǎn)移到小離心管中，并用Tris-HClbuffer中和到pH為7—8。4。C保存直到測定噬菌^度或擴(kuò)增。⑦.對照另一孔不包被蛋白按相同方法操作，得至(J艦噬菌體并測定濃度。2.擴(kuò)增，第二輪及之后幾輪鵬與艦①.保留10-20^L上步得到的噬菌做mOT于測濃度，餘刺余的噬菌體，擴(kuò)增產(chǎn)生用于下一輪篩選的噬菌體。提ltr將大腸桿菌ER2738[F，laciqA(lacZ)M15proA""B+zzf::TnlO(Tet^/fhuA2supEthiA(lac-proAB)A(hsdMS-mcrB)5(rk—mk"McrB。菌株保存在含50%甘油的LB培養(yǎng)基中，存于-7(TC]接到LB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)到OD60tan為0.5時(shí)，取lmL已培養(yǎng)的大腸桿菌ER2738轉(zhuǎn)接到含有30mLLB培養(yǎng)基的三角瓶中，同地^r增的噬菌働n入到t角瓶中，37'C搖床培養(yǎng)4.5小時(shí)。②.轉(zhuǎn)移上歩的培l(xiāng)^/到離心管中，室溫，10000ipm離心15射中。將80%的上清吸至噺的離心管中，加入1/6上清^^只的PEG溶液，4'C節(jié)趙夜。③.《C，10000rpm離心30^H中，緩慢倒出上清，再小心的將管壁上的液體離心下來，用微*#液器小心棄掉。.用200nLTBS重懸上步的沉淀，轉(zhuǎn)移懸游U0.5mL離心管中，室溫10000rpm離心5倂中。⑤.上清轉(zhuǎn)移到新的0.5龍離心管中，逸就是擴(kuò)增了的,體。4"保存用于測濃度和下一輪篩選?！?包被ELISA板的另一個(gè)L，加入10HpfU第一輪擴(kuò)增噬菌體。按第一輪的方法進(jìn)行第二輪及之后幾輪的篩選和擴(kuò)增，每輪噬菌體的加入量要,與第一輪一致。3.噬菌鵬度的測定的具體實(shí)施①.規(guī)桿菌ER2738接種到5mLLB培養(yǎng)基中，37。C搖床培養(yǎng)魏數(shù)早中期(OD6oonm大約0.5)。②.融4fcJL層膠(含有0.7。/。瓊脂的LB)，條3ml7管，45。C7j^舒衡，準(zhǔn)備好《頓。③.用LB培養(yǎng)勘爭淵兌(或擴(kuò)增)后的噬菌體進(jìn)行10倍系列稀釋。稀釋比例如下對于擴(kuò)增的噬菌艦，對于擴(kuò)增的噬菌,，稀釋10^和10"倍。對于fm下來的噬菌體液，第一輪按1()2和103,，以后每多一輪就增加10倍稀釋度。.將lO^iL噬菌^^働n入到200iA第一步的ER2738菌液中，，輕輕混勻，室繊置1—5分鐘。轉(zhuǎn)移第三步中噬菌鵬染的ER2738菌液到第二步中45。C平衡的上層膠中，腿搖動(dòng)，立即倒入預(yù)溫的LB平板(涂有IPTG和X-gal)上，均勻鋪平。⑤.7細(xì)5倂中，反轉(zhuǎn)平板，37。C培養(yǎng)過夜。⑥.計(jì)數(shù)器統(tǒng)計(jì)平社的噬^sm量，根據(jù),倍數(shù)計(jì)算噬菌體的濃度。結(jié)果進(jìn)行5輪富集篩選，每輪從Plt上洗脫下來的噬菌體量在總體i^漸升高，與對照孔比較實(shí)現(xiàn)了104倍富集(表1)。表1中五輪的噬菌體數(shù)用圖1。圖1中縱坐標(biāo)用對數(shù)值表示，橫坐標(biāo)代表輪數(shù)。表l篩MPKR^特異性結(jié)合的噬菌體<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>a.第五輪皿下的u離體量與第四輪持平說明對PKR^結(jié)^fl鶴體的富集EiSiiUt頓n，更多輪的,并不能增加富集離。實(shí)施例3:ELISA檢測篩選到的噬菌體對PKRcat艦照結(jié)合能力①.用NaHC03溶釋蛋白為100pg/mL的溶液，要求NaHCOa的終濃度為O.IM。加lOOpL該溶液到96孔板的兩個(gè)孔中，4'C過夜固定。同,照同樣的方法將BSA力口入另兩個(gè)孔作對照。②.每孔加100^3%的BSA封閉未結(jié)合蛋白的部分，室溫?fù)u擺平臺方爐1小時(shí)。③.根據(jù)所測的第五輪冼脫下的噬菌體的濃度，將噬菌體用TBST稀釋，每孔加10(VL，噬菌體約109—101G。室溫，離平臺方爐l小時(shí)。.*孔用200|JTBST洗6次。⑤.HRP-抗M13抗體(PhaimaciaBiotech公司)按1:5000用TBST稀釋，每孑L加lOO^iL,室溫?fù)u擺平臺方ifil小時(shí)。針L用TBST洗6次。⑦.按60^L四氨基聯(lián)苯胺(TMB，Sigma公司，lOmg/mL溶于DMSO)加到10mL^f酸-醋酸鈉(Critate-Ac)中，再加入3^LH202配制底物，每孔加l(KVL所配制的底物顯色。⑧.1倂中后加100MLlMH2S。4終lhH應(yīng)。用酶標(biāo)儀在OD450nm下測定吸光值。結(jié)果第五輪得到的特異性噬菌體庫與PKR^結(jié)合能力脇大于原始噬菌體庫，第五輪得到的特異性噬菌體庫與PKR^結(jié)合能力也繊大于其與BSA結(jié)合能力，即第五輪得至啲B驢體庫能夠特異性與PKR^結(jié)合(圖2)。圖2中橫坐標(biāo)代表不同的噬菌體庫，輕標(biāo)標(biāo)平均凈吸光值，lib代表文庫噬菌體，R5代表第五輪篩選到的特異性噬菌體，白色柱代表與PKIU的結(jié)合，黑色柱代表與對照的結(jié)合。實(shí)施例4:單克隆噬菌體的分離制備1.特異性結(jié)合的噬菌體克隆的確定①.在測定第五輪淵兌噬菌體的平虹挑取10個(gè)單克隆鑒定多鵬列。②.用滅菌的牙^t兆取一個(gè)藍(lán)色噬^^王轉(zhuǎn)接^i咅養(yǎng)至對數(shù)中期的規(guī)桿菌ER2738的i體中。③.37'C搖床培養(yǎng)4—5小時(shí)。.轉(zhuǎn)移培l(xiāng)^tl到7mL離心管中，10000rpm離心10射中。⑤.將80%的上清吸到新的離心管中，加1/6上清#^只的PEG溶液，4'C沉淀2小時(shí)。⑥.4'C，10000rpm離心30併中，緩侵倒出上清，用微誠液器小心4娥留的液體吸棄。⑦.用200nLTBS重懸沉淀，轉(zhuǎn)移懸液到0.5mL離心管中，4°C，lOOOOrpm離心5射中。⑧.上清轉(zhuǎn)移到新的0.5mL離心管中，逸就是所挑取的噬菌脾克隆。4'C保存用于測濃度，如果要長期保存，加50%甘油，凍于一2(TC。2.ffl3!ELISA檢測挑取的單克?、?用NaHCO3溶液稀釋蛋白為100)ag/mL的溶液，要求NaHC03的終濃度為O.IM。對于*單克隆要包MM少兩個(gè)孔，一個(gè)孔包,妙萬篩的蛋白，另一個(gè)孔包被BSA作對照。每孔加100)aL蛋白，4t:過夜固定。②.每孔加100nL3e/。的BSA封閉未結(jié)合蛋白的部分，室溫J離平臺方燈1小時(shí)。③.根據(jù)所測的噬菌脾克隆濃度，將一定量的噬菌脾克隆用TBST稀釋，銜L加100iaL，使噬菌働口入量在109—1010。室溫J離平臺方燈1小時(shí)。.^h孑Lffl200WTBST洗6次。.抗條1:5000用TBST稀釋，每孔加100|xL，室溫?fù)u擺平臺方燈1小時(shí)。針L用TBST洗6次。⑦.按60^LTMB(10mg/mL溶于DMSO)加到10mLCritate-Ac中，再加入3|^11202配制底物，每孑L加lOO^L顯色。⑧.1倂中后加100(XL1MH2S04終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在OD45(ta下測定吸光值。結(jié)果IO個(gè)單克隆都表現(xiàn)出對PKIU的高結(jié)合性(圖3)。圖3中橫坐標(biāo)表示不同的噬菌體單克隆，縱坐標(biāo)表示平均凈吸光值；白色柱^Plt孔的平均凈吸光值；黑色柱表示BSA孔的平均凈吸光值。圖3中針(l織脾克隆均與PHBSA結(jié)合。洗滌后，用辣M:氧化物謝禺聯(lián)M13抗體及其底物TMB對^Niia行ELISA反應(yīng)，并檢測OD450nm。對^克M行了兩組檢測，圖中為兩組檢測的平均值。實(shí)施例5:噬菌體基因組單鏈DNA的提取和12，列的獲得①.將所挑取的IO個(gè)單克隆噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增。②.取6(VL擴(kuò)增后的單克隆噬菌鵬液，力口入20ioLPEG溶液，置于4。CfeK^內(nèi)節(jié)趙夜。③.10000rpm離心10射中，棄上清并倒扣離心管，使液^^l^。.加入200pL碘化物緩沖液，再加入500nL^zK乙醇，室溫孵育10辦中。⑤.10000rpm離心10^H中，棄上清，用70%乙醇洗沉淀。⑥.10000rpm離心10射中，棄上清，千燥，讓殘余液鵂發(fā)完全。⑦.重懸沉淀于30^L去離子7K中，該溶液即該單克隆噬菌體的基因組單鏈DNA。⑧.以一96gffl弓物(5，-CCCTCATAGTTAGCGTAAC03'，NewEnglandBiolabs隨機(jī)十二肽噬菌體展示文庫產(chǎn)品)測序。測序結(jié)果用PrimePrimier瀏糊譯，得到多S游列。序列如下Ser-Val-His-Leu-Tyr-His-Ser-Thr-Lys-Thr-Leu-AigAsp-Tyr-Met-Ser-Thr-Leu-Phe-Met-Ala-HiS"Gln-Thr實(shí)施例6:固相多肽合成①.翻Fmoc做錢酸合成的策略，在固相載體上合成多肽；合成^g用TFA(三氟乙酸)切割，乙醚沉淀得到多肽禾,品。②.用制備色譜(HPLC)純化多肽，得到多月衫屯品。用MerckC18色譜柱，含0.05%的TFA的乙麟性梯度冼脫(乙腈濃度在30min內(nèi)從5%變化到35%)，紫外210nm波長檢測，收集單一組分的峰。③質(zhì)譜測試(MS)。結(jié)果HPLC峰面積積分比較得到兩種多肽會(huì)艘均大于95%，質(zhì)譜中目標(biāo)肽的W離子,口設(shè)計(jì)肽的理論M量一致，兩^結(jié)果表明獲得了高鄉(xiāng)艘的目標(biāo)肽。實(shí)施例7:合成多肽的競爭ELISA實(shí)驗(yàn)①.用NaHC(V溶液稀釋蛋白為20(ig/niL的溶液，要求NaHC03的終濃度為0.1M。每孔加60^iL，共48個(gè)孔，4。C過夜固定。②.倒掉蛋白液，針L用200^LTBS洗四遍。③.每孔加200^3%的BSA封閉未結(jié)合蛋白的部分，室溫?fù)u擺平臺腹置l小時(shí)。.倒掉BSA液，加入不同濃度梯度的多肽1和多肽2(6個(gè)梯度)，每L加謂^L，室溫?fù)u擺平臺驢1小時(shí)。多肽1和多肽2分別以無餅列(ScrambledSequence:)為對照，其它步驟相同。.^h孑L^應(yīng)加入109的噬菌體(如加入多肽l的孑L用帶有多肽1的噬菌體去競爭)，讓其和多肽競爭與蛋白的結(jié)合，室溫矛離平臺廳1小時(shí)。⑥.針孑L用200ioLTBST洗8次。⑦.抗條1:5000用TBST,，毎孔加60ijL，室溫?fù)u擺平臺方燈1小時(shí)。⑧.旨孔用TBST洗8次。⑨.60(xLTMB(10mg/mL溶于DMSO)加入到10mLCritate-Ac(pH6.0)中，再加入3^11202即為底物，每孔加100^L顯色。90s后加50nLlMH2SO4終止鵬。⑩.用^t示儀在OD450nm下測定吸光值。.結(jié)果隨著多肽1和多肽2濃度增加，表征噬菌粘Plt結(jié)合的OD^逐漸斷氐；而無餅列多肽的加入并不引起OD^的附氏(圖4)。表明合成多肽l和合成多肽2f灘與對應(yīng)噬菌體競爭結(jié)合Pl實(shí)施例8:多JWPKR^,活性的影響①.用DMSO配制5m^ml多肽(多肽l，多肽2，對照多肽)儲(chǔ)液，保存于一7(TC冰箱。②.用緩沖液TBS稀釋多肽l至100ng/mL，對照多肽至100jxg/mL;用含2XDMSO的TBS■多肽2至10^ig/mL。用含2%DMSO的TBS3^#釋多肽1至濃度為50jag/mL，10嗎/mL，5嗎/mL，l嗎/mL;稀釋多肽2至5ng/mL，2.5ng/mL，l嗎/raL，0.5嗎/mL。③.1(VL不同濃度多肽與50ng純化PKILt混合，冰上孵育15射中。.其棘驟與鄉(xiāng)例l(3)Plt活性的初步分析相同，求得elF2a的磷酸ftf號。結(jié)果:對照多月樹Plt激酶活性沒有影B向，多肽1和多肽2抑制PKR^對elF2a的磷酸化反應(yīng)(圖5)。多肽1的I"約為2.5yM，多月太2的ICso約為250nM。SEQUENCELISTING〈110〉南開大學(xué)〈120〉與PKR激酶結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的多tt^其應(yīng)用〈160>2〈210>1〈211〉12<212>PRT〈213〉A(chǔ)I序列<220><221〉PEPTIDE〈222>(1)..(12)〈223〉〈400〉1SerValHisLeuTyrHisSerThrLysThrLeuAig1510〈210〉2〈211>12〈212〉PRT<213〉A(chǔ)X序列〈220〉<221>PEPTIDE〈222〉(1)..(12)<223>〈■>2AspTyrMetSerThrLeuPheMetAlaHisGinThr1510權(quán)利要求1.與PKR激酶結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的多肽，其氨基酸序列如下Asp-Tyr-Met-Ser-Thr-Leu-Phe-Met-Ala-His-Gln-Thr。2.如權(quán)利要求l戶腿的多肽，其特征在于，該多肽能與PKR激酶結(jié)構(gòu)鵬異性結(jié)合，并且能,制Plt磷酸化elF2a的能力，IQo約為250nM。3.權(quán)利要求1戶腿的多肽在開發(fā)Plt抑制劑中的應(yīng)用。全文摘要一種能夠與PKR激酶結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的多肽及其應(yīng)用。本發(fā)明應(yīng)用噬菌體展示文庫技術(shù)，篩選能夠與PKR<sub>cat</sub>特異性結(jié)合的12肽，其氨基酸序列為Asp-Tyr-Met-Ser-Thr-Leu-Phe-Met-Ala-His-Gln-Thr。該12肽具有與PKR<sub>cat</sub>特異性結(jié)合的特性，并且能夠抑制其激酶活性。因此，該12肽對研究PKR<sub>cat</sub>在細(xì)胞調(diào)亡中作用及PKR<sub>cat</sub>抑制劑的開發(fā)具有實(shí)用價(jià)值。文檔編號C07K7/00GK101314614SQ20081005352公開日2008年12月3日申請日期2008年6月16日優(yōu)先權(quán)日2008年6月16日發(fā)明者常云松,張宏愷,張翠竹,曹又佳,杜明娟申請人:南開大學(xué)