專利名稱：：鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法和注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法和注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法，尤其涉及一種使用新型的病毒滅活法制備鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的方法。
背景技術(shù)：
：鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是從小鼠頜下腺中分離純化的神經(jīng)生長(zhǎng)因子的凍干制品，其傳統(tǒng)制備工藝為將小鼠頜下腺組織勻漿，得勻漿上清液；然后將勻漿上清液離心、去沉淀后，上離子交換層析I，收集流穿液；流穿液進(jìn)行酸化解離、離心，得酸解上清液；酸解上清液上離子交換層析，收集目標(biāo)蛋白峰，即得神經(jīng)生長(zhǎng)因子原液；再加入賦形劑甘露醇和穩(wěn)定劑人血白蛋白，經(jīng)除菌過(guò)濾后，分裝，凍干得制品。由于鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子來(lái)源于小鼠，因而該制品存在生物安全性問(wèn)題，主要是鼠源性病毒對(duì)原材料頜下腺的污染或潛在性污染。為了保證該制品的安全性，在控制供體鼠飼養(yǎng)環(huán)境和原材料頜下腺質(zhì)量的同時(shí)，研究生產(chǎn)過(guò)程中去除或滅活病毒工藝對(duì)制品的安全性起著十分重要的作用。對(duì)于血液制品來(lái)說(shuō)，國(guó)內(nèi)外較成熟的病毒滅活/去除工藝方法有巴氏消毒法、干熱法、有機(jī)溶劑/去污劑法、納米膜過(guò)濾法、光化學(xué)法等，但對(duì)于動(dòng)物源性生化提取制品尤其是規(guī)模化生產(chǎn)量的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的病毒滅活工藝，國(guó)內(nèi)外報(bào)道很少。有機(jī)溶劑/去污劑法是利用有機(jī)溶劑和去污劑的配伍，破壞病毒的脂質(zhì)包膜，使其失去傳染性，從而達(dá)到滅活病毒的目的。但該方法對(duì)非脂包膜病毒沒(méi)有去除作用，并且人為引入了有機(jī)溶劑和去污劑，而徹底清除有機(jī)溶劑和去污劑有很大難度，因而加大了產(chǎn)品污染的風(fēng)險(xiǎn);納米膜過(guò)濾法主要利用病毒顆粒和蛋白分子的大小差異通過(guò)納米級(jí)的濾膜把病毒除去，適用于分子量較小(直徑較小)的蛋白，不適于較大直徑蛋白制品的病毒去除,且納米膜價(jià)格昂貴;光化學(xué)法是利用某些光敏劑對(duì)病毒表面及病毒核酸結(jié)構(gòu)有強(qiáng)烈的親和性，在適當(dāng)波長(zhǎng)的光照下易激活，從而通過(guò)光化學(xué)作用破壞與其接觸的病毒結(jié)構(gòu)，但是光化學(xué)法對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子蛋白的活性損傷較大；巴氏消毒法屬熱力處理滅活病毒方法，即通過(guò)熱量使病毒蛋白變性，破壞病毒結(jié)構(gòu)進(jìn)而滅活病毒，對(duì)脂質(zhì)膜病毒及非脂質(zhì)膜病毒均能有效去除，臨床記錄顯示巴氏消毒法是目前病毒滅活方法中最可靠的方法。但熱力也常使蛋白制品變性或生物學(xué)活性降低。如何能既保持神經(jīng)生長(zhǎng)因子活性，又能徹底地去除病3毒，這是目前尚待解決的問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問(wèn)題。本發(fā)明中的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法在傳統(tǒng)工藝中加入100KD和5KD超濾膜過(guò)濾和巴氏消毒工藝，可有效過(guò)濾大分子病毒，同時(shí)通過(guò)巴氏消毒法進(jìn)一步滅活偽狂犬病毒(PRV)、Sindbis病毒、腦心肌炎(EMC)病毒等潛在病毒，既不引入任何外來(lái)有機(jī)溶劑和去污劑等污染物，又能保持鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子注射液的高純度、高比活及高安全性。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法，將小鼠頜下腺組織勻漿，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，離心去沉淀，得勻漿上清液；勻漿上清液去除細(xì)胞碎片后上陽(yáng)離子交換層析I,收集流穿液，流穿液進(jìn)行酸化解離、離心，得酸解上清液；將酸解上清液上陽(yáng)離子交換層析II,收集目標(biāo)蛋白峰，得蛋白收集液，其特征在于將蛋白收集液進(jìn)行超濾結(jié)合巴氏消毒法去除病毒，再經(jīng)超濾濃縮，除菌過(guò)濾后制得。前述鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法中，將蛋白收集液進(jìn)行100KD超濾膜過(guò)濾后，將100KD超濾膜濾下液用注射用水或注射用生理鹽水稀釋至140pg/ml，在5565'C水浴中恒溫1~12小時(shí)，然后經(jīng)5KD超濾膜和除菌過(guò)濾制得神經(jīng)生長(zhǎng)因子原液。100KD超濾膜過(guò)濾可去除液體中的大分子病毒；在5565'C水浴中恒溫112小時(shí)，可有效滅活偽狂犬病毒(PRV)、Sindbis病毒、腦心肌炎(EMC)病毒等潛在病毒，并保持所制得的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生物學(xué)活性；5KD超濾膜過(guò)濾可在濃縮樣品的同時(shí)轉(zhuǎn)換緩沖液。前述鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法中，所述IOOKD超濾膜濾下液優(yōu)選用注射用水或注射用生理鹽水稀釋至530叫/ml，特別優(yōu)選用注射用生理鹽水稀釋至20pg/ml。前述鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法中，所述2(Hig/ml100KD超濾膜濾下液優(yōu)選在60'C土rc水浴中恒溫IO小時(shí)，從而可最大程度地保持鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子生物學(xué)活性。前述鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法中，將陽(yáng)離子交換層析II經(jīng)Tris-HCl流洗后用Tris-HCl-NaCl溶液洗脫，收集目標(biāo)蛋白峰，得蛋白收集液。前述鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法中，陽(yáng)離子交換層析I流穿液優(yōu)選用pH4.0的醋酸緩沖液進(jìn)行酸化解離io分鐘。前述鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法中，陽(yáng)離子交換層析柱I的介質(zhì)為Qt"Cellulose52或CM-S印haroseFF，陽(yáng)離子交換層析柱II的介質(zhì)為CM~Cellulose52或CM-S印haroseFF。一種注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法,在注射用生理鹽水中加入前述方法中制得的神經(jīng)生長(zhǎng)因子原液中加入賦形劑和穩(wěn)定劑，除菌過(guò)濾后分裝凍干得制品。前述注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法中，賦形劑優(yōu)選為甘露醇，穩(wěn)定劑優(yōu)選為人血白蛋白。本發(fā)明中的新型的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法在傳統(tǒng)工藝中加入100KD、5KD超濾膜過(guò)濾和巴氏消毒工藝，可有效過(guò)濾大分子病毒，同時(shí)通過(guò)巴氏消毒法進(jìn)一步滅活偽狂犬病毒(PRV)、Sindbis病毒、腦心肌炎(EMC)病毒等潛在病毒，從而在不引入任何外來(lái)有機(jī)溶劑和去污劑等污染物的基礎(chǔ)上，保持鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生物學(xué)活性，得到高純度、高比活及高安全性的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子產(chǎn)品。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。實(shí)施例l將小鼠頜下腺組織勻漿，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，離心去沉淀，得勻漿上清液；勻漿上清液去除細(xì)胞碎片后上CM"Cellulose52柱，收集流穿液，流穿液進(jìn)行透析、用pH4.0的醋酸緩沖液進(jìn)行酸化解離IO分鐘、離心，得酸解上清液；將酸解上清液上CM"Cellulose52柱，經(jīng)Tris-HCl流洗后用Tris-HC1-NaCl溶液洗脫收集目標(biāo)蛋白峰，得蛋白收集液。用IOOKD超濾膜對(duì)蛋白收集液進(jìn)行超濾，以去除大分子病毒；100KD超濾膜濾下液用注射用水稀釋至5ng/ml，在6CTC水浴中恒溫10小時(shí)，然后經(jīng)5KD超濾膜超濾及過(guò)濾除菌，即得鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子原液；鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的檢測(cè)數(shù)據(jù)如表1所示。實(shí)施例2與實(shí)施例1的不同之處在于將100KD超濾膜濾下液用注射用水稀釋至lOpg/ml,在55'C水浴中恒溫12小時(shí)，然后經(jīng)5KD超濾膜超濾及過(guò)濾除菌，即得鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子原液。鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的檢測(cè)數(shù)據(jù)如表1所示。實(shí)施例3與實(shí)施例1的不同之處在于將100KD超濾膜濾下液用注射用生理鹽水稀釋至20ng/ml，在60'C水浴中恒溫10小時(shí)，然后經(jīng)5KD超濾膜超濾及過(guò)濾除菌，即得鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子原液。鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的檢測(cè)數(shù)據(jù)如表1所示。實(shí)施例4與實(shí)施例1的不同之處在于將100KD超濾膜濾下液用注射用生理鹽水稀釋至30嗎/ml，在65'C水浴中恒溫1小時(shí)，然后經(jīng)5KD超濾膜超濾及除菌過(guò)濾，即得鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子原液。鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的檢測(cè)數(shù)據(jù)如表1所示。實(shí)施例5用注射用水配制生理鹽水，加入鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子原液至終濃度為18lig/ml或30ug/ml，并加入檢定合格的人血白蛋白使其終含量為1%，甘露醇終濃度為5%，經(jīng)混勻、除菌過(guò)濾后，分裝、凍干，得注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子凍干制品。本申請(qǐng)人對(duì)實(shí)施例14中制得的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子(中間品)巴氏消毒法滅活病毒前后的質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定對(duì)比，結(jié)果表明在5~30pg/ml濃度下，鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子經(jīng)55'C65'C處理112小時(shí)后，其pH值、蛋白含量、比活性和紫外掃描光譜均維持穩(wěn)定。而當(dāng)濃度大于40叫/ml的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子經(jīng)過(guò)55'C65'C處理10小時(shí)后，其蛋白含量、比活性、紫外掃描光譜均發(fā)生較大變化或偏離。表l鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子(中間品)巴氏消毒法滅活病毒后主要參數(shù)測(cè)定結(jié)果檢定項(xiàng)目檢定結(jié)果原數(shù)值實(shí)施例l實(shí)施例2實(shí)施例3實(shí)施例4pH值7.17,07.07.07.0±0.2蛋白含量(mg/ral)0.0050.0100.0200,030/比活性(AU/mg)1.0*1061.0*1061.0*1061.0*1061.0*106紫外掃描光譜(nm)280279280280280±3中國(guó)藥品生物制品檢定所在實(shí)施例3巴氏消毒法滅活病毒前加入指示病毒偽狂犬病毒(PRV)，對(duì)病毒滅活效果做了驗(yàn)證，病毒滴定方法采用96孔細(xì)胞病變法，計(jì)算按Karber法，驗(yàn)證結(jié)果如表2所示表2巴氏法滅活鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子中PRV指示病毒的效果處理時(shí)間殘余偽狂犬病毒PRV滴度(LgTCIDM/0.lml)(小時(shí))S20040201S20040202S2004020306.506.626.880.25《-O.50《-O.50《-0.500.5《-0.50《-0.50《-0.501《-O.50《-0.50《-0.502《-0.50《-0.50《-0.506<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注本試驗(yàn)樣本中病毒最低檢測(cè)限為-0.50LgTCIDso/O.lml。驗(yàn)證結(jié)果三批鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子采用實(shí)施例3中的生產(chǎn)工藝，在5961'C進(jìn)行10小時(shí)加熱處理后，可滅活所加入指示病毒PRV分別為S20040201批》6.50LgTCID5。/0.lml,S20040202批>6.62LgTCIDw/0.lml，S20040203批>6.88LgTCID5。/0.lml。中國(guó)藥品生物制品檢定所在實(shí)施例3巴氏消毒法滅活病毒前加入指示病毒Sindbis病毒，對(duì)病毒滅活效果做了驗(yàn)證，病毒滴定用BHK-21細(xì)胞，方法采用6孔盤蝕斑法。驗(yàn)證結(jié)果如表3所示表3巴氏法滅活鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子中Sindbis指示病毒的效果處理時(shí)間殘余Sindbis病毒滴度(LgTCID5。/0.lml)(小時(shí))S20040201S20040202S20040203<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>驗(yàn)證結(jié)果三批鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子采用實(shí)施例3中的生產(chǎn)工藝，在5961'C進(jìn)行10小時(shí)加熱處理后，可滅活所加入指示病毒Sindbis分別為S20040201批>6.49LgPFU/ml，S20040202批》6.45LgPFU/ml,S20040203批》6.60LgPFU/ml。中國(guó)藥品生物制品檢定所在實(shí)施例3巴氏消毒法滅活病毒前加入指示病毒腦心肌炎(EMC)病毒，對(duì)病毒滅活效果做了驗(yàn)證，病毒滴定用VERO細(xì)胞，96孔微量病變法。驗(yàn)證結(jié)果如表4所示表4巴氏法滅活鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子中EMC指示病毒的效果處理時(shí)間殘余腦心肌炎(EMC)病毒滴度(LgTCIDs。/0.lml)(小時(shí))S20040201S20040202S2004020304.755.505.600.5《0.50《0.50《0.50<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>驗(yàn)證結(jié)果三批鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子采用實(shí)施例3中的生產(chǎn)工藝，在596rC進(jìn)行10小時(shí)加熱處理后，可滅活所加入指示病毒EMC分別為S20040201批>4.25LgTCID5。/0.lml，S20040202批>5.00LgTCID5。/0.lml,S20040203批》5.13LgTCID5。/0.lral。病毒滅活驗(yàn)證結(jié)論根據(jù)中國(guó)藥品生物制品檢定所檢定的結(jié)果，可以認(rèn)為本方法是有效的鼠源病毒去除方法。為有效保證注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的質(zhì)量及其安全性，按本發(fā)明實(shí)施例3工藝連續(xù)生產(chǎn)的三批鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子原液，S04、S05、S06，檢測(cè)結(jié)果見表5;按本發(fā)明實(shí)施例5工藝連續(xù)生產(chǎn)三批注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子產(chǎn)品，批號(hào)20040504、20040505、20040506,委托中國(guó)藥品生物制品檢定所進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表6:表5三批鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子原液檢測(cè)結(jié)果匯總表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表6三批注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子成品檢測(cè)結(jié)果匯總表檢測(cè)項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)批次200405042004050520040506外觀白色疏松體，加水溶解，無(wú)異物符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定PH值6.5—7.56.76.86.8水份《3.0%0.78%0.83%0.81%生物活性CAU/支)》9000180001800018000蛋白含量《18ug±20%-7.06%-2.67%-10.5%無(wú)菌試驗(yàn)無(wú)菌生長(zhǎng)符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定熱原試驗(yàn)符合藥典規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定異常毒性符合藥典規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定注射劑檢査可見異物符合藥典規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定裝量差異符合藥典規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定結(jié)果表明鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子原液和鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子凍干制品全部質(zhì)量指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。上述三批注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子成品經(jīng)穩(wěn)定性考察,結(jié)果顯示用本方法制備的注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子在28'C條件下保存42個(gè)月質(zhì)量穩(wěn)定。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化,均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1、一種鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法，將小鼠頜下腺組織勻漿，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，離心去沉淀，得勻漿上清液；勻漿上清液去除細(xì)胞碎片后上陽(yáng)離子交換層析I，收集流穿液，流穿液進(jìn)行酸化解離、離心，得酸解上清液；將酸解上清液上陽(yáng)離子交換層析II，收集目標(biāo)蛋白峰，得蛋白收集液，其特征在于將蛋白收集液進(jìn)行超濾結(jié)合巴氏消毒法去除病毒，再經(jīng)超濾濃縮，除菌過(guò)濾后制得。2、根據(jù)權(quán)利要求l中所述的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法，其特征在于將蛋白收集液進(jìn)行100KD超濾膜過(guò)濾后，將100KD超濾膜濾下液用注射用水或注射用生理鹽水稀釋至l~40ng/ml,在5565'C水浴中恒溫112小時(shí)，然后經(jīng)5KD超濾膜和除菌過(guò)濾制得神經(jīng)生長(zhǎng)因子原液。3、根據(jù)權(quán)利要求2中所述的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法，其特征在于100KD超濾膜濾下液用注射用水或注射用生理鹽水稀釋至530pg/ml。4、根據(jù)權(quán)利要求2中所述的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法，其特征在于IOOKD超濾膜濾下液優(yōu)選用注射用生理鹽水稀釋至20ng/ml。5、根據(jù)權(quán)利要求4中所述的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法，其特征在于所述20pg/raliookd超濾膜濾下液優(yōu)選在60'c±ix:水浴中恒溫10小時(shí)。6、根據(jù)權(quán)利要求3中所述的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法，其特征在于將陽(yáng)離子交換層析II經(jīng)Tris-HCl流洗后用Tris-HCl-NaCl溶液洗脫，收集目標(biāo)蛋白峰，得蛋白收集液。7、根據(jù)權(quán)利要求3中所述的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法，其特征在于陽(yáng)離子交換層析I流穿液優(yōu)選用PH4.0的醋酸緩沖液進(jìn)行酸化解離10分鐘。8、根據(jù)權(quán)利要求3中所述的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法，其特征在于陽(yáng)離子交換層析柱I的介質(zhì)為CM-Cellulose52或CM-S印haroseFF，陽(yáng)離子交換層析柱II的介質(zhì)為CM-Cellulose52或CM-S印haroseFF。9、一種注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法，在注射用生理鹽水中加入權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)制得的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子原液中加入賦形劑和穩(wěn)定劑，除菌過(guò)濾后分裝、凍干得制品。10、根據(jù)權(quán)利要求9中所述的注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法，其特征在于賦形劑優(yōu)選為甘露醇，穩(wěn)定劑優(yōu)選為人血白蛋白。全文摘要本發(fā)明公開了一種鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的制備方法和注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法。本發(fā)明中的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法在傳統(tǒng)工藝中加入100KD和5KD超濾膜過(guò)濾和巴氏消毒工藝，可有效過(guò)濾大分子病毒，同時(shí)通過(guò)巴氏消毒法進(jìn)一步滅活偽狂犬病毒(PRV)、Sindbis病毒、腦心肌炎(EMC)病毒等潛在病毒，既不引入任何外來(lái)有機(jī)溶劑和去污劑等污染物，又能保持鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的高純度、高比活及高安全性。文檔編號(hào)C07K1/34GK101613394SQ20081007131公開日2009年12月30日申請(qǐng)日期2008年6月27日優(yōu)先權(quán)日2008年6月27日發(fā)明者任宏偉,朗孫,楊佑瑤,熊玲媛,陳遠(yuǎn)志,馬凌燕申請(qǐng)人:熊玲媛;任宏偉;廈門北大之路生物工程有限公司