專利名稱：：重組胎兒彎桿菌n端表面膜蛋白及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種重組蛋白，尤其涉及一種重組胎兒彎桿菌N端表面膜蛋白及其編碼基因，本發(fā)明還涉及該重組胎兒彎桿菌N端表面膜蛋白在牛胎兒彎桿菌病血清學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用，屬于動(dòng)物疾病檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：胎兒彎桿菌(Campylobacterfetus)屬于彎桿菌屬的成員，包括胎兒彎桿菌胎兒亞種(C.fetussubsp.fetus)和胎兒彎桿菌性病亞種(C.fetussubsp.venerealis)。自McFadyean等(1913)從流產(chǎn)綿羊的陰道分泌物中分離到弧菌樣^t生物以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者己對(duì)胎兒彎桿菌進(jìn)行大量研究，發(fā)現(xiàn)胎兒彎桿菌呈世界性分布，是危害人或動(dòng)物健康的重要病原微生物之一。胎兒彎桿菌叉稱胎兒弧菌，是一種革蘭氏陰性，一端或兩端鞭毛，不形成芽孢或莢膜，"S，，狀或螺旋狀的小彎桿菌，但在老齡培養(yǎng)物中可呈球形或螺旋狀長(zhǎng)絲(由多個(gè)S形菌體形成的鏈)。胎兒彎桿菌胎兒亞種可引起牛羊的流產(chǎn)和不育，性病亞種專嗜牛的生殖道，破壞牛的胎盤(pán)，導(dǎo)致不孕；公牛感染后，癥狀不明顯，但可以污染精液，通過(guò)配種或人工授精等造成胎兒彎桿菌性病亞種的傳播。胎兒彎桿菌通過(guò)污染的水源、食物、精液、流產(chǎn)的胎兒和糞便等進(jìn)行傳播，非易感動(dòng)物和鳥(niǎo)類可作為其感染的第二宿主。帶菌公牛、感染母牛和康復(fù)母牛是主要的傳染源。人，尤其患有免疫缺陷癥的人，感染胎兒彎桿菌后能引起腦膜炎、菌血癥、關(guān)節(jié)炎和腹瀉等疾病。因此，胎兒彎桿菌嚴(yán)重威脅著人類的健康并給畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。胎兒彎桿菌病的診斷方法有細(xì)菌學(xué)方法、分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法等。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于胎兒彎桿菌病的診斷方法主要依賴于生化實(shí)驗(yàn)，例如氧化酶實(shí)驗(yàn)(使用瓊脂平板表面經(jīng)24h培養(yǎng)的生長(zhǎng)物〔也可取用于抗生素試驗(yàn)的平板〕，將氧化酶試劑滴于棉拭子上，并用棉拭子去接觸表面生長(zhǎng)物，在接觸點(diǎn)出現(xiàn)深藍(lán)色斑點(diǎn)者為陽(yáng)性。)，硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)(將肉湯培養(yǎng)物接種于加有0.02%鹽酸半胱氨酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,將一根浸有飽和乙酸鉛的濾紙條懸于試管的上部〔不讓濾紙條接觸培養(yǎng)基〕，旋緊試管帽，置空氣中于37'C培養(yǎng)。每日檢查,觀察濾紙條是否變黑,紙條變黑表明有硫化氫產(chǎn)生,為陽(yáng)性反應(yīng)。對(duì)未出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)者需培養(yǎng)5d,方可做出最后判斷)以及1%甘氨酸生長(zhǎng)試驗(yàn)等。病原分離是檢測(cè)傳染性疾病的常規(guī)方法，但是由于胎兒彎桿菌的生長(zhǎng)需要嚴(yán)格的氣體環(huán)境和生化條件，且對(duì)采集的病料有特殊要求，這給胎兒彎桿菌的分離帶來(lái)很大困難。秦貞奎等(1987)建議用無(wú)菌的3.5%的02,10%的0)2，86.5。/。的N2來(lái)分離和培養(yǎng)胎兒彎桿菌。但一般的實(shí)驗(yàn)室不具這種條件，且不易操作。另夕卜，胎兒彎桿菌在合適的培養(yǎng)基上也生長(zhǎng)緩慢，既便得到了可疑菌落，用生化試驗(yàn)來(lái)鑒定胎兒彎桿菌難度較大，因?yàn)槠湫玛惔x速度慢，適用的生化實(shí)驗(yàn)少，且有些生物中間型更不易區(qū)別。由于胎兒彎桿菌分離難度大，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，且有一定的主觀性，不利于處理大量樣品。因此，研究檢測(cè)胎兒彎桿菌病的新方法，對(duì)于了解其在我國(guó)的分布和流行情況具有重要意義。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，國(guó)外主要采用PCR方法，DNA指紋印跡，脈沖場(chǎng)凝膠電泳對(duì)胎兒彎桿菌進(jìn)行分離鑒定。例如Oyofo等利用flaA基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，用來(lái)檢測(cè)空腸彎桿菌和大腸彎桿菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:只有空腸彎桿菌和大腸彎桿菌的樣品出現(xiàn)450bp擴(kuò)增產(chǎn)物，而胎兒彎桿菌、螺旋體等微生物無(wú)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。該聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)能纟企測(cè)到0.0062pg純化的空腸彎桿菌或大腸彎桿菌的基因組DNA。這說(shuō)明聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在檢測(cè)空腸彎桿菌或大腸彎桿菌時(shí)具有特異性和敏感性。Vargas等(2003)利用PCR技術(shù)對(duì)胎兒彎桿菌亞型的分型進(jìn)行了研究，在其研究過(guò)程中運(yùn)用脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)，并應(yīng)用樹(shù)狀圖對(duì)其進(jìn)行了分析。Re皿ie等用生化實(shí)驗(yàn)和藥敏實(shí)驗(yàn)研究分離自感染人的血液和糞便胎兒彎桿菌的差異，并通過(guò)脈沖電場(chǎng)凝膠電泳得到胎兒彎桿菌基因組DNA酶切后的基因圖譜來(lái)證實(shí)，這說(shuō)明利用胎兒彎桿菌基因圖譜來(lái)發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)其突變抹具有一定的意義。sloMasakiFujita等用內(nèi)切酶Sa/I和SmaI分別酶切21林胎兒彎桿菌的基因組DNA,利用脈沖電場(chǎng)凝膠電泳獲得它們的指紋圖譜，然后分析各菌抹間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，為研究胎兒彎桿菌的流行病學(xué)提供了方便。也有利用PCR方法通過(guò)擴(kuò)增16sRNA的方法來(lái)檢測(cè)胎兒彎桿菌的研究。分子生物學(xué)方法雖然特異性和敏感性較高，但只適于實(shí)驗(yàn)室操作而不適于臨床推廣應(yīng)用。血清學(xué)方法尤其是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法在細(xì)菌疾病的檢測(cè)中是經(jīng)濟(jì)，方便和省時(shí)省力的首選方法。Newsam等(1967)建立了利用特異性IgA進(jìn)行的陰道粘液凝集實(shí)驗(yàn)，但這一方法只適用于群體檢查，不能用于個(gè)體確診。并且該法僅能檢測(cè)出50%的感染動(dòng)物。由于IgA抗體在感染后30-70天才開(kāi)始出現(xiàn)，且抗體水平低，持續(xù)一段時(shí)間后，部分動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)抗體消失。SaeedAkhtar利用ELISA方法對(duì)來(lái)自加利福尼亞的630份牛血清進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用其數(shù)據(jù)來(lái)評(píng)定胎兒彎桿菌、睡眠嗜血菌和牛病毒性腹瀉病毒等的血清學(xué)陽(yáng)性率及陰性率。Brooks等利用自己研究的四個(gè)單克隆抗體與胎兒彎桿菌脂多糖核心抗原表位結(jié)合，以蛋白酶K消化和石,友酸水洗涂下來(lái)的脂多糖作為抗原，應(yīng)用ELISA方法對(duì)四個(gè)單克隆抗體進(jìn)行;險(xiǎn)測(cè)。他們得出這些單克隆抗體對(duì)于胎兒彎桿菌具有;^艮高的特異性，可作為鑒定胎兒彎桿菌的潛在性免疫診斷試劑。胎兒彎桿菌野型菌抹表面覆蓋有一層高分子量的表面蛋白，這層蛋白對(duì)胎兒彎桿菌的毒力起重要作用，其分子量約為97-149KDa,該表面蛋白在引起牛羊的流產(chǎn)等疾病中起了至關(guān)重要作用。在混合培養(yǎng)中，單一菌抹可以表達(dá)三種蛋白，但以其中一種占主導(dǎo)地位，其原因尚不十分清楚。有的自發(fā)突變抹缺失高分子量的表面蛋白后，對(duì)正常血清變得敏感。ShujiFujimoto等用冷凍蝕刻分析技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)98KDa的表面蛋白呈六角形排列，中心距為24nm;127KDa和149KDa的表面蛋白呈四角形排列，中心距為8nm。事實(shí)表明高分子量的表面蛋白的保守，特別是氨基(N)端具有保守性，可能和它抵抗補(bǔ)體成分C3b與菌體相結(jié)合、排泄、自我組裝和形成晶體結(jié)構(gòu)等功能有關(guān)。由于表面蛋白抵抗補(bǔ)體成分C3b與菌體相結(jié)合，因此它具有抗血清、抗呑噬的作用。高分子量的表面蛋白由sap基因族編碼，由I型分泌系統(tǒng)分泌和運(yùn)輸。sap基因族中sapA2基因，編碼全長(zhǎng)1109個(gè)氨基酸的表層蛋白，sapA2基因閱讀框前的70個(gè)堿基及與其相連的閱讀框中的550個(gè)堿基是保守的，并以完整的基因形式存在于基因組中。用sapA基因5'保守端作為探針對(duì)脈沖電場(chǎng)凝膠電泳后的凝膠進(jìn)行Southern雜交，結(jié)果表明sap基因族緊密群聚于基因組中。由于胎兒彎桿菌8個(gè)緊密群聚的sap基因族的重組,其表達(dá)的高分子量的表面蛋白的抗原性不斷發(fā)生變化，以逃避宿主的免疫殺傷作用。sap同位基因的重組伴隨著一個(gè)6.2kb的sapA基因的含啟動(dòng)子序列的基因組件的倒置，或和一個(gè)甚至多個(gè)sap基因的側(cè)翼序列一起倒置。這和sap基因側(cè)翼序列的一致及其5，端含有相同識(shí)別序列有關(guān)。能促進(jìn)同源堿基配對(duì)和單鏈DNA交換的RecA蛋白在sap基因族的重組中起到不可缺少的作用。Murali等研究發(fā)現(xiàn)，sapA基因啟動(dòng)子的缺失能導(dǎo)致高分子量表面蛋白的缺失。研究胎兒彎桿菌野型林擁有的高分子量的表面蛋白，對(duì)于進(jìn)一步了解其致病機(jī)理，制造基因疫苗，控制胎兒彎桿菌的傳播具有重要作用。Grogono-Thomas等人將胎兒彎桿菌97KDa的表面蛋白SapA純化，皮下途徑免疫該表面蛋白，發(fā)現(xiàn)表面蛋白是非常強(qiáng)的抗原，可以從奶，血清，膽汁及尿液中檢測(cè)到抗體。研究人員從經(jīng)胎兒彎桿菌表面蛋白(97KD)免疫過(guò)的2只兔體內(nèi)找到位于表面蛋白N末端保守區(qū)第184個(gè)氨基酸多肽結(jié)合的IgG抗體，其中被鑒定的2個(gè)假定的抗原表位位于氨基酸81到110和141到160之間。胎兒彎桿菌J05577抹表面蛋白全基因sapA由3974個(gè)堿基組成，其開(kāi)放閱讀框架為2820個(gè)堿基，所表達(dá)的蛋白約為97KDa，與上述所說(shuō)保守區(qū)域的免疫保護(hù)效果較好的蛋白位置相符，這就更說(shuō)明表面蛋白是一種較好的血清學(xué)檢測(cè)抗原。另夕卜，Wang等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)胎兒彎桿菌表面蛋白具有多個(gè)抗原表位和較強(qiáng)的致病作用。在感染動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)的占主導(dǎo)地位的表面蛋白的大小和類晶體結(jié)構(gòu)不斷發(fā)生變化，從而導(dǎo)致其相應(yīng)抗體的不斷變化。目前，國(guó)內(nèi)還沒(méi)有關(guān)于牛胎兒彎桿菌表面蛋白的研究報(bào)道，更沒(méi)有應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)牛胎兒彎桿菌病的研究，故本發(fā)明應(yīng)用胎兒彎桿菌表面蛋白作為抗原建立間接ELISA診斷方法，以達(dá)到對(duì)胎兒彎桿菌病的快速特異的診斷。但由于胎兒彎桿菌表面蛋白基因片段較長(zhǎng)，全基因表達(dá)困難和產(chǎn)量過(guò)低，不符合作為診斷抗原的要求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的之一是提供一種可作為胎兒彎桿菌病診斷抗原的重組蛋白；本發(fā)明目的之二是提供編碼上述重組蛋白的基因。本發(fā)明目的之三是提供一種制備上述重組蛋白的方法。本發(fā)明上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的可作為胎兒彎桿菌病診斷抗原的重組胎兒彎桿菌N端表面膜蛋白，其為SEQIDN0:2所示的氨基酸序列。編碼上述重組胎兒彎桿菌N端表面膜蛋白的基因，其堿基序列為SEQIDNO:l所示。一種制備上述重組胎兒彎桿菌N端表面膜蛋白的方法，包括(1)、從胎兒彎桿菌(Campylobacterfetus)菌林中提取基因組DNA;(2)、以SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的堿基序列為引物，以步驟(1)所制備的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)、將步驟(2)所擴(kuò)增得到的基因片段連接于表達(dá)載體中，得到重組表達(dá)載體；(4)將重組表達(dá)載體在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；收集、純化所表達(dá)的蛋白，即得。上述方法中，其中，步驟(3)中所述的表達(dá)載體優(yōu)選為pET22b、pET30a、pGEX-6p-l或pET32a(+)載體，更優(yōu)選為pET32a(+);所述的重組表達(dá)載體優(yōu)選是pET32-sapA-N;步驟(4)中所述的純化蛋白的方法優(yōu)選為金屬鰲合層析的方法。本發(fā)明對(duì)位于胎兒彎桿菌表面蛋白N端1398bp的基因進(jìn)行了表達(dá)，所表達(dá)的可溶性蛋白(rSapA-N)經(jīng)過(guò)金屬鰲合層析的方法純化，得到約66KD大小的蛋白，經(jīng)過(guò)ELISA檢測(cè)和Westernblot分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有很好的免疫活性；將本發(fā)明表達(dá)的蛋白質(zhì)作為抗原，可用間接ELISA試驗(yàn)方法檢測(cè)胎兒彎桿菌病，檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明該抗原具有很高的特異性和敏感性，可用于胎兒彎桿菌病的血清學(xué)診斷。圖1sapA-N基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果；1sapA-NPCR產(chǎn)物；2,MarkerDL2000。圖2pET-sapA-N重組質(zhì)粒的酶切鑒定；1pET-sap-N質(zhì)粒的酶切；2DL15000DNAMarkcr。圖3重組質(zhì)粒的蛋白表達(dá)；1,2pET-sap-N細(xì)菌裂解上清,3，4sap-N細(xì)菌裂解沉淀；5,6pET32a載體對(duì)照；蛋白質(zhì)分子量marker。圖4重組rSap-N蛋白的Westernblotting結(jié)果；1:蛋白質(zhì)Marker;2:表達(dá)蛋白rSap-N。具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明的有益效果，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1編碼胎兒彎桿菌N端(sapA-N)表面蛋白DNA的制備sapA-N基因(1398bp)的PCR擴(kuò)增胎兒彎桿菌553抹(吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局)基因組lul,引物sapA-N-U和sapA-N-L各0.5ul(sapA-N曙U5'GAATTCGCAAGTGAGGGTGATGGT3'(SEQIDNO:3);sapA-N-L5'AAGTCGACAACCTTAGCAGCAGCTC3，(SEQIDNO:4))引物濃lOpMol,10xTaqDNA聚合酶Buffer2.5ul、2mMdNTP1.5ul、TaqDNA聚合酶0.5ul，以水補(bǔ)足，反應(yīng)體系為25ul，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)的條件為95。C變性10分鐘，94。C變性1.5分鐘，55。C退火1.5分鐘，72。C延伸1.5分鐘，30個(gè)循環(huán)，72。C延伸10分鐘。在1.0%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，100V電壓20分鐘后觀察結(jié)果。然后用膠回收試劑盒進(jìn)行sapA-N基因的回收。結(jié)果，PCR擴(kuò)增出1389bp的DNA片段(圖1)，與實(shí)際大小相符。實(shí)施例2編碼胎兒彎桿菌N端(sapA-N)表面蛋白基因的分子克隆、表達(dá)和純化.sapA-N基因的分子克隆先將上述Taq酶擴(kuò)增的sapA-N基因連接pMD18T-Vector,轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)月包，獲得重組質(zhì)粒pMD18T-sapA-N。經(jīng)酶切和PCR鑒定的重組質(zhì)粒，用￡coiI和Sa/I切下并膠回收sapA-N基因，將它們分別連入經(jīng)酶切處理的pET32a(+)的相應(yīng)位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，酶切和PCR鑒定后獲得重組質(zhì)粒pET32-sapA-N。結(jié)果經(jīng)過(guò)酶切鑒定(如圖2所示)，表明已經(jīng)成功構(gòu)建含有目的基因的重組表達(dá)載體，經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行了表達(dá)(如圖3所示)，表達(dá)的重組蛋白(rSapA-N)與實(shí)際設(shè)計(jì)的大小相符。將IPTG誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)過(guò)離心、洗涂后進(jìn)行超聲波裂解，高速離心后收集上清液，應(yīng)用親和層析柱進(jìn)行純化，測(cè)定純化后的蛋白濃度為2.964mg/ml。純化后的rSapA-N置于-7(TC保存。純化后的rSapA-N的Westernblotting結(jié)果見(jiàn)圖4。試驗(yàn)例1本發(fā)明抗原蛋白的診斷效果試驗(yàn)一、試驗(yàn)材料1、供試樣品用本發(fā)明實(shí)施例2所純化的蛋白質(zhì)作為包被抗原。2、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照由本實(shí)驗(yàn)室保存?？瞻讓?duì)照為100|il底物溶液加50nl終止液。3、試劑明膠、吐溫20、TMB(鄰苯二胺)。二、試^瞼方法將本發(fā)明實(shí)施例2所表達(dá)的蛋白純化后，所純化的蛋白可以作為ELISA的診斷抗原，用于臨床樣品的檢測(cè)，能夠達(dá)到預(yù)期的診斷效果。ELISA檢測(cè)程序1、將純化后的抗原用pH9.5的碳酸鹽緩沖液稀釋后進(jìn)行包被ELISA板(Nunco公司)，50pl/孔，室溫過(guò)夜；2、次日厄掉液體，力。1%明膠(Sigma)進(jìn)行封閉，150^1/孔37。C濕盒l(wèi)h;3、取出后甩掉液體，用pH7.6的PBST洗滌3次，300^1/孔每次3min;4、加用PBST稀釋后的待檢血清，50pl/孔37。C濕盒l(wèi)h,同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照；5、取出后甩掉液體，用pH7.6的PBST洗滌3次，300^1/孔每次3min;6、加用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗牛的二抗(Sigma公司)，50^1/孔，37X:濕盒l(wèi)h;7、取出后甩掉液體，用pH7.6的PBST洗滌4次，300^1/孔每次3min;8、加底物TMB5(Hil/孔，避光室溫放置10min顯色；9、力。50nl/孔2MH2S04終止反應(yīng)，450nm測(cè)定OD值。10、結(jié)果判定OD>0.45為陽(yáng)性，OD<0.45為陰性。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1表lELISA檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>說(shuō)明供試樣品的數(shù)值結(jié)果大于等于0.45為陽(yáng)性結(jié)果表明采用本發(fā)明表達(dá)的蛋白質(zhì)作為抗原，可用間接ELISA試驗(yàn)方法檢測(cè)胎兒彎桿菌病，檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明該抗原具有很高的特異性和敏感性，可用于胎兒彎桿菌病的血清學(xué)i貪斷。序列表<110〉中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所<120>重組胎兒彎桿菌N端表面膜蛋白及其編碼基因和應(yīng)用<130>PKL0878<160〉4<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>1389<212〉DNA<213〉Campylobacterfetus<400>1atgttaaacattcaatgctttatatcactattatggg城ggc幼gtgag60ggtgatggtaataagtat"tggttagattatatagtttaggagtttcaagt120ttagct3atattatgcttgatagtccaggggcggctaaattctttggtgattctctttta180gc3ggtaBtg犯犯agattttgttactaagatatatagtatagcttt鄉(xiāng)taatactagt240gatgttgatggcattaattattggactaaggcaataactggcggtggagaatttactgat300agt犯gggtaatgttattagtgttgctagtttaBgcaagggtgatttaataggtgctatg360attaactctatggUaatggcggtagtgctgagtctaaggcta/tat"ttgeiggctaaggca420gctgctagtgattactttgccgatgctactttggt犯gggatattagtggattaga/tgag480ggtactacttctaagttaattagcgagattaatagtgcteigtgatcttgataaggttaag540agtgagattgatgctttgaagagtgagctacct犯tccgggtagtacttatgatcttaca600gagggtaatgataatttaaagggtactgatttagacgatacttttaatgggactacatat660gtaggtaatggtactaataagagtactcttagtgcatttgataagartagatggtcggtg720cUggg鄉(xiāng)gatacgttgaatgcgatatttactgcaataacacgcgctgcgctactaact780gatcaagctgcactaaaaggcgtacaaacgtagaaaatatcaatataatt840tcagatctagaaacaagtggcgatttcgttttcaacggtt■gtacttggcgctttgctaccgacgcatctaaaagcgtaaatgtagaaaca960ac3gg肌cgataactgctttcaccgcagccgg幼caggc3犯gtcgatgttgtcgccggt1020aaaatctctgcccttacggccgattcgcgaacaagcgtaaatttaactgctacaaacgac1080actatcacattaaccagtgcaaacgctgctactagtgtgaatttaaaacagCggC6LggCC1140aaagacgctacaataacatccgcaa/tgcagcaa幼atataacaatagacgcaacaggatt1200gcaactataacttcagctacggctgtagagaatttgacagttaaacatgc1260gcgctaaatggtggcatggataaacttgcaacagttactcttgac幼tgctgctttaact1320gctgcaatagatataaaatctgcaagcacact幼atttaataaattcaagtgtt犯cgga1380ccaaaacat1389<210>2<211>463<212〉PRT<213>Campylobacterfetus<400>2MetLeuAsnLysThrAspValSerMetLeuTyrlieThrlieMetGly1015MetAlaSerGluGlyAspGlyAsnLysTyrTrpLeuAspTyrAlaAsn202530AsnAsnSerI>euGlyValSerSerLeuAlaAsnlieMetLeuAspSer354045ProGlyAlaAlaLysPhePheGlyAspSerLeuLeuAlaGlyAsnGlu505560LysAspPheValThrLyslieTyrSerlieAlaLeuGlyAsnThrSer65707580AspValAspGlylieAsnTyrTrpThrLysAlalieThrGlyGlyGly859095GluPheThrA印SerLysGlyAsnVallieSerValAlaSerLeuSer100105110LysGlyAspLeulieGlyAlaMetlieAsnSerMetValAsnGlyGly115120125SerAlaGluSerLysAlaliePheGluAlaLysAlaAlaAlaSerAsp130135140TyrPheAlaAspAlaThrLeuValArgAsplieSerGlyLeuAspGlu145150155160GlyThrThrSerLysLeulieSerGlulieAsnSerAlaSerAspLeu165170175AspLysValLysSerGlulieAspAlaLeuLysSerGluLeuProAsn180185190ProGlySerThrTyrAspLeuThrGluGlyAsnAspAsnLeuLysGly195加O205ThrAspLeuAspAspThrPheAsnGlyThrThrTyrValGlyAsnGly210215220ThrAsnLysSerThrLeuSerAlaPheAspLysThrArgTrpSerVal225230235240LeuGlyArgAspThrLeuAsnAlaliePheThrAlalieThrArgAla245250255AlaLeuLeuThrAspGinAlaGluLeulielieThrLysArgArgThr260265270AsnValGluAsnlieAsnlielieSerAspLeuGluThrSerGlyAsp275280285PheValPheAsnGlyTyrGluLysValGlyPheAsnValLeuGlyAsp290295300lieValSerPheAlaThrAspAlaSerLysSerValAsnValGluThr305310315320ThrGlyThrlieThrAlaPheThrAlaAlaGlyThrGlyLysValAsp325330335ValValAlaGlyLyslieSerAlaLeuThrAlaAspSerArgThrSer340345350ValAsnLeuThrAlaThrAsnAspThrlieThrUuThrSerAlaAsn355360365AlaAlaThrSerValAsnLeuLysGinArgGinAlaLysAspAlaThr370375380lieThrSerWaMetGinGinLysTyrAsnAsnArgArgAsnArglie385390395400Ala丁hrlieThrSerAlaThrAlaValGluAsnLeuThrValLysHis405楊415AlaThrAsnValAlaLeuAsnGlyGlyMetAspLysLeuAlaThrVal420425430ThrLeuAspAsnAlaAlaLeuThrAlaAlalieAsplieLysSerAla435440445SerThrLeuAsnLeulieAsnSerSerValAsnGiyProLysHis450455460<210〉3<211>24<212>腿<213>artificalsequence〈400>3g犯ttcgc犯gtgagggtgatggt24<210>4<211〉25<212>DNA<2L3>artificalsequence<400>4aagtcgacaaccttagcagcagctc2權(quán)利要求1.重組胎兒彎桿菌(Campylobacterfetus)N端表面膜蛋白，其特征在于其氨基酸序列為SEQIDNO2所示。2、編碼權(quán)利要求1所述的重組胎兒彎桿菌N端表面膜蛋白的DNA,其特征在于其堿基序列為SEQIDNO:1所示。3、含有權(quán)利要求2所述DNA的表達(dá)載體。4、含有權(quán)利要求3所述表達(dá)載體的細(xì)胞系。5、一種制備權(quán)利要求1所述的重組胎兒彎桿菌N端表面膜蛋白的方法，包括(1)、從胎兒彎桿菌(Campylobacterfetus)菌抹中提取基因組DNA;(2)、以SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的堿基序列為引物，以步驟(1)所制備的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)、將步驟(2)所擴(kuò)增得到的基因片段連接于表達(dá)載體中，得到重組表達(dá)載體；(4)、將重組表達(dá)載體在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；收集、純化所表達(dá)的蛋白，即得。6、按照權(quán)利要求5的方法中，其特征在于步驟(3)中所述的表達(dá)載體選自pET22b、pET30a、pGEX-6p陽(yáng)l或pET32a(+)載體。7、按照權(quán)利要求6的方法中，其特征在于步驟(3)中所述的表達(dá)載體是pET32a(+)載體；所述的重組表達(dá)載體是pET32-sapA-N。8、按照權(quán)利要求5的方法中，其特征在于步驟(4)中所述的純化蛋白的方法為金屬鰲合層析的方法。9、權(quán)利要求1所述的重組胎兒彎桿菌N端表面膜蛋白在制備檢測(cè)牛胎兒彎桿菌病血清學(xué)試劑中的用途。'10、權(quán)利要求2所述的DNA在制備檢測(cè)牛胎兒彎桿菌病血清學(xué)試劑中的用途。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了胎兒彎桿菌N端表面膜重組蛋白及其編碼基因，本發(fā)明還公開(kāi)了該重組蛋白的制備方法及其在牛胎兒彎桿菌病血清學(xué)診斷中的應(yīng)用。本發(fā)明對(duì)位于胎兒彎桿菌表面蛋白N端1398bp的基因進(jìn)行了表達(dá)，所表達(dá)的可溶性蛋白(rSapA-N)經(jīng)過(guò)金屬鰲合層析的方法純化，得到約66KD大小的蛋白，經(jīng)過(guò)ELISA檢測(cè)和Westernblot分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有很好的免疫活性；將本發(fā)明表達(dá)的蛋白質(zhì)作為抗原，可用間接ELISA試驗(yàn)方法檢測(cè)胎兒彎桿菌病，檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明該抗原具有很高的特異性和敏感性，可用于胎兒彎桿菌病的血清學(xué)診斷。文檔編號(hào)C07K1/16GK101302250SQ20081011159公開(kāi)日2008年11月12日申請(qǐng)日期2008年6月10日優(yōu)先權(quán)日2008年6月10日發(fā)明者劉思國(guó),劉慧芳,薇司,王春來(lái),趙海玲申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所