專利名稱：一種豬鏈球菌2型表面細(xì)胞壁蛋白、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌蛋白，具體地說涉及一種豬鏈球菌的表面細(xì)胞壁蛋 白，還涉及該蛋白質(zhì)的制備方法以及用途。
背景技術(shù)：
豬鏈球菌(S^^tococcws^^),屬于蘭氏分類法的R群，有35個血清型， 以豬鏈球菌2型流行最廣，致病性最強(qiáng)。自丹麥在1968年最早報道人感染豬鏈 球菌病后，20世紀(jì)70年代以來，歐美部分國家和香港地區(qū)均報道過豬鏈球菌 病例，主要以腦膜炎為主，中毒性休克綜合征(TSS)少見，未見暴發(fā)流行。 我國于1998年和2005年兩次在江蘇和四川暴發(fā)人感染豬鏈球菌2型疫情，不同 于國外人感染病例以腦膜炎為主的特點，臨床表現(xiàn)為休克型和腦膜炎型。多 數(shù)病例死于中毒性休克綜合征(TSS)，病理改變主要表現(xiàn)為全身多器官受損， 敗血癥伴彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)。人豬鏈球菌病已成為嚴(yán)重威脅我國人民 健康的一種新的人畜共患病，如何有效地預(yù)防和控制豬鏈球菌感染已成為科 學(xué)家們面臨的重要研究難題。
由于對毒力因子和保護(hù)性抗原了解甚少，同一血清型的菌株在不同的地 區(qū)毒力也不盡相同，高致病性豬鏈球菌感染缺乏有效的診斷耙標(biāo)對該類病 原的分離鑒定主要依靠傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定，然后用豬鏈球菌高免血清進(jìn)行凝集試驗分型。但家畜廣泛攜帶鏈球菌，許多菌株毒力低，因此僅僅 靠生化反應(yīng)檢測豬鏈球菌是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，必須建立針對特異毒力因子的檢測 手段，以區(qū)分弱毒株和強(qiáng)毒株。以上情況都阻礙了有效的豬鏈球菌病疫苗的 研制及對感染的及時診斷與控制。
縱觀國外豬鏈球菌病疫苗的研制情況，主要經(jīng)歷了全菌免疫和抗原蛋白
免疫兩個階段。上世紀(jì)90年代，有研究者以福爾馬林滅活的豬鏈球菌進(jìn)行靜 脈注射能剌激被免疫豬產(chǎn)生調(diào)理化的抗體[HoltME， EnrightMR， Alexander TJ. (1990 ) Immunisation of pigs with killed cultures of 5if，tococcws type 2. feit^48:23-7]。也有研究者通過篩選無毒力的豬鏈球菌突變體，如溫度 敏感性突變體、鏈霉素依賴性突變體等來獲得具有保護(hù)性的全菌疫苗[Kebede M， Chengappa MM, Stuart JG. ( 1990 ) Isolation and characterization of temperature-sensitive mutants of浙取ococcws sw&: efficacy trial of the mutant vaccine in mice.版M/cra6fo/. 22:249-57. Foster N， Staats JJ， Chengappa MM.
(1994 ) Isolation, characterization and protection studies in mice of a streptomycin-dependent mutant of Sfre; tococcws細(xì)'s type 1/2. Cowi腦w. 18:155-63.]，但是滅活的全菌免疫常會引起免疫綜合征等副作用。后續(xù)有研究 者利用豬鏈球菌相關(guān)毒力因子溶菌酶釋放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)結(jié) 合油包水型乳劑(WO)和氫氧化鋁佐劑(AH)作為疫苗，對其保護(hù)性和毒副作用 作了評價，發(fā)現(xiàn)用MRP+EF/WO免疫的豬與用全菌/WO免疫的豬具有同等有 效的抗-MRP和抗-EF滴度，而且在免疫后的存活豬中，沒有觀察到明顯的 臨床表征[WisselinkHJ， VechtU， Stockhofe-Zurwieden N， Smith HE. (2001) Protection of pigs against challenge with virulent微》serotype 2 strains by a muramidase曙released protein and extracellular factor vaccine. Vet Rec.148:473-7.]。也有人用純化的溶血素(SLY)作為疫苗免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)能對小 鼠產(chǎn)生完全保護(hù)作用，免受毒力株的傷害[Jacobs AA， Loeffen PL， van den Berg AJ， Storm PK. (1994) Identification, purification, and characterization of a thiol-activated hemolysin (suilysin) of Sfreptococcws Infect Immun.
62:1742-8.]。但豬鏈球菌的毒力因子較常時間以來就呈現(xiàn)出時空上的相對多樣 性，雖然MRP、 EF與毒力高度相關(guān)，但與歐洲致病株不同的是多數(shù)加拿大 致病株不表達(dá)MRP和EF，且MRP和EF的2-型豬鏈球菌缺失突變體與野生 型一樣同樣具備毒力[Gottshalk M， Lebrun A， Wisselink HJ， Dubreuil JD， Smith HE, Vecht U. (1998) Production of virulence-related proteins by Canadian strains of 5^e/ tococcws sm's capsular type 2. Can J Vet Res 62:75-79.]。我國流行株禾口非 流行株都表達(dá)MRP，且動物實驗顯示流行株培養(yǎng)分泌的上清并不引起病變， 單靠現(xiàn)了解的MRP、 EF、 SLY等毒力因子不足以解釋我國2-型豬鏈球菌的致 病機(jī)理，使用MRP作為人免疫疫苗產(chǎn)生抗體中和MRP可能難以達(dá)到理想的 效果。而在國內(nèi)，豬鏈球菌疫苗的研制還處于起步狀態(tài)，即滅活的全菌疫苗[王 卓，舒秀偉,王文成.豬鏈球菌病二價滅活疫苗候選株培養(yǎng)條件的優(yōu)化及其安 全性試驗.(2004)中國藥獸雜志.38: 34-36.]。因此有必要根據(jù)我國實際情況， 研制適合我國的2-型豬鏈球菌的新型疫苗，發(fā)掘新的具有免疫原性的毒力因 子是尋找新型疫苗的重要途徑。
一般來說，表面暴露蛋白和細(xì)胞壁附著蛋白常被作為疫苗的候選耙標(biāo)和 血清學(xué)診斷試劑。近10年來，也有研究者試圖尋找有免疫原性的豬鏈球菌表 面細(xì)胞壁蛋白作為疫苗的候選分子，1996年Haataja S等分離并鑒定出一種半 乳糖抑制型黏附素，在23種血清型的豬鏈球菌中，用免疫印跡的方法均能檢 測到這種黏附素的存在，發(fā)現(xiàn)具有很強(qiáng)的免疫原性和調(diào)理功能，適合作為疫苗候選分子[HaatajaS, TikkanenK， HytonenJ， Finne J. (1996)The Gal alpha 1-4 Gal-binding adhesin of 5^ptococcus sm's， a gram-positive meningitis-associated bacterium. Adv Exp Med Biol. 408:25-34.] 。 2005年 Okwumabua O等人通過對2-型豬鏈球菌的全基因組進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)一種分子 量為38kDa蛋白，具有很好的免疫原性和保護(hù)性,認(rèn)為這種蛋白是較好的疫苗
候選分子并且適合用作診斷試劑的開發(fā)，這種蛋白的生物學(xué)功能以及與致病 機(jī)理的關(guān)系正在進(jìn)一步研究中[OkwumabuaO， Chinnapapakkagari S. (2005) Identification of the gene encoding a 38-kilodalton immunogenic and protective antigen of 5^/ tococc^ Clin Diagn Lab Immunol. 12:484-90]。
目前在獲得具有免疫原性的蛋白方面，還缺乏有力的手段，傳統(tǒng)生物學(xué) 方法鑒定免疫原性蛋白是困難的，需要構(gòu)建基因文庫，然后用相應(yīng)血清篩選， 該方法耗時較長，不能實現(xiàn)高通量篩選，并可能存在假陽性反應(yīng)。免疫蛋白 質(zhì)組是一種快速、高效篩選候選診斷靶標(biāo)的方法，通過將2D電泳分辨率高 和質(zhì)譜直接鑒定蛋白質(zhì)的優(yōu)勢結(jié)合，直接選取2D電泳膠上有免疫反應(yīng)的蛋 白點，以質(zhì)譜方法進(jìn)行鑒定，因此，借助免疫蛋白質(zhì)組學(xué)手段則完全可能在 較短時間內(nèi)快速高效的篩選并鑒定免疫原性蛋白，尤其對豬鏈球菌研究相對 較少的病原微生物來說，更有可能短時間內(nèi)鑒定多個全新的免疫原性蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種豬鏈球菌2型新型表面細(xì)胞壁蛋白、其制備方法及用 途。本發(fā)明所公開的豬鏈球菌2型表面細(xì)胞壁蛋白具有序列表中序列1所示 的氨基酸序列，編碼該表面細(xì)胞壁蛋白的基因具有序列表中序列2所示的核 苷酸序列。該蛋白命名為SSU98—0267，其genebank編號為gi| 146320114。編碼該蛋白的基因在豬鏈球菌2型強(qiáng)致病力菌株中廣泛存在。
該表面細(xì)胞壁蛋白是通過免疫蛋白質(zhì)組鑒定的2型豬鏈球菌新的免疫原 性抗原分子，目前根據(jù)豬鏈球菌基因組注釋的結(jié)果，僅有該基因開放閱讀框 架的預(yù)測，尚未有該蛋白在豬鏈球菌中表達(dá)的報道，也未有該基因功能的線 索。
本發(fā)明還公開了表達(dá)上述豬鏈球菌2型表面細(xì)胞壁蛋白的重組表達(dá)質(zhì) 粒，其含有序列表中序列2的核苷酸序列。上述表達(dá)質(zhì)?？梢詾榇竽c桿菌表 達(dá)質(zhì)粒，具體質(zhì)?？梢允莗ET32a等。
本發(fā)明還公開了含有上述表達(dá)豬鏈球菌2型表面細(xì)胞壁蛋白的重組表達(dá) 質(zhì)粒的菌株，該菌株為大腸桿菌，可以為BL21菌株。
本發(fā)明還公開了上述豬鏈球菌2型表面細(xì)胞壁蛋白的制備方法，該方法 包括如下步驟
首先克隆該表面細(xì)胞壁蛋白基因可通過PCR方法進(jìn)行，首先設(shè)計合成 引物，在引物兩端可添加酶切位點和保護(hù)性堿基，然后按照PCR方法，用豬 鏈球菌制備的模板，在一定條件下進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電 泳，并回收產(chǎn)物并進(jìn)行酶切，確定表面細(xì)胞壁蛋白基因。然后是表達(dá)該表面 細(xì)胞壁蛋白基因的重組質(zhì)粒制備將制備的表面細(xì)胞壁蛋白基因與大腸桿菌 表達(dá)載體相連接，表達(dá)載體可以為原核表達(dá)載體，可采用商業(yè)的原核表達(dá)載 體，如大腸桿菌表達(dá)載體pET32a，制備表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，制備重 組菌，利用菌落PCR和限制性內(nèi)切酶進(jìn)行重組菌的篩選和鑒定；對重組菌進(jìn) 行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；超聲波破碎重組菌，收集上清，以GE鎳親和層析柱進(jìn)行 純化。
本發(fā)明還公開了上述表面細(xì)胞壁蛋白的用途。該蛋白可用作診斷靶標(biāo)，在豬鏈球菌感染的動物和人血清中針對該蛋白的抗體明顯上升，因而可用于 開發(fā)豬鏈球菌感染的診斷試劑，同時又是重要的保護(hù)性抗原，可用于制備疫
苗。本發(fā)明還公開了表面細(xì)胞壁蛋白在制備豬鏈球菌2型疫苗中的應(yīng)用。該 蛋白制備的免疫血清調(diào)理的全血殺傷實驗發(fā)現(xiàn)該蛋白具有相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)性，可 作為重點疫苗候選和診斷分子。
本發(fā)明首先將該表面細(xì)胞壁蛋白鑒定為豬鏈球菌2型新的免疫原性抗原 分子。己通過基因工程方法制備了該抗原并制備了相應(yīng)抗體。通過抗體調(diào)理
的全血殺菌試驗證實該蛋白制備的免疫血清可顯著提高人全血的殺菌作用， 與豬鏈球菌全菌免疫血清的調(diào)理殺菌作用相當(dāng)，是新的高效保護(hù)性抗原，可 作為重點疫苗候選分子。


圖1為重組質(zhì)粒酶切圖譜。其中1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL15000， 2為重 組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和Xhol酶雙酶切。
圖2為重組質(zhì)粒表達(dá)圖譜，其中l(wèi)-5為誘導(dǎo)后，6為誘導(dǎo)前，7為低分子 量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，從上至下依次為97.4 kDa， 66.2 kDa， 43.0 kDa， 31.0kDa， 20.0kDa。
圖3針對SSU98—0267特異抗體的比較。病人和健康人的抗體水平比較 (A)，豬感染前后的抗體水平比較(B)。 ELISA實驗用于評價針對SSU98—0267 特異的抗體反應(yīng)，硫氧還蛋白(Trx)用作陰性對照。
具體實施例方式
實施例一 豬鏈球菌2型表面細(xì)胞壁 蛋白SSU98一0267的表達(dá)純化及抗體制備1材料和方法 1.1菌株和質(zhì)粒
豬鏈球菌2型98HAH12株[Chen C， Tang J， Dong W， Wang C， Feng Y， et al (2007) A Glimpse of Streptococcal Toxic Shock Syndrome from Comparative Genomics of S.suis 2 Chinese Isolates. PLoS ONE 2(3): e315]; BL21 ，均為國際 標(biāo)準(zhǔn)株；表達(dá)載體pET32a(+)為Novagen公司產(chǎn)品。 1.2酶和試劑
EcoRI和XhoI等限制性內(nèi)切酶以及Taq酶、dNTPs 、 DL15000^ 量標(biāo)準(zhǔn)等 PCR所用試劑均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；DNA回收試劑盒為天 為公司產(chǎn)品；鎳親和層析柱為GE公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取盒為V-gene公司產(chǎn)品； 弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑為Sigma公司產(chǎn)品；Amp為中諾藥業(yè)產(chǎn)品。
1.3 PCR引物設(shè)計及SSU98J)267核酸序列，蛋白序列
根據(jù)所要擴(kuò)增的片段,設(shè)計一對引物,引物兩端分別添加EcoRI和XhoI酶切 位點和保護(hù)性堿基，引物P1和P2可擴(kuò)增豬鏈球菌2型SSU98—0267基因開放 閱讀框(ORF)全長片斷。引物序列分別為
上游弓I物P1: 5'國tagaattcagcaagcag咖gttgtgtc誦3，見序歹據(jù)中序歹lj3; 下游引物P2: 5，-gcctcgagttcttcttttttgtttttgaatag -3，見序列表中序列4。 核酸序列> SSU98—0267 見序列表中序列2。 蛋白序列>SSU98_0267 見序列表中序列l(wèi)。
1.4 PCR擴(kuò)增
按下列順序和條件依次加入各反應(yīng)物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。豬鏈球菌2型模 板DNA 2pL， lOXbuffer 5|tiL,2.5 mmol/L dNTPs 3 P L，引物P1和P2 ( 5 y mol/L ) 各l[iL, ddH20 37pL， LA-7b《酶(5U/uL) lpL。擴(kuò)增的條件為；94 °C 7min;94°C lmin， 55°C lmin， 72°C 2min， 30個循環(huán);72 °C 7min。 1.5PCR產(chǎn)物的回收和酶切
PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳，后以DNA回收試劑盒回收目的片段， 并以EcoRI和XhoI 37"C酶切3h。 1.6重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定
在含有100ug/mLAmp的LB肉湯中接種攜帶pET32a空質(zhì)粒的DH5 a 大腸桿菌單菌落，37T:搖振培養(yǎng)12 16h后，P/。轉(zhuǎn)接入100ug/mLAmp的 新鮮LB肉湯37匸搖振培養(yǎng)6h,以質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒。EcoRI和XhoI雙 酶切后，以DNA回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。將PCR雙酶切回收產(chǎn)物與空質(zhì) 粒雙酶切回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5ci宿主菌。感受態(tài)細(xì)菌的 制備、轉(zhuǎn)化均按常規(guī)方法進(jìn)行，禾'」用菌落PCR和限制性內(nèi)切酶酶切進(jìn)行重組 菌的篩選和鑒定。 1.7重組質(zhì)粒的測序和序列分析
重組質(zhì)粒的序列測定采用Sanger雙脫氧末端終止法，由北京三博遠(yuǎn)志生 物技術(shù)有限公司完成，以驗證其閱讀框架，并以BLAST軟件進(jìn)行同源性分析。 1.8重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)和純化
將重組質(zhì)粒按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌BL21 ，利用Amp抗性篩選 重組菌，挑單菌落接種LB肉湯中(含100ug/mLAmp)， 3(TC劇烈搖振培養(yǎng)2 4h，當(dāng)菌液濃度OD6oo達(dá)0.5 0.6時，加IPTG至終濃度lmmol/L， 3(TC繼續(xù) 劇烈搖振培養(yǎng)2 4h。 6000r/min離心10min ，沉淀以蒸餾水重懸，加等體積 的2X電泳上樣緩沖液煮沸10min， SDS-PAGE檢測。含空pET32a(+)的大腸桿 菌BL21亦同樣經(jīng)IPTG誘導(dǎo)處理后，SDS-PAGE檢測表達(dá)情況。以超聲波破碎 誘導(dǎo)的重組菌，收集上清，以GE鎳親和層析柱進(jìn)行親和層析，具體步驟按使用說明書進(jìn)行。
1.9重組蛋白動物免疫試驗
將收集的蛋白以PH7.2 10mmol/L的PBS稀釋至0.1mg/ml，加入等量的弗氏 完全佐劑，皮下免疫Wistar大鼠(購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗動物中心)，0.5m1/ 只；以后3 — 5周，分別以0.2， 0.4， 0.8， 1.6mg/ml加弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫， 第7周斷尾取血ELISA法測抗體效價。同時設(shè)立全菌免疫對照組和空白對照組 (pET32a空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21，誘導(dǎo)表達(dá)Trx蛋白，以此蛋白免疫大鼠為空白對 照)。以硫酸銨沉淀法制備抗血清。 2.結(jié)果
2.1PCR結(jié)果PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，出現(xiàn)一條2298bp的條帶，大小與預(yù)期一 致。
2.2重組質(zhì)粒的鑒定
SSU98—0267基因片段經(jīng)回收，以EcoR I和Xho I酶切位點定向克隆至 pET-32a中，獲得重組質(zhì)粒，命名為SSU98—0267-pET-32a。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受 態(tài)的DH5a宿主菌，經(jīng)Amp抗性篩選得到重組菌。提取重組質(zhì)粒，經(jīng)EcoR I 和XhoI雙酶切，可切出約3000bp左右的片斷，說明SSU98一0267片段已成功 克隆，見圖l。 2.3重組質(zhì)粒的表達(dá)
重組BL21轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，菌體SDS-PAGE顯示有一條100kD的蛋 白帶，而含誘導(dǎo)前的菌在該處無特異條帶，見圖2。經(jīng)鎳柱純化獲得純化的 SSU98J)267蛋白。 2.4測序結(jié)果和序列分析
克隆的序列長度經(jīng)測序為2298bp，如序列表中序列2所示，翻譯后為765個氨基酸殘基，見序列表中序列l(wèi)。
實施例二豬鏈球菌2型表面細(xì)胞壁蛋白 SSU98一0267的免疫原性及抗體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬試驗 1.1重組豬鏈球菌2型表面細(xì)胞壁蛋白SSU98一0267和多抗的制備見實施例
1.2 SSU98一0267抗體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬
血平板刮取豬鏈球菌2型單菌落，接入THB培養(yǎng)基，37°C， C02孵箱培養(yǎng) 8h后轉(zhuǎn)接新鮮THB培養(yǎng)基培養(yǎng)8h至對數(shù)生長期。取lml菌液(約l X 108CFU/ml) 13，000rpm， lmin集菌，PBS洗菌并重懸，調(diào)整至l(^CFU/ml，涂血平板，記 為初始菌量。取50pl (^106CFU/ml)菌液加入10(Hd抗體，37。Cl5min后冰上 15min;加入350pl健康人全血37。C ， 3h;加入551 % saponin,冰上20min; 反復(fù)吹打后稀釋涂血平板，16h后血平板記數(shù)單克隆。 1.3感染豬與人中SSU98—0267蛋白特異抗體測定
采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定病人和感染動物中針對該蛋白的 特異抗體，采用健康人的血清和感染前的動物血清作為對照。采用5pg/ml的 重組蛋白包被酶聯(lián)板，包被緩沖液為0.05 M NaHC03 (PH 9.6) ， 4。C包被過 夜，然后采用3% BSA 37 °C封閉3 h。病人和健康人血清樣品1:500稀釋， 感染前后豬血清均1:200稀釋，反應(yīng)信號通過辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記 的二抗進(jìn)行檢測。 2.結(jié)果
2.1重組蛋白抗體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用
經(jīng)GE鎳親和層析柱層析獲得純化的重組蛋白SSU98J)267，分別加弗氏完全和不完全佐劑免疫后，制備抗血清，進(jìn)行間接殺菌試驗。殺菌率計算
(CFUrTrx—CFUr98—0267) /CFUrTrx。 Trx為從含pET32a (+)空載體的大腸桿 菌BL21鎳柱純化的硫氧還蛋白。
抗體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬試驗分別用SSU98J)267重組蛋白；MRP重組蛋白 免疫大鼠后的大鼠血清調(diào)理健康人血，進(jìn)行人全血對豬鏈球菌2型活菌的殺傷 試驗。SSU98—0267重組蛋白的抗血清調(diào)理人全血對豬鏈球菌2型的殺傷率為 50%左右，但略低于MRP蛋白的抗血清，同樣條件下MRP蛋白的抗血清調(diào)理 人全血對豬鏈球菌2型的殺傷率為90%左右。 2.2感染的人和豬血清中SSU98—0267特異抗體檢測
我們檢測了 6名豬鏈球菌2型感染的病人和5名健康人血清中 SSU98—0267特異抗體的存在狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康人相比，病人SSU98—0267 特異抗體水平明顯升高，見圖3A。我們檢測了豬鏈球菌2型感染豬前后血清 中SSU98—0267特異抗體的存在狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與感染前相比，感染后血清 中SSU98—0267特異抗體水平顯著升高，見圖3B。上述實驗結(jié)果表明 SSU98 0267可作為診斷耙標(biāo)用于豬鏈球菌2型感染的血清學(xué)診斷。<110〉
<120〉
<130>
<160〉
<170〉
<210〉 <211> <212〉 <213〉
<400〉
豬鏈表面細(xì)胞壁蛋白0267. SEQ 序歹U 表
中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所 一種豬鏈球菌2型表面細(xì)胞壁蛋白、其制備方法及用途
4
Patentln version 3.2 1
765 PRT
1
Met Ser Lys Gin Lys Val Val Ser Ser Leu Leu Leu Ser Thr Val Val
1 5
10
15
Leu Gly Gly Leu Ala Phe Tyr Ser Thr Thr Thr Val Lys Ala Glu Ser 20 25 30
Leu Glu Pro Asp Val Thr Ser Val Asn Ala Ser Asp Ala Thr Asn Lys
35 40
45
Pro Val Val Pro Asn Glu Glu Gly Gly Asp Phe Leu Ala Glu Glu Glu
50 55
60
Leu Glu Asp Asp Asp Thr Leu Glu Glu Glu Leu Asn Glu Lys Ala Glu 65 70 75 80
Glu Val Thr Glu Pro Ser Ser Pro Glu Ala Leu Leu Gin Pro Arg Ala 85 90 95
Met Met Ser Asp Ser Glu Thr Ser Gly Met Glu Glu lie Pro Met Asn 100 105 110
Asp Glu Pro Ser Asp Asn Thr Glu Glu Lys Val Glu Lys Gin Gin Ser
115 120
125
Pro Leu lie Gin Thr Ser Asn Ala Asp Tyr Lys Ser Gly Lys Asp Gin
130 135
140
Glu Lys Leu Arg Thr Ser Val Ser lie Asn Leu Leu Lys Ala Glu Glu
145 150
155
160
Gly Gin lie Gin Trp Lys Val Thr Phe Asp Thr Ser Glu Trp Ser Phe 165 170 175
Asn Val Lys His Gly Gly Val Tyr Phe lie Leu Pro Asn Gly Leu Asp 180 185 190
Leu Thr Lys lie Val Asp Asn Asn Gin His Asp lie Thr Ala Ser Phe195
200
豬鏈表面細(xì)胞壁蛋白0267. SEQ 205
Pro Thr Asp lie Asn Asp Tyr Arg Asn Ser Gly Gin Glu Lys Tyr Arg 210 215 220
Phe Phe Ser Ser Lys Gin Gly Leu Asp Asn Glu Asn Gly Phe Asn Ser
225
230 235
240
Gin Trp Asn Trp Ser Ala Gly Gin Ala Asn Pro Ser Glu Thr Val Asn
245 250
255
Ser Trp Lys Ser Gly Asn Arg Leu Ser Lys lie Tyr Phe lie Asn Gin
260 265
270
lie Thr Asp Thr Thr Glu Leu Thr Tyr Thr Leu Thr Ala Lys Val Thr 275 280 285
Glu Pro Asn Gin Gin Ser Phe Pro Leu Leu Ala Val Met Lys Ser Phe 290 295 300
Thr Tyr Thr Asn Ser Lys Ser Thr Glu Val Thr Ser Leu Gly Ala Arg
305
310 315
320
Glu lie Thr Leu Glu Lys Glu Lys Thr Leu Pro Pro Lys Glu Asn Pro
325 330
335
Lys Pro Glu Pro Glu Ala Pro Lys Pro Asp Ala Pro Gin Ala Pro Ser
340 345
350
Ala Pro Glu Ser Pro Thr Glu Glu Pro Lys Lys Glu Asp Ala Pro Gin 355 360 365
Thr Pro Gin Ala Pro Ser Thr Pro Glu Lys Gin Pro Glu Val Pro Glu 370 375 380
Ser Pro Asn Pro Glu Thr Pro Asp Ala Pro Ser Thr Pro Lys Asp Glu 385 390 395 400
Pro Gin Ala Pro Ser lie Pro Glu Glu Lys Pro Gin Val Pro Glu Glu
405 410
415
Pro Lys Gin Glu Ala Pro Ser Ala Pro Ser Thr Pro Glu Lys Gin Pro
420 425
430
Glu Ala Pro Glu Ser Pro Thr Glu Glu Pro Lys Lys Glu Asp Ala Pro 435 440 445
Ala Pro Ser Thr Pro Glu Lys Gin Pro Glu Val Pro Glu Ser Pro Asn 450 455 460
Pro Glu Thr Pro Asp Ala Pro Ser Thr Pro Lys Asp Glu Pro Gin Val豬鏈表面細(xì)胞壁蛋白0267. SEQ 465 470 475 480
Pro Ser lie Pro Glu Glu Gin Pro Lys Glu Thr Pro Ala Pro Glu Glu 485 490 495
Pro Lys Lys Glu Asp Thr Pro Gin Thr Pro Gin Ala Pro Ser Thr Pro 500 505 510
Lys Glu Glu Ala Pro Lys Glu Glu Val Pro Thr Pro Pro Ala Pro Ser 515 520 525
Val Pro Glu Glu Gin Pro Lys Glu Thr Pro Thr Pro Glu Val Pro Lys 530 535 540
Gin Glu Asp Val Gin Pro Glu Ala Pro Lys Ser Asp Lys Val Glu Ser 545 550 555 560
Asp Lys Gin Met Pro Glu Thr Lys Lys Pro Asp Met Lys Gin Pro Lys 565 570 575
Ala Asp Asp Met Pro Lys Glu Gin Lys Pro Lys Ala Asp Glu Pro Lys 580 585 590
Ala Glu Gin Pro Gin Met Asp Lys Pro Gin Met Glu Ala Pro Lys Lys 595 600 605
Asp Ser Glu Ala Pro Lys Ser Asp Lys Val Glu Thr Asp Lys Gin Leu 610 615 620
Pro Glu Thr Lys Gin Pro Asp Met Lys Gin Pro Lys Ala Asp Asp Met 625 630 635 640
Pro Lys Glu Gin Lys Pro Lys Ala Asp Glu Pro Lys Ala Glu Gin Pro 645 650 655
Gin Met Asp Lys Pro Gin Met Glu Ala Pro Lys Lys Asp Ser Glu Ala 660 665 670
Pro Lys Ser Asp Lys Val Glu Thr Asp Lys Pro Met Pro Glu Thr Lys 675 680 685
Gin Pro Asp Met Lys Gin Pro Lys Ala Asp Lys Pro Glu Ala Glu Lys 690 695 700
Ala Gin Met Pro Arg Thr Glu Gly Met Lys Pro Glu Ser Lys Ala Ser 705 710 715 720
Met Met Pro Lys Ala Glu Ala Pro Lys Ala Thr Leu Pro Asn Thr Gly 725 730 735
Glu Ala Ser Ser Ala lie Gly Trp Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Leu豬鏈表面細(xì)胞壁蛋白0267. SEQ 740 745 750
Ala Thr Gly Leu Tyr Leu Phe Lys Asn Lys Lys Glu Glu 755 760 765
<210> 2
<211> 2298
<212〉 腿 <213>
<400> 2
atgagcaagc3g犯agttgtgtccagtttattattaagcacagtcgtatt3ggggg3tta60
gccttttattc犯cg3caacggttaaagcagaatcgctagaaccagatgttacatcagtt120
aatgcaagcgatgctactaagtaccaaatg犯g鄉(xiāng)g鄉(xiāng)cgacttttta180
gctgaagagg3gCttg犯g3tgatgacactttggaagaagaattaaatgagaaagccgaa240
gaggttactgagccatcttcacctgaagcacttctccaacctcgtgcgatgatgagtgat300
tctgaaactagtggtatggaaga犯ttccgaaccttcagataatacggaa360
g,aggtagagaagcaacagtcgccattaattcaaacctcaaatgcagattat幼aagt420
ggtaaagatca^gaigaaacttaggacatcagtatctataaatctgttgaaggcggaagaa■
ggtcagattcagtggaaagtaacttttgatacaagcgaatggtcttttaatgttaaacat540
gggggtgtttattttattcttccaaatggtttggacttaacaaagattgttgataataat600
caacatgatataacagcctccttccctacggatattaatgattacagaaattctggtcaa660
gtttctttagtagtaaacaaggtcttgacaacgaaaatggttttaattct720
caatggaactggtctgctggtcaagctaatcctagtgaaacagtaaacagttggaaatca780
ggcaatcgtttgtctaagatttatttcataaat c aaat aacagatactaccgaattgacc840
tatactttaactgctaaggtaactgaaccaaatcagcaatcattccctcttctggcagtg900
atgaagagctttacgtatacaaactctaagagtacagaggttacttcgctaggtgcacgt960
gagattacccttgagaaagaaaaaac t c t accacctaaggag犯tccaaaaccagagcca1020
gaagctccaaaaccagacgctccacaagcgccatcagcaccggaatctccaacggaagaa1080
cctaagaaggaagacgctcccaagcgcca/tcgactccggaaaaac aac c a1140
gaagtaccggaatcaccaaacccagagacaccagacgcgccatcgactccaaaagatgaa1200
ccgcaggctccatcaattccccacaagtaccggaagagccaaaacaagag1260
gctccatcagctccgtcaactccggaaaaacaaccagaagcaccggaatctccaacggaa1320
gaacctaagaaggaagacgctccagcgccatcgactccggaaaaac aac cagaagtaccg1380
g犯tcaccaaacccagagacaccagacgcgccatcgactccaaaagatgagccgcaagtt1440
ccatcaatccc卿ggagcaaccaaaagagactccagcgccagaagaacctaagaaggaa1500
gatactccgcaaacaccacaagcgccatcaactcctaaagaggaagcaccgaaggaagaa1560
gttccaacaccaccggctccatcagtaccagaagagcaactcca3cacc31620
gaagttcca_￡iaacaagaagatgttcaaccggaagcgccaaaatctgataaetgtagaatct1680豬鏈表面細(xì)胞壁蛋白0267.SEQ
tgccagaaactaagaaaccagatatgaagc aaccgaaggc agacgacatg1740
cctaaggaacaaaagccgaaagccgacgagccaaaggcEig agcaaccaca aatggacaaa1800
ccacaaatggaagctcctaagaaagattcggaagcgccaa aatctgataa agtagaaact1860
gacaagcaattgccagaaactaagcaaccagatatgaagc aaccgaaggc agacgacatg1920
cctaaggaac3gCCg3Cg3gcc朋aggc3g agcaaccaca aatggax:3aai1980
ccacaaatggaagctcctaagaaagattcggaagcELccaLa aatctgataa agtagaaact2040
tgccagaiaacgatatgaagc aaccgaaggc agataaacca2100
gaagcagagaaagctcaaatgccacggacagagggtatga agcctgaatc taaggcttca2160
atgatgccaaaagcagaggca_ccaaaagcaactttgccaa atacaggcga agcaagtagc2220
gcaataggctggctaggtggtgctttagccactcttgcca caggcttgta tctattcaaa2280
犯gaatag2298
<210〉 3 <211〉 28 <212〉 DNA <213>
<400> 3 tagaattcagcaagcagaaagttgtgtc28
<210〉 4 <211> 32 <212> 腿 <213>
<400> 4 gcctcgagttcttcttttttgtttttgaat3權(quán)利要求
1.一種豬鏈球菌2型表面細(xì)胞壁蛋白，其特征在于具有序列表中序列1的氨基酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的表面細(xì)胞壁蛋白，其編碼基因具有序列表中序列2 的核苷酸序列。
3. —種表達(dá)豬鏈球菌2型表面細(xì)胞壁蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于 含有序列表中序列2的核苷酸序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)質(zhì)粒，其中表達(dá)質(zhì)粒為大腸桿菌表達(dá) 質(zhì)粒pET32a。
5. —種表達(dá)豬鏈球菌2型表面細(xì)胞壁蛋白的菌株，其特征在于含有權(quán)利 要求3所述重組表達(dá)質(zhì)粒。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述菌株，其中表達(dá)菌株為大腸桿菌BL21。
7. 權(quán)利要求1或2所述表面細(xì)胞壁蛋白的制備方法，包括如下步驟-(1) 克隆該表面細(xì)胞壁蛋白基因；(2) 將基因與大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；(3) 誘導(dǎo)表達(dá)；(4) 對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其中大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒為pET32a，大腸桿 菌為￡. co//BL21。
9. 權(quán)利要求1或2所述的表面細(xì)胞壁蛋白在制備豬鏈球菌2型感染診斷 試劑中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求1或2所述的表面細(xì)胞壁蛋白在制備豬鏈球菌2型疫苗中的 應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬鏈球菌2型表面細(xì)胞壁蛋白，其genebank編號為gi|146320114，還公開了該蛋白質(zhì)的制備方法及用途。該蛋白質(zhì)可用作診斷靶標(biāo)，在豬鏈球菌感染的病人可檢測到該蛋白特異的抗體。同時又是重要的保護(hù)性抗原，可用于制備疫苗。
文檔編號C07K14/195GK101613400SQ20081011551
公開日2009年12月30日 申請日期2008年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月25日
發(fā)明者姜永強(qiáng), 煒 張, 李文君, 耿紅冉, 媛 袁, 鄭玉玲 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所