專利名稱：：抗人顆粒酶m的單克隆抗體和雜交瘤細(xì)胞株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及單克隆抗體領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及抗人顆粒酶M的單克隆抗體M0428，它是由小鼠雜交瘤細(xì)胞株M0428產(chǎn)生的。
背景技術(shù)：
：顆粒酶(Gzm)調(diào)節(jié)的靶細(xì)胞殺傷是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)殺傷病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的主要效應(yīng)途徑。在人當(dāng)中存在5種顆粒酶，分別是顆粒酶A、B、K、H和M。盡管顆粒酶A和B誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡途徑已經(jīng)基本闡明，然而其它孤兒顆粒酶(K、H和M)在CTL調(diào)節(jié)的靶細(xì)胞殺傷中的作用遠(yuǎn)未闡明。人GzmM基因位于染色體19pl3.3，約1.6kb，包含5個外顯子和4個內(nèi)含子。GzmM與一組嗜中性彈性蛋白酶共定位于19號染色體上，與AZU1-PRTN3-ELA2基因簇相隔320kb(Birdetal.,2005，詳見后附參考文獻(xiàn)列表)。人GzmM為含有232個氨基酸殘基的蛋白酶，非糖基化分子量預(yù)計(jì)為27kDa。預(yù)測GzmM有3N糖基化位點(diǎn)，分別為46NGSH、177NNSR、183NGSL，糖基化后的分子量約為32kDa。人與大鼠的Met-ase66%氨基酸同源，其三聯(lián)催化位點(diǎn)、8個Cys殘基和一些形成底物結(jié)合口袋的氨基酸都是保守的(Smythetal.，1993)，而GzmM與其他Gzm氨基酸同源性不到40%(Sattaretal.，2003)。GzmM的6個Cys與其他顆粒酶一樣形成3對二硫鍵，另外2個則沒有形成二硫鍵。盡管GzmB、GzmA和GzmM的晶體結(jié)構(gòu)己經(jīng)解析(Hink-Schauereta.，2003)，GzmM的結(jié)構(gòu)尚未見報道。與其他四種Gzm不同，人GzmM在活化的CTL細(xì)胞中沒有表達(dá)。與GzmA和PFP—樣，它組成型高表達(dá)于自然殺傷細(xì)胞(NK)和外周大淋巴細(xì)胞(LGL)，在CD3+CD56+T細(xì)胞和Y5T細(xì)胞中有少量表達(dá)，而GzmB在新分離的NK中幾乎檢測不到(Hink-Schaueretal.,2002)。GzmM獨(dú)特的酶活性、基因定位及特定的表達(dá)譜提示它有不同的殺傷作用，可能在先天免疫中發(fā)揮重要作用。KHYG，一種強(qiáng)細(xì)胞毒性的NK細(xì)胞系，可能通PFP/GzmM途徑引起腫瘤細(xì)胞凋亡(Sucketal.,2005)。到目前為止，GzmM介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)理尚不清楚。Symth等對GzmM在細(xì)胞凋亡中的作用進(jìn)行了初步研究(Kellyetal.，1996)，發(fā)現(xiàn)在穿孔素的協(xié)助下，GzmM很快破壞細(xì)胞膜的完整性并引起DNA的破壞，此過程早于GzmB介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)GzmM能夠引起染色體濃縮，細(xì)胞核萎縮變小，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，胞質(zhì)電子密度增加并有大液泡出現(xiàn)。GzmM切ICAD釋放CAD的活性，并切割DNA修復(fù)酶PARP加速了核的破壞。GzmM引起的細(xì)胞凋亡激活了caspase3，產(chǎn)生17kDa的酶活形式(Luetal.，2006)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，GzmM能夠有效的水解GzmM的抑制劑P19(proteaseinhibitor9)。而某些腫瘤細(xì)胞通過高表達(dá)PI9抑制GzmB的活性，從而逃避CTL對其殺傷作用(Mahrusetal.,2004)。這提示，GzmM能夠抑制PI9,使得CTL細(xì)胞通過GzmB途徑殺傷腫瘤細(xì)胞。參與細(xì)胞毒性抑制作用的絲氨酸蛋白酶抑制齊USPI-CI(serineproteaseinhibitorinvolvedincytotoxicityinhibition)能夠不可逆的與純化的GzmM結(jié)合，并且能保護(hù)細(xì)胞免受穿孔素/GzmM介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。顆粒酶M單抗的潛在用途包括1.檢測組織和細(xì)胞或其裂解液中顆粒酶M的含量，可用于腫瘤和自身免疫性疾病的臨床監(jiān)測；2.偶聯(lián)靶向分子，可用于導(dǎo)向藥物的開發(fā)。例如，可以將待導(dǎo)向的藥物與顆粒酶M單抗綴合，而顆粒酶M單抗能夠特異識別顆粒酶M，從而將藥物導(dǎo)向顆粒酶M相關(guān)的細(xì)胞(如表達(dá)顆粒酶M的細(xì)胞)，從而發(fā)揮作用。然而，到目前為止，由于GzmM的研究較新，其晶體結(jié)構(gòu)尚未解析，致使一直未有獲得人顆粒酶M的單抗的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供抗人顆粒酶M的單克隆抗體，更具體地一種抗人顆粒酶M的單克隆抗體M0428。本發(fā)明提供了一種抗人顆粒酶M的單克隆抗體M0428，其特征在于，它是由小鼠雜交瘤細(xì)胞株M0428產(chǎn)生的。以重組人顆粒酶M免疫Balb/C小鼠，應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備的一株能穩(wěn)定分泌特異性抗人顆粒酶單克隆抗體的細(xì)胞株M0428。M0428單抗與重組人顆粒酶M及表達(dá)人天然顆粒酶M的細(xì)胞呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，而與其它不表達(dá)顆粒酶M的細(xì)胞無交叉反應(yīng)。本發(fā)明提供抗人顆粒酶M的單克隆抗體。更具體地，本發(fā)明提供以下各項(xiàng)1)一種抗人顆粒酶M的單克隆抗體M0428，它由小鼠雜交瘤細(xì)胞株M0428(CGMCCNo.2580)產(chǎn)生。2)—種產(chǎn)生抗人顆粒酶M單克隆抗體M0428的雜交瘤細(xì)胞，其特征在于，它是保藏號為CGMCCNo.2580的小鼠雜交瘤細(xì)胞株M0428。3)以上1)所述的單克隆抗體M0428在制備免疫抑制劑中的應(yīng)用。所述免疫抑制劑可以含有其它輔劑或佐劑，其制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的技術(shù)。4)以上l)所述的單克隆抗體M0428在制備導(dǎo)向藥物中的應(yīng)用。5)用于檢測顆粒酶M的含量的試劑盒，其包含以上1)所述的單克隆抗體M0428。試劑盒的制備可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法來進(jìn)行。6)根據(jù)以上5)的試劑盒，其中所述顆粒酶M的含量可用于腫瘤或自身免疫性疾病的臨床監(jiān)測。7)根據(jù)以上5)或6)的試劑盒，其中所述試劑盒用于檢測NK細(xì)胞、PBMC或外周大淋巴細(xì)胞的顆粒酶M的含量。8)—種檢測細(xì)胞的顆粒酶M的含量的方法，該方法包括(1)將以上1)所述的單克隆抗體M0428與待檢測的分離的細(xì)胞或該細(xì)胞的裂解液進(jìn)行接觸；和(2)判斷是否有陽性反應(yīng)。在一個實(shí)施方案中，所述分離的細(xì)胞是從人體分離的。細(xì)胞裂解液的制備可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法來進(jìn)行。9)根據(jù)以上8)的方法，其中所述陽性反應(yīng)是通過免疫熒光檢測進(jìn)行判斷的。免疫熒光檢測可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法來進(jìn)行。圖1表示M0428單抗，按常規(guī)方法對重組人顆粒酶M(泳道1)、NK92細(xì)胞裂解液(泳道2)、PBMC裂解液(泳道3)、K562細(xì)胞裂解液(泳道4)進(jìn)行Westernblot。具體實(shí)施例方式CTL細(xì)胞和NK細(xì)胞在抗病毒及細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌感染、器官移植排斥和抗腫瘤應(yīng)答中具有重要意義。Gzm是絲氨酸蛋白酶家族的成員，存在于活化的CTL和NK細(xì)胞中，是其發(fā)揮細(xì)胞毒作用的主要效應(yīng)分子。NK和CTL細(xì)胞通過直接釋放細(xì)胞毒性顆粒殺傷耙細(xì)胞的機(jī)理已成為近年來分子免疫學(xué)及腫瘤生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。大量的實(shí)驗(yàn)小組GzmA和GzmB進(jìn)行了廣泛而深入的研究，但是GzmA基因敲除小鼠、GzmB基因敲除小鼠以及GzmA和GzmB基因雙敲除的小鼠盡管存在某些免疫缺陷，這三類小鼠的CTL仍然能夠裂解耙細(xì)胞。這提示我們其它孤兒Gzm在CTL及NK細(xì)胞的殺傷過程中也發(fā)揮重要作用。GzmM引起一種不同于GzmA及GzmB的新的細(xì)胞死亡；GzmM誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡不依賴caspase的活化及線粒體的破壞；PI染色DNA含量GzmM不引起DNA片段化(Kellyetal.，1996)。Caspae廣譜抑制劑Z-VAD(100pm)等的研究顯示高濃度的Z-VAD(200nm)也不能抑制GzmM誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡；GzmM誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡不激活caspase，也不引起磷脂酰絲氨酸跨膜外翻。Caspse是多種GzmB的作用下裂解為兩個亞單位并形成有活性的異四聚體形式(Adrainetal.,2005)。盡管多種caspase均為GzmB的底物，在GzmB/PFP處理的細(xì)胞中，caspase3和7很快被切割(Yangetal.，1998)。盡管我們用的轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑Gzm與GzmM的濃度不同，但GzmM(l|im)/PJ與GzmM(83nM)/PFP誘導(dǎo)了相似的細(xì)胞凋亡率。本發(fā)明包括一種特異性的抗人顆粒酶M單克隆抗體M0428，它是由小鼠雜交瘤細(xì)胞株M0428產(chǎn)生的。以重組人顆粒酶M免疫Balb/C小鼠，應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備的一株能穩(wěn)定分泌特異性抗人顆粒酶單克隆抗體的細(xì)胞株M0428。本發(fā)明中的一種陽性雜交瘤細(xì)胞為抗人顆粒酶M單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株M0428，該雜交瘤細(xì)胞株于2008年7月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國，北京)，保藏號為CGMCCNo.2580。本發(fā)明中的抗人顆粒酶M單克隆抗體M0428的實(shí)驗(yàn)表明，M0428單抗與重組人顆粒酶M及表達(dá)人天然顆粒酶M的細(xì)胞呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，而與其它不表達(dá)顆粒酶M的細(xì)胞無交叉反應(yīng)。本發(fā)明中的抗人顆粒酶M單克隆抗體M0428具有以下的特點(diǎn)和性能(1)與重組人顆粒酶M呈強(qiáng)陽性反應(yīng)；(2)與人NK腫瘤細(xì)胞系NK92呈強(qiáng)陽性反應(yīng)；(3)與人外周血單核細(xì)胞PBMC呈強(qiáng)陽性反應(yīng)；(4)與人白血病細(xì)胞K562呈陰性反應(yīng)。實(shí)施例lM0428單抗的制備和純化(1)雜交瘤的制備以重組人顆粒酶M(制備參見LuH.，HouQ,,Zhao,T.，Zhang,H.,ZhangQ.,WuL.,Fan,Z.GranzymeMdirectlycleavesICADtounleashcaspase-activatedDNaseleadingtoDNAfragmentation.77zeo//附m麗ofogy.2006,177:1171-1178)免疫Balb/C小鼠(購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司)，腹腔注射，每只小鼠每次50微克重組人顆粒酶M。2周后對小鼠進(jìn)行再次免疫，注射量和方法不變。待小鼠血清效價達(dá)到要求，即效價達(dá)到1:200以上，之后準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)胞融合，融合前三天對小鼠進(jìn)行沖擊免疫。在免疫小鼠的同時準(zhǔn)備小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0(ATCCCRL-1772)。將以上獲得的致敏的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合(《實(shí)用免疫學(xué)》，楊廷彬主編，長春出版社，1994年12月出版)，用HAT培養(yǎng)基(購于Irwitrogen公司，HAT系次黃嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidin)三種物質(zhì)各英文首字之綴列，HAT培養(yǎng)基也就是指含有這三種物質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)基)進(jìn)行選擇性培養(yǎng)(以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為飼養(yǎng)細(xì)胞)。接著，用ELISA方法檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清以重組人顆粒酶M包被96孔板，4。C過夜。用含0.05%tween-20的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，加待檢上清lOOpl，37t:孵育lh。用含0.05%tween-20的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，加酶標(biāo)二抗(抗小鼠IgG-HRP)(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，37'C孵育lh。洗滌3次，加底物顯色劑四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)50^，室溫靜置5分鐘，加終止液(2mol/L的硫酸)5(^1。結(jié)果用BIORAD680型酶標(biāo)儀測定，檢測波長為450nm值，OD值高于陰性對照2倍以上者可視為陽性。然后，將選出的陽性雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)(有限稀釋法，以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為飼養(yǎng)細(xì)胞)。經(jīng)過2-3輪克隆化培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定的能夠產(chǎn)生高效價單抗的雜交瘤細(xì)胞克隆。將雜交瘤細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存保種。本發(fā)明中的一種陽性雜交瘤細(xì)胞為抗人顆粒酶M單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株M0428，該雜交瘤細(xì)胞株于2008年7月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國，北京)，保藏號為CGMCCNo.2580。(2)M0428單抗的制備和純化將上述雜交瘤細(xì)胞M0428接種至Balb/C小鼠腹腔，制備腹水，再從腹水中提取單抗。單抗M0428的純化采用ProteinG親和層析法。首先制備ProteinG親和層析柱(購于"GE"公司)，用PBS(磷酸鹽緩沖液)平衡柱子后，取含M0428單抗的腹水過柱，然后用PBS洗柱子，至OD值接近于零，以0.2M的甘氨酸-HC1溶液(pH2.8)洗脫，收集洗脫液，測定各收集管的OD值，保留峰值區(qū)的洗脫液，洗脫液經(jīng)透析濃縮后-2(TC凍存。實(shí)施例2M0428單抗的鑒定將在實(shí)施例1中制備和純化的M0428單抗，按常規(guī)方法對重組人顆粒酶M、人NK腫瘤細(xì)胞系NK92細(xì)胞(ATCC:CRL-2407)的裂解液、人外周血單核細(xì)胞PBMC(制備參考《實(shí)用免疫學(xué)》，楊廷彬主編，長春出版社，1994年12月出版)的裂解液、人白血病細(xì)胞K562細(xì)胞(ATCC:CCL-243)的裂解液進(jìn)行westernblotting,結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，M0428單抗與重組人顆粒酶M及表達(dá)人天然顆粒酶M的細(xì)胞(NK92和PBMC)呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，而與其它不表達(dá)顆粒酶的細(xì)胞(K562)無交叉反應(yīng)。在實(shí)施例1中制備的M0428單抗，按常規(guī)方法對NK92細(xì)胞(ATCC:CRL-2407)、PBMC(制備參考《實(shí)用免疫學(xué)》，楊廷彬主編，長春出版社，1994年12月出版)、和K562細(xì)胞(ATCC:CCL-243)進(jìn)行免疫熒光反應(yīng)。結(jié)果表明，M0428單抗與表達(dá)人天然顆粒酶M的細(xì)胞(NK92和PBMC)呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，而與其它不表達(dá)顆粒酶的細(xì)胞(K562)無交叉反應(yīng)。用M0428單抗按常規(guī)方法對NK92、PBMC和K562細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測。結(jié)果如表l所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>—"表示無反應(yīng)，"+"表示有反應(yīng)。盡管本發(fā)明的具體實(shí)施例已經(jīng)描述如上，但是可以知道本發(fā)明可以進(jìn)行除了上述說明以外的實(shí)踐。本發(fā)明的保護(hù)范圍不受說明書的限制。參考文獻(xiàn)BirdCH,SunJ,UngK，KarambalisD,WhisstockJC,TrapaniJA,BirdPI.CationicsitesongranzymeBcontributetocytotoxicitybypromotingitsuptakeintotargetcells.MolCellBiol.2005Sep;25(17):7854-67.SmythMJ,SayersTJ,WiltroutT，PowersJC,TrapaniJA.Met-ase:cloninganddistinctchromosomallocationofaserineproteasepreferentiallyexpressedinhumannaturalkillercells.JImmunol.1993Decl;151(ll):6195-205SattarR,AliSA,AbbasiA.Bioinformaticsofgranzymes:sequencecomparisonandstructuralstudiesongranzymefamilybyhomologymodeling.BiochemBiophysResCommun.2003Sep5;308(4):726-35.Hink-SchauerC,Est6banez-PerpiME,KurschusFC，BodeW,JenneDE.Crystalstructureoftheapoptosis-inducinghumangranzymeAdimer.NatStructBiol.2003M;10(7):535-40.Hink-SchauerC,Est6banez-Perp跑E,WilharmE,Fuentes-PriorP,KlinkertW,BodeW,JenneDE.The2.2-Acrystalstructureofhumanpro-granzymeKrevealsarigidzymogenwithunusualfeatures.JBiolChem.2002Dec27;277(52):50923陽33.Epub2002Oct15.SuckG,BranchDR,SmythMJ,MillerRG,VergidisJ,FahimS,KeatingA.KHYG-1,amodelforthestudyofenhancednaturalkillercellcytotoxicity.ExpHematol.2005Oct;33(10):1160-71KellyJM,O'ConnorMD,HulettMD,ThiaKY,SmythMJ.CloningandexpressionoftherecombinantmousenaturalkillercellgranzymeMet-ase-1.Immu加genetics.19%;44(5):340-50.Lu，H.,Hou,Q.,Zhao,T,,Zhang,H.,Zhang,Q.,Wu,L.,andFan,Z.'GranzymeMdirectlycleavesinhibitorofcaspase-activatedDNase(CAD)tounleashCADleadingtoDNAfragmentation.JImmunol2006.177，1171-1178.MahrusS,KisielW,CraikCS.GranzymeMisaregulatoryproteasethatinactivatesproteinaseinhibitor9,anendogenousinhibitorofgranzymeB.JBiolChem.2004Dec24;279(52):54275-82.Epub2004Oct19.KellyJM,O'ConnorMD,HulettMD,ThiaKY,SmythMJ.CloningandexpressionoftherecombinantmousenaturalkillercellgranzymeMet-ase-1.Immunogenetics.1996;44(5):340-50.AdrainC,MurphyBM,MartinSJ.MolecularorderingofthecaspaseactivationcascadeinitiatedbythecytotoxicTlymphocyte/naturalkiller(CTL/NK)proteasegranzymeB.JBiolChem.2005Feb11;280(6):4663-73,Epub2004Nov29.Yang,A.,Kaghad,M.,Wang,Y"Gillett,E.,Fleming,M.D"Dotsch,V"Andrews,N.C.，Caput,D.,andMcKeon,F.p63,ap53homologat3q27-29,encodesmultipleproductswithtransactivating,death-inducing,anddominant-negativeactivities.Molecularcell1998.2,305-316.權(quán)利要求1.抗人顆粒酶M的單克隆抗體。2.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其為M0428，它由小鼠雜交瘤細(xì)胞株M0428(CGMCCNo.2580)產(chǎn)生。3.—種產(chǎn)生抗人顆粒酶M單克隆抗體M0428的雜交瘤細(xì)胞，其特征在于，它是保藏號為CGMCCNo.2580的小鼠雜交瘤細(xì)胞株M0428。4.權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體在制備免疫抑制劑中的應(yīng)用。5.權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體在制備導(dǎo)向藥物中的應(yīng)用。6.用于檢測顆粒酶M的含量的試劑盒，其包含權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體。7.根據(jù)權(quán)利要求6的試劑盒，其中所述顆粒酶M的含量可用于腫瘤或自身免疫性疾病的臨床監(jiān)測。8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的試劑盒，其中所述試劑盒用于檢測NK細(xì)胞、PBMC或外周大淋巴細(xì)胞的顆粒酶M的含量。9.一種檢測細(xì)胞的顆粒酶M的含量的方法，該方法包括(1)將權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體與待檢測的分離的細(xì)胞或該細(xì)胞的裂解液進(jìn)行接觸；和(2)判斷是否有陽性反應(yīng)。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述陽性反應(yīng)是通過免疫熒光檢測進(jìn)行判斷的。全文摘要本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生抗人顆粒酶M單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞及其分泌的單克隆抗體，特別是M0428，該單克隆抗體與重組人顆粒酶M及表達(dá)人天然顆粒酶M的細(xì)胞呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，而與其它不表達(dá)顆粒酶M的細(xì)胞無交叉反應(yīng)。本發(fā)明還提供了包含單克隆抗體M0428的試劑盒和使用單克隆抗體M0428檢測顆粒酶M的含量的方法。文檔編號C07K16/40GK101633696SQ20081011707公開日2010年1月27日申請日期2008年7月23日優(yōu)先權(quán)日2008年7月23日發(fā)明者強(qiáng)侯,劉圣武,吳連鋒,唐海東,張紅蓮,翀李,麗王,王德朋,范祖森申請人:中國科學(xué)院生物物理研究所