專利名稱：：梓醇及其衍生物在制備防治腦血管疾病藥物中的用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及梓醇及其衍生物醫(yī)藥用途，即梓醇及其衍生物在有效治療多種腦血管疾病藥物中的應用。
背景技術：
：腦血管疾病是嚴重危害人類健康的一組常見病和多發(fā)病，是繼心臟病、惡性腫瘤之后威脅人類健康的第三大"殺手"。腦血管疾病分缺血性腦血管病和出血性腦血管病兩大類，前者常見的有短暫腦缺血發(fā)作(TIA)和腦梗塞，后者常見的有腦出血和蛛網(wǎng)膜下腔出血。因其高發(fā)病率、高致殘率、高致死率和高復發(fā)率而給個人、家庭和社會帶來了極大的痛苦、巨大的精神壓力和沉重的經(jīng)濟負擔。幸存者也往往要面對軀體功能障礙、視力聽力缺失、認知功能下降和情感人格改變等一系列神經(jīng)精神功能損害的癥狀，還得承受由軀體疾病所引起的沉重心里負擔。嚴重的后遺癥往往顯著降低腦血管病幸存者的生活獨立性，使患者生活質量和自然社會適應能力明顯下降。隨著我國人口預期壽命的延長和人口老齡化速度的加快，腦血管疾病的發(fā)病率和患病率逐年增高。一直以來，腦血管疾病造成的神經(jīng)細胞死亡沒有切實有效的治療方法，留下無法恢復的神經(jīng)功能缺損，給患者及家庭帶來極大的痛苦。雖然國內(nèi)外研究人員從溶栓治療到介入微創(chuàng)治療，都力求恢復血供，保護處于"半暗帶"的神經(jīng)元，治療腦血管疾病的藥物都以維持生命機能、對癥支持治療和防治并發(fā)癥為主要目的，但是都不能阻斷腦損傷的發(fā)生和促使受損腦組織再生。因此，能夠促使神經(jīng)再生，替代壞死神經(jīng)而重建神經(jīng)功能而達到"無后遺癥"才是治療的最終目標。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，梓醇及其衍生物目前尚無在治療腦血管疾病上的應用。
發(fā)明內(nèi)容研究證明，梓醇及其衍生物能夠能夠通過血腦屏障，可以提高機腦組織缺血缺氧的耐受能力，促進神經(jīng)元軸突和樹突生長、增強突觸重構、促進腦損傷后神經(jīng)功能恢復。因此，本發(fā)明的目的是提供梓醇及其衍生物在制備防治或治療腦血管疾病藥物上的應用。本發(fā)明提供的預防或治療腦血管疾病的化合物是梓醇和其衍生物，即為所示化合物I:OH(I)其中化合物R,為H、OH或者OR4(R4為QCs?；?，dC5的垸基或糖苷基)，R2為H、OH或ORs(R5為QCs?；?，C,C5的烷基)，R3為OH或者OR6(R6為酰基)；在I式中若R,為OH，R2為OH，R3為OH，則該結構式所確定的化合物是梓醇；若R,為H。^^!_。，R2為OH,R3為OH，則該結構式所確定的化合物是梓苷；若&為OH，胡黃連苦苷；若Ri為OH，胡黃連苷；若Rl為HO物是黃金樹苷；若Ri為OH，R2為H。_^|_。，R3為OH，則該結構式所確定的化合物是R2為OH，R3為?！?。，則該結構式所確定的化合物是—!-。，R2為OH，R3為OH，則該結構式所確定的化合R2為''，R;為OH，則該結構式所確定的化合物是Scutellarioside-II;上述化合物的藥學應用采用的實驗的方法及結果開顱法制備SD大鼠局灶性永久性腦缺血模型。造模成功后分為模型組、生理鹽水組、梓醇低、中、高劑量(1、5、10mg/kg體重)治療組和胞磷膽堿陽性藥物對照組，同時設立假手術組為對照。以腹腔注射給予不同劑量梓醇為干預措施，首次給藥時間分為腦缺血后6h或腦缺血后24h，每天給藥一次，連續(xù)7天；采用Bederson評分、肌力測試、平衡木試驗和前肢技巧性食物抓取試驗評價各組神經(jīng)功能恢復狀況；采用高效液相色譜技術定性檢測梓醇能否進入腦脊液；采用Golgi-Cox染色顯示神經(jīng)元樹突和樹突棘，觀察梓醇對神經(jīng)元樹突生長的影響；采用免疫熒光組化和Westernblot檢測新生軸突和突觸分子標志GAP-43和P38蛋白表達，觀察梓醇對腦缺血后神經(jīng)元軸突新生和突觸重構的影響；采用電鏡技術觀測大腦皮質神經(jīng)氈內(nèi)突觸數(shù)目，觀察梓醇對腦缺血后神經(jīng)元超微結構的影響；采用神經(jīng)示蹤和免疫熒光雙標技術顯示脊髓頸膨大區(qū)皮質脊髓束芽生纖維以及腦缺血灶周圍殘存大腦皮質與健側感覺運動皮質區(qū)的纖維聯(lián)系，觀察梓醇對長距離軸突芽生的影響；采用免疫熒光組化和Westernblot檢測各實驗組NogoA、NgR、BDNF和TrkB蛋白表達變化，初步探討梓醇促神經(jīng)修復作用分子基礎。1.梓醇及其衍生物促進腦缺血大鼠神經(jīng)缺失功能恢復采用Bederson神經(jīng)功能評分、肌力評定、平衡木行走試驗和左前肢食物抓取試驗等多種方法評定腦缺血后1、4、7、15和21天各實驗組神經(jīng)缺失功能恢復狀況，證實梓醇及其衍生物對腦缺血后功能恢復有促進作用。在腦缺血后21天，梓醇及其衍生物中、高劑量組受累前肢(左)食物抓取成功率分別為48.7%±5.4%(約相當于基線值72%)和47.3%±4.8%(約相當于基線值70%)，與模型組(25.8%±4.1%，約相當于基線值38%)比較差異具有顯著性0<0.05)。提示梓醇及其衍生物對腦缺血后感覺運動功能恢復有促進作用。且腦缺血后21天時，術后6h開始給藥組和術后24h開始給藥組左前肢抓取成功率差異無顯著性(p>0.05)。提示腦缺血后給予梓醇及其衍生物治療能促進大鼠功能恢復。2.梓醇及其衍生物促進大鼠腦缺血后神經(jīng)元軸突和樹突生長作用(i)梓醇及其衍生物促進缺血灶周圍大腦皮質GAP-43蛋白表達GAP-43是神經(jīng)元新生軸突的分子標志。缺血灶周圍區(qū)大腦皮質GAP-43陽性細胞數(shù)模型組和生理鹽水組均較假手術組增加，但差異無顯著性(&0.05)梓醇及其衍生物各劑量治療組和胞磷膽堿組陽性細胞均比假手術組、模型組和生理鹽水組明顯增加，且梓醇及其衍生物各劑量治療組比胞磷膽堿組增加更明顯(/<0.05)。Westernblot檢測結果與此相符。提示梓醇及其衍生物對神經(jīng)元軸突新生有促進作用。(2)梓醇及其衍生物促進腦缺血灶周圍皮質神經(jīng)元樹突生長模型組缺血周圍殘存大腦皮質神經(jīng)元樹突平均分支為24.67±4.04，較假手術組14.67±2.08明顯減少(/<0.05);梓醇及其衍生物中劑量組為23.67士3.51，比模型組和胞磷膽堿組顯著增加。<0.05)，接近假手術組水平(p〉0.05)。各組樹突棘密度變化趨勢與樹突分支變化趨勢相似。提示腦缺血后缺血灶周圍大腦皮質神經(jīng)元樹突分支和樹突棘密度均明顯減少；梓醇及其衍生物可促進樹突分叉，增加樹突棘密度。(3)梓醇及其衍生物增強缺血灶周圍大腦皮質芽生軸突與健側感覺運動皮質區(qū)的聯(lián)系綠色熒光顯示BDA標記的神經(jīng)細胞和纖維，綠色熒光強度系數(shù)越大反映缺血灶周圍大腦皮質內(nèi)BDA標記纖維的數(shù)量越多。紅色熒光標記GAP-43表達陽性的神經(jīng)細胞和軸突，紅色熒光強度系數(shù)越大反映缺血灶周圍大腦皮質具有生長反應的神經(jīng)細胞和新生突纖維的數(shù)量越多。兩者共定位呈黃色，顯示缺血灶周圍皮質新生的芽生軸突已經(jīng)與健側感覺運動皮質建立纖維聯(lián)系；Pearson相關系數(shù)反映芽生軸突被BDA標記的頻度，其值越大反映缺血灶周圍皮質芽生軸突與健側感覺運動皮質區(qū)的纖維聯(lián)系越密切。結果綠色熒光強度系數(shù)各實驗組間無明顯差異(p>0.05)，提示梓醇及其衍生物不增加健側感覺運動皮質區(qū)向缺血灶周圍皮質區(qū)單位面積纖維投射數(shù)目。紅色熒光強度系數(shù)梓醇及其衍生物中劑量組明顯大于假手術組、模型組、生理鹽水組和胞磷膽堿組(p<0.05)，提示梓醇及其衍生物可明顯促進缺血灶周圍皮質神經(jīng)元軸突芽生。pearson相關系數(shù)模型組較假手術組明顯增加(p<0.05)，梓醇及其衍生物中劑量組明顯大于模型組和胞磷膽堿組(/<0.05)，提示缺血灶周圍皮質芽生軸突是缺血灶周圍大腦皮質與健側感覺運動皮質腦區(qū)建立聯(lián)系的纖維基礎之一；梓醇及其衍生物治療可增加健側感覺運動皮質區(qū)和缺血灶周圍大腦皮質間的纖維聯(lián)系。(4)梓醇及其衍生物增加脊髓頸膨大區(qū)健側皮質脊髓束越邊纖維數(shù)量大鼠皮質脊髓束在脊髓頸膨大節(jié)段集中走行在脊髓后(背)索。正常情況下，皮質脊髓束絕大部分纖維發(fā)枝支配同側脊髓前角，很少越邊支配對側脊髓前角。腦缺血后，模型組健側皮質脊髓束越邊纖維占4.7%±1.3%，較假手術組1.4%±0.5%明顯增加(p<0.05)，提示健側大腦半球感覺運動皮質在腦缺血后功能恢復過程可能發(fā)揮重要作用。梓醇及其衍生物干預后，健側皮質脊髓束越邊纖維占8.5%±2.1%，較模型組和胞磷膽堿組(5.5%±1.8%)明顯增加(p<0.05)，提示梓醇及其衍生物對腦缺血后神經(jīng)元長距離軸突芽生有促進作用。(5)梓醇及其衍生物促進脊髓頸膨大區(qū)健側皮質脊髓束纖維芽生用綠色熒光顯示BDA標記的健側皮質脊髓束，紅色熒光顯示GAP-43表達陽性的新生軸突纖維，BDA/GAP-43共定位后呈黃色，顯示健側皮質脊髓束芽生的軸突。BDA/GAP-43共定位分析，紅色熒光強度系數(shù)越大GAP-43表達水平越高；Pearson相關系數(shù)越大脊髓頸膨大區(qū)健側皮質脊髓束新生的芽生軸突越多。模型組紅色熒光強度系數(shù)明顯大于假手術組(;<().05);梓醇及其衍生物組較其他各實驗組均明顯增大05);提示梓醇及其衍生物對神經(jīng)元軸突芽生有促進作用。模型組Pearson相關系數(shù)明顯大于假手術組(p<0.05)，梓醇及其衍生物組較模型組和胞磷膽堿組均明顯增大(/<0.05)。提示腦缺血損傷可刺激健側皮質脊髓束芽生；梓醇及其衍生物對腦缺血后健側皮質脊髓束芽生有明顯促進作用。(6)梓醇及其衍生物下調健側大腦皮質Nogo-A蛋白表達Nogo-A陽性細胞呈現(xiàn)紅色，分布在損傷側和健側大腦皮層、海馬、紋狀體等腦區(qū)。大腦皮層Nogo-A陽性細胞數(shù)(個/視野)假手術組為56.33士5.51，模型組為213.33±3.78，差異具有顯著性("<0.05);梓醇及其衍生物中、高劑量組分別為121.5土8.35和100.33±7.51，均比模型組、生理鹽水組和胞磷膽堿組明顯減少(p<0.05)。Westenblot檢測結果與此相符。提示腦缺血后大腦皮質內(nèi)Nogo-A表達上調，梓醇及其衍生物對Nogo-A蛋白表達有下調作用。(7)梓醇及其衍生物下調健側大腦皮質NgR蛋白表達損傷側和健側大腦皮層、海馬、紋狀體等腦區(qū)均可見NgR陽性細胞，胞漿和突起呈綠色，細胞核未著色，具有神經(jīng)元的典型形態(tài)特征。健側大腦皮質NgR陽性細胞數(shù)假手術組、模型組和生理鹽水組組間差異無顯著性(;〉0.05)，提示腦缺血后15天，大腦皮質內(nèi)NgR表達水平接近正常生理狀態(tài)。梓醇及其衍生物中、高劑量組NgR陽性細胞數(shù)均比模型組、生理鹽水組和胞磷膽堿組明顯減少(p<0.05)。Westenblot檢測結果與NgR原位檢測結果相符。提示梓醇及其衍生物對腦缺血后大腦皮質內(nèi)NgR蛋白表達有下調作用。3.梓醇及其衍生物對大鼠腦缺血后突觸重構的誘導作用(1)梓醇及其衍生物上調腦缺血后腦內(nèi)突觸素蛋白表達突觸素(P38)是突觸的分子標志，用FITC標記，呈現(xiàn)綠色熒光。陽性著色部位呈大小較均勻的點狀或顆粒狀，主要分布在神經(jīng)氈內(nèi)。陽性著色部位IOD值模型組和生理鹽水組與假手術組差異無顯著性(/〉0.05)，梓醇及其衍生物中、高劑量組均顯著高于模型組和胞磷膽堿組(尸<0.05)。Westernblot半定量分析結果與此基本一致。提示梓醇及其衍生物能上調腦缺血后腦內(nèi)突觸素蛋白表達。(2)梓醇及其衍生物增加大腦感覺運動皮質神經(jīng)氈內(nèi)突觸數(shù)目電鏡下，感覺運動皮質神經(jīng)氈內(nèi)突觸數(shù)目除假手術組外，各實驗組缺血側均比健側減少。模型組健側神經(jīng)氈內(nèi)突觸數(shù)目與假手術組差異無顯著性(P〉0.05)，但缺血側明顯少于假手術組(p<0.05),提示腦缺血后存在突觸丟失現(xiàn)象；梓醇及其衍生物中劑量組健側和缺血側均比模型組和生理鹽水組明顯增加(p<0.05)，但與胞磷膽堿組差異無顯著性(p〉0.05)，提示梓醇及其衍生物對腦缺血后突觸重構有明顯促進作用。G)梓醇及其衍生物促進缺血灶周圍大腦皮質新生軸突形成突觸連接綠色熒光顯示P38標記的突觸前末端，紅色熒光顯示GAP-43表達陽性的軸突纖維，GAP-43/P38共定位后呈現(xiàn)黃色，顯示新生軸突形成的突觸末端。用Pearson相關系數(shù)反映GAP-43/P38共定位頻度。Pearson相關系數(shù)越大說明新生軸突形成突觸越多。模型組和生理鹽水組Pearson相關系數(shù)明顯大于假手術組(p<0.05)，提示腦缺血可刺激新生軸突形成突觸連接；梓醇及其衍生物各劑量組均比模型組明顯增大(p<0.05)，且梓醇及其衍生物中、高劑量組明顯大于胞磷膽堿組(;<0.05)。提示梓醇及其衍生物可增強腦缺血后新生軸突形成新的突觸連接，促進腦缺血后有效軸突芽生。(4)梓醇及其衍生物上調缺血灶周圍大腦皮質BDNF蛋白表達BDNF陽性細胞被Cy3標記，胞漿和突起呈現(xiàn)紅色，胞核不著色，陽性細胞主要為神經(jīng)元。BDNF陽性細胞數(shù)模型組和生理鹽水組均較假手術組明顯增加(尸<0.05)，提示腦缺血后BDNF表達上調；梓醇及其衍生物治療組均比模型組明顯增加(尸<0.05)，且梓醇及其衍生物中、高劑量治療組也比胞磷膽堿組明顯增加(尸<0.05)。Westernblot檢測結果與此相符。提示梓醇及其衍生物可上調腦缺血后BDNF蛋白表達。(5)梓醇及其衍生物上調缺血灶周圍大腦皮質TrkB蛋白表達TrkB陽性細胞胞漿和突起被FITC標記，呈現(xiàn)綠色，胞核不著色。缺血灶周圍大腦皮質TrkB陽性細胞數(shù)模型組較假手術組有減少趨勢，但差異無顯著性(尸〉0.05);梓醇及其衍生物中劑量治療組明顯多于模型組和胞磷膽堿組(尸<0.05)。Westernblot檢測結果與此相符。提示梓醇及其衍生物可上調腦缺血后TrkB蛋白表達。4.梓醇及其衍生物能夠通過血腦屏障給藥后40min的大鼠腦脊液，HPLC法檢測分析發(fā)現(xiàn)在保留時間為10.4min處可見梓醇及其衍生物的紫外吸收峰，與腦脊液加樣對照梓醇及其衍生物的紫外吸收峰保留時間相同，表明給藥后梓醇及其衍生物分布到大鼠腦脊液中。本發(fā)明中梓醇及其衍生物毒性很小。梓醇及其衍生物急性毒性試驗口服最大給藥量為36.0g/kg43.0g/kg，未見動物死亡。腹腔注射給藥LDs。為9.0g/kg17g/kg，靜脈注射給藥LDw,為1.lg/kg2.4g/kg。圖1olgi-Cox染色顯示各實驗組缺血周圍大腦皮質代表性神經(jīng)元樹突和樹突棘(Golgi-Cox染色，A100X，B200X,C-F400X)，圖中A顯示大腦皮質神經(jīng)元分層排列、B顯示大腦皮質錐體細胞層、C假手術組錐體神經(jīng)元、D模型組錐，神經(jīng)元、E梓醇中劑量治療組錐體神經(jīng)元、F胞磷膽堿治療對照組錐體神經(jīng)元；圖2腦缺血15天后健側感覺運動皮質區(qū)注入神經(jīng)示蹤劑前后大鼠的姿勢反射；圖中A注入神經(jīng)示蹤劑BDA之前，右側大腦中動脈缺血所致的左側前肢癱瘓巳部分恢復(可以伸直)；B健側(左)感覺運動皮質區(qū)注入神經(jīng)示蹤劑后3h，先前受累前肢(左)再度出現(xiàn)屈曲抱胸體征。圖3腦缺血后健側感覺運動皮質與其他腦區(qū)的纖維投射；圖中A假手術組，B模型組，C梓醇中劑量組，D胞磷膽堿組圖4缺血側大腦皮質芽生軸突及其與健側感覺運動皮質的聯(lián)系，圖中左為假手術組，右為模型組；圖5DA和GAP-43免疫熒光雙標脊髓頸膨大區(qū)皮質脊髓束軸突芽生，圖中左為梓醇組，右為胞磷膽堿組；圖6實驗組缺血灶周邊殘存大腦皮質神經(jīng)元突觸超微結構變化，圖中A:假手術組，B:模型組，C:中劑量梓醇治療組，D:胞磷膽堿治療對照組。具體實施例用以下的實施例對本發(fā)明作具體說明，但本發(fā)明并不局限于所列舉的實施例包含內(nèi)容。本發(fā)明的實驗動物，購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心(合格證號檢動字2002A040)。實例1、梓醇及其衍生物誘導大鼠大腦皮質神經(jīng)元軸突生長的離體實驗無菌條件下取出生后24h內(nèi)的乳鼠大腦皮質，剪去胼胝體和其他白質，D-Hank液清洗兩遍，0.2X胰酶溶液37。C消化5min，制備細胞懸液，以lXl(f細胞密度接種于兩塊96孔板內(nèi)，每孔種100"1。在37。C、5%的0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DF12，血清濃度為15%。培養(yǎng)24h后全量換成NeurobasalA神經(jīng)元專用培養(yǎng)基(含2XB27)，選擇性培養(yǎng)神經(jīng)元，以后每3天半量換液1次。皮層神經(jīng)元培養(yǎng)第6天后進行神經(jīng)元鑒定，并分組開始作相應藥物干預，繼續(xù)培養(yǎng)48h后行指標檢測。實驗分為空白對照組、梓醇及其衍生物干預組和胞磷膽堿組?？瞻讓φ战M不用任何藥物進行干預；梓醇及其衍生物干預組分設終濃度為O.25、0.5、1.0、2.5、5.0mg/ml五個亞組，梓醇及其衍生物用NeurobasalA神經(jīng)元專用培養(yǎng)液配制；胞磷膽堿組為本實驗陽性藥物對照組，其終濃度為lmg/ml。每組重復3次。各實驗組藥物干預48h后，1000rmin'離心2min，棄原培養(yǎng)液，每孔加入無血清培養(yǎng)液及20riMTT,繼續(xù)培養(yǎng)4h。1000rmirT離心2min，棄原液，每孔加入二甲亞砜(DMSO)200W，震蕩5min，選擇570nm波長，用全自動酶標儀(BioRad550型)檢測各孔吸光值(A值)。神經(jīng)元種植后定時在倒置相差顯微鏡下觀察其生長情況。藥物千預48h后，HE染色，400倍鏡下測量神經(jīng)元軸突起始部至生長錐末端的距離，計為神經(jīng)元軸突長度。每組各孔隨機選擇5個視野，共測量100個神經(jīng)元軸突長度，所測細胞必須有暈光和突起，取其平均值作為該組的實驗結果。本實驗中測量目尺1個刻度二25X10/98Mm。表1-1.不同藥物干預對神經(jīng)元生存活性及軸突長度的影響(無±s)吸光度A值組另lj(570nm)軸突平均長度(um)空白對照組0.463±0.04272.779±21.404胞磷膽堿組0.464±0.12872.562±15.783梓醇及其衍生物各濃度治療組0.25mg/ml亞組.0.357±0.10058.107±12.548"0.5mg/ml亞組0.338±0.12678.231±16.7571.0mg/ml亞組0.351±0.06998.098±38.356"2.5mg/ml亞組0.358±0.132132.885土40.982""5.0mg/ml亞組0.325±0,195106.122±40.087*"注梓醇及其衍生物各濃度治療組吸光度A值分別與空白對照組和胞磷膽堿組相比較，均pX).05;梓醇及其衍生物各濃度治療組軸突平均長度與空白對照組比較*尸<0.05,**尸<0.01:與胞磷膽堿組比較▲/<().05,"尸<0.01。從表中可以分析得出梓醇及其衍生物能明顯促進皮質神經(jīng)元軸突生長，但對其生存活性無顯著影響。實例2、梓醇及其衍生物促腦缺血大鼠神經(jīng)修復的行為學評價實驗一、制備局灶腦缺血模型，造模后6h開始腹腔注射不同劑量梓醇及其衍生物進行干預，采用神經(jīng)行為學評定方法觀察造模后不同時點各組大鼠神經(jīng)功能恢復狀況，初步明確梓醇及其衍生物對腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復有無積極作用。同時，設置一組造模后24h首次給予梓醇及其衍生物中劑量治療組，初步了解大鼠腦缺血后延遲給予梓醇及其衍生物治療是否有效，探討梓醇及其衍生物的有效給藥時間窗。實驗分為8組，即假手術組，模型組，生理鹽水組，造模后6h給藥梓醇及其衍生物低、中、高劑量(分別為l、5、10mg/kg體重)治療組，造模后24h給藥梓醇及其衍生物中劑量治療組和胞磷膽堿治療對照組。每組6只。實驗二、采用高效液相色譜(HPLC)法檢測正常大鼠尾靜脈一次性注射中劑量梓醇及其衍生物后腦脊液中是否含有梓醇及其衍生物，初步明確梓醇及其衍生物能否透過血腦屏障。重復3次。Bederson評分粗略反映各組腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復狀況，可見術后第15天和第21天，術后6h給藥梓醇及其衍生物高、中劑量組和術后24h給藥梓醇及其衍生物中劑量組大部分鼠已恢復到假手術組的功能狀態(tài)，比其他實驗組恢復更好，且差異具有顯著性(y^c:0.05)。提示梓醇及其衍生物可促進腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復，且延遲至腦缺血后24h給藥仍然有效。肌力評定除假手術組外，各組術后第24小時，肌力低下程度與首次給藥前相同，組間無明顯差異(/^>0.05)，各組與假手術組比較差異有顯著性(尸<0.05)。術后第4天，各組(假手術組除外)肌力開始恢復，7天時肌力已明顯改善(,<0.05)，尤其是梓醇及其衍生物各劑量治療組和胞磷膽堿組改善更明顯，與模型組和生理鹽水組比較差異具有顯著性(尸<0.05)。術后第15天和第21天時，術后6h給藥梓醇及其衍生物各劑量治療組、術后24h給藥梓醇及其衍生物中劑量治療組和胞磷膽堿組肌力已恢復正常，而模型組和生理鹽水組仍未完全恢復正常，提示梓醇及其衍生物可促進腦缺血大鼠癱瘓肢體肌力恢復，且腦缺血后延遲用藥仍有效。平衡木試驗反映腦缺血大鼠感覺運動整合能力和運動協(xié)調功能的恢復狀況?？梢娦g后15d和21d時，術后6h開始給藥的梓醇及其衍生物高、中劑量組和術后24h開始給藥的梓醇及其衍生物中劑量組得分明顯低于其他各實驗組(尸<0.05)，但均未恢復至假手術組水平。提示梓醇及其衍生物對腦缺血大鼠運動平衡功能的恢復有促進作用，且延遲給藥也有效。食物抓取試驗反映腦缺血大鼠受累肢體精細感覺和運動功能恢復狀況。各實驗組大鼠術前測定左前肢食物抓取成功率基線為65.7%±4.8%68.0%±3.6%，組間無明顯差異(/〉0.05)。假手術組術后l、4、7、15和21d左前肢食物抓取成功率維持在基線水平，波動在65.0%±5.1%70.2%±5.3%之間。模型組、生理鹽水組、梓醇及其衍生物治療組和胞磷膽堿組術后第1天，大鼠抓取成功率明顯下降，各組抓取成功率降為1.5%±1.2%2.5%±1.9%，組間差異無顯著性(/〉0.05)。術后第4天，各組左前肢抓取功能開始恢復，抓取成功率上升至11.55%±2.5%13.8%士2.2%,但組間無明顯差異(&0.05)。術后第7天，各實驗組大鼠受累前肢抓取成功率明顯增加，其中，模型組為15.7%±4.1%,梓醇及其衍生物低、中、高治療組分別為17.7%±3.6%、30.3%±7.1%、29.2%±7.1%，梓醇及其衍生物中、高劑量治療組與模型組差異具有顯著性(尸<0.05)。術后第15天，各組大鼠左前肢抓取功能仍在恢復，梓醇及其衍生物高、中劑量組明顯比其他實驗組恢復好，差異具有顯著性(尸<0.05)。術后21天，模型組受累前肢抓取成功率恢復至25.8%±4.1%(約相當于基線值38%)，梓醇及其衍生物中、高劑量治療組抓取成功率分別為48.7%±5.4%(約相當于基線值72%)和47.3%±4.8%(約相當于基線值70%)，與模型組差異具有顯著性(尸<0.05)。提示梓醇及其衍生物對腦缺血后感覺運動功能恢復有促進作用。術后24h開始給予梓醇及其衍生物治療組，觀察至術后21天，發(fā)現(xiàn)術后7d、15d和21d受累前肢抓取功能均比模型組對應時點恢復更好(P<0.05)，并與術后6h開始給予梓醇及其衍生物治療組對應時點無顯著性差異(/〉0.05)。提示腦缺血后延遲給予梓醇及其衍生物治療仍對大鼠功能恢復有促進作用。采用HPLC法檢測給藥后40min的大鼠腦脊液，分析發(fā)現(xiàn)在相同保留時間處出現(xiàn)了梓醇及其衍生物的紫外吸收峰，說明給藥后的大鼠腦脊液中含有梓醇及其衍生物，梓醇及其衍生物可以分布到腦脊液中。上述實驗提示梓醇及其衍生物可促進腦缺血大鼠肢體功能恢復，中劑量(5mg/kg體重)效佳；腦缺血后24h梓醇及其衍生物延遲給藥仍然有效；梓醇及其衍生物可以分布到腦脊液中。實例3、梓醇及其衍生物對大鼠腦缺血后神經(jīng)元軸突樹突生長的影響實驗一、采用免疫熒光組織化學技術和WesternBlot分析方法檢測各實驗組大鼠局灶腦缺血后缺血周圍區(qū)和健側運動皮質區(qū)軸突再生標志物GAP-43蛋白表達變化，初步明確梓醇及其衍生物對大鼠局灶腦缺血后軸突再生的影響。實驗分為7組，即假手術組，模型組，生理鹽水組，梓醇及其衍生物高、中、低劑量治療組，胞磷膽堿治療對照組。每組6只。實驗二、采用神經(jīng)示蹤技術顯示大鼠局灶腦缺血后缺血周圍區(qū)和脊髓頸膨大(C4-C6)區(qū)軸突芽生狀況，觀察梓醇及其衍生物對腦缺血后軸突芽生的干預作用。實驗分為5組，即假手術組，模型組，生理鹽水組，梓醇及其衍生物中劑量治療組和胞磷膽堿治療對照組。每組3只。實驗三、采用神經(jīng)示蹤技術結合免疫熒光雙標染色進一步顯示各實驗組大鼠局灶腦缺血后健存神經(jīng)元軸突再生現(xiàn)象，觀察梓醇及其衍生物對大鼠局灶腦缺血后神經(jīng)元軸突再生的影響。實驗分為5組，即假手術組，模型組，生理鹽水組，梓醇及其衍生物中劑量治療組和胞磷膽堿治療對照組。每組3只。實驗四、采用Golgi-Cox染色顯示各實驗組大鼠局灶腦缺血后健存神經(jīng)元樹突分支和樹突棘密度變化，觀察梓醇及其衍生物對其影響，初步明確梓醇及其衍生物對大鼠局灶腦缺血后神經(jīng)元樹突可塑性的可能作用。實驗分為5組，即假手術組，模型組，生理鹽水組，梓醇及其衍生物中劑量治療組和胞磷膽堿治療對照組。每組3只。實驗五、采用免疫組織化學技術和WesternBlot分析方法檢測各實驗組大鼠局灶腦缺血后缺血周圍區(qū)和健側運動皮質區(qū)勿動蛋白-A(NogoA)及其受體NogoR(NgR)蛋白表達變化，觀察梓醇及其衍生物對其影響，初步了解梓醇及其衍生物影響大鼠局灶腦缺血后神經(jīng)元突起可塑性變化的可能機制。實驗分為7組，即假手術組，模型組，生理鹽水組，梓醇及其衍生物低、中、高劑量治療組，胞磷膽堿治療對照組。每組6只。梓醇及其衍生物低、中、高劑量治療組給藥劑量分別為1、5、10mg/kg體重，胞磷膽堿組給藥劑量為0.5g/kg體重。梓醇及其衍生物和胞磷膽堿均用生理鹽水配制，每次給藥總體積為3ml。生理鹽水組經(jīng)腹腔注射等體積生理鹽水。假手術組和模型組不給任何藥物干預。藥物干預組均于術后24h首次經(jīng)腹腔注射給藥，以后每天1次，連續(xù)7d。表3-1.各實驗組缺血周圍區(qū)大腦皮質GAP-43蛋白表達(5±5",/f3)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>與假手術組比，Ap<0.05;與模型組比，Ap<0.05;與生理鹽水組比，*p<0.05;與胞磷膽堿組比，^<0.05。表3_2.梓醇對神經(jīng)元樹突分支和樹突棘密度的影響(^士S,/2=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表3-3.各實驗組脊髓頸膨大區(qū)健側皮質脊髓束越邊纖維相對量(％,無土^S^g)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表3-5各實驗組缺血灶對側大腦皮質NgR蛋白表達_1^±&n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>梓醇高劑量組_136.33±5.25，_0.07±0.02，_^!手術組比，A。<0.05;與模型組比，A。<0.05,與生理鹽水組比，、<0.05;與胞磷膽堿組比，^。<0.05。實驗結果提示梓醇及其衍生物可促進腦缺血灶周圍皮質神經(jīng)元軸突芽生；梓醇及其衍生物可促進腦缺血灶周圍皮質神經(jīng)元樹突分叉和樹突棘密度增加；梓醇及其衍生物可促進腦缺血后健側皮質脊髓束發(fā)芽并越邊支配脊髓失神經(jīng)支配區(qū)；梓醇及其衍生物可下調局灶腦缺血后腦內(nèi)Nogo-A和NgR蛋白表達。實例4、梓醇及其衍生物對大鼠腦缺血后突觸重構的誘導作用實驗一、采用免疫熒光組化染色(單標)和Westernblot分析方法檢測大鼠局灶腦缺血后缺血灶周圍殘存大腦皮質內(nèi)突觸標志物突觸素(P38)蛋白表達變化，從光鏡形態(tài)和蛋白質水平觀察梓醇及其衍生物對大鼠局灶腦缺血后突觸分子標志的影響，初步明確梓醇及其衍生物對腦缺血后突觸重構的作用。實驗分為7組，即假手術組，模型組，生理鹽水組，梓醇及其衍生物低、中、高劑量治療組，胞磷膽堿治療對照組。每組6只。實驗二、采用免疫熒光雙標技術觀察各實驗組大鼠局灶腦缺血后缺血灶周囤殘存人腦皮質內(nèi)新生軸突形成突觸連接的變化，進一步了解梓醇及其衍生物是否能夠促進腦缺血后有效軸突芽生，即芽生軸突是否能夠形成突觸。實驗分為7組，即假手術組，模型組，生理鹽水組，梓醇及其衍生物低、中、高劑量治療組和胞磷膽堿治療對照組。每組6只。實驗三、采用投射電鏡結合體視學方法觀察各實驗組大鼠局灶腦缺血后缺血灶周圍殘存大腦皮質內(nèi)神經(jīng)元突觸數(shù)目的變化，進一步從超微結構水平了解梓醇及其衍生物是否能促進大鼠局灶腦缺血后有效軸突芽生。實驗分為5組，即假手術組，模型組，生理鹽水組，梓醇及其衍生物中劑量治療組和胞磷膽堿治療對照組。每組3只。實驗四、采用免疫炎光組織化學技術和Westernblot分析方法檢測各實驗組大鼠局灶腦缺血后缺血灶周圍殘存腦組織內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)及其受體TrkB蛋白表達的變化，初步探討梓醇及其衍生物影響大鼠局灶腦缺血后突觸重構的可能機制。實驗分為7組，即假手術組，模型組，生理鹽水組，梓醇及其衍生物低、中、高劑量治療組和胞磷膽堿治療對照組。每組6只。梓醇及其衍生物高、中、低劑量分別為IO、5、lmg/kg體重，胞磷膽堿鈉劑量為0.5g/kg體重，上述藥物均用生理鹽水配制，終體積為3ml。生理鹽水組給予等體積生理鹽水。術后1天開始腹腔注射給藥，每日1次，連續(xù)7天。假手術組和模型組不給任何干預。表4-1.各實驗組大鼠健側和缺血側大腦皮質突觸數(shù)目比較(5士S,n=3)組別突觸數(shù)目(個/40000倍視野)健側感覺運動皮質缺血灶周圍殘存皮質假手術組11.50±1.3812.83±1.47模型組11.17±2.326.17±2.40A生理鹽水組12.50±1.876.67±2.07^胞磷膽堿組15.67±2.66AA10.33±3.27A梓醇中劑量組17.33士1.21"11.33±2.88A與假手術組比，<0.05;與模型組比,<0.05;與生理鹽水組比，><0.05;與胞磷膽堿組比,°/7<0.05.表4-2.各實驗組缺血灶周圍大腦皮質P38和GAP-43共定位相關參數(shù)比較(5±S，n=3)組別綠色熒光強度系數(shù)紅色熒光強度系數(shù)Pearson相關系數(shù)假手術組1.04±0.110.60±0.020.14±0.02模型組L19士0.10※0.66±0.090.27土0.04※生理鹽水組1.14±0.18《0.68±0.030.32±0.03《胞磷膽堿組1.01±0.090.85士0.07※a0.48士0.01※a梓醇低劑量組1.31士0.03※"0.83±0.03"^0.50土0.04※a梓醇中劑量組1.38土0.10※"0.92土0.06※"0.63±0.03《A*梓醇高劑量組1.53士0.19※"0.80±0.10《A0.72土0.06※"注與假手術組比較，※P〈0.05;與模型組比較，<0.05;與胞磷膽堿組比較,*/7<0.05.表4-3.各實驗組缺血灶周圍大腦皮質TrkB蛋白表達二丄5±S，n=3)組另ljTrkB陽性細胞數(shù)(個/400倍視野)TrkB蛋白相對表達量(TrkB/e-actin校正OD值)假手術組122.30±3.780.59±0.01模型組104.17±8.250.67±0.07生理鹽水組107.67±14.150.84±0.22胞磷膽堿組106.33±7.371.39±0.39AA梓醇低劑量組142.83±6.17AA1.29±0.06AA梓醇中劑量組174.67±8.33AA1.85±0.47"*0梓醇高劑量組146.00士4.82"1.92±0.37"*0與假手術組比，Ap<0.05;與模型組比，'\p<0.05;與生理鹽水組比，、<0.05;與胞磷膽堿組比，p<0,05。實驗結果提示梓醇及其衍生物可有效減輕腦缺血后神經(jīng)元及突觸超微結構損傷，增加突觸數(shù)目；上調突觸素蛋白表達，促進腦缺血后芽生軸突形成新的突觸連接；上調腦缺血后腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)及其受體TrkB蛋白表達，促進神經(jīng)元有效軸突芽生。權利要求1、一種新型的預防治療腦血管疾病的化合物。其特征是梓醇和其衍生物，即為所示化合物I其中化合物R1為H、OH或者OR4(R4為C1～C5?；?，C1～C5的烷基或糖苷基)，R2為H、OH或OR5(R5為C1～C5?；?，C1～C5的烷基)，R3為OH或者OR6(R6為?；?；在I式中若R1為OH，R2為OH，R3為OH，則該結構式所確定的化合物是梓醇；若R1為，R2為OH，R3為OH，則該結構式所確定的化合物是梓苷；若R1為OH，R2為，R3為OH，則該結構式所確定的化合物是胡黃連苦苷；若R1為OH，R2為OH，R3為，則該結構式所確定的化合物是胡黃連苷；若R1為R2為OH，R3為OH，則該結構式所確定的化合物是黃金樹苷；若R1為OH，R2為R3為OH，則該結構式所確定的化合物是Scutellarioside-II；2、權利要求1所述化合物I梓醇及其衍生物在制備防治腦血管疾病藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及梓醇及其衍生物在制備腦血管疾病防治藥物中的醫(yī)藥用途。梓醇及其衍生物能夠通過血腦屏障，有耐缺氧作用提高腦組織缺血缺氧的耐受能力，促進神經(jīng)元軸突和樹突生長、增強突觸重構，促進腦缺血后受累肢體神經(jīng)功能恢復，可以與在藥理學上可接受的賦型劑配制成不同的劑型防治腦血管疾病。梓醇及其衍生物可以與其它促神經(jīng)修復藥物和腦可塑性藥物以不同的比例配成具有上述治療和預防作用的組合物，并配制成藥理學上可接受的不同劑型。文檔編號C07H17/04GK101250205SQ200810069458公開日2008年8月27日申請日期2008年3月12日優(yōu)先權日2008年3月12日發(fā)明者東萬,胡子成,鵬謝申請人:謝鵬;萬東