專(zhuān)利名稱(chēng)：一種胸腺五肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域中多肽的合成方法，具體說(shuō)是一種胸腺五肽液相合成制備方法。 可適用于大規(guī)模。
技術(shù)背景胸月泉五肽，英文名Thymopoietin pentapeptide; TP-5; Thymopentin， 結(jié)構(gòu)式為 Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-0H，分子式及分子量C,。H化NA，679.77 。胸腺五肽通過(guò)促進(jìn)或抑制的雙向調(diào)節(jié)作用使免疫能力趨于7H常，是一種很有發(fā)展前景的 免疫功能調(diào)節(jié)藥物。而且迄今為止的實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)研究和臨床藥理學(xué)研究以及臨床應(yīng)用均未發(fā) 現(xiàn)胸腺五肽有任何毒副作用。胸腺五肽于1985年在意大利上市，商品名為T(mén)imunox 。傳統(tǒng)的胸腺五肽合成均由固相合成法完成，成本高，難于規(guī)模化生產(chǎn)，產(chǎn)物純化難度很大，有時(shí)甚至用高壓液相色譜法也難于達(dá)到所希望的純度。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種采用混合酸酐法合成胸腺五肽Arg-Lys- Asp- Val-Tyr-0H的方法。 所述方法過(guò)程有二肽合成-三肽合成-四欣合成-五肽合成-粗品生成；它是以N-甲基嗎啉 為催化劑，采用氯甲酸垸基酯為活化劑，活化被保護(hù)的氨基酸形成高反應(yīng)活性的混合酸酐， 與氨基端裸露的氨基酸或肽反應(yīng)來(lái)合成胸腺五肽；各肽合成中均采用N-甲基嗎啉為催化劑， 氯甲酸烷基酯為活化劑，氯甲酸烷基酯(ClC0具，RpEt、 'Bu)選用氯甲酸乙酯、氯甲酸異丁 酯。各肽合成過(guò)程包括混合酸酐的生成-過(guò)濾-減壓濃縮-酸堿洗滌-千燥除水-各肽生成-脫保 護(hù)基的過(guò)程，合成五肽后，脫掉保護(hù)基團(tuán)，生成粗品胸腺五肽，再純化；所述被保護(hù)的氨基酸按各肽合成順序是酪氨酸芐酯與纈氨酸的混合酸酐反應(yīng)得到二肽、天門(mén)冬氨酸的混合酸酐 與二肽反應(yīng)得到三肽、賴(lài)氨酸的混合酸酐與三肽反應(yīng)得到四肽、精氨酸的混合酸酐與四肽反 應(yīng)得到五肽粗品，所用氨基酸的2-氨基采用芴甲氧羰基(Fmoc)保護(hù)，精氨酸的2-氨基由叔 T氧羰基(Boc)保護(hù)，天門(mén)冬氨酸的側(cè)鏈羧基采用叔丁酯基保護(hù)，賴(lài)氨酸的側(cè)鏈氨基用叔丁 氧羰基基保護(hù)，精氨酸的側(cè)鏈胍基HC1保護(hù)，酪氨酸的酚羥基用芐基保護(hù)，羧基用酯基保護(hù)； 酪氨酸酯為酪氨酸芐酯?；旌纤狒纳蛇^(guò)程中的反應(yīng)溫度為-20 -15°C;各肽合成過(guò)程中 的反應(yīng)溫度為-10 (TC。酸洗滌-干燥除水，分別用稀鹽酸和飽和食鹽水洗滌，用無(wú)水硫酸鈉 干燥；脫保護(hù)基過(guò)程為，加入哌啶脫除芴甲氧羰基(Fmoc)保護(hù)基團(tuán)，減壓濃縮后，用醚洗； 加入有機(jī)溶劑溶解，有機(jī)溶劑可以是二氯甲垸、氯仿，在用二氯甲烷或氯仿溶解并冷藏備用， 其中溶劑優(yōu)選二氯甲垸；所述粗品生成是指合成五肽后，用三氟乙酸-巰基茴香醚系統(tǒng)脫除所 有保護(hù)基團(tuán)。在粗品生成后的純化過(guò)程為，用制備性高壓液相色譜純化，得到純度大于99%的胸腺五 肽水溶液，然后用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥得到白色凍干粉狀物固體，純度可以達(dá)到99%以上。 所用的各種保護(hù)氨基酸均能很容易從廠家購(gòu)得。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比有如下優(yōu)點(diǎn) 1產(chǎn)成本相對(duì)較低，以固相合成胸腺五肽為例，其實(shí)際產(chǎn)率僅為理論產(chǎn)率的50%,而本發(fā)明 的產(chǎn)率大于理論產(chǎn)率的60%;2在整個(gè)的生產(chǎn)工藝中所用的試劑價(jià)格相對(duì)較低；3在整個(gè)的生產(chǎn)過(guò)程中所主要采用的是通用設(shè)備，而不象現(xiàn)有技術(shù)中需依賴(lài)大型設(shè)備，因此 生產(chǎn)費(fèi)用較低；4生產(chǎn)工藝較為簡(jiǎn)單，反應(yīng)過(guò)程易于控制，生產(chǎn)工藝的可重復(fù)性強(qiáng)； 5綜合生產(chǎn)周期較短，進(jìn)一步減小生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率； 6合成規(guī)?？纱蠓忍岣撸菀讓?shí)現(xiàn)工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)實(shí)施例、實(shí)驗(yàn)例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但這些實(shí)施例并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1 二肽化合物Val-Try(Bzl)0bzl HC1的合成把13. 58克的Fmoc-Val-0H溶解于160ml 二氯甲垸中，加入35ml的N-甲基嗎啉，反應(yīng) 瓶冷卻，在-20 -15'C條件下向其中加入6.76ml的氯甲酸丁酯，反應(yīng)10分鐘后，將15. 92 克酪氨酸芐醚芐酯鹽酸鹽的二氯甲垸溶液160ml預(yù)冷至-15 -l(TC加入反應(yīng)瓶?jī)?nèi)，再向其中 加入8ml的N-甲基嗎啉，加樣完畢后，反應(yīng)自然恢復(fù)至室溫。并繼續(xù)反應(yīng)l小時(shí)，至反應(yīng)完 全。加入2%稀鹽酸水溶液洗滌3次和飽和食鹽水洗滌3次，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉十燥，過(guò)濾 出干燥劑，加入80ml哌啶，攪拌20分鐘，減壓蒸T-，得黃色油狀物，用石油醚洗滌干燥得 固體18. 29克。實(shí)施例2 三肽化合物Asp(OBut)-Val-Try(Bzl)Obzl HC1的合成。將實(shí)施例1中合成的二肽化合物18.29克，用160ml 二氯甲垸溶解預(yù)冷至-15'C ，備用。 將16. 46克Fmoc-Asp-OH溶解于160ml 二氯甲烷中，向其中加入35ml N-甲基嗎啉，反 應(yīng)瓶冷卻，在-20 -15'C條件下向其中加入6.76ml的氯甲酸丁酯，反應(yīng)10分鐘后，再向反 應(yīng)瓶?jī)?nèi)加入上述預(yù)冷的脫Fmoc-保護(hù)后的二肽的二氯甲烷溶液，將反應(yīng)自然恢復(fù)至室溫，并 繼續(xù)攪拌1小時(shí)左右，用TLC和HPLC檢測(cè)反應(yīng)至完全結(jié)束后，加入2%稀鹽酸水溶液洗滌3 次和飽和食鹽水洗滌3次，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾出干燥劑，加入80ml哌啶，攪拌20分鐘，減壓蒸干，得黃色油狀物，用石油醚洗滌干燥得固體25.36克。 實(shí)施例3 四肽化合物L(fēng)ys(OBut)- Asp (OBut)-Val-Try (Bzl) Obzl HC1的合成。將實(shí)施例2中合成的三肽化合物25. 36克，用160ml 二氯甲烷溶解預(yù)冷至-15。C，放置冰相備用o使18. 74克Fmoc-Lys ( OBut)-OH溶于160ml 二氯甲烷中，向其中加入35ml N-甲基嗎啉， 反應(yīng)瓶冷卻，在-20 -15'C條件下向其中加入6.76ml的氯甲酸丁酯，反應(yīng)10分鐘后，再向 反應(yīng)瓶?jī)?nèi)加入上述預(yù)冷的脫Fmoc-保護(hù)后的三肽的二氯甲烷溶液，將反應(yīng)自然恢復(fù)至室溫， 并繼續(xù)攪拌1小時(shí)左右，用TLC和HPLC檢測(cè)反應(yīng)至完全結(jié)束后，加入2%稀鹽酸水溶液洗滌3 次和飽和食鹽水洗滌3次，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾出干燥劑，加入80ml哌啶，攪 袢20分鐘，減壓蒸干，得黃色油狀物，用石油醚洗漆干燥得固體34.45克。 實(shí)施例4 五肽化合物Arg- Lys(OBut)- Asp(0But)-Va1-Try (Bzl)Obzl HC1的合成。將實(shí)施例3中合成的三肽化合物34. 45克，用160ml 二氯甲垸溶解預(yù)冷至-15'C ,放置冰 箱備用。將13. 12克Boc-Arg-OH HC1溶于160ml 二氯甲烷中，向其中加入35ml N-甲基嗎啉， 反應(yīng)瓶冷卻，在-20 -15'C條件下向其中加入6. 76ml的氯甲酸丁酯，反應(yīng)10分鐘后，再向 反應(yīng)瓶?jī)?nèi)加入上述預(yù)冷的脫Fmoc-保護(hù)后的四肽的二氯甲垸溶液，將反應(yīng)自然恢復(fù)至室溫， 并繼續(xù)攪拌1小時(shí)左右，用TLC和HPLC檢測(cè)反應(yīng)至完全結(jié)束后，加入2%稀鹽酸水溶液洗滌3 次和飽和食鹽水洗滌3次有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾出干燥劑，加入80ml哌啶，攪 拌20分鐘，減壓蒸干，得黃色油狀物，用石油醚洗滌干燥得固體50.65克。 實(shí)施例5胸腺五肽粗肽的合成向50.65克五肽化合物Arg- Lys(0But)- Asp (OBut) -Val-Try (Bzl) Obzl HC1中加入 400 ml切割液(95%TFA、 2. 5%水、2. 5%巰基茴香醚)反應(yīng)2小時(shí)，冷卻至-40。C。加入用乙 醚5L和石油醚10L (預(yù)先冷卻至-4CTC)的混合溶液析出結(jié)品。然后離心干燥得胸腺五肽粗 品約40克。實(shí)施例6胸腺五肽的純化將40克胸腺五肽粗品溶于200ml水中，調(diào)PH值8. 0，制備型高壓液相色譜柱純化(C18 柱乙腈/水梯度洗脫)冷凍干燥機(jī)干燥得胸腺五肽為白色凍干粉狀固體16克，收率60%。
權(quán)利要求
1.一種合成胸腺五肽Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH的方法，其特征在于進(jìn)行如下步驟的反應(yīng)(1)酪氨酸芐酯鹽酸鹽為起始原料，以N-甲基嗎啉為催化劑，采用氯甲酸烷基酯為活化劑，活化Fmoc-Val-OH形成高活性的混合酸酐，與Tyr(Bzl)-Obzl·HCl反應(yīng)，得到Fmoc-Val-Tyr(Bzl)-Obzl·HCl二肽；(2)采用脫保護(hù)試劑將(1)中制得的二肽的氨端脫保護(hù)，得到Val-Tyr(Bzl)-Obzl·HCl二肽；(3)以N-甲基嗎啉為催化劑，采用氯甲酸烷基酯為活化劑，活化Fmoc-Asp(OBut)-OH形成高活性的混合酸酐，使(2)中制得的產(chǎn)物與Fmoc-Asp(OBut)-OH反應(yīng)得到Fmoc-Asp(OBut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl·HCl三肽；(4)采用脫保護(hù)試劑將(3)中制得的三肽的氨端脫保護(hù)，得到Asp(OBut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl·HCl三肽；(5)以N-甲基嗎啉為催化劑，采用氯甲酸烷基酯為活化劑，活化Fmoc-Lys(OBut)-OH形成高活性的混合酸酐，與(4)中制得的產(chǎn)物反應(yīng)，得到Fmoc-Lys(OBut)-Asp(OBut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl·HCl四肽；(6)采用脫保護(hù)試劑將(5)中制得的四肽的氨端脫保護(hù)，得到Lys(OBut)-Asp(OBut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl·HCl四肽；(7)以N-甲基嗎啉為催化劑，采用氯甲酸烷基酯為活化劑，活化Boc-Arg-OH·HCl形成高活性的混合酸酐，與(6)中制得的產(chǎn)物反應(yīng)，得到保護(hù)的Boc-Arg-Lys(OBut)-Asp(OBut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl五肽；(8)將(7)中制得的五肽中加入適量的TFA/H2O/TIS＝95/2.5/2.5脫保護(hù)，得到Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH五肽。
2. 權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括將(8)中制得的產(chǎn)物經(jīng)C18反相柱純化脫鹽，得到純 化產(chǎn)物。
3. 權(quán)利要求1的方法縮合步驟采用氯甲酸乙酯或氯甲酸異丁酯為活化劑。
4. 權(quán)利要求1的方法所述，其步驟(1)、 (3)、 (5)和(7)中混合酸酐生成過(guò)程中的反應(yīng)溫 度為-20'C -lOt:,各肽生成反應(yīng)溫度為-1(TC (TC，其步驟(2)、 (4)、 (6)脫保護(hù)反應(yīng)溫 度為20"C 30。C，其步驟(8)脫保護(hù)反應(yīng)溫度為10'C 4(TC。
5. 權(quán)利要求1的方法所述，其步驟(1)、 (3)、 (5)和(7)中混合酸酐生成過(guò)程中的反應(yīng)時(shí) 間為0.5 1小時(shí)，各肽生成反應(yīng)為] 4小時(shí)，其步驟(2)、 (4)、 (6)脫保護(hù)反應(yīng)時(shí)間為 20分鐘~40分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種胸腺五肽的制備方法。包括如下步驟以酪氨酸芐酯鹽酸鹽為起始原料，以N-甲基嗎啉為催化劑，采用氯甲酸烷基酯為活化劑，活化被保護(hù)的氨基酸形成高活性的混合酸酐與氨基端裸露的氨基酸或肽反應(yīng)。通過(guò)二肽合成-三肽合成-四肽合成-五肽合成-粗品生成-純化，制備高純度胸腺五肽。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)化了工藝，三廢污染少，便于工業(yè)化實(shí)施。
文檔編號(hào)C07K1/02GK101597318SQ20081006465
公開(kāi)日2009年12月9日 申請(qǐng)日期2008年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月3日
發(fā)明者任仲輝, 冷國(guó)慶, 李會(huì)成, 李鄭武, 勝 梁, 王永存, 田學(xué)萍, 葛存慧, 趙華南, 陳玉軍 申請(qǐng)人:哈藥集團(tuán)生物工程有限公司