專利名稱：：一種三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥有效成分的制備方法，具體涉及三七中皂苦類成分的制備方法。
背景技術(shù)：
：三七為五力口-牛才直物三七[尸fl"(3x"otog/we"g(Burk.)RH.Chen]的干燥根，為我國名貴中藥，其主要有效成分為皂苷類化合物。據(jù)統(tǒng)計(jì)，迄今已從三七中分離得到50余種達(dá)瑪烷型的三萜皂苷，其中以三七皂苷R1、人參皂苷Rgl、Re、Rbl和Rd為主要成分。三七總皂苷對血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和代謝方面等均具有廣泛的藥理活性[參見，"中藥藥理與應(yīng)用(第二版)"，王浴生、鄧文龍、薛春生主編，第598-606頁，人民衛(wèi)生出版社，北京，1998年]。但是，不同皂苷的藥理作用各有差異，有的甚至截然相反，例如人參皂苷Rgl能促選血管新生，而人參皂苷Rbl則發(fā)揮其抑制作用[參見，SenguptaS，TohSA,SellersLA等,Circulation,2004,110,1219-1225]。因此，皂香單體的開發(fā)及其應(yīng)用潛力巨大。三七、人參CPgz'"sewg)和西洋參CP—"《w咖/z',)同為人參屬植物，化學(xué)成分上具有相似性，均含有人參皂苷Rgl、Re、Rbl和Rd，而三七皂苦R1為三七中特有的成分。其中除人參皂苷Re外，其余四種皂苷以三七中含量最高(見表1)[參見，WanJB,LiSP，ChenJM等，J.Sep.Sci.2007,30,825-832]。因此，選擇三七作為原料進(jìn)行上述皂苷分離制備是合理的、可行的。表l:三七皂苷R1、人參急香Rgl、Re、Rbl和Rd在三七、人參和西洋參中的含量(mg/g)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>三七皂苷R1、人參急苦Rbl、Rgl和Re現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于三七、人參、西洋參及其相關(guān)制品的質(zhì)量控制中。中國藥典規(guī)定三七、三七片的含量測定指標(biāo)為三七皂苷R1、人參皂苷RM和Rgl[參見，"中華人民共和國藥典2005版"，國家藥典委員會，PlO-ll，P323，化學(xué)工業(yè)出版社，北京，2005年];人參、紅參、西洋參的質(zhì)量控制指標(biāo)為人參皂苷Rgl、Rbl和Re[參見，"中華人民共和國藥典2005版"，國家藥典委員會，P7-8,P105，P87，化學(xué)工業(yè)出版社，北京，2005年];人參葉為人參皂苷Rgl和Re[參見，"中華人民共和國藥典2005版"，國家藥典委員會，P8，化學(xué)工業(yè)出版社，北京，2005年]。因此，在檢驗(yàn)和分析上述中藥質(zhì)量時(shí)，需要大量的化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品。除此之外，人參屬其它植物均有較為類似的化學(xué)成分，這些植物包括越南人參(戶v/e加a膨"^)、竹節(jié)參/opow/cws)、姜狀'三七(尸.z/wg7'6ere"^)和屏邊三七(尸./eawa/ws)等[參見,ZhuS,ZouK,FushimiH等，PlantaMed.2004,70,666-667]。上述中藥的質(zhì)量控制和藥理研究大多集中在皂苷類成分，因此市場上對于三七皂苷Rl、人參皂苷Rgl、Re、Rbl和Rd有著巨大的需求量。由于分離工藝的制約，傳統(tǒng)工藝?yán)梅磸?fù)柱色譜進(jìn)行三七皂苷Rl、人參皂苷Rgl、Re、Rbl和Rd的分離制備，需要大量使用曱醇、氯仿和乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、效率低下、操作困難、生產(chǎn)成本過高，而且易造成環(huán)境污染，使用的溶劑不便于回收利用。近年來，有人將高速逆流色譜技術(shù)應(yīng)用于三七皂苷R1、人參皂苷Rgl、Re、Rbl和Rd的分離制備[參見，CaoXL，TianY,ZhangTY等，J.Liq.Chromatogr.Rel.Technol.2003,26,1579-1591;DuQ,JerzG,WaibelR等，JChromatogrA.2003，1008,173-80],但利用反相色譜法同時(shí)分離制備上述皂苷尚未見報(bào)道。雖然在人參皂苷的分析上，一般亦釆用反相高效液相色鐠法，然而為了分開人參皂苷Rgl和Re，需要使用低比例的乙腈，使整個(gè)分析時(shí)間大大的延長，不利于皂苷的分離制備[參見，WanJB，LaiCM,LiSP等，J.PharmBiomedAnal.2006,41，274-279]。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明目的在于提供一種能夠適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)要求，環(huán)保、簡便、快速制備三七皂苷R1、人參皂苷Rgl、Re、Rbl和/或Rd的方法。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種釆用反相高效液相色語制備三七皂苷R1、人參皂苷Rgl、Re、Rbl和/或Rd的方法，該方法包括采用乙醇-水系統(tǒng)為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，所述乙醇-水系統(tǒng)為30%-80%(v/v)的乙醇-水溶液，所述洗脫為等度或梯度洗脫。上述反相高效液相色i普分離的樣品為三七提取物、三七總皂苷或三七皂苷中間體，其中所述三七提取物為三七藥材經(jīng)40。/。-95。/。(v/v)乙醇滲漉提取、熱回流提取、超聲提,取或加壓溶劑提取而得的提取物。所述三々急苷中間體為原人參三醇型皂香或原人參二醇型皂苦，原人參三醇型皂苦主要包含三七皂苷R1、人參皂苷Rgl和Re,原人參二醇型皂苷主要包含人參皂香Rbl和Rd。當(dāng)所述分離的樣品為三七提取物或三七總皂苷時(shí)，洗脫步驟為以30%~60%(v/v)乙醇-水系統(tǒng)洗脫至三七皂苷R1、人參皂苷Rgl和Re的洗脫峰出現(xiàn)，再將流動(dòng)相切換為50%~80%(v/v)乙醇-水系統(tǒng)。當(dāng)所述分離樣品為原人參三醇皂苷時(shí)，所述洗脫步驟為以30%~60%(v/v)乙醇-水系統(tǒng)進(jìn)行等度或梯度洗脫。當(dāng)所述分離樣品為原人參二醇皂苷時(shí)，所述洗脫步驟為以50%~80%(v/v)乙醇-水系統(tǒng)進(jìn)行等度或梯度洗脫。上述反相高效液相色i普的流速優(yōu)選為6.0ml/min;以C18反相鍵合硅膠為固定相。上述方法還包括在203nm下進(jìn)行檢測并分別收集三七皂苷Rl、人參皂苷Rgl、Re、Rbl和Rd的洗脫峰，以及將收集的溶液減壓揮去溶劑后，真空冷凍干燥制得凍干并分。采用反相高效液相色鐠制備三七皂苷R1、人參皂苷Rgl、Re、Rbl和/或Rd的方法包括以下具體步驟直接將三七提取物、三七總皂苷或三七皂苷中間體(原人參三醇皂苷或原人參二醇急芬)應(yīng)用于制備型反相高效液相色語，以C18反相鍵合硅膠為固定相，乙醇-水系統(tǒng)為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，203nm下檢測，流速6.0ml/min,分別收集三七皂苷R1、人參皂苷Rgl、Re、Rbl和Rd的洗脫峰，以上所述乙醇-水系統(tǒng)流動(dòng)相具體參數(shù)為①中間體原人參三醇皂苷等度或梯度洗脫，30%~60%乙醇-水系統(tǒng)(v/v)。②中間體原人參二醇皂苷等度或梯度洗脫，50%~80%乙醇-水系統(tǒng)(v/v)。③三七才是取物或三七總皂苷A相30%~60%乙醇-水系統(tǒng)(v/v);B相50%~80%乙醇-水系統(tǒng)(v/v),按梯度進(jìn)行系統(tǒng)洗脫。首先是100Q/oA相，待三七急苷Rl、人參急苷Rgl和Re的洗脫峰出來之后，流動(dòng)相切換為100%B相。其中三七提取物制備過程如下三七藥材粉末，使用40%95°/。(v/v)乙醇-水滲漉提取、熱回流提取、超聲提取或加壓溶劑提取后，減壓回收溶劑得提取物。合并各皂苷"洗脫液，減壓揮去溶劑，真空冷凍干燥即得三七皂苷R1、人參皂苷Rgl、Re、Rbl和Rd單體化合物的凍干粉。經(jīng)HPLC分析，203nm檢測，按色i普歸一化法計(jì)算，其純度均在97%之上。本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)過程中進(jìn)行了色譜參數(shù)的優(yōu)化，這些參數(shù)包括流動(dòng)相種類、流動(dòng)相配比，流速及上樣量。由于人參皂苷Rgl和人參皂苷Re在反相液相上的保留時(shí)間最為接近，故使用兩者的分離度為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行參數(shù)的優(yōu)化。流動(dòng)相考察了乙腈-水、甲醇-水和乙醇-水系統(tǒng)，結(jié)果表明乙醇-水系統(tǒng)最適合應(yīng)用于三七中上述皂苷的分離制備(見圖2)。對于流動(dòng)相配比，同時(shí)考察了不同濃度的乙腈-水、曱醇-水和乙醇-水系統(tǒng)對分離度的影響，結(jié)果表明，使用不同濃度的乙腈-水或曱醇-水系統(tǒng)均難以得到較佳的分離度，而30%~60%(v/v)乙醇-水系統(tǒng)能較好的分離人參皂苷Rgl和人參皂苷Re，故本發(fā)明使用乙醇-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相。在對流速的考察過程中，發(fā)現(xiàn)流速越低，分離度越高，但所使用的時(shí)間越長(見圖3),故選取適中的流速為6.0ml/min,既保證分離效果，又能兼顧分離時(shí)間。上樣量對分離效果也有著明顯的影響(見圖4)，不同的色譜柱其載藥量不同，應(yīng)根據(jù)色譜柱的規(guī)格進(jìn)行上樣量的考察。本發(fā)明采用的技術(shù)方案具有如下的優(yōu)點(diǎn)①工藝筒單，生產(chǎn)周期短。由于三七中人參皂苷化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，極性相近，以往的方法所得的產(chǎn)品純度較低，如需進(jìn)一步分離，還得靠制備性高效液相，分離工藝復(fù)雜，生產(chǎn)周期較長。一般情況，柱層析需要數(shù)周甚至數(shù)月的時(shí)間，而本發(fā)明優(yōu)選分離參數(shù)，尤其是分離使用的溶劑系統(tǒng)，直接使用反相液相色譜法，使之能從提取物或市售的三七總皂苷中同時(shí)分離得到三七皂苷R1、人參皂苷Rgl、Re、Rbl和Rd,單次分離在60min之內(nèi)，生產(chǎn)周期大為縮短。②環(huán)保、成本低。一般人參皂苷的分離，多使用曱醇、氯仿、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，不僅對生產(chǎn)人員的健康造成威脅，而且對環(huán)境產(chǎn)生一定程度的污染。本工藝全程僅僅使用乙醇和水兩種溶劑，無毒、環(huán)保，終產(chǎn)品亦無需作其它有機(jī)溶劑的^f企查，真正實(shí)現(xiàn)環(huán)保、無污染生產(chǎn)。乙醇-水溶劑回收后，根據(jù)不同濃度的密度對應(yīng)值進(jìn)行勾兌，可重新進(jìn)行使用，不需要新增溶劑分離設(shè)備，而且大孔吸附樹脂和反相分離材料通過一定方式處理后，亦可重復(fù)利用，大大減低生產(chǎn)成本。③純度高。傳統(tǒng)反復(fù)柱層析的方法得到的單體純度較低且差異很大，往碎需要進(jìn)一步純化，而利用本發(fā)明工藝生產(chǎn)6，人參皂苷純度均達(dá)97%以上，高于一般定性鑒別的對照品純度95%。以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明，其中圖1為本發(fā)明的工藝路線圖2為表示不同溶劑系統(tǒng)對分離效果的影響的色鐠圖，其中(A):乙腈-水系統(tǒng)；(B):曱醇-水系統(tǒng)；(C)乙醇-水系統(tǒng)。1:三七皂苷R1;2:人參皂苷Re;3:人參皂苦Rgl;圖3為表示不同流速對分離效果及分離時(shí)間的影響的曲線圖4為表示不同上樣量對分離效果的影響的色譜圖，其中(A):原人參三醇型皂苷50mg;(B):原人參三醇型皂苷40mg;(C)原人參三醇型急苷30mg。1:三七皂苦R1;2:人參皂苷Re;3:人參皂苷Rgl;圖5為市售三七總皂苷的制備型高效液相色譜圖及產(chǎn)品純度檢測的分析型高效液相色謙圖。圖6為原人參三醇型皂苷的制備型高效液相色譜圖及產(chǎn)品純度檢測的分析型高效液相色譜圖。圖7為原人參二醇型皂苷的制備型高效液相色語圖及產(chǎn)品純度檢測的分析型高效液相色譜圖。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1三七藥材粉末200g，用70°/。乙醇1000ml超聲提取，提取時(shí)間2h，重復(fù)三次合并提取液，真空揮發(fā)溶劑得提取物。上述提取物充分地溶于200ml40%(v/v)乙醇-水中。將上述提取物的溶液應(yīng)用于制備型反相高效液相色鐠，以AlltimaC18(250x22mm,10pm)為色i普柱，203nm檢測，流速6.0ml/min，40%(v/v)乙醇-水系統(tǒng)(A相)和60%(v/v)乙醇-水系統(tǒng)(B相)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序如表2所示，分別收集三七皂苦R1、人參皂苷Re、Rgl、Rbl和Rd的洗脫峰。表2梯度洗脫程序時(shí)間(min)A相B相0，1000221000240100600100合并各人參皂苷的收集液，減壓揮去溶劑，真空冷凍干燥即得三七皂苷R1、人參皂苷Rgl、Re、Rbl和Rd單體化合物的凍干粉。三七提取物的制備型高效液相色譜圖，及產(chǎn)品純度檢測的分析型高效液相色譜圖，均與圖5極為類似。實(shí)施例2取市售三七總急苷20g，充分地溶于200ml純水中，將上述提取物的溶液應(yīng)用于制備型反相高效液相色譜，以AlltimaC18(250x22mm,10jam)為固定相，203nm檢測，流速6.0ml/min,40%(v/v)乙醇-水系統(tǒng)(A相)和60°/。(v/v)乙醇-水系統(tǒng)(B相)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序如表2所示，分別收集三七皂苷R1、人參皂苷Re、Rgl、Rbl和Rd的洗脫峰(見圖5)。合并各人參皂苷的收集液，減壓揮去溶劑，真空冷凍干燥即得三七皂苷R1、人參皂苷Rgl、Re、Rbl和Rd單體化合物的凍干粉。實(shí)施例3三七藥材粉末200g,用70%乙醇1000ml超聲提取，提取時(shí)間2h,重復(fù)三次合并提取液，真空揮發(fā)溶劑得提取物。上述提取物充分地溶于200ml水中，應(yīng)用于500gD-101大孔吸附樹脂，先用3000ml的純水進(jìn)行洗脫，后用30%(v/v)乙醇-水6000ml進(jìn)行洗脫，最后用3000ml80%(v/v)乙醇-水進(jìn)行洗脫分別合并30%和80%乙醇-水洗脫液，減壓揮去溶劑，真空冷凍干燥，得到中間體三七原人參三醇型急苷和原人參二醇型急香。將上述分離得到的原人參三醇型皂苷應(yīng)用于制備型反相高效液相色i普，以AlltimaC18(250x22mm,10|im)為固定相，40%(v/v)乙醇-水系統(tǒng)為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，203nm檢測，流速6.0ml/min,分別收集三七皂苷R1、人參皂苷Re和Rgl的峰(見圖6)。將上述分離得到的原人參二醇型皂苷應(yīng)用于制備型反相高效液相色鐠，以C18為固定相，，60%(v/v)乙醇-水系統(tǒng)為流動(dòng)相進(jìn)行等疼洗脫，203nm檢測，流速6.0ml/min,分別收集人參急苦Rbl和Rd的峰(見圖7)。合并各人參皂苷的收集液，減壓揮去溶劑，真空冷凍干燥即得三七皂苷R1、人參皂苷Rgl、Re、Rbl和Rd單體化合物的凍干粉。實(shí)施例4取市售三七總皂苷20g,充分地溶于200ml純水中，應(yīng)用于500gD-101大孔吸附樹脂，先用3000ml的純水進(jìn)行洗脫，后用30%(v/v)乙醇誦水6000ml進(jìn)行洗脫，最后用3000ml80%(v/v)乙醇-水進(jìn)行洗脫分別合并30%和80%乙醇-水洗脫液，減壓揮去溶劑，真空冷凍干燥，得到中間體三七原人參三醇型皂苷和原人參二醇型皂苷。將上述分離得到的原人參三醇型皂苷應(yīng)用于制備型反相高效液相色譜，以AlltimaC18(250x22mm，lOpm)為固定相，40%(v/v)乙醇-水系統(tǒng)為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，203nm檢測，流速6.0ml/min,分別收集三七皂苷R1、人參皂香Re和Rgl的峰(與圖6極為類似)。將上述分離得到的原人參二醇型皂苷應(yīng)用于制備型反相高效液相色10譜，以C18為固定相，60%(v/v)乙醇-水系統(tǒng)為流動(dòng)相進(jìn)^f亍等度洗脫，203nm檢測，流速6.0ml/min，分別收集人參急香Rbl和Rd的峰(與圖7極為類似)。合并各人參皂苷的收集液，減壓揮去溶劑，真空冷凍干燥即得三七急苷R1、人參皂苷Rgl、Re、Rbl和Rd單體化合物的凍干粉。權(quán)利要求1.一種采用反相高效液相色譜制備三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1和/或Rd的方法，其特征在于，所述方法包括采用乙醇-水系統(tǒng)為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙醇-水系統(tǒng)為300/。-80%(v/v)的乙醇-水溶液。3.根據(jù)權(quán)利要求l或2所述的方法，其特征在于，所述洗脫為等度或梯度洗脫。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述反相高效液相色鐠分離的樣品為三七提取物、三七總皂苷或三七皂苷中間體。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述三七提取物為三七藥材經(jīng)40°/。95°/。(v/v)乙醇滲漉提取、熱回流提取、超聲提取或加壓溶劑提取而得的提取物。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述三七皂苷中間體為原人參三醇型皂香或原人參二醇型皂苷。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述原人參三醇型皂苷主要包含三七皂苷Rl、人參皂苷Rgl和Re;所述原人參二醇型皂苷主要包含人參急苷Rbl和Rd。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述分離的樣品為三七提取物或三七總急苷，所述洗脫步驟為以30%~60%(v/v)乙醇-水系統(tǒng)洗脫至三七急苷Rl、人參急苷Rgl和Re的洗脫峰出現(xiàn)，再將流動(dòng)相切換為50%~80%(v/v)乙醇-水系統(tǒng)。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述分離樣品為原人參三醇皂苷，所述洗脫步驟為以30%~60%(v/v)乙醇-水系統(tǒng)進(jìn)行等度或梯度洗脫。10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述分離樣品為原人參二醇急苷，所述洗脫步驟為以50%80%(v/v)乙醇-水系統(tǒng)進(jìn)行等度或梯度洗脫。11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述反相高效液相色i普的流速為6.0ml/min。12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述反相高效液相色譜以C18反相鍵合硅膠為固定相。13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在203nm下進(jìn)行;險(xiǎn)測并分別收集三七皂苷Rl、人參皂苷Rgl、Re、RM和/或Rd的洗脫峰。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將收集的溶液減壓揮去溶劑后，真空冷凍干燥制得凍干粉。全文摘要本發(fā)明提供一種能夠適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)要求，環(huán)保、簡便、快速制備三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1和/或Rd的方法。該方法以三七提取物、三七總皂苷或三七皂苷中間體為起始原料，采用制備型反相高效液相色譜法以乙醇-水系統(tǒng)為流動(dòng)相進(jìn)行等度或梯度洗脫，所述乙醇-水系統(tǒng)為30％-80％(v/v)的乙醇-水溶液。該方法具有工藝簡單、無污染、成本低和純度高，其產(chǎn)品純度均在97％以上的優(yōu)點(diǎn)。文檔編號C07J17/00GK101575357SQ200810096148公開日2009年11月11日申請日期2008年5月9日優(yōu)先權(quán)日2008年5月9日發(fā)明者萬建波,張慶文,王一濤申請人:澳門大學(xué)