專利名稱：：抗腫瘤藥物組合物,其制備方法和其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種以三萜生物堿化合物環(huán)蘇黃楊寧M為活性成分的藥物組合物，以及它的制備方法及其在治療腫瘤疾病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：據(jù)中藥大辭典記載中藥黃楊性平，味苦，無毒。功用主治祛風(fēng)濕，理氣，止痛，治風(fēng)濕疼痛，胸腹脹氣，牙痛，疼痛，跌打損傷?！侗静菥V目》記載黃楊木具有祛風(fēng)除濕、行氣活血的作用。黃楊木粉是民間流傳治療心病的有效藥物。環(huán)維黃楊星D(CyclovirobuxinumD)系從黃豐湯禾斗t直物^j、卩十黃豐湯(5zaz^附z'cro//^〃aSieb.etZucc.)及其同屬植物中提取的一種生物堿，亦稱黃楊寧、環(huán)常綠黃楊堿D、黃楊堿等，化學(xué)結(jié)構(gòu)屬三萜生物堿。環(huán)維黃楊星D主要用于治療氣滯血瘀所致的胸痹心痛、脈結(jié)代、冠心病、心律失常者。現(xiàn)代藥理研究顯示環(huán)維黃楊星D有保護神經(jīng)元、抗心律失常及心肌缺血等作用。臨床上，對缺血性心臟病、心律失常等均具有較好的作用，是我國成功研制的一種治療心血管疾病的新藥。多年的臨床應(yīng)用顯示，環(huán)維黃楊星D對多種心律失常、心絞痛、冠心病、心功能不全等具有良好的療效，并被收錄于《中國藥典)2000年版一部。環(huán)維黃楊星D作為一種非苷類強心藥服用藥時安全性較大，且長期應(yīng)用毒副作用低，這些都預(yù)示著這種從天然植物中提取的新藥有著良好的應(yīng)用前景。目前有關(guān)環(huán)維黃楊星D心血管藥理作用的系統(tǒng)研究，如鈣增敏作用、消除心肌肥大作用、對抗心肌缺血的治療機理、對腎素一血管緊張素系統(tǒng)的影響等等，有待進一步深入研究。黃楊木中生物堿一般對心絞痛、心律失常、心功能不全有較好的作用?，F(xiàn)有技術(shù)中未見有黃楊三萜生物堿抗腫瘤活性的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種以三萜生物堿化合物環(huán)蘇黃楊寧M為活性成分的藥物組合物，以及它的制備方法及其在治療腫瘤疾病中的應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案抗腫瘤藥物組合物，其中含有治療有效量的結(jié)構(gòu)式所示的化合物環(huán)蘇黃楊寧M和藥學(xué)上可接受的載體，HCH2。上述藥物組合物的制備方法，采集小葉黃楊萬^^.""'^0尸/^//"的地上部分，粉碎后用70%丙酮常溫滲漉提取3-4次，每次l-2天，合并提取液，減壓濃縮至無丙酮蒸出，得到浸膏；所得浸膏加一定量的H3C酸水稀釋并調(diào)pH值為2-3，用乙酸乙酯萃取2-3次，得到非生物堿部分；酸水液堿化至pH為9-10，用氯仿萃取2-3次得到總生物堿部分；氯仿部分在常壓硅膠柱上柱層析，用氯仿-甲醇梯度洗脫進行粗分，用TLC檢測，得到4-6個部分.氯仿-甲醇(50:1)部分再用石油醚-丙酮(石油醚-乙酸乙酯)梯度洗脫，洗脫得到化合物環(huán)蘇黃楊寧M，再加入藥學(xué)上可接受的載體即可。更具體地制備方法為取小葉黃楊地上部分，粉碎后用70%丙酮常溫滲漉提取3次，每次2天；合并提取液，減壓濃縮至無丙酮蒸出，得到浸膏，加酸水稀釋調(diào)pH-2，分別用3000ml乙酸乙酯萃取3次，得到非生物堿部分；酸水液堿化至pHHO，用氯仿萃取3次得到生物堿部分；氯仿萃取拌硅膠在常壓硅膠柱上柱層析，氯仿-甲醇(100:0,50:1,20:1,10:1,2:1)梯度洗脫，用TLC檢測，得到5個部分Fr.l-Fr.5;取Fr.2部分經(jīng)硅膠柱層次石油醚-丙酮(20:1,5:1)得到Fr.2丄Fr.2.2兩個組分；Fr.2.1經(jīng)繼續(xù)上硅膠柱用石油醚-丙酮(40:l,20:1，10:l)梯度洗脫，得到石油醚-丙酮(20:1)洗脫液洗脫得到部分濃縮后分離純化，并用SephadexLH-20進一步純化得到環(huán)蘇黃楊寧M，再加入藥學(xué)上可接受的載體即可。本發(fā)明的藥物組合物含有治療有效量的化合物環(huán)蘇黃楊寧M為活性成分，以及含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的化合物和組合物可用于制備治療腫瘤疾病的藥物。尤其是用于制備治療肝癌和白血病的藥物。上文所述的的藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑如水等，填充劑如淀粉、蔗糖等；黏合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如十六垸醇；吸附載體如高嶺土和皂黏土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、以及和聚乙二醇等。另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。本發(fā)明化合物可以組合物的形式通過口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥的方式施用于需要這種治療的患者。用于口服時，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑、膠囊等，制成液體制劑如水或油懸浮劑或其他液體制劑如糖漿、酏劑等；用于腸胃外給藥時，可將其制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等。優(yōu)選的形式是片劑、膠囊和注射劑。本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選含有重量比為0.1%99.5%的活性成分，最優(yōu)選含有重量比為0.5%~95%的活性成分。本發(fā)明化合物的施用量可根據(jù)用藥途徑、患者的年齡、體重、所治療的疾病的類型和嚴(yán)重程度等變化，其日劑量可以是0.01-10mg/kg體重，優(yōu)選0.15mg/kg體重?？梢砸淮位蚨啻问┯?。具體實施例方式下面結(jié)合本發(fā)明的實施例進一步來說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但不以此來限定本發(fā)明。實施例l:化合物環(huán)蘇黃楊寧M的制備及其特征取小葉黃楊5ums.m/crap/^/a地上部分14Kg，粉碎后用70%丙酮常溫滲漉提取3次，每次2天；合并提取液，減壓濃縮至無丙酮蒸出，得到浸膏800g，加酸水3000ml稀釋調(diào)pH-2，分別用3000ml乙酸乙酯萃取3次，得到非生物堿部分。酸水液堿化至pH-lO，用3000ml氯仿萃取3次得到生物堿部分135g。氯仿萃取(135g)拌硅膠180g在常壓硅膠柱(硅膠400g)上柱層析，氯仿-甲醇(100:0,50:1,20:1,10:1,2:1)梯度洗脫，用TLC檢觀U，得至ij5個部分(Fr.l-Fr.5)。Fr.2(18g)硅膠柱層次石油醚-丙酮(20:1，5:1)得到Fr.2.1，F(xiàn)r.2.2兩個組分。Fr.2.1(4g)經(jīng)繼續(xù)上硅膠柱用石油醚-丙酮(40:l,20:1，10:l)梯度洗脫，得到石油醚-丙酮(20:1)洗脫液洗脫得到部分濃縮后分離純化，并用SephadexLH-20進一步純化得到化合物環(huán)蘇黃楊寧M(BM-8)純品，重約13mg。BM-8化合物的結(jié)構(gòu)表征.-BM-8化合物C24H35NO，無色針晶(丙酮)，UV(MeOH)Xmax(loge)243(3.2)mn。質(zhì)譜EI-MSm/z:353(M+)，71，58。氫核磁共振譜數(shù)據(jù)S(ppm，CDCB，500MHz):2.86(dd，/=4，11.6，H-3)，0.10,0.35(dd，《/=4.4，H-19),0.94(s，18-CH3)，1.29(s，32-CH3)，2.46(s，N-CH3)，1.80(d，聲7,6，21-CH3)，6.53(q，/=7.6，H隱20)，4.57(s，Ha-30)，4.80(s，Hb-30)。碳核磁共振譜數(shù)據(jù)S(ppm,CDC13,500MHz):31.7(t，C-l)，23.4(t，C陽2)，63.5(d，C國3)，153.6(s，C-4)，44.1(d，C國5)，23.4(t，C-6)，26.4(t，C-7)，45.4(d，C-8)，22.7(s，C-9)，32.4(s，C國IO)，25.5(t，C-ll)，34.4(t，C-12)，42.3(s，C-13)，46.7(s，C-14)，49.3(t，C-15)，206.5(d，C-16)，146.5(d，C畫17)，13.2(q，18國CH3)，29.3(t，C國19)，130.2(d，C-20)，20.8(q，21-CH3),101.0(t，C-30)，24.1(q，32-CH3)，34.5(q，N-CH3)。紅外光譜數(shù)據(jù)IR(KBr)vmax:3610，2982，1705，1640cm國l。BM-8化合物名稱為化合物環(huán)蘇黃楊寧M(CydosuffrobuxinineM)BM-8化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>實施例2:化合物BM-8的抗腫瘤生物活性試驗采用體外抗腫瘤細(xì)胞毒性的生物活性測定方法抗腫瘕藥物篩選的細(xì)胞系培養(yǎng)于含5%胎牛血清，2mML-谷氨酸的RPMI1640培養(yǎng)基中。一個典型的篩選過程如下于96孔板中每孔加入10(^1密度為5x104-4x105/ml的細(xì)胞。細(xì)胞密度的選擇依賴于細(xì)胞傳代的時間即由一個細(xì)胞變?yōu)閮蓚€細(xì)胞所需要的時間。然后置于37"，5%C02，95%空氣，100%相對濕度環(huán)境下培養(yǎng)24小時。24小時后，每個細(xì)胞系取兩塊板，用含TCA的situ固定，以測定藥物加入前的細(xì)胞數(shù)(Tz)。待測藥物用DMSO溶解，終濃度為所需濃度的400倍，冷凍保存。按所需取出藥物，融化，用含50iig/ml慶大霉素的完全培養(yǎng)基稀釋至濃度為所需最大濃度的2倍。除4倍梯度稀釋外，也采用10倍或者1/21og梯度稀釋藥物。每個藥物5個梯度，設(shè)對照。然后向含細(xì)胞的孔中每孔加入稀釋好的藥物100"1，那么藥物濃度為所需濃度。加藥后，37°C，5%C02，95%空氣，100%相對濕度環(huán)境下培養(yǎng)48小時。對于貼壁細(xì)胞，通過加入冰冷的TCA殺死細(xì)胞。具體操作如下逐滴加入50nl含50。/。(w/v)TCA(重濃度10Q/。TCA)，4°C，放置60分鐘，固定細(xì)胞，去上清，逐滴加入水，洗滌5次，空氣中干燥。每孔加入100pl0.4%(w/v且用1%乙酸稀釋)，室溫孵育10分鐘。染色結(jié)束后用1%乙酸洗滌5次，除去未結(jié)合的染料，空氣中干燥。結(jié)合的染料用lOMmtrizmabase溶解。自動讀板儀測定光吸收(515nm)。對于懸浮細(xì)胞，殺死細(xì)胞時逐滴加入50pl80%TCA(終濃度16%)，將細(xì)胞固定于板底，其余步驟與貼壁細(xì)胞相同。用7個光吸收值(加入藥物前的TZ;對照C;五個藥物濃度Ti;)，可以計算各個藥物濃度下細(xì)胞的生長水平。藥物對腫瘤細(xì)胞生長抑制的計算如下當(dāng)Ti^Tz時，在藥物濃度i的生長抑制率為[(Ti-Tz)/(C-Tz)]x跳當(dāng)Ti^Tz時，在藥物濃度i的生長抑制率為[(Ti-Tz)/Tz]xl00;反映量效的三個參數(shù)的計算如下-GI50(生長抑制50%)可由[(Ti-Tz)/(C-Tz)]xl00-50計算得出。其反映藥物導(dǎo)致試驗組蛋白增加比對照組增加減少50%時的藥物濃度。TGI(生長完全抑制)可由Ti-Tz計算得出。LC50(導(dǎo)致藥物處理后蛋白的含量比處理前減少50%的藥物濃度)，顯示處理后細(xì)胞的凈損失，其可以由[(Ti-Tz)/Tz]xl00=50計算得出。如果活性達到一定水平的話，可以計算出這三個參數(shù)值。如果活性太低或者太高，參數(shù)的值可以用大于或者小于最大或者最小的試驗濃度來表示。表1化合物BM-8的細(xì)胞毒生物生物活性(IC50in[iM)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>從表1中數(shù)據(jù)可以看出化合物BM-8對腫瘤細(xì)胞系HepG2(肝癌細(xì)胞株)、K562(白血病細(xì)胞株)的細(xì)胞毒生物活性(IC50in^M)十分明顯化合物BM-8對兩種腫瘤細(xì)胞系的抑制活性IC50，均在pM數(shù)量級上；對兩個個腫瘤細(xì)胞系HepG2(肝癌細(xì)胞株)、K562(白血病細(xì)胞株)的生物活性更是十分明顯，IC50分別達0.78，0.37pM，足見BM-8抑制腫瘤細(xì)胞的顯著活性。表明化合物BM-8對腫瘤細(xì)胞系的抑制活性十分強，比陽性對照順鉑(Cisplatin)的活性要好。陽性對照順鉑(Cisplatin)是目前仍然廣泛應(yīng)用的臨床抗腫瘤化療藥物，表明化合物BM-8對腫瘤細(xì)胞系HepG2(肝癌細(xì)胞株)、K562(白血病細(xì)胞株)的細(xì)胞毒生物活性(IC50in^M)十分明顯，具有很好的潛在抗白血病、肝癌腫瘤的治療藥物的開發(fā)及其利用前景。實施例3:片齊(J:實施例1所得化合物BM-810mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸鎂5mg;制備方法將化合物、乳糖和淀粉混合，用水均勻濕潤，把濕潤后的混合物過篩并干燥，再過篩，加入硬脂酸鎂，然后將混合物壓片，每片重250mg，化合物含量為10mg。實施例4:安瓿劑實施例1所得化合物BM-82mg，氯化鈉10mg;制備方法將化合物和氯化鈉溶解于適量的注射用水中，過濾所得溶液，在無菌條件下裝入安瓿瓶中。實施例5:膠囊劑實施例1所得化合物BM-810mg，乳糖187mg，硬脂酸鎂3mg;制備方法將化合物與助劑混合，過篩，均勻混合，把得到的混合物裝入硬明膠膠囊，每個膠囊重200mg，活性成分含量為10mg。權(quán)利要求1.抗腫瘤藥物組合物，其中含有治療有效量的結(jié)構(gòu)式所示的化合物環(huán)蘇黃楊寧M和藥學(xué)上可接受的載體，id="icf0001"file="S2008100584498C00011.gif"wi="97"he="61"top="63"left="39"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>2、權(quán)利要求1藥物組合物的制備方法，采集小葉黃楊^m^.w/crop/;;//"的地上部分，粉碎后用70%丙酮常溫滲漉提取3-4次，每次l-2天，合并提取液，減壓濃縮至無丙酮蒸出，得到浸膏；所得浸膏加一定量的酸水稀釋并調(diào)pH值為2-3，用乙酸乙酯萃取2-3次，得到非生物堿部分；酸水液堿化至pH為9-10，用氯仿萃取2-3次得到總生物堿部分；氯仿部分在常壓硅膠柱上柱層析，用氯仿-甲醇梯度洗脫進行粗分，用TLC檢測，得到4-6個部分.氯仿-甲醇(50:1)部分再用石油醚-丙酮(石油醚-乙酸乙酯)梯度洗脫，洗脫得到化合物環(huán)蘇黃楊寧M，再加入藥學(xué)上可接受的載體即可。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于取小葉黃楊地上部分，粉碎后用70%丙酮常溫滲漉提取3次，每次2天；合并提取液，減壓濃縮至無丙酮蒸出，得到浸膏，加酸水稀釋調(diào)pH-2，分別用3000ml乙酸乙酯萃取3次，得到非生物堿部分；酸水液堿化至pH=10，用氯仿萃取3次得到生物堿部分；氯仿萃取拌硅膠在常壓硅膠柱上柱層析，氯仿-甲醇(100:0,50:1,20:1,10:1,2:1)梯度洗脫，用TLC檢測，得到5個部分Fr.l-Fr.5;取Fr.2部分經(jīng)硅膠柱層次石油醚-丙酮(20:1,5:1)得到Fr.2.1，F(xiàn)r.2.2兩個組分；Fr.2.1經(jīng)繼續(xù)上硅膠柱用石油醚-丙酮(40:l,20:1，10:l)梯度洗脫，得到石油醚-丙酮(20:1)洗脫液洗脫得到部分濃縮后分離純化，并用SephadexLH-20進一步純化得到環(huán)蘇黃楊寧M，再加入藥學(xué)上可接受的載體即可。4、權(quán)利要求1化合物環(huán)蘇黃楊寧M在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。5、權(quán)利要求l組合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。6、權(quán)利要求1化合物環(huán)蘇黃楊寧M在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用。7、權(quán)利要求1化合物環(huán)蘇黃楊寧M在制備抗白血病藥物中的應(yīng)用。全文摘要抗腫瘤藥物組合物，其中含有治療有效量的結(jié)構(gòu)式所示的化合物環(huán)蘇黃楊寧M和藥學(xué)上可接受的載體，其制備方法和其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。文檔編號C07J53/00GK101284860SQ200810058449公開日2008年10月15日申請日期2008年5月27日優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日發(fā)明者晨卿,琳周,赟孫,張長芹,張雁麗,邱明華,閆玉鑫申請人:中國科學(xué)院昆明植物研究所