專利名稱：一種可誘發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫的異種抗原-Fc融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可誘發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫的異種抗原一Fc融合蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，占女性惡性腫瘤的18%，全世界每年約 有120萬婦女患乳腺癌，50萬人死于乳腺癌。在西歐、北美等發(fā)達(dá)國家，乳腺癌發(fā) 病率占女性惡性腫瘤的首位。亞洲是乳腺癌的低發(fā)區(qū)，但是近年來，我國乳腺癌的 發(fā)病率正在呈逐年上升的趨勢(shì)，從1999年的十萬分之十七增加到2003年的十萬分 之五十二，上升三倍。手術(shù)、化療和放療是乳腺癌的常規(guī)治療手段，隨著醫(yī)療水平 的不斷迸步，原發(fā)性腫瘤的治療技術(shù)，尤其是早期診斷患者的外科治療效果得到了 明顯提高。但對(duì)晚期患者則難以奏效，且大多數(shù)腫瘤患者就診時(shí)己處于晚期，其療 效大大受限，特別是當(dāng)腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移或多發(fā)轉(zhuǎn)移時(shí)，常規(guī)治療不能達(dá)到腫 瘤局部及全身的控制。腫瘤的主動(dòng)免疫治療以激發(fā)或增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能為手段， 選擇性地針對(duì)腫瘤細(xì)胞，特異性地發(fā)揮殺傷作用而不影響正常細(xì)胞的生存，進(jìn)而達(dá) 到控制和殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。
原癌基因Her2(又稱ErbB2或Her2/neu)是表皮生長因子受體家族成員之一，位 于人染色體17q21，是由1255個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量為185kDa。前653 個(gè)氨基酸為胞外區(qū)，富含半胱氮酸和2個(gè)配體結(jié)合域；第654 675位氨基酸為穿 膜區(qū)，起錨定作用；第676 1255位氨基酸為胞內(nèi)區(qū)，具有內(nèi)在酪氨酸激酶活性， 含有自身酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。Her2在25X 30X的乳腺癌中過表達(dá)，在正常組織 中低表達(dá)，是與乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)的腫瘤相關(guān)抗原之一 (Swiatoniowski G， Dabrowska M, Klaniewski T, et al. Erb-2 overexpression in breast cancer. Ginekol Pol, 2003， 74(4):332-338.)，己成為良好的腫瘤免疫生物治療的耙分 子。臨床前期研究發(fā)現(xiàn)，Her2高表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能(Petit T， Borel C, Ghnassia JP, et al Chemotherapy response of breast cancer depends on HER-2 status and anthracycline dose intensity in the neoadjuvant setting [J]. Clin Cancer Res, 2001, 7(6):1577-1581.)，且與腫瘤細(xì)胞的化療及激素治療的耐藥有關(guān)。Salmon等報(bào)道， Her2基因過表達(dá)的乳腺癌患者平均生存時(shí)間為3年，而Her2陰性患者為6 7年(Slamon DJ， Clark GM， Wong SG, et al. Human breast cancer correlation of relapse and survival with amplication of the HER-2/neu oncogene [J]. Science, 1987, 235(4785):177-182.)。目前已有大量證據(jù)顯示，Her2過表達(dá)是預(yù)測(cè)乳腺癌預(yù)后的重 要指標(biāo)。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞的Her2蛋白水平比正常乳腺上皮高10 100倍。Her2高表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活及腫瘤新生血管的生成等， Her2過度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療不敏感。有報(bào)告顯示乳腺癌患者唾液中Her2含量 較正常人高10倍以上，有望用于早期乳腺癌的篩選性診斷。Tutsi等對(duì)698例原發(fā) 性乳腺癌患者進(jìn)行了持續(xù)54個(gè)月的追蹤隨訪發(fā)現(xiàn)，無論是淋巴結(jié)陰性還是陽性組， 單因素或多因素分析均顯示Her2基因的過表達(dá)是主要的預(yù)后指標(biāo)(Tsutsui S， Ohno S， Murakami S, et al. Prognostic value of c-erbB-2 expression in breast and ovarian cancer[J].J Surq Oncol， 2002, 79(4):216-23.)。
Her2屬自身蛋白，機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)于過表達(dá)的自身蛋白往往處于耐受狀態(tài)。因 此，如何打破機(jī)體對(duì)腫瘤抗原的免疫耐受、誘發(fā)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)，是腫瘤免 疫治療取得突破的關(guān)鍵。研究表明，同源異種抗原可誘發(fā)增強(qiáng)對(duì)相應(yīng)自身抗原的免 疫應(yīng)答。Disis等證實(shí)，用全長大鼠neu蛋白免疫大鼠時(shí)，不能誘導(dǎo)抗大鼠neu蛋白 的免疫應(yīng)答，但是，用與neu蛋白有高度同源的Her2胞內(nèi)段蛋白免疫大鼠，則可 導(dǎo)致大鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的抗Her2及neu的細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答(Disis ML, Shiota FM， Cheever MA. Human HER-2/neu protein immunization circumvents tolerance to rat neu: a vaccine strategy for self tumor antigens [J]. Immunology, 1998, 93(2): 192-199.)。 因 此，利用異種抗原大鼠neu蛋白亦有可能打破機(jī)體對(duì)Her2的免疫耐受，產(chǎn)生抗Her2 的免疫應(yīng)答。
人IgGlFc段可結(jié)合于FcYlII受體(FcYIIIR,CD16)，該受體存在于單核細(xì)胞、 樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞膜表面，IgGl Fc與Fc7RIII結(jié)合后可介導(dǎo)抗體依賴 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)，誘導(dǎo)細(xì)胞因子、趨化因子及炎癥因子的釋放。Fc受 體不但可有效地介導(dǎo)抗原抗體復(fù)合物內(nèi)化，提高M(jìn)HC-II類途徑的抗原遞呈效率，而 且Fc受體介導(dǎo)的抗原攝取還可通過MHC-I類途徑交叉遞呈(Albert ML, Sauter B, Bhardwaj N. Dendritic cells acquire antigen from apoptotic cells and induce class I-restricted CTLs. Nature 1998; 392:86—9. Ravetch JV. Fc receptors: rubor redux. Cell 1994; 78:553—60. Regnault A, Lankar D, Lacabanne V " a/. Fey receptor-mediated induction of dendritic cell maturation and major histocompatibility complex class
4I-restricted antigen presentation after immune complex internalization. J Exp Med 1999; 189:371-80.)。研究表明，F(xiàn)cYR介導(dǎo)的抗原攝取效率比吞噬及吞飲強(qiáng)100 1000倍， 可有效促進(jìn)抗原的遞呈(Akiyama K, Ebihara S, Yada A, " a/. Targeting Apoptotic Tumor Cells to FcR Provides Efficient and Versatile Vaccination Against Tumors by Dendritic Cells. J Immunol, 2003， 170(4): 1641-1648. You ZY, Huang XF， Hester J, " a/. Induction of vigorous helper and cytotoxic T cell as well as B cell responses by DCs expressing a modified antigen targeting receptor-mediated internalization pathway. J Immunol, 2000, 165:4581-4592.)。
佐劑可決定免疫反應(yīng)的類型，增強(qiáng)抗原的刺激作用。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激 因子(Granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)可激活抗原提呈細(xì) 胞、參與T細(xì)胞的活化、誘導(dǎo)特異性CTL的產(chǎn)生、提高抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cell, APC)的遞呈效率，是細(xì)胞免疫的重要增強(qiáng)因子(Lefrance F, Cool V, Velu T, "a/. Granulocyte macrophage colony stimulating factor gene transfer to induce a protective antitumoral immune response against the 9L rat gliosarcoma model [J]. Int J Oncol, 2002, 20(5):1077-1085.)，其在基因疫苗、分子疫苗及腫瘤疫苗等各類疫苗中的免疫佐劑 作用已被廣泛石開究(Disis ML, Bernhard H， Shiota FM, " /. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; an effective adjuvant for protein and peptide-based vaccines [J]. Blood, 1996， 88(1):202-210.) 。GM-CSF可促進(jìn)多種炎細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、 中性粒細(xì)胞及漿細(xì)胞等參與抗腫瘤免疫反應(yīng)。Dranoff將GM-CSF作為黑色素瘤疫苗 的免疫佐劑，發(fā)現(xiàn)GM-CSF相對(duì)于其它細(xì)胞因子佐劑可產(chǎn)生更持久、更有效的免疫 促進(jìn)作用(Dranoff G. GM-CSF-secreting melanoma vaccines [J] . Oncogene, 2003， 22 (20) : 3188-3192.)?？ń槊?Bacillus Calmette-Guerin， BCG)是最早應(yīng)用于腫瘤生 物治療的制劑，也是最強(qiáng)的免疫佐劑之一。作為結(jié)核分支桿菌的減毒活疫苗，具有 很強(qiáng)的非特異性免疫刺激作用，能活化巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生 IFN-Y和IL-12等Thl型細(xì)胞因子，介導(dǎo)以細(xì)胞免疫為主的免疫應(yīng)答(Lammd L, Thor DE， Harris SC, W a/. Bacillus Calmette-Guerin immunotherapy of superficial bladder cancer[ J]. JUrol, 1980, 124:38-40.)。 BCG在臨床上已成功地應(yīng)用于表淺型膀胱癌的 膀胱內(nèi)注射治療，在預(yù)防膀胱腫瘤復(fù)發(fā)和治療殘存癌、原位癌中已經(jīng)取得了肯定療 效(O，Donnell MA， DeWolf DC. Bacillus Calmette-Gu6rin immunotherapy for superficial bladder cancer. New prospects for an old war horse. Surg Oncol Clin N Am,
51995,4:189-202.)。 ？干擾素(IFN-y )是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，主要由活化的T細(xì)胞 和NK細(xì)胞產(chǎn)生。IFN-Y能促進(jìn)多種細(xì)胞表面表達(dá)MHC-I類和II類分子，促進(jìn)ThO細(xì)胞 分化為Thl細(xì)胞，激活巨噬細(xì)胞、DC和NK細(xì)胞等，在誘導(dǎo)Thl類免疫反應(yīng)中起著主導(dǎo) 作用。IFN-Y參與控制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移，在腫瘤免疫監(jiān)視過程中發(fā)揮重要的作用 (Doherty GM, Alexander HR, Merino MJ， Venzon DJ, Norton JA. Role of endogenous interferon gamma in murine tumor growth and tumor necrosis factor alpha antitumor efficacy. Ann Surg Oncol 1996; 3:198—203. Street SE, Cretney E， Smyth MJ. Perforin and interferon-gamma activities independently control tumor initiation, growth and metastasis. Blood 2001; 97:192-7.)。在腫瘤基因治療研究中顯示，IFN-y可提高腫瘤 的免疫原性(Kaplan DH， Shankaran V， Dighe AS Demonstration of an interferon gamma-dependent tumor surveillance system in immunocompetent mice. Proc Nat Acad Sci 1998;95:7556-61.)。
單核細(xì)胞來源于骨髓起源的CD34+細(xì)胞。它們進(jìn)入組織并最終分化為組織中的 駐留型巨噬細(xì)胞，包括肝臟的Kupffer細(xì)胞、肺泡中的巨噬細(xì)胞和骨髓中的破骨細(xì) 胞。免疫系統(tǒng)中，巨噬細(xì)胞可同時(shí)發(fā)揮正、負(fù)向的調(diào)節(jié)作用(Gordons. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol 2003; 3:23—35. Stout RD, Suttles J. T cell signaling of macrophage function in inflammatory disease. Front Biosci 1997; 2:dl97-d206.): —方面，它們可通過釋放細(xì)胞毒性分子可對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生直接的 殺傷(Olikowsky T, Wang ZQ， Dudhane A W a/. Two distinct pathways of human macrophage differentiation are mediated by interferon-^ and interleukin-10. Immunol 1997; 91:96—112. Lopez M, Bony V， Martinache C a/. Tumoricidal potential of human macrophages grown Wfro from blood monocytes. J Exp Ther Oncol 1996; 1:143-54.)，或通過遞呈抗原和產(chǎn)生白介素-12 (IL-12)刺激淋巴細(xì)胞應(yīng)答(Verreck FA, de Boer T, Langenberg DM. Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco) bacteria. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101:4560-5.);另一方面，腫瘤細(xì)胞通過釋放高水平的抑制因 子來破壞免疫系統(tǒng)的平衡，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞抗腫瘤功能的下調(diào)(ElgertKD， AllevaDG, Mullins DW. Tumor-induced immune dysfunction: the macrophage connection. J Leukoc Biol 1998; 64:275—90. Mantovani A, Sica A, Sozzani S a/. The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization. Trends Immunol
62004;25(12):677-86.)。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞可抑制T細(xì)胞和NK細(xì) 胞的抗月中瘤活性(Kono K, Salazar-Onfray F, Petersson Ma/. Hydrogen peroxide secreted by tumor-derived macrophages down-modulates signal-transducing zeta molecules and inhibits tumor-specific T cell- and natural killer cell-mediated cytotoxicity. Eur J Immunol 1996;26:1308-13.)。
免疫系統(tǒng)由相互作用的多種細(xì)胞組成。來源于免疫系統(tǒng)的激活信號(hào)和抑制信號(hào) 以及周圍細(xì)胞的代謝物之間復(fù)雜的相互作用調(diào)節(jié)局部免疫反應(yīng)的范圍和強(qiáng)度。不同 類型細(xì)胞之間廣泛的相互作用和調(diào)節(jié)決定免疫應(yīng)答的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可誘發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫的異種抗原一Fc融合蛋白。
本發(fā)明所提供的融合蛋白是如下l)或2)的蛋白質(zhì)
1) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
2) 將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過-一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/
或缺失和/或添加且具有抗腫瘤活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列2自氨基末端第1 - 121位為neu的L2結(jié)構(gòu)域，第122-241位為 neu的S2結(jié)構(gòu)域，第242 - 464位為人IgGl Fc區(qū)。
上述融合蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 所述融合蛋白編碼基因的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示。 含有上述融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本 發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種治療腫瘤的疫苗。 所述腫瘤具體可為高表達(dá)Her2的乳腺癌。 本發(fā)明所提供的疫苗的活性成分是上述融合蛋白。 所述疫苗中還可以含有如下l)或2)的佐劑
1) GM-CSF和BCG;
2) IFN-y禾口 BCG。
實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的融合蛋白對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有較好的抑制效果，加入上述l) 或2)的佐劑后，抑制效果明顯提高，所述融合蛋白和上述l)或2)的佐劑可以以 任一配比混合。
當(dāng)然，所述疫苗中也可以只含有所述融合蛋白、佐劑GM-CSF和BCG或只含有
7融合蛋白、佐劑IFN-y和BCG。
具體的說，本發(fā)明是將大鼠neu L2-S2功能域的編碼序列與人IgG Fc區(qū)編碼序 列融合，構(gòu)建真核表達(dá)載體；在CHO細(xì)胞中獲得穩(wěn)定表達(dá)，應(yīng)用rProtein A Sepharose Fast Flow親和層析純化neu-Fc融合蛋白，應(yīng)用SDS-PAGE和Western blot鑒定重 組蛋白；Ficoll密度梯度離心法分離人PBMC， MTT法檢測(cè)融合蛋白對(duì)PBMC的促 增殖作用；通過ELISA法檢測(cè)PBMC產(chǎn)生的IL-12和IL-10水平的變化；應(yīng)用流式 細(xì)胞分析檢測(cè)單核細(xì)胞表型的變化；LDH法檢測(cè)PBMC在佐劑協(xié)同異種抗原刺激 下對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用；pcDNA3.0/Her2轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌細(xì)胞EMT6，獲得一株高 表達(dá)Her2的EMT6/Her2細(xì)胞株；利用該細(xì)胞株構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，觀察佐劑和 融合蛋白聯(lián)合應(yīng)用對(duì)腫瘤生長的影響；對(duì)腫瘤組織作HE染色及組織學(xué)分析。
結(jié)果表明，neu-Fc是分子量約為66 kDa的蛋白；PBMC經(jīng)MCF-7細(xì)胞上清誘 導(dǎo)后，IL-12水平降低，IL-10水平顯著升高；10 nM neu-Fc對(duì)PBMC具有顯著的促 增殖作用；neu-Fc與佐劑聯(lián)合作用可顯著促進(jìn)PBMC中IL-12的表達(dá)并下調(diào)IL-10 的表達(dá)；佐劑協(xié)同融合蛋白作用下，單核細(xì)胞表面MHCII類分子表達(dá)上調(diào)；佐劑 協(xié)同融合蛋白刺激可導(dǎo)致PBMC對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性顯著增強(qiáng)；建立的 EMT6/Her2細(xì)胞中，Her2的表達(dá)率為99.59%;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，佐劑協(xié)同融合蛋白對(duì) 腫瘤生長有明顯的抑制作用；腫瘤組織HE染色組織學(xué)分析觀察到，佐劑協(xié)同融合 蛋白治療組的腫瘤組織內(nèi)和包膜周圍有大量淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤，腫瘤細(xì)胞 廣泛壞死，而對(duì)照組腫瘤無明顯包膜，腫瘤細(xì)胞生長活躍，無炎細(xì)胞浸潤。結(jié)果表 明，佐劑輔助融合蛋白可誘導(dǎo)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。


圖1為neu-Fc蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果
圖2為neu-Fc對(duì)PBMC具有明顯的促增殖作用
圖3為MCF-7細(xì)胞上清誘導(dǎo)后PBMC分泌IL-12和IL-10的變化
圖4為neu-Fc、 GM-CSF和BCG聯(lián)合應(yīng)用對(duì)PBMC分泌IL-12和IL-10表達(dá)的影
響
圖5為neu-Fc、 IFN- y和BCG聯(lián)合應(yīng)用對(duì)PBMC分泌IL-12和IL-10表達(dá)的影
響
圖6為FACS分析單核細(xì)胞表型
圖7為neu-Fc， IFN- y和BCG誘導(dǎo)的PBMC體外抗腫瘤活性
8圖8為構(gòu)建的細(xì)胞株EMT6/Her2表達(dá)Her2的情況
圖9為neu-Fc、 IFN- y和BCG聯(lián)合應(yīng)用裸鼠體內(nèi)抑瘤活性觀察
圖10為neu-Fc、 IFN-y和BCG聯(lián)合應(yīng)用裸鼠體內(nèi)抑瘤活性觀察、腫瘤的組織
學(xué)觀察及體內(nèi)毒性評(píng)價(jià)
具體實(shí)施例方式
人淋巴細(xì)胞分離液(相對(duì)密度為1.077)購自天津TBD生物技術(shù)發(fā)展公司，特級(jí) 胎牛血清購于北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所，無酚紅RPMI-1640購于Hyclone公司， DMEM購于GIBCO公司，HRP-羊抗鼠抗體購自中杉公司，抗Her2抗體(Ab20)購于 Neomarkers公司，重組人GM-CSF (hGM-CSF)及IFN-y均購于ProSpec-Tany TechnoGene公司，BCG購于北京生物制品研究所，IL-12和IL-10 ELISA檢測(cè)試劑 盒購于北京達(dá)克為生物技術(shù)有限公司，增強(qiáng)型ECL試劑盒購于北京普利萊基因技 術(shù)有限公司。
實(shí)施例1、融合蛋白neu-Fc聯(lián)合GM-CSF和BCG的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng) 1、 neu-Fc的構(gòu)建、表達(dá)及純化
大鼠neu的胞外區(qū)包括Ll、 Sl、 L2和S2四個(gè)結(jié)構(gòu)域。根據(jù)大鼠neu胞外區(qū)的 L2和S2結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)引物5'-tgccatggtccgagtgtgctatggtctg-3，禾口
5，-agtttagcggccgcgtgggtgcagttgatggg-3，， PCR擴(kuò)增大鼠neu胞外區(qū)的L2和S2結(jié)構(gòu)域 的編碼序列(上游引物位于大鼠neu胞外區(qū)的L2結(jié)構(gòu)域，下游引物位于大鼠neu 胞外區(qū)的S2結(jié)構(gòu)域)。
提取健康人離體的外周血單個(gè)核細(xì)胞的總RNA，利用RT-PCR方法擴(kuò)增出人 1gGl Fc段的cDNA。將人IgGl Fc段的cDNA經(jīng)7VM和屈ol雙酶切后插入到經(jīng)同 樣酶切的載體pCI-neo (購自Promega公司)中，得到重組表達(dá)載體pCI-neo/Fc。
將上述大鼠neu胞外區(qū)的L2和S2結(jié)構(gòu)域的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用五coi I和Wort雙 酶切后與經(jīng)同樣酶切的重組表達(dá)載體pCI-neo/Fc相連接，使大鼠neu的L2和S2結(jié) 構(gòu)域融合于人IgGlFc段的N端，將得到的重組表達(dá)載體命名為pCI/neu-Fc。將 pCI/neu-Fc進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，大鼠neu的L2和S2結(jié)構(gòu)域的編碼序列已經(jīng)和人 IgGl Fc段的編碼序列正確相連接，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示， 將其編碼的融合蛋白命名為neu-Fc，該融合蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所 示。
將重組表達(dá)載體pCI/neu-Fc轉(zhuǎn)染二氫葉酸還原酶缺陷型的CHO細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48
9小時(shí)后，細(xì)胞在含有10X透析血清的DMEM培養(yǎng)基和甲氨喋呤中篩選，獲得穩(wěn)定 高表達(dá)融合蛋白neu-Fc的克隆。培養(yǎng)該細(xì)胞克隆，收獲上清，應(yīng)用rProteinA Sepharose Fast Flow親和層析純化表達(dá)上清，獲得高純度的融合蛋白neu-Fc。對(duì)融 合蛋白neu-Fc進(jìn)行N端序列測(cè)定，結(jié)果表明，neu-Fc N末端的15個(gè)氨基酸殘基和 序列表中序列4的自N末端的第1-15位氨基酸殘基相同。
2、 neu-Fc蛋白的鑒定
將上述步驟1獲得的neu-Fc蛋白經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定其分子量，結(jié)果如圖1所 示。其中，M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為neu-Fc的SDS-PAGE電泳結(jié)果，2為neu-Fc 的Western blot結(jié)果。結(jié)果表明，neu-Fc的分子量為約66 kDa。由于neu與Her2 的同源性較高，可利用抗人Her2抗體(Ab20)(購于Neomarkers公司)對(duì)上述步驟 1獲得的neu-Fc蛋白進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果表明，抗人Her2抗體可識(shí)別neu-Fc 融合蛋白，陽性反應(yīng)條帶的位置與上述步驟1純化得到的neu-Fc蛋白在SDS-PAGE 中的位置一致。
3、 MTT法測(cè)定neu-Fc促進(jìn)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)增殖的作用
1) PBMC的分離與培養(yǎng)
采用Ficoll法分離人PBMC，將分離自健康人的新鮮離體白膜層細(xì)胞約30ml分別 加入到兩個(gè)50ml的培養(yǎng)瓶中，再分別加入等體積的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋。 將稀釋好的白膜層細(xì)胞沿管壁緩慢滴加在淋巴細(xì)胞分離液液面上，每管滴加5 ml， 使白膜層與淋巴細(xì)胞分離液的體積比為l:l， 2000rpm離心30分鐘。離心后可以看到 試管內(nèi)液面分為4層。自上而下依次為黃色血漿層、白色薄膜層(PBMC層)、無 色透明的分離液層和紅細(xì)胞層。
將上述PBMC層吸至另一50 ml培養(yǎng)瓶中，加入等體積的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng) 液稀釋，800rpm離心10分鐘。離心后試管底部有乳白色沉淀出現(xiàn)，用手指將沉淀輕 輕彈散開，加入無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)液吹懸細(xì)胞，800 rpm離心10分鐘洗滌細(xì)胞3 次，離心后的上清液透亮，停止洗漆。將細(xì)胞沉淀用含20%胎牛血清的無酚紅 RPMI-1640培養(yǎng)液重懸并計(jì)數(shù)。
2) MTT法測(cè)定neu-Fc促增殖作用
調(diào)整上述步驟l)獲得的PBMC的密度為2X10Vml，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 每孔IOO ^d。用含20X血清的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)液將上述步驟l獲得的neu-Fc蛋 白稀釋為2 nM、 10 nM和50 nM，并加入到培養(yǎng)有PBMC的細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔IOO pl。
10同時(shí)以不加neu-Fc蛋白作為對(duì)照。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。37"培養(yǎng)箱中孵育96小時(shí) 后，每孔吸出IIO pl培養(yǎng)液，然后加入IO pl 5 mg/ml的MTT溶液。繼續(xù)培養(yǎng)4 6小時(shí)， 2000rpm離心10分鐘，棄上清。每孔中加入IOO ^d酸化SDS，充分混勻，37。C培養(yǎng)過 夜，酶聯(lián)儀上測(cè)定A57o值，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，2nM和10nM的neu-Fc均具 有顯著的促細(xì)胞增殖作用(P<0.05) ， 10nMneu-Fc的促增殖作用最強(qiáng)。
4、 MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)上清抑制PBMC分泌IL-12及刺激IL-10的分泌
用含20%血清的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)液將PBMC的密度調(diào)為2X 106/ml，加 入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100nl，然后加入MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)上清100 pl。對(duì)照 孔中不加MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)上清，補(bǔ)充RPMI-1640 100 pl，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。 培養(yǎng)48-72小時(shí)后，進(jìn)行細(xì)胞因子檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。圖中，表示P< 0.05， 表示P<0.01。結(jié)果表明，PBMC與MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)上清共孵育后，
Thl型細(xì)胞因子IL-12水平明顯降低(P<0.05) ，Th2型細(xì)胞因子IL-10水平顯著升 高(P<0.01)，表明MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)上清中存在可導(dǎo)致PBMC處于免疫抑制狀態(tài) 的物質(zhì)。
5、 neu-Fc、 GM-CSF和BCG聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞因子分泌的影響
用含20%血清的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)液將PBMC的密度調(diào)為2X 106/ml，加 入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100pl。實(shí)驗(yàn)組加入MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)上清100 pl，培 養(yǎng)48-72小時(shí)后，吸去培養(yǎng)液，并分為如下四個(gè)處理1、補(bǔ)充RPMI-1640 100 pl
(對(duì)照組)；2、加入含終濃度為10 nMneu-Fc的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基100 3、加入含終濃度為20 ng/ml GM-CSF、 300嗎/ml BCG的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基 100 pl ; 4、加入含終濃度為20 ng/ml GM-CSF、 300 (ig/ml BCG和10 nM neu-Fc的 無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基100 pl。
每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。72小時(shí)后2000 rpm離心10分鐘，吸出上清，按照ELISA 檢測(cè)試劑盒的要求檢測(cè)上清中的細(xì)胞因子，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件， 所有數(shù)據(jù)采用X土SD表示，組間比較采用one sample-ANOVA法分析，以P<0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果如圖4所示。其中，黑色柱子表示加入融合蛋白neu-Fc， 白色柱子表示未加融合蛋白neu-Fc。
結(jié)果表明，neu-Fc單獨(dú)作用于PBMC時(shí)，IL-12分泌水平略有升高，而IL-10分泌 水平明顯受到抑制(P<0.01);當(dāng)同時(shí)用GM-CSF、 BCG和neu-Fc處理PBMC時(shí)， IL-12的水平升高則更為顯著(P〈0.01)，而IL-10水平進(jìn)一步降低(P<0.05)。表明，
11neu-Fc促增殖的細(xì)胞群體主要為Thl型細(xì)胞，GM-CSF、 BCG和neu-Fc的聯(lián)合應(yīng)用能 強(qiáng)有力地誘導(dǎo)PBMC向Thl型應(yīng)答轉(zhuǎn)換。
實(shí)施例2、異種蛋白neu-Fc聯(lián)合IFN- Y和BCG的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)
1、 neu-Fc、 IFN-Y和BCG聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞因子分泌的影響
用含20%血清的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)液將PBMC的密度調(diào)為2X 106/ml，加 入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 ^。實(shí)驗(yàn)組加入MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)上清100 pl，培 養(yǎng)48-72小時(shí)后，吸去培養(yǎng)液，并分為如下幾個(gè)處理1、補(bǔ)充RPMI-1640 100 2、加入含終濃度為10 nM neu-Fc的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基100 3、加入含終 濃度為40U/ml IFN- y的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基100 pi; 4、加入含終濃度為40U/ml IFN- Y和10 nM neu-Fc的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基100 5、加入含終濃度為300 |ig/ml BCG的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基100 pi; 6、加入含終濃度為300 |ig/ml BCG 和10 nM neu-Fc的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基100 (il; 7、加入含終濃度為40U/ml IFN-Y 、 300昭/ml BCG的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基100 ^ ; 8、加入含終濃度為40U/ml IFN- Y 、 300 (ig/ml BCG和10 nM neu-Fc的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基100 (il。對(duì)照 組不加MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)上清，分別補(bǔ)充RPMI-1640 100^1或含10 nM neu-Fc的 RPMI-1640培養(yǎng)基100 pl。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。72小時(shí)后2000 rpm離心10分 鐘，吸出上清，按照ELISA檢測(cè)試劑盒的要求檢測(cè)上清中的細(xì)胞因子，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)采用X±SD表示，組間比較采用one sample-ANOVA法分析，以P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果如圖5所示。其中， 黑色柱子表示加入融合蛋白neu-Fc，白色柱子表示未加融合蛋白neu-Fc。
結(jié)果表明，neu-Fc單獨(dú)作用可導(dǎo)致細(xì)胞分泌IL-12水平顯著增高，IL-10的分 泌受抑制；IFN- Y單獨(dú)作用不能逆轉(zhuǎn)MCF-7細(xì)胞上清對(duì)Thl細(xì)胞的抑制作用；但是， 當(dāng)與neu-Fc共同作用時(shí)，IL-12的水平升高及IL-10的水平明顯降低，與neu-Fc 單獨(dú)作用相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.01)。 BCG與IFN- Y聯(lián)合作用能顯著上調(diào)IL-12 的水平，與兩者單獨(dú)作用相比作用明顯增強(qiáng)；而當(dāng)BCG、 IFN-Y和neu-Fc共同作 用時(shí)，IL-12的分泌水平進(jìn)一步提高；BCG單獨(dú)作用可顯著抑制IL-10的分泌，而 與IFN- y聯(lián)合應(yīng)用并未能進(jìn)一步下調(diào)IL-10的水平。
2、 neu-Fc和BCG、 IFN-Y聯(lián)合誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)單核細(xì)胞表型
單核細(xì)胞是體外誘導(dǎo)DC的來源，單核細(xì)胞在體外通過內(nèi)皮細(xì)胞遷移或在體內(nèi) 吞噬抗原后亦可分化為DC。按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法(TangCB，InmanMD，RooijenNV
12e/ a/. Th Type 1-Stimulating Activity of Lung Macrophages Inhibits Th2-Mediated Allergic Airway Inflammation by an IFN個(gè)Dependent Mechanism. J Immunol 2001; 166:1471-81.)，利用單核細(xì)胞的黏附特性分離單核細(xì)胞，具體方法如下
按照上述實(shí)施例1步驟3的方法，將分離的PBMC培養(yǎng)于50 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中， 在含20y。胎牛血清的無酚紅RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。2小時(shí)后，在倒置顯微鏡下 觀察，可見部分細(xì)胞己貼壁，此時(shí)將上清吸去，并用無酚紅的RPMI 1640培養(yǎng)液清 洗貼壁細(xì)胞，此貼壁細(xì)胞即為單核細(xì)胞。
將單核細(xì)胞培養(yǎng)于含20%血清的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)液中，加入MCF-7細(xì) 胞培養(yǎng)上清100 pl。培養(yǎng)24-48小時(shí)后，加入含終濃度為40 U/ml IFN-Y 、 10 nM neu-Fc和300嗎/ml BCG的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基，同時(shí)以未用MCF-7細(xì)胞培 養(yǎng)上清作用及未加刺激物的細(xì)胞分別作為對(duì)照。培養(yǎng)48-72小時(shí)后，6000rpm離心 30秒收集細(xì)胞，用FACS洗液(PBS+2%BSA或2X胎牛血清+0.1。/。NaN3)洗滌3 次。然后分別加入抗-CDllb-PE抗體、抗-CD14-FITC抗體、抗-CD80-FITC抗體、 抗-CD86-PE抗體和抗-MHC-DR-PE抗體(以上抗體均購于Ebioscience公司)，冰 浴、避光輕搖20-40分鐘。6 000rpm離心30秒后，棄上清，再洗滌3次。最后一 次離心后，棄上清，用1%的多聚甲醛固定，流式細(xì)胞儀分析單核細(xì)胞表型。
單核細(xì)胞膜表面CD14和CDllb的表達(dá)如圖6所示。其中，A為單核細(xì)胞CD14 的表達(dá)，B為單核細(xì)胞CDllb的表達(dá)。從圖中可以看出，單核細(xì)胞的CDllb陽性率 約為96%， CD14的陽性率約為90%。
在MCF-7細(xì)胞上清的誘導(dǎo)下，單核細(xì)胞表面HLA-DR、 CD80和CD86分子的表達(dá) 顯著下調(diào)。BCG、 IFN-Y和neu-Fc聯(lián)合作用刺激48小時(shí)后，單核細(xì)胞表面HLA— DR的表達(dá)由50%提高至75%， CD80的表達(dá)由39%提高至47%， CD86的表達(dá)由44 %提高至64% ，具體結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，單核細(xì)胞在BCG、IFN- Y和neu-Fc 聯(lián)合作用下被活化。
表l單核細(xì)胞共刺激分子和MHC n類分子的表達(dá)
CD80CD86HLA-DR
對(duì)照組75.63%±5.92%62.6%±10.14%91.99%±6.14%
MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)上清38.60%±9.28%44.17%±13.46%50.00%±24.53%
neu-Fc+IFN-Y+BCG47.05%±4.61%64.28%±1.92%75.210/0±3.40%
13殺傷實(shí)驗(yàn)(LDH法)
為了觀察neu-Fc、 IFN-Y和BCG是否可促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞(PBMC)對(duì)Her2過表 達(dá)腫瘤細(xì)胞的抑制活性，構(gòu)建了 MCF-7/Her2細(xì)胞，并分析了 4種不同的乳腺癌細(xì) 胞(T47D、 MCF-7、 MCF-7/Her2和SKBR3細(xì)胞)表面MHC-II類分子的表達(dá)水平，具
體的實(shí)驗(yàn)過程如下
1) MCF-7/Her2細(xì)胞的構(gòu)建
提取人乳腺癌細(xì)胞SKBR3的總RNA，利用RT-PCR方法擴(kuò)增出Her2的cDNA。 將擴(kuò)增得到的Her2的cDNA插入到真核表達(dá)載體pcDNA3 (購自Invitrogen公司) 的///"dl1和A7wl位點(diǎn)間，將得到的重組質(zhì)粒命名為pcDNA3/Her2。
用pcDNA3/Her2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，800嗎/ml G418 (Sigma)加壓篩選 10天后，獲得穩(wěn)定表達(dá)Her2的MCF-7細(xì)胞。經(jīng)過有限稀釋法獲得高表達(dá)Her2的細(xì) 胞克隆，將其命名為MCF-7/Her2。 MCF-7/Her2細(xì)胞在含200嗎/ml G418的培養(yǎng)液 中維持。
MCF-7/Her2細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞和T47D細(xì)胞表達(dá)Her2的情況如圖7A所示。其 中，虛線表示T47D細(xì)胞表達(dá)Her2的情況，細(xì)的實(shí)線表示MCF-7細(xì)胞表達(dá)Her2的 情況，粗的實(shí)線表示MCF-7/Her2細(xì)胞表達(dá)Her2的情況。
2) 效應(yīng)細(xì)胞的處理
用含20。/。胎牛血清的無酚紅RPMI 1640培養(yǎng)液將上述實(shí)施例1分離的PBMC 細(xì)胞濃度調(diào)整至lX106/ml，分為4組1、陰性對(duì)照；2、加入neu-Fc; 3、加入IFN-y和BCG; 4、加入neu-Fc、 IFN-Y禾BBCG。 neu-Fc的終濃度為10 nM， IFN-Y的終 濃度為40 U/ml， BCG的終濃度為300嗎/ml，作用96小時(shí)。
3) 靶細(xì)胞的處理
T47D、 MCF-7、 MCF-7/Her2禾n SKBR3是4種表達(dá)不同水平Her2和低水平 MHC-II的人類乳腺癌細(xì)胞系(T47D、 MCF-7和SKBR3均購自美國ADCC) 。 4種 細(xì)胞經(jīng)過2000 U/ml的IFN- Y作用96小時(shí)后，應(yīng)用FACS檢測(cè)細(xì)胞表面細(xì)C-DR的 表達(dá)。結(jié)果如圖7B和圖7C所示。其中，圖7B為IFN-Y作用前T47D、 MCF-7、 MCF-7/Her2和SKBR3細(xì)胞表面MHC-DR的表達(dá)情況，圖7C為IFN- Y作用后T47D、 MCF-7、 MCF-7/Her2和SKBR3細(xì)胞表面MHODR的表達(dá)情況。
結(jié)果表明，IFN-y處理可使T47D、 MCF-7、 MCF-7/Her2三種細(xì)胞表面MHC-DR 的表達(dá)明顯上調(diào)，而SKBR3無明顯變化，因此選擇T47D、 MCF-7和MCF-7/Her2
14作為殺傷實(shí)驗(yàn)中的靶細(xì)胞。
用2000 U/ml的IFN- Y分別作用于T47D、 MCF-7和MCF-7/Her2細(xì)胞96小時(shí)
后，將細(xì)胞分別用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，800rpm離心5分鐘，細(xì)胞洗滌兩次后計(jì) 數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為4X107ml，鋪于96孔板中，每孔IOO pl。 4)效靶作用
收集上述步驟2)的效應(yīng)細(xì)胞，用無酚紅RPMI 1640洗兩次并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞 密度為8X 105/ml，每孔100 pl。當(dāng)上述步驟3)的靶細(xì)胞貼壁后，用無酚紅的RPMI 1640培養(yǎng)液將耙細(xì)胞洗兩次，然后將效應(yīng)細(xì)胞加入培養(yǎng)有靶細(xì)胞的培養(yǎng)板中，使效 應(yīng)細(xì)胞和耙細(xì)胞的數(shù)量比分別為20: 1和10: 1。同時(shí)以僅含效應(yīng)細(xì)胞和僅含靶細(xì) 胞的孔作為對(duì)照，每種處理設(shè)三個(gè)重復(fù)孔。37。C培養(yǎng)3-4小時(shí)后，250g離心3分鐘， 從每孔中吸出50pl上清液至另一96孔板中。采用細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，按說明書 中的步驟首先配制反應(yīng)試劑，然后將其加入到上述96孔板中，每孔50pl，室溫避 光反應(yīng)10 30分鐘，測(cè)OD艦值。結(jié)果如圖7D和圖7E所示。其中，圖7D為效應(yīng)細(xì) 胞和靶細(xì)胞的數(shù)量比為20: 1時(shí)的測(cè)定結(jié)果，圖7E為效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的數(shù)量比 為10: 1時(shí)的測(cè)定結(jié)果。在僅含靶細(xì)胞的3個(gè)孔中加入1% (體積百分含量)的 Triton(曲拉通，用PBS稀釋)10pl，作為最大靶細(xì)胞釋放孔。
結(jié)果表明，neu-Fc、 IFN-Y和BCG聯(lián)合作用刺激效應(yīng)細(xì)胞對(duì)高表達(dá)Her2的細(xì)胞可 產(chǎn)生最有效的殺傷，與neu-Fc或BCG + IFN-Y刺激的效果相比，具有明顯的差異 (P<aW)。且效應(yīng)細(xì)胞對(duì)MCF-7/Her2細(xì)胞的殺傷率較T47D細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞更高，提 示效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷依賴于細(xì)胞表面Her分子的密度。
實(shí)施例3、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
1、 EMT6/Her2細(xì)胞的構(gòu)建
用pcDNA3/Her2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染來源于Balb/C鼠的小鼠乳腺癌細(xì)胞EMT6 (購自美國 ADCC),在800嗎/mlG418壓力下篩選表達(dá)Her2的EMT6細(xì)胞，經(jīng)兩次有限稀釋法 及加壓篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)Her2的EMT6細(xì)胞克隆，將其命名為EMT6/Her2。同 時(shí)以未轉(zhuǎn)染pcDNA3/Her2質(zhì)粒的EMT6細(xì)胞作為對(duì)照。采用抗Her2抗體(Ab20)購于 Neomarkers公司及FACS檢測(cè)EMT6/Her2細(xì)胞表達(dá)Her2的情況，F(xiàn)ACS檢測(cè)結(jié)果 如圖8所示。其中，圖8A為對(duì)照組EMT6細(xì)胞的FACS檢測(cè)結(jié)果，圖8B為EMT6/Her2 細(xì)胞的FACS檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果表明，近100%的EMT6/Her2細(xì)胞表達(dá)Her2分子。
2、 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
151) 注射抗原劑量的確定
EMT6/Her2細(xì)胞用無抗生素和血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成4X 106/ml，于 右側(cè)腋下皮下注射4一6周齡的雌性Balb/C小鼠，每只小鼠注射0.1ml。注射后第 6天，可見小鼠注射部位有腫瘤生長，隨機(jī)將小鼠分為4組，分別為對(duì)照組、佐劑 組、高劑量抗原加佐劑組和低劑量抗原加佐劑組，每組6只小鼠。其中，抗原為上 述實(shí)施例1獲得的neu-Fc融合蛋白，高劑量組抗原用量為每只小鼠20嗎，低劑量 組抗原用量為每只小鼠10 佐劑為IFN- Y (每只小鼠2000 U)和BCG (每只小 鼠0.5 mg)。
將上述成瘤小鼠尾靜脈注射抗原及腫瘤周圍皮下注射佐劑，對(duì)照組尾靜脈和腫 瘤周圍皮下均注射與實(shí)驗(yàn)組等體積的無抗生素和血清的RPMI-1640培養(yǎng)液；佐劑組 尾靜脈注射無抗生素和血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，腫瘤周圍皮下注射佐劑；高劑量 和低劑量抗原加佐劑組尾靜脈注射不同劑量的抗原，腫瘤周圍皮下注射佐劑。每周 給藥一次，共給藥兩次。每3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠腫瘤的長徑和短徑，計(jì)算小鼠 腫瘤的體積(體積二長徑X短徑2《0.5)。注射EMT6/Her2細(xì)胞3周后，將小鼠斷 頸處死，稱量小鼠體重，將腫瘤剝出，稱量腫瘤的重量。結(jié)果如圖9所示。
結(jié)果表明，neu-Fc、 IFN-y和BCG聯(lián)合作用可抑制腫瘤的生長，高劑量的neu-Fc 并未誘導(dǎo)更高的抗腫瘤活性，提示產(chǎn)生的保護(hù)性免疫應(yīng)答不具有劑量依賴性特征。 根據(jù)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果，下面的實(shí)驗(yàn)中采用10pg的抗原劑量。
2) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
EMT6/Her2細(xì)胞用無抗生素和血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成4 X 106/ml，于 右側(cè)腋下皮下注射4一6周齡的雌性Balb/C小鼠，每只小鼠注射0.1ml。注射后的 第6天，可見小鼠注射部位有腫瘤生長，隨機(jī)將小鼠分為4組，分別為對(duì)照組、佐 劑組、抗原組和抗原加佐劑組，每組6只小鼠。其中，抗原為上述實(shí)施例l獲得的 neu-Fc蛋白，抗原的劑量為每只小鼠10嗎，佐劑用量同第一批動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。注射方 法同上，每周給藥一次，共給藥四次。每3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠腫瘤的長徑和短 徑，計(jì)算小鼠腫瘤的體積(體積二長徑X短徑2《0.5)。注射EMT6/Her2細(xì)胞30 天后，將小鼠斷頸處死，稱量小鼠體重，將腫瘤剝出，稱量腫瘤的重量，并按組別 排列照相。腫瘤組織隨后固定于10%中性福爾馬林(Na2HP(X 12H20，3.28g; NaH2P04 *2H20，0. 9g;甲醛，24ral;加水至200ml)中，石蠟包埋，HE染色，顯微鏡 下觀察照相。結(jié)果如圖10所示。其中，圖IOA為不同組別小鼠腫瘤體積的測(cè)定結(jié)
16果，圖IOB為不同組別小鼠腫瘤重量的測(cè)定結(jié)果，圖IOC為不同組別小鼠腫瘤的照片。
從圖10A和10B可以看出，對(duì)照組腫瘤生長迅速，neu-Fc組和IFN- y +BCG 組均產(chǎn)生一定的抑瘤作用，而neu-Fc、 IFN-y和BCG聯(lián)合應(yīng)用則可更有效地抑制 腫瘤生長。圖IOC中，肉眼觀察可見，neu-Fc、 IFN-y和BCG聯(lián)合應(yīng)用組的腫瘤 血管形成減少，腫瘤組織蒼白，而其它各組腫瘤表面可見明顯的血管形成。組織學(xué) 觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠腫瘤組織由大量低分化的細(xì)胞構(gòu)成，腫瘤呈實(shí)性、無腺管樣 結(jié)構(gòu)，鏡下易見核分裂象。neu-Fc、 IFN，和BCG聯(lián)合治療組腫瘤組織有纖維囊膜 包裹，包膜下可見大量細(xì)胞壞死，瘤組織內(nèi)外有大量的中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤， 如圖IOG所示；而對(duì)照組腫瘤則無炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，如圖10D -圖IOF所示。對(duì) 小鼠體重的觀察結(jié)果可知，治療未引起明顯的毒副作用，結(jié)果如圖IOH和圖IOI所 示。此外，小鼠的肝、腎和肺等臟器未見病理改變。
17序列表
〈160〉 2
<210> 1 〈211〉 1395 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈400〉 1
ggctgcaaga已gatctttgg gagcctggca tttttgccgg agagctttga tggggacccc 60
tcctccggca ttgctccgct gaggcctgag cagctccaag tgttcgaaac cctggaggag 120
atcacagg"U acctgtacat ctcagcatgg ccagacagtc tccgtgacct cagtgtcttc 180
cagaaccttc gaatcattcg gggacggatt ctccacgatg gcgcgtact:c attgacactg 240
c卿gcctgg ggatccactc gctggggctg cgctcactgc gggagctggg cagtggattg 300
gctctgattc accgcaacgc ccatctctgc tttgtacaca ctgtaccttg ggaccagctc 360
ttccggaacc cacatcaggc cctgctccac agtgggaacc ggccggaaga ggattgtggt 420
ctcgagggct tggtctgtaa ctcactgtgt gcccacgggc actgctgggg gccagggccc 480
acccagtgtg tcaactgcag tcatttcctt cggggccagg agtgtgtgga ggagtgccga 540
gtatggaagg ggctcccccg ggagtatgtg agtgacsagc gctgtctgcc gtgtcacccc 600
gagtgtcagc ctc肌犯cag ctcagagacc tgctttggat cggaggctga tcagtgtgca 660
gcctgcgccc actacaagga ctcgtcctcc tgtgtggctc gctgccccag tggtgtgaaa 720
ccgacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 780
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 840
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtx 960
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020
tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 1140
agcctgacc"t gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200
aatgggcagc cggagaac船ctacaagacc acgcctcccg tgctggactx cgacggcccc 1260
ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1320
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctxtccctg 1380
tctccgggta aataa 1395
〈210〉 2
18<211〉 464 <212> PRT 〈213〉 人工序列
〈400〉 2
Gly Cys Lys Lys lie Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe 15 10 15
Asp Gly Asp Pro Ser Ser Gly lie Ala Pro Leu Arg Pro Glu Gin Leu 20 25 30
Gin Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu lie Thr Gly Tyr Leu Tyr lie Ser 35 40 45
Ala Trp Pro Asp Ser Leu Arg Asp Leu Ser Val Phe Gin Asn Leu Arg 50 55 60
lie lie Arg Gly Arg lie Leu His Asp Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu 65 70 75 80
Gin Gly Leu Gly lie His Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu 85 90 95
Gly Ser Gly Leu Ala Leu lie His Arg Asn Ala His Leu Cys Phe Val
19100 105 110
His Thr Val Pro Trp Asp Gin Leu Phe Arg Asn Pro His Gin Ala Leu 115 120 125
Leu His Ser Gly Asn Arg Pro Glu Glu Asp Cys Gly Leu Glu Gly Leu 130 135 140
Val Cys Asn Ser Leu Cys Ala His Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro 145 150 155 160
Thr Gin Cys Val Asn Cys Ser His Phe Leu Arg Gly Gin Glu Cys Val 165 170 175
Glu Glu Cys Arg Val Trp Lys Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Ser Asp 180 185 190
Lys Arg Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gin Pro Gin Asn Ser Ser 195 200 205
Glu Thr Cys Phe Gly Ser Glu Ala Asp Gin Cys Ala Ala Cys Ala His 210 215 220
20Tyr Lys Asp Ser Ser Ser Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys 225 230 235 240
Pro Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 245 250 255
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met工le Ser Arg 260 265 270
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 275 280 285
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 290 295 300
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 305 310 315 320
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 325 330 335
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr
21340 345 350
lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 355 360 365
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 370 375 380
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser 385 390 395 400
Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 405 410 415
Ser Asp Gly Pro Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 420 425 430
Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 435 440 445
Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460
2權(quán)利要求
1、一種融合蛋白是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗腫瘤活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2、 權(quán)利要求l所述融合蛋白的編碼基因。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示。
4、 含有權(quán)利要求2或3所述融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞 系或重組菌。
5、 一種預(yù)防和/或治療腫瘤的疫苗，它的活性成分是權(quán)利要求1所述的融合蛋白。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的疫苗，其特征在于所述腫瘤為乳腺癌。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗，其特征在于所述疫苗中還含有佐劑，所述佐劑為GM-CSF和BCG。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗，其特征在于所述疫苗中還含有佐劑，所述 佐劑為IFN-y和BCG。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有抗腫瘤活性的融合蛋白。該融合蛋白是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與抗腫瘤相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。以該融合蛋白為活性成分并加入佐劑GM-CSF和BCG或IFN-γ和BCG制成的疫苗對(duì)腫瘤生長有明顯的抑制作用，腫瘤HE染色切片中可以觀察到，腫瘤組織內(nèi)和包膜周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤，證明佐劑輔助融合蛋白可誘導(dǎo)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。
文檔編號(hào)C07K19/00GK101638440SQ20081014714
公開日2010年2月3日 申請(qǐng)日期2008年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月29日
發(fā)明者明 施, 解志剛, 寧 郭 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所