專利名稱：一種提取植物dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取DNA的方法。
背景技術(shù)：
DNA是分子生物學(xué)研究的主要對象之一，在進行分子生物學(xué)操作過程中, 基因組DNA的質(zhì)量好壞是影響其成敗的關(guān)鍵因素。例如，在PCR過程中多糖、 多酚和色素等都會嚴重的影響DNA聚合酶的活性，干擾引物與模板的結(jié)合導(dǎo) 致擴增失敗。
植物尤其是一些林木中含有大量的多糖物質(zhì)，多糖是提取植物DNA的主 要干擾物質(zhì),由于它與核酸的物理性質(zhì)非常相似，在提取過程中多糖物質(zhì)通常 與DNA共沉淀下來，非常難與DNA分開，因此嚴重地影響了所提取的DNA 的質(zhì)量。目前，國內(nèi)外在提取植物基因組DNA過程中，為了去除多糖采用以 下幾種方法①用低濃度乙醇去除多糖法在DNA提取液中加入無水乙醇至 終濃度10% 30%，再通過酚/仿抽提去除多糖，或者是先用濃度為100mmol/L 的NaAc溶解DNA沉淀，再用低濃度乙醇抽提分離出多糖；②CTAB法CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)比SDS (十二烷基硫酸鈉)去除多糖類物質(zhì)的效果 好，適當(dāng)?shù)靥岣逤TAB和0 -巰基乙醇的含量(不低于1%)可有效地去除多糖等 次生物質(zhì)；但是此方法中如果CTAB濃度過高，在保溫時提取材料與CTAB緩 沖液難以充分混勻，這就需要延長保溫時間，也同時增加了 DNA降解的機率； ③在去除多糖時采用先加不含CTAB的緩沖液抽提多糖，在通過離心除去多糖 的方法；④高鹽沉淀多糖法認為緩沖液中含有高濃度的NaCl將有助于去除 多糖。
但是目前的這幾種去除多糖提取植物DNA的方法都只對含有少量多糖的 植物提取材料有效，而對于多糖含量高的植物(如白樺)或部位(如老葉
片)基本無效，因此目前尚未有一種普遍有效的去除植物材料中多糖，保證所
提取DNA質(zhì)量的DNA提取方法，特別是缺乏有效的、針對多糖含量高的植 物的DNA提取方法。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了解決目前植物DNA提取方法都只對含有少量多糖的 植物提取材料有效，對多糖含量高的植物或部位基本無效的問題，而提供的一 種提取植物DNA的方法。提取植物DNA按以下步驟進行 一、植物提取材料用液氮研磨成粉末， 然后取0.15 0.25g研磨粉末轉(zhuǎn)入lmL提取緩沖液I中在溫度為45士1'C的條 件下水浴10min，再在10000g條件下離心10min; 二、取步驟一離心沉淀物轉(zhuǎn) 入0.5 lmL提取緩沖液II中在溫度為65土rC的條件下水浴10min，之后加入 0.5 lmL氯仿在12000g的條件下離心5min;三、取步驟二離心上清液并加 入上清液等體積的異丙醇，混勻后在10000 12000g條件下離心10min，再用 體積濃度為75%、體積為0.5mL的乙醇洗滌離心沉淀2次，然后室溫氣干， 即得到植物提取材料的DNA;其中步驟一中的提取緩沖液I由乙二胺四乙酸(EDTA)、 NaCl和去離子水組成，提取緩沖液I中乙二胺四乙酸的濃度為50 mmol/L、 NaCl的濃度為0.16mol/L;步驟二中的提取緩沖液II由乙二胺四乙酸(EDTA)、 NaCl、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基肌氨酸鈉(SLS)、 巰基乙醇和去離子水組成，提取緩沖液II中乙二胺四乙酸的濃度為50 mmol/L、 NaCl的濃度為lmol/L、十六烷基三甲基溴化銨的濃度為2.5gA00mL、十二烷 基肌氨酸鈉的濃度為0.1g/100mL、巰基乙醇的濃度為1 mL/100mL。本發(fā)明方法步驟一中在45士rC的條件下進行水浴可以使多糖和RNA完全 溶解在提取緩沖液I中，而DNA則與蛋白形成復(fù)合物DNP沉淀出來(DNP 在提取緩沖液I中溶解度極低)，因此通過離心即可將DNA與多糖及RNA分 開。本發(fā)明方法步驟二提取緩沖液II中CTAB的濃度提高到2.5g/100mL，同 時還加入了另一種去污劑十二垸基肌氨酸鈉(SLS)，促進DNA與蛋白質(zhì)的分 離，并提高了DNA在提取緩沖液II中的溶解。本發(fā)明方法是一種可以廣泛使 用的植物DNA提取方法，它不受植物提取材料多糖含量的影響，在DNA提 取過程中可將植物中的多糖徹底去除，提高了 DNA提取的效率、純度和質(zhì)量。


圖1是具體實施方式
六所提取的DNA的凝膠電泳圖，圖2是采用現(xiàn)有 CTAB法所提取的DNA的凝膠電泳圖。
具體實施方式
具體實施方式
一本實施方式提取植物DNA按以下步驟進行 一、植物 提取材料用液氮研磨成粉末，然后取0.15 0.25§研磨粉末轉(zhuǎn)入lmL提取緩沖 液I中在溫度為45士rC的條件下水浴10min，再在10000g條件下離心10min; 二、取步驟一離心沉淀物轉(zhuǎn)入0.5 lmL提取緩沖液II中在溫度為65土rC的條 件下水浴10min，之后加入0.5 lmL氯仿在12000g的條件下離心5min;三、 取步驟二離心上清液并加入上清液等體積的異丙醇，混勻后在10000 12000g 條件下離心10min，再用體積濃度為75%、體積為0.5mL的乙醇洗滌離心沉淀 2次，然后空氣室溫干燥，即得到植物提取材料的DNA;其中步驟一中的提 取緩沖液I由乙二胺四乙酸(EDTA)、 NaCl和去離子水組成，提取緩沖液I 中乙二胺四乙酸的濃度為50mmol/L、 NaCl的濃度為0.16mol/L;步驟二中的 提取緩沖液II由乙二胺四乙酸(EDTA)、 NaCl、十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB)、十二垸基肌氨酸鈉(SLS)、巰基乙醇和去離子水組成，提取緩沖 液II中乙二胺四乙酸的濃度為50 mmol/L、 NaCl的濃度為lmol/L、十六烷基 三甲基溴化銨的濃度為2.5g/100mL、十二烷基肌氨酸鈉的濃度為0.1g/100mL、 巰基乙醇的濃度為1 mL/100mL。本實施方式在提取過程中采用低濃度NaCl溶液去除多糖，效果顯著，克 服了本領(lǐng)域技術(shù)人員的偏見。本實施方式方法特別適用于多糖含量高的植物材料提取DNA。本實施方式方法操作簡單，易于掌握，步驟少，可有效的提高植物DNA 提取效率。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟二水浴 過程中將裝有提取緩沖液II和離心沉淀物的離心管顛倒3 10次。其它步驟及 參數(shù)與實施方式一相同。本實施方式可以保證反應(yīng)均勻且充分，提高植物DNA的提取質(zhì)量。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟三中加入的異丙醇的溫度為0 4°C (預(yù)冷)。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。 本實施方式可以有效的沉淀DNA，提高植物DNA的得率。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟二中加入氯仿后用振蕩器震蕩2 3min，然后再進行離心。其它步驟及參數(shù)與實施方 式一相同。本實施方式可以保證氯仿作用充分，有效去除雜蛋白，提高植物DNA的 質(zhì)量。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一的不同點是將提取得到 的植物DNA置于TE緩沖液中保藏。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。
具體實施方式
六本實施方式提取白樺成熟葉片DNA按以下步驟進行一、 白樺成熟葉片用液氮研磨成粉末，然后取0.2g研磨粉末轉(zhuǎn)入lmL提取緩 沖液I中在溫度為45。C的條件下水浴10min，再在10000g條件下離心10min;二、 取步驟一離心沉淀物轉(zhuǎn)入0.6mL提取緩沖液II中在溫度為65'C的條件下 水浴10min，之后加入0.6mL氯仿在12000g的條件下離心5min;三、取步驟 二離心上清液并加入上清液等體積的異丙醇，混勻后在12000g條件下離心 10min，再用體積濃度為75%、體積為0.5mL的乙醇洗滌離心沉淀2次，然后 空氣室溫干燥，即得到白樺成熟葉片的DNA;其中步驟一中的提取緩沖液I 由乙二胺四乙酸(EDTA)、 NaCl和去離子水組成，提取緩沖液I中乙二胺四 乙酸的濃度為50 mmol/L、 NaCl的濃度為0.16mol/L;步驟二中的提取緩沖液 n由乙二胺四乙酸(EDTA)、 NaCl、十六垸基三甲基溴化銨(CTAB)、十二 烷基肌氨酸鈉(SLS)、巰基乙醇和去離子水組成，提取緩沖液II中乙二胺四 乙酸的濃度為50 mmol/L、 NaCl的濃度為lmol/L、十六烷基三甲基溴化銨的 濃度為2.5g/100mL、十二烷基肌氨酸鈉的濃度為0.1g/100mL、巰基乙醇的濃 度為1 mL/100mL。白樺的組織細胞中含有大量的多糖、多酚，本實施方式提取緩沖液I作用后的上清成粘稠狀，說明溶解了大量的多糖；步驟一沉淀呈白色，說明大量的多糖已經(jīng)在步驟一中去除了。本實施方式所提取的DNA的凝膠電泳圖如圖1 所示。現(xiàn)有CTAB法提取相同的白樺成熟葉片取白樺成熟葉片在研缽中加入 -196'C的液氮，將植物組織迅速研磨成粉末，把粉末轉(zhuǎn)入65。C預(yù)熱的含2mL CTAB的提取緩沖液的離心管中(提取緩沖液中Tris的濃度為100mmol/L; EDTA的濃度為20 mmol/L; NaCl的濃度為1.4 mol/L; CTAB的濃度為2.0g/100mL;巰基乙醇的濃度為2 5mL/100mL)，使之充分混勻，于65。C水 浴保溫30min，期間緩慢顛倒離心管數(shù)次，保溫30min后，使之冷卻至室溫(室 溫應(yīng)大于15°C，否則CTAB-核酸復(fù)合物會發(fā)生沉淀)，加入等體積氯仿/異戊 醇(24: 1)進行抽提，緩慢顛倒離心管混勻10min，再12000rpm室溫離心 10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，棄沉淀；(重復(fù)抽提2次)在上清液中加 入等體積預(yù)冷的異丙醇，輕緩顛倒混合均勻，室溫放置10 20min，沉淀DNA12 OOOrpm室溫離心10min，棄上清液，用0.5ml的75%乙醇洗滌2次以除去殘留 的鹽；空氣干燥后，將沉淀物溶于20(VL滅菌去離子水中。
CTAB法所得沉淀較多，呈淡黃色，加入的TE緩沖液溶解較困難，呈粘 稠狀；提取的DNA的凝膠電泳圖如圖2所示。
圖1和圖2凝膠電泳結(jié)果進行比較，可以清楚的看出本實施方式提取的 DNA條帶明亮、整齊，其帶型無降解拖尾現(xiàn)象，DNA得率高，說明本實施方 式所提取的DNA比采用現(xiàn)有CTAB法提取的DNA的質(zhì)量更為優(yōu)異。
權(quán)利要求
1、一種提取植物DNA的方法，其特征在于提取植物DNA按以下步驟進行一、植物提取材料用液氮研磨成粉末，然后取0.15～0.25g研磨粉末轉(zhuǎn)入1mL提取緩沖液I中在溫度為45±1℃的條件下水浴10min，再在10000g條件下離心10min；二、取步驟一離心沉淀物轉(zhuǎn)入0.5～1mL提取緩沖液II中在溫度為65±1℃的條件下水浴10min，之后加入0.5～1mL氯仿在12000g的條件下離心5min；三、取步驟二離心上清液并加入上清液等體積的異丙醇，混勻后在10000～12000g條件下離心10min，再用體積濃度為75％、體積為0.5mL的乙醇洗滌離心沉淀2次，然后室溫氣干，即得到植物提取材料的DNA；其中步驟一中的提取緩沖液I由乙二胺四乙酸、NaCl和去離子水組成，提取緩沖液I中乙二胺四乙酸的濃度為50mmol/L、NaCl的濃度為0.16mol/L；步驟二中的提取緩沖液II由乙二胺四乙酸、NaCl、十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基肌氨酸鈉、巰基乙醇和去離子水組成，提取緩沖液II中乙二胺四乙酸的濃度為50mmol/L、NaCl的濃度為1mol/L、十六烷基三甲基溴化銨的濃度為2.5g/100mL、十二烷基肌氨酸鈉的濃度為0.1g/100mL、巰基乙醇的濃度為1mL/100mL。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取植物DNA的方法，其特征在于步驟 二水浴過程中將裝有提取緩沖液II和離心沉淀物的離心管顛倒3 10次。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取植物DNA的方法，其特征在于步驟 三中加入的異丙醇的溫度為0 4°C。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取植物DNA的方法，其特征在于步驟 二中加入氯仿后用振蕩器震蕩2 3min，然后再進行離心。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取植物DNA的方法，其特征在于將提 取得到的植物DNA置于TE緩沖液中保藏。
全文摘要
一種提取植物DNA的方法，它涉及一種提取DNA的方法。它解決了目前植物DNA提取方法都只對含有少量多糖的植物提取材料有效，對多糖含量高的植物或部位基本無效的問題。提取方法一、植物提取材料用液氮研磨成粉末，然后轉(zhuǎn)入提取緩沖液I中進行水浴，再離心；二、取步驟一離心沉淀物轉(zhuǎn)提取緩沖液II中進行水浴，之后加入氯仿離心；三、取步驟二離心上清液并加入上清液等體積的異丙醇，混勻后離心，再用乙醇洗滌離心沉淀，然后干燥，即得到植物提取材料的DNA。本發(fā)明方法是一種可以廣泛使用的植物DNA提取方法，它不受植物提取材料多糖含量的影響，在DNA提取過程中可將植物中的多糖徹底去除，提高了DNA提取的效率、純度和質(zhì)量。
文檔編號C07H1/00GK101302509SQ20081006490
公開日2008年11月12日 申請日期2008年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月11日
發(fā)明者劉桂豐, 靜 姜, 李慧玉, 楊傳平, 王玉成 申請人:東北林業(yè)大學(xué)