專利名稱：人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體rd9及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種抗狂犬病毒的抗體及其制備與應(yīng)用，
尤其是一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9及其制備與應(yīng)用。
(二)
背景技術(shù)：
狂犬病是死亡率最高的傳染病，病死率為100%?？袢≡谑澜绶秶鷥?nèi)廣 泛分布，全世界每年有6萬多人死于狂犬病。我國也屬于狂犬病高發(fā)國家。 目前，又一次狂犬病流行高峰正在我國形成!狂犬病的防治已成為我國最重要 的公共衛(wèi)生問題之一。人類要從地球上消滅狂犬病幾乎是不可能的，因為狂 犬病是人畜共生的疾病，而人類至今還不能控制動物狂犬病的發(fā)生。因此，
狂犬病暴露后的預(yù)防是狂犬病防治的主要措施。對于嚴(yán)重暴露者(n型m型 感染)，世界衛(wèi)生組織建議同時應(yīng)用疫苗和抗狂犬病抗體進(jìn)行主動和被動聯(lián)
合治療。人感染狂犬病毒的潛伏期一般為l至3個月，但也可短至一周就發(fā)
病。因此，對于免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟的兒童，及免疫力低下不能及時產(chǎn)生抗 體的人群，暴露后必須使用抗體進(jìn)行防治。
人源單抗是臨床用藥的首選，但我國人源抗體的研制尚處于起步階段， 主要由于各種抗體技術(shù)平臺有待于構(gòu)建，另外，真核系統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的局限亦 是抗體帶j備的主要瓶頸之一。
人源克隆展示技術(shù)(cloning display)的出現(xiàn)是人源抗體制備史上的里程 碑，是一種篩選蛋白質(zhì)的強(qiáng)有力工具，該技術(shù)將基因型和蛋白表型聯(lián)系在一起， 利甩目標(biāo)蛋白的特異性配基可從蛋白質(zhì)展示文庫中篩選出目標(biāo)蛋白并找到相 應(yīng)的基因序列。過去，應(yīng)用較多的展示技術(shù)有噬菌體展示(phage display)、 細(xì)菌表面展示(bacterial surface display)、酵母展示(yeast display)等。 但這些技術(shù)必須依賴細(xì)胞，由于受細(xì)菌轉(zhuǎn)化效率、噬菌體包裝、跨膜分泌和蛋 白酶降解等限制因素的影響,庫容量及其分子多樣性都受到限制。為克服以上 缺點，20世紀(jì)90年代中期另一種新的體外展示技術(shù)一核糖體展示技術(shù) (ribosome display)應(yīng)用而生，由于該技術(shù)完全在體外進(jìn)行，彌補(bǔ)了細(xì)胞內(nèi) 展示的不足，能顯著增加庫容量及分子多樣性，庫容量可高達(dá)IO13 1015， 比噬菌體展示文庫(約109)提高了 104 106倍。此外，核糖體展示技術(shù)建 庫簡便、易于篩選，為特異性人源抗體的制備注入了新的活力，顯示出了誘 人的發(fā)展前景。
'目前最多報道的基因工程抗體是scFv， scFv-Fc和Fab等，scFv在多種 疾病的診斷中作出了很大貢獻(xiàn)，但是由于其空間結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性極大的限制 了其在臨床治療中的應(yīng)用。scFv-Fc和Fab由于分子較大，含有多個糖基化位 點，原核系統(tǒng)中難以完成抗體的成熟，常常要求在真核系統(tǒng)中表達(dá)制備，但 由于目前在真核細(xì)胞中發(fā)酵技術(shù)的局限使之難以形成規(guī)?；a(chǎn)。
三結(jié)構(gòu)域抗體可以明顯改進(jìn)scFv的穩(wěn)定性，其改構(gòu)策略是應(yīng)用人 IGg(CHl)5，端12個氨基酸(AKTTAPSVYPLA)代替scFv的Linker (Gly4Ser) 3，改構(gòu)以后的抗體穩(wěn)定性有明顯改進(jìn)，分析原因可能由于CH1可以提供并維
持抗體分子的有效空間構(gòu)象。而且，三結(jié)構(gòu)域抗體具有以下特點結(jié)構(gòu)簡單，
易于構(gòu)建；從血管進(jìn)入其他組織的能力，包括通過血腦屏障的能力均強(qiáng)于全 分子抗體，使進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的狂犬病毒的清除成為可能；而且，易于 在原核系統(tǒng)中制備可溶性有活性的抗體。因此，三結(jié)構(gòu)域抗體是一種很有前 景的預(yù)防和治療狂犬病的臨床用小分子抗體。
在各種情況下，開發(fā)和研制一種新抗狂犬病毒的抗體，使其可以用作有-效預(yù)防和治療狂犬病的藥物則成為現(xiàn)階段生物技術(shù)工作者亟待解決的重要課 題。

發(fā)明內(nèi)容
本^:明的目的在于提供一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體
RD9及其制備與應(yīng)用，所述抗體是利用分子生物學(xué)技術(shù)一一核糖體展示技術(shù)篩 選到了一株針對狂犬病毒糖蛋白(Gp)的人源抗體基因RD9，并實現(xiàn)了此株抗 體在原核系統(tǒng)的高效表達(dá)，其生物學(xué)特性研究表明RD9是一株高親和力，穩(wěn) 定性較好，結(jié)構(gòu)簡單，易于構(gòu)建的可以特異中和狂犬病毒的人源基因工程抗 體，其基因和其基因產(chǎn)物可用于制備預(yù)防和治療狂犬病的臨床用藥；所述抗 體的制備方法易于規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。
本發(fā)明的另一目的在于所述抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因及其編碼的多 肽在預(yù)防和治療狂犬病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案
一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9，其特征在于為人 源抗體，是由重鏈可變區(qū)VH、輕鏈可變區(qū)VL和以重鏈恒定區(qū)1(CH1)5'端12 個氨基酸的序列作為連接肽AKTTAPSVYPLA構(gòu)成的三結(jié)構(gòu)域單鏈抗體VH-連接 肽-VK，簡稱VH/K。
'上述一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9，其特征在于 所述抗體基因的重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因來源于對人源抗狂犬病毒 核糖體抗體庫的富集篩選，其重鏈可變區(qū)基因、輕鏈可變區(qū)基因具有如序列 表<400>1和〈400>3所示的序列。上述一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9，其特征在于 所述抗'體基因編碼的多肽序列如序列表<400> 2和<400〉 4所示的序列。
上述一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9，其特征在于 對所述的氨基酸序列進(jìn)行改變、缺失或添加一個或幾個氨基酸，而仍保留中 和狂犬病毒的能力。
上述一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9的制備方法，
其特征在于該方法利用基因重組技術(shù)的方法來制備，具體步驟包括
(1) 核糖體展示單鏈抗體基因庫(VH/k)的fe建
1-1)細(xì)胞總RNA的提取和cDNA的合成； 1-2)人源抗體VH和VL基因的PCR擴(kuò)增； 1-3) PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析； 'l-4)抗體重、輕鏈DNA的拼接；
(2) 核糖體展示單鏈抗體基因庫的構(gòu)建；
(3) 體外轉(zhuǎn)錄和翻譯； .(4)核糖體復(fù)合物的親和篩選；
(5) VH/k抗體基因的克隆表達(dá)；
(6) ELISA鑒定陽性克隆并進(jìn)行序列分析；
(7) 人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9的高效表達(dá)和純化；
(8) 人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9的特異性抗原結(jié)合活 性檢測；
(9) 人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9的相對親和力測定； (l.O)人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9的相對穩(wěn)定性研究; (11)人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9中和活性的研究。 上述所述步驟(7)人源抗狂犬她毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9的高效
表達(dá)和純化的具體步驟包括
'(l)抗體基因表達(dá)載體的構(gòu)建；
(2) 在一個合適的系統(tǒng)或宿主中將抗體基因表達(dá)；
(3) 大量培養(yǎng)和擴(kuò)增抗體表達(dá)宿主；
(4) 對表達(dá)的抗體分離純化。
上述所述抗體基因表達(dá)載體可以是質(zhì)粒載體或病毒載體、動物轉(zhuǎn)基因的 載體或者通用載體；所述抗體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入一個合適的系統(tǒng)或宿主中 加以表達(dá)，其中適合的系統(tǒng)或宿主包括動物或植物的細(xì)胞，細(xì)胞株、細(xì)菌或 酵母；該動物是轉(zhuǎn)基因動物。
上述一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9的制備方法， 還可以利用化學(xué)合成技術(shù)來制備和生產(chǎn)。上述一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9的應(yīng)用，其特
征在于所述抗體在制備用于診斷或治療狂犬病藥物中的應(yīng)用，包括抗體基
因和抗體基因編碼的多肽。
上述所述抗體基因在制備用于診斷或治療狂犬病藥物中的應(yīng)用。 上述所述抗體基因編碼的多肽在制備用于診斷或治療狂犬病藥物中的應(yīng)用。.
本發(fā)明的有益效果分析
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性
基因工程抗體RD9，簡稱VH/K， VH/K新型基因工程抗體發(fā)揮了小分子工程抗 體可進(jìn)入血腦屏障的優(yōu)勢，使進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的狂犬病毒的清除成為可 能，同時，其特有的穩(wěn)定性克服了最常見的小分子單鏈抗體(single chain variable region fragments scFv)不穩(wěn)定的弊端，為其成為臨床抗狂犬病 毒預(yù)防和治療的特異性抗體藥物奠定了分子基礎(chǔ)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明涉及一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和 性基因工程抗體RD9基因及其編碼的多肽在制備用于診斷或治療狂犬病藥物 中的應(yīng)用，本發(fā)明所述的抗狂犬病毒抗體的重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基 因是^;用三名經(jīng)狂犬病毒疫苗免疫者外周血中淋巴細(xì)胞所構(gòu)建的抗體庫中， 用表達(dá)純化的狂犬病毒糖蛋白篩選獲得的VH/K，經(jīng)過序列測定和在NCBI中 BLAST比較分析后，確認(rèn)所述的VH和VL基因及其編碼的氨基酸序列如附圖3 所示。將此VH和VL基因，分別應(yīng)用因特網(wǎng)上專業(yè)的已知抗體基因序列數(shù)據(jù) 庫IMGT和NCBI對所得序列進(jìn)行同源性比較和其胚系基因來源分析表明，所 獲得的基因序列的確來自人胚系基因，和現(xiàn)有報道的各種抗體基因序列均不 完全一致。所得到的VH和VL基因可編碼正確的人抗體可變區(qū)。
本發(fā)明克服以往克隆展示技術(shù)的不足，首次應(yīng)用核糖體展示技術(shù)，用三 名經(jīng)狂犬病毒疫苗免疫者外周血中分離淋巴細(xì)胞，構(gòu)建人源抗體庫中，庫容 量達(dá)6.7X1012。用表達(dá)純化的狂犬病毒糖蛋白作為篩選抗原篩選，碎功地獲 得l株高親和力、穩(wěn)定性較好的可以特異中和狂犬病毒的人源新型基因工程 抗體。VH/K新型基因工程抗體發(fā)揮了小分子工程抗體可進(jìn)入血腦屏障的優(yōu) 勢，使進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的狂犬病毒的清除成為可能，同時，其特有的穩(wěn) 定性克服了最常見的小分子單鏈抗體不穩(wěn)定的弊端，為其成為臨床抗狂犬病 毒預(yù)防和治療的特異性抗體藥物奠定了分子基礎(chǔ)。同時實現(xiàn)了其在原核系統(tǒng) 中的高效表達(dá)，克服了大多數(shù)人源基因工程抗體難以在真核表達(dá)系統(tǒng)中大規(guī) 模發(fā)酵的技術(shù)瓶頸?；谏鲜龅目贵w重鏈、輕鏈可變區(qū)基因，可以采用基因 工程方法，構(gòu)建和表達(dá)成多種形式的小分子基因工程抗體，如Fab、 F(ab)2, 抗體融合蛋白等，或體外人工合成與此抗體相同的輕、重鏈6個CDR區(qū)的核苷酸序列或編碼相同氨基酸的核苷酸序列，或克隆如其它表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行制備， 從而獲得抗狂犬病毒糖蛋白的中和抗體或相關(guān)蛋白或多肽產(chǎn)物，以制備用于 臨床上預(yù)防和治療狂犬病的藥物，人源抗狂犬病毒糖蛋白基因工程抗體的獲 得，將^t我國狂犬病的預(yù)防，診斷和治療提供新的途徑。
(四)


圖1為抗體基因庫的PCR擴(kuò)增。
周2為核糖體展示VH/K抗體基因庫的構(gòu)建。
圖3為人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9的高效表達(dá)和純化。
圖4為人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9的抗原特異性結(jié) 合活性。
圖5為人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9的相對親和力檢測。
圖.6為人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9的穩(wěn)定性檢測。 圖7為人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9的中和活性檢測。
(五)
具體實施例方式
實施例l:核糖體展示單鏈抗體基因庫(VH/k)的構(gòu)建 抗體基因庫的構(gòu)建主要分四大步驟
1-1)細(xì)胞總RNA的提取和cDNA的合成
細(xì)胞總RNA的提取用狂犬病毒Vero疫苗.(法國 里昂巴斯德梅里厄血清 疫苗公司)對三名志愿者進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，2周后，再加強(qiáng)免疫一次。抽取經(jīng)免 疫的三名志愿者外周血40ml,每毫升血加入5U肝素。用等量PBS稀釋外周血， 從管壁輕輕加入己盛有淋巴細(xì)胞分離液(中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)血液研究所)的離 心管中，置低速臺式離心機(jī)，2500r/iiiin，離心20min。用毛細(xì)吸管輕輕吸取 淋巴細(xì)'胞層，置于另一15ml離心管中。用生理鹽水作等量稀釋，1000r/min， 離心10min，小心去上清，如此重復(fù)洗兩遍。按每10ml血加lml生理鹽水的 比例重懸沉淀，分裝于EP管中。然后用總RNA分離試劑盒(Promega公司) 提取細(xì)胞總RNA。
cDNA的合成(RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司)以細(xì)胞總RNA為模 板，HuIgGFor、 HuIgMFor和HuCLFor為引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，RT-PCR 的反應(yīng)條4牛為30°C 10min，42。C 30 min， 99'C 5 min， 5°C 5 min。戶7f有的 cDNA將用于制備構(gòu)成VH/K基因庫的不同家族VH和VL基因。 合成cDNA的引物序列如下
HuIgGFor: 5' ~GTC CAC CTT GGT GTT GCT GGG CTT--3' 'HuIgMFor: 5， 一TGG MG AGG CAC GTT CTT TTC TTT--3'HuCLFor: 5' —AGA CTC TCC CCT GTT GAA GCA CTT—3， l-2)人源抗體VH和VL基因的PCR擴(kuò)增
VH和VL基因的PCR擴(kuò)增取上述合成的cDNA 4 u 1為模板，擴(kuò)增人抗 體VH和VL基因的上、下游引物各lumol，dNTP200 ix mol/L， lOXTaq buffer 5pL， ，TaqDNA酶5U，總體積50ul 。 PCR的反應(yīng)條件為94。C變性50 sec， 57。C復(fù)性50 sec， 72。C延伸50 sec，經(jīng)過30個循環(huán)后，72。C延伸10 min。 擴(kuò)增結(jié)果見圖l。
擴(kuò)增人重鏈可變區(qū)基因引物序列如下 . VHup: 5， ga gat ata tcc atg (c/g)ag gt(g/c) ca(g/c) etc gag (c/g)ag tct gg 3'
VHdown: 5， gga gac tg(c/g) gtc atc (a/g) c (c/a) at(t/g) tcg gag acg agg ggg aaa ag 3，
擴(kuò)增的VH 3，端帶有重鏈恒定區(qū)1(CH1)5'端編碼AKTTAPSVYPLA 12個氨基 酸的基因序列。
擴(kuò)增人重鏈可變區(qū)基因VH的3'端引物(簡并)序列如下 VL叩5， ga(c/a) at(t/g) g(t/c)g atg ac(c/g) cag tct cc3， VLdown 5， get cta gaa cac tct ccc ctg ttg aag ct 3 1-3)PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析
將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Promega公司柱式回收試劑盒快速回收純化，'然后將 不同家族VH、 VL基因分別克隆入PMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5ci，通過a-互補(bǔ)的藍(lán)白篩選隨機(jī)挑選重組子。重組質(zhì)粒送博亞公司測序， 將其與已知基因序列比較，并用相關(guān)軟件分析。
l-4)抗體重、輕鏈DNA的拼接
將序列分析正確的不同家族的VH和VL基因兩兩組裝，分子形式為 VH-linker-VL， Linker為1. 2所制備的VH基因末端所帶的(CHI) 5，端12個 氨基酸(AKTTAPSVYPLA)的序列。將純化的重、輕鏈產(chǎn)物定量確定等摩爾比例， VH DNA 6 ii L， VL DNA 6 u L， TaqDNA多聚酶5U，總體積100 u 1， 94°C60 s ， 50°C80 s ， 72°C120 s ，擴(kuò)增7個循環(huán)后，加入引物VHup和VLdown，外加1U DNA聚合酶，94°C90s， 58°C80 s ， 72。C140s，再進(jìn)行30個循環(huán)。由此成功 構(gòu)建了 VH/K抗體基因庫。
實施例2:核糖體展示單鏈抗體基因庫的構(gòu)建
用于核糖體展示的單鏈抗體基因的構(gòu)建由組裝PCR完成，以純化的VH/K 抗體基因為模板，分別以RDTb/ Ck/for和RDT7/Ck/for為引物進(jìn)行兩步PCR， 第一步在N端加上原核核糖體結(jié)合位點(SD序列)。第二步在基因兩端分別構(gòu) 建T7啟動子、5'-莖環(huán)結(jié)構(gòu)和3'-莖環(huán)結(jié)構(gòu)。TaqDNA多聚酶5U，總體積50ix 1，94'C60s ，5(TC80s ，72'C120s ，擴(kuò)增30循環(huán)后，構(gòu)建的基因片段約為1000bp, 見圖2，所構(gòu)建的核糖體展示抗體基因庫庫容量達(dá)6. 7X 1012。
所需引物序列如下 Ck/for 5， ccg cac acc agt aag gtg tgc ggt get cta gaa cac tct cc 3， RDTb 5， aga cca caa egg ttt ccc tct aga aat aat ttt gtt taa ctt taa gaa g.ga gat ata tec 3，
RDT7 5, ata cga aat taa tac gac tea eta tag gga gac cac aac gg3， 實施例3:體外轉(zhuǎn)錄和翻譯 '
體外轉(zhuǎn)錄和翻譯采用invitrogen公司的expresswayTM Plus Expression System,按操作手冊進(jìn)行。終止反應(yīng)后，在上清液中加入預(yù)冷的1/5體積的 含有10 y。(w/v)BSA的WBT。反應(yīng)混合物在4-C， 1400g離心5min后，將上清 液轉(zhuǎn)移到一個新的冰預(yù)冷的EP管中。
實施例4:核糖體復(fù)合物的親和篩選 '
用重組Gp蛋白(本室制備)包被96孔板，用BSA-S. cerevisiae RNA-PBS 封閉。將翻譯混合物轉(zhuǎn)至包被的孔中，微孔板在冷室中輕搖lh,傾掉翻譯反 應(yīng)液，微孔板用WBT洗5次。隨后在孔中加入預(yù)冷的洗脫緩沖液，冰上輕搖 5min以洗脫mRNA。洗脫下來的mRNA用RNeasy kit進(jìn)行純化。純化后mRNA 、溶于RNase-free 7乂中，用RNase-free DNase進(jìn)行處理，去掉反應(yīng)液中的DNA 分子。純化的mRNA作為模板，進(jìn)行RT-PCR， PCR產(chǎn)物用作下一輪循環(huán)，艮卩 轉(zhuǎn)錄—翻譯—篩選。 '
實施例5: VH/k抗體基因的克隆表達(dá)
將最后一輪篩選獲得的mRNA的RT-PCR基因產(chǎn)物兩端插入Nco I和Not I 位點，雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)載體pET22b(+)用T4連接酶連接，然 后轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)。接種200個陽性重組子單菌落于10ml含lOOrag /L Amp的LB培養(yǎng)基中，37"C振蕩培養(yǎng)過夜。按1:50將過夜培養(yǎng)物接種于新鮮 2XYT-A(含100mg /L Amp)培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)至0D6。。=0. 8，加IPTG誘導(dǎo) 1 mmol./L， 37。C振蕩培養(yǎng)3. 5h。 8000 rpm離心10 min收集菌體。懸于裂解 緩沖液，超聲破碎，離心收集上清，產(chǎn)物用于ELISA。
實施例6: ELISA鑒定陽性克隆并進(jìn)行序列分析
用Gp重組蛋白包被96孔板，濕盒中4。C過夜。3%BSA-PBS (pH'7.0)進(jìn) 行封閉，37°C lh。加入上述制備抗體，每孔70ul， 37°C lh。加入HRP標(biāo)記 的抗人IgG k鏈抗體，每孔50wl , 37°Clh; A、 B液顯色，用2\1仏504終止 反應(yīng)后，在450nm波長下測定0D值，鑒定陽性克??；選擇10個陽性克隆， 提取質(zhì)粒，送公司測序，將其與己知基因序列比較，并用相關(guān)軟件分析，其 中證實一株特異性較好的全新人源抗狂犬病毒VH/k抗體，命名為RD9，其重鏈可變區(qū)基因、輕鏈可變區(qū)基因具有序列表〈400〉1和〈400〉3所示的序列，其 重鏈可變區(qū)基因、輕鏈可變區(qū)基因編碼的多肽序列具有序列表〈400〉2和 〈400〉4所示的序列。
實施例7:人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9的高效表達(dá)和
純化
7-l)抗體基因表達(dá)載體的構(gòu)建(實施例5):將RD9抗體基因克隆入表達(dá) 載體pET22b(+)，并成功轉(zhuǎn)化入宿主菌E.coli BL21 (DE3)中;
7-'2)在一個合適的系統(tǒng)或宿主中將抗體基因表達(dá)挑取構(gòu)建好的陽性RD9 單菌落于10ml含100mg /L Amp的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)過夜；
7-3)大量培養(yǎng)和擴(kuò)增抗體表達(dá)宿主按1:50將過夜培養(yǎng)物接種于新鮮 2XYT-A(含100mg /L Amp)培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)至0D6。。=0. 8，加IPTG誘導(dǎo) 至終濃度為l咖ol /L， 3(TC振蕩培養(yǎng)5h， 8000 rpm離心10 min收集菌體， 懸于裂解緩沖液，超聲破碎，離心收集上清；
7-4)對表達(dá)的抗體分離純化將7-3中所收集的上清用Ni—NTA柱進(jìn)行 純化，將5ml HiTrap Chelating HP(5ml)預(yù)裝柱與AKTA FPLC蛋白純化儀連 接，用緩沖液A沖洗柱子至基線穩(wěn)定時，慢速上樣。然后再用緩沖液A沖洗 柱子，至基線和上樣前一致，然后用緩沖液B(O. 1M磷酸二氫鈉、0.01M Tris-HCI, pH8.0)和緩沖液C (0. 1M磷酸二氫鈉、0.01M Tris-HCI、 250畫1 imidazole, pH8.0)進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫峰的流出液，取少量與等體積的 2XSDS樣品緩沖液混合，煮沸5min后離心，取上清進(jìn)行15% SDS-PAGE電泳 分析，結(jié)果表明，實現(xiàn)了人源RD9VH/K抗體在原核細(xì)胞中的高效表達(dá)，表達(dá) 量達(dá)'菌體總蛋白的25%以上，制備了可溶性的純化抗體，見圖3。
實施例8:人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9的特異性抗原 結(jié)合活性檢測將Gp重組蛋白和狂犬病毒Vero疫苗用包被液稀釋成不同濃 度，96孔板上每孔加60n 1 ，重復(fù)3個孔，用TNFa作為陰性對照，PBS作空 白對照，濕盒中4'C過夜。3% BSA-PBS (pH 7.0)進(jìn)行封閉，37°C lh。加入 用PBS稀釋的純化抗體，每孔70ul， 37°C lh;加入HRP標(biāo)記的抗人IgG k 鏈抗體(sigma公司)，每孔50ii1 ， 37。Clh; A、 B液顯色，用仏504終止反 應(yīng)后，在450nm波長下測定0D值，見圖4。結(jié)果表明，人源VH/k抗體可以特 異的與Gp和狂犬病毒結(jié)合，而不能與TNFa結(jié)合，表明此株抗體是特異針對 狂犬病毒糖蛋白的人源基因工程抗體，即其抗體基因、抗體基因編碼的多肽 亦特異針對狂犬病毒糖蛋白。
實施例9:人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9的相對親和 力測定
釆用硫氰酸鹽洗脫法對RD9的相對親和力進(jìn)行檢測。Gp包被96孔板，用BSA-PBS封閉，加入上述純化人源化抗體RD9，用含不同濃度NH4SCN的PBS溶 液孵育，洗板。服P標(biāo)記的抗His-Tag抗體作為二抗。以O(shè)D柳下降50%時相 應(yīng)的NH4SCN的濃度作為相對親和力指數(shù)，見圖5，結(jié)果表明RD9VH/K的親和 力較好，其相對親和力指數(shù)為1. 4mol/L。
實施例10:人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9的相對穩(wěn)定 性研究
穩(wěn)定性是影響抗體功能的最重要的生物學(xué)特性之一。用人血清、PBS與純 化抗體在37'C共同孵育，Gp重組蛋白包板，ELISA法檢測抗體的相對穩(wěn)定性， 見圖6。
結(jié)果顯示，RD9在PBS中37。C 2.5h后活性稍有降低，以后一直較穩(wěn)定， 到第6d時仍然具有活性，而scFv —般在PBS中37°C lh后其活性就急劇降 低，2h后已基本沒有了活性。在血清中，RD9的活性在第8d還可檢卿到，而 scFv'fe血清中約2h時其活性就會急速降低。
實施例11:人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9中和活性的
研究
將制備的抗體片段用MEM培養(yǎng)基調(diào)整為400y g/ml，并用MEM培養(yǎng)基作梯 度稀釋。取一定量各稀釋度的抗體加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，再加入等量中和 用病毒懸液，要求每孔的狂犬病毒蝕斑數(shù)為10 60個，用抗狂犬病毒鼠McAb 抗體作陽性對照，anti-TNFa scFv作陰性對照。每稀釋度接種4孔，放置37°C 水浴lh ;再將準(zhǔn)備好的Vero細(xì)胞懸液接種于上述24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔 接種lml;置于5%0)2 34"C溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng)8天后，去培養(yǎng)液后用含0. 1%結(jié) 晶紫的10%甲醛蒸餾水染色5 min，流水沖后于低倍光學(xué)顯微鏡下計數(shù)空斑， 見風(fēng)7。
結(jié)果表明人源抗體RD9和抗狂犬病毒鼠McAb抗體一樣可以完全抑制形成 蝕斑的活病毒顆粒，且抑制程度與抗體片段的濃度成正比。而anti-TNFascFv 對狂犬病毒蝕斑形成無抑制作用。這說明所制備的抗Gp人源抗體RD9能特異 中和狂犬病毒，阻止狂犬病毒對Vero細(xì)胞的吸附，抑制了狂犬病毒對靶細(xì)胞 的感染，證明人源RD9抗體是一株特異性較好，高親和力的中和抗體。人源 抗狂犬病毒糖蛋白基因工程抗體RD9的獲得，將對我國狂犬病的預(yù)防，診斷 和治療提供新的途徑。
(六)序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所
<120>人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9及其制備與應(yīng)用 <130>
<150〉 CN200710057213.6
<151> 2007-04-26
〈160> 4
〈170> Patentln version 3. 3
〈210> 1 '
〈211> 378
〈212> DNA
<213> 人(human)
<220>
〈221〉 V—region <222> (1)..(378)
<223>人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程杭體RD9重鏈可變區(qū)基因的核苷酸序 列
<400> 1 gaggtgcagctcgaggagtctgggggaggcgtggtccagc ctgggaggtccctgagactc60
tcctgtgca'gcctctggattcaccttcaatagttatgctg tccactgggtccgccaggct120
ccaggcaaggggctggagtgggtggcagttgtctcaaatg atggagatgacaaatactac180
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ctgcaaatgaacagcctgagagctgaggacacggctgtgt attactgtgcg卿ggtttc300
tatggUcggggagtcttctcgcggcctctgatgcttttg atatctggggccaagggaca360
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<210〉 2
<211〉 126
<212> PRT
<213〉 人(human)<220>
<221〉 V—region <222> (1)..(126)
〈223〉人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9重鏈可變區(qū)蛋白質(zhì)的氨基酸 序列
〈400〉 2
Glu Val Gin Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Val 1.5 10
Val Gin Pro Gly Arg 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25
30
Ala Val His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40
45
Ala Val Val Ser Asn Asp Gly Asp Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55
60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr.
65 70 75
80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90
95
Ala Arg Gly Phe Tyr Gly Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Ser Asp Ala
100 105
110
Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser
115 120
125
〈210〉 3
<211〉 324
<212〉 DNA
<213〉 人(human)
〈220〉
〈221〉 V—region <222〉 (1)..(324)<223>人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9輕鏈可變區(qū)基因的核苷酸序 列
〈400〉 3 gacattgtgatgacgcagtctccaggcacc ctgtctttgtctccaggggagagagccacc60
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<212〉 PRT
<213〉 人(human)
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〈221〉 V-region 〈222〉 (l)..(贈
〈223〉人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9輕鏈可變區(qū)蛋白質(zhì)的氨基酸 序列
<400〉 4
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu' Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val His Leu Thr 20 25 30
Ser Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Val Tyr Ala Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Lys Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Asp lie Lys 100 10權(quán)利要求
1、一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9，其特征在于為人源抗體，是由重鏈可變區(qū)VH、輕鏈可變區(qū)VL和以重鏈恒定區(qū)1(CH1)5’端12個氨基酸的序列作為連接肽AKTTAPSVYPLA構(gòu)成的三結(jié)構(gòu)域單鏈抗體VH-連接肽-VK。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程 抗體RD9，其特征在于所述抗體基因的重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基 因來源于對人源抗狂犬病毒核糖體抗體庫的富集篩選，其重鏈可變區(qū)基因、 輕鏈可變區(qū)基因具有如序列表〈400〉1和<400〉3所示的序列。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因 工程抗體RD9，其特征在于所述抗體基因編碼的多肽序列如序列表〈400〉2 和〈4(J0〉4所示的序列。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程 抗體RD9，其特征在于對所述的氨基酸序列進(jìn)行改變、缺失或添加一個 或幾個氨基酸，而仍保留中和狂犬病毒的能力。
5、 一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9的制備方法，其特征在于該方法利用基因重組技術(shù)的方法來制備，具體步驟包括(1) 核糖體展示單鏈抗體基因庫(VH/k)的構(gòu)建l-l)細(xì)胞總RNA的提取和cDNA的合成； l-2)人源抗體VH和VL基因的PCR擴(kuò)增； l-3) PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析； 'l-4)抗體重、輕鏈DNA的拼接；(2) 核糖體展示單鏈抗體基因庫的構(gòu)建；(3) 體外轉(zhuǎn)錄和翻譯；'(4)核糖體復(fù)合物的親和篩選；(5) VH/k抗體基因的克隆表達(dá)；(6) ELISA鑒定陽性克隆并進(jìn)行序列分析；(7) 人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9的高效表達(dá)和純化；(8) 人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9的特異性抗原結(jié) 合活性檢測；(9) 人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9的相對親和力測定；(10) 人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9的相對穩(wěn)定性研究；(11) 人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9中和活性的研究。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所說的一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程 抗體RD9的制備方法，其特征在于所述步驟(7)人源抗狂犬病毒糖蛋白中 和性基因工程抗體RD9的高效表達(dá)和純化的具體步驟包括(1) 抗體基因表達(dá)載體的構(gòu)建；(2) 在一個合適的系統(tǒng)或宿主中將抗體基因表達(dá)；(3) 大量培養(yǎng)和擴(kuò)增抗體表達(dá)宿主；(4) 對表達(dá)的抗體分離純化。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程 抗體RD9的制備方法，其特征在于上述步驟(l)中抗體基因表達(dá)載體是質(zhì) 粒載體或病毒載體、動物轉(zhuǎn)基因的載體或者通用載體；所述抗體基因的表 達(dá)載體轉(zhuǎn)入一個合適的系統(tǒng)或宿主中加以表達(dá)，其中適合的系統(tǒng)或宿主包 括動物或植物的細(xì)胞，細(xì)胞株、細(xì)菌或酵母；該動物是轉(zhuǎn)基因動物。
8、 一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9的應(yīng)用，其特征在于所述抗體在制備用于診斷或治療狂犬病藥物中的應(yīng)用，包括抗體 基因和抗體基因編碼的多肽。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程 抗體RD9的應(yīng)用，其特征在于所述抗體基因在制備用于診斷或治療狂犬 病藥物中的應(yīng)用。
10、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工 程抗體RD9的應(yīng)用，其特征在于'所述抗體基因編碼的多肽在制備用于診 斷或治療狂犬病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體RD9及其制備與應(yīng)用，所述抗體是由重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)和以重鏈恒定區(qū)1(CH1)5’端12個氨基酸的序列作為連接肽AKTTAPSVYPLA構(gòu)成的三結(jié)構(gòu)域單鏈抗體VH-連接肽-VK，并實現(xiàn)了此株抗體在原核系統(tǒng)的高效表達(dá)，其生物學(xué)特性研究表明RD9是一株高親和力，穩(wěn)定性較好，可以特異中和狂犬病毒的人源基因工程抗體，其基因和其基因產(chǎn)物可用于制備預(yù)防和治療狂犬病的臨床用藥；所述抗體的制備方法易于規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)，本發(fā)明解決的另一技術(shù)問題是所述抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因及其編碼的多肽在預(yù)防和治療狂犬病藥物中的應(yīng)用。
文檔編號C07K16/08GK101550189SQ200810093980
公開日2009年10月7日 申請日期2008年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月25日
發(fā)明者弓景波, 楊志華, 趙小玲 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所