專利名稱：：N-[4-(1-氰基環(huán)戊基)苯基]-2-(4-吡啶甲基)氨基-3-吡啶甲酰胺的鹽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及N-[4-(l-氰基環(huán)戊基)苯基]-2-(4-批啶甲基)氨基-3-吡啶甲酰胺的可藥用鹽。
背景技術(shù)：
：在惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中，腫瘤的新生血管形成起著非常重要的作用。當(dāng)腫瘤的體積生長超過lmmS時，需要生成新的血管或者從已有的血管上出芽生成血管分支，以提供足夠的血支持腫瘤細(xì)胞的存活。腫瘤的生長速度與轉(zhuǎn)移傾向性與促血管新生因子水平以及新生的微血管數(shù)量有關(guān)。自從上世紀(jì)70年代初Folkman提出"抗血管生成治療"的假說之后，人們對這一領(lǐng)域的認(rèn)識有了長足的進(jìn)展，抑制腫瘤新生血管生成已被公認(rèn)為一種嶄新的抗癌策略。酪氨酸激酶血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體(VEGFR)在腫瘤的新生血管生成中具極其重要的作用，是阻斷腫瘤新生血管生成中的重要靶點(diǎn)。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是體內(nèi)最主要促進(jìn)血管生成的因子。VEGF與位于內(nèi)皮細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)結(jié)合后導(dǎo)致多種血管生成的反應(yīng)，如細(xì)胞增殖、遷移、血管通透性增加、內(nèi)皮細(xì)胞前體從骨髓移出。VEGFR家族的成員包括VEGFR1(Flt-1)、VEGFR2(KDR/Flk-1)、VEGFR3(Flt-4)。促血管生成主要由VEGF與VEGFR2(KDR/Flk-1)結(jié)合后介導(dǎo)。大量的人類腫瘤顯示出較高的VEGFR水平。目前已有VEGF及其受體VEGFR的單克隆抗體及VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制劑40多種抑制新生血管生血管生成的藥物進(jìn)入臨床研究。Genetech公司經(jīng)過十幾年研制成功的VEGF單克隆抗體Avastin已于2004年批準(zhǔn)上市。Avastin對結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌的合用療效證實了其作為抗VEGF藥的機(jī)理是可行的，亦對抗新生血管生成作為抗癌瘤靶點(diǎn)的機(jī)理做出了巨大的貢獻(xiàn)。VEGFR的小分子抑制劑近年來最令人矚目的藥物包括諾華(Novartis)/先靈公司研發(fā)的治療結(jié)直腸癌的VEGFR抑制劑Vatalanib(PTK787)，以及阿斯利康公司治療復(fù)發(fā)/難治性非小細(xì)胞肺癌的VEGFR和表皮生長因子受體(EGFR)雙靶點(diǎn)3抑制劑Zactima(ZD-6474)。VEGF抑制劑日漸成為一種非常具有應(yīng)用前景的新型非細(xì)胞毒抗腫瘤藥物。與抑制腫瘤生長的傳統(tǒng)細(xì)胞毒藥物相比，靶向新生血管生成的治療藥物具有更高的特異性、更低的毒性，以及有利于克服腫瘤的耐藥性，并且可用于多種腫瘤的治療。N-[4-(1-氰基環(huán)戊基)苯基]-2-(4-吡啶甲基)氨基-3-吡啶甲酰胺(以下稱"化合物A")為新一代酪氨酸激酶抑制劑，該化合物的結(jié)構(gòu)如下結(jié)構(gòu)式(I)所示結(jié)構(gòu)式(I):化合物A上述化合物被記載于中國專利申請第02138671.4中，該文獻(xiàn)的相關(guān)內(nèi)容可作為本申請的參考。在不同的實驗室酪氨酸激酶受體酶水平檢測中已發(fā)現(xiàn)化合物A對VEGFR-2具有很強(qiáng)的選擇性抑制作用，IC5o為1nM左右。另外對Ret，VEGFR-1，PDGFR-P，c-kit，cSRC等激酶也具有一定的選擇性抑制活性。人類腫瘤裸鼠異體移植藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，化合物A對結(jié)腸癌Lsl74t裸鼠異體移植瘤的藥效明顯強(qiáng)于PTK787;化合物A與奧沙利鉑合用提高藥效，但不增加毒性；無論單用還是合用療效均優(yōu)于PTK787。對非細(xì)胞肺癌A549裸鼠異體移植瘤的藥效明顯強(qiáng)于PTK787，最大藥效與常規(guī)劑量下ZD6474的藥效相當(dāng)。毒性方面，化合物A在最大的給藥劑量400mg/kg裸鼠能夠較好耐受。但在藥物研究過程中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)討-[4-(1-氰基環(huán)戊基)苯基]-2-(4-吡啶甲基)氨基-3-吡錠甲酰胺在穩(wěn)定性、生物利用度等方面仍然不能令人滿意。
發(fā)明內(nèi)容針對該化合物在使用過程中存在的穩(wěn)定性、生物利用度等問題，本發(fā)明人經(jīng)過長期努力，發(fā)現(xiàn)將N-[4-(l-氰基環(huán)戊基)苯基]-2-(4-吡啶甲基)氨基-3-吡啶甲酰胺制備成相應(yīng)的可藥用鹽能夠解決這一問題。本發(fā)明第一方面涉及1^[4-(1-氰基環(huán)戊基)苯基]-2-(4-吡啶甲基)氨基-3-吡啶甲酰胺的可藥用鹽，其中所述的可藥用鹽為本領(lǐng)域常規(guī)的無機(jī)鹽或者有機(jī)鹽，進(jìn)一步的，所述的無機(jī)鹽優(yōu)選為鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽以及磷酸鹽；所述的有機(jī)鹽優(yōu)選為甲磺酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、醋酸鹽、三氟醋酸鹽、富馬酸鹽、檸檬酸鹽、枸櫞酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、萘磺酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽。尤其優(yōu)選可藥用鹽為甲磺酸鹽和鹽酸鹽，其相對于其他鹽在穩(wěn)定性、性狀以及生物利用度方面更具優(yōu)勢。本發(fā)明第二方面涉及N-[4-(l-氰基環(huán)戊基)苯基]-2-(4-吡啶甲基)氨基-3-吡啶甲酰胺的可藥用鹽的制備，該化合物的制備可根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)的成鹽方法制備。本發(fā)明第三方面涉及一種藥物組合物，該藥物組合物含有治療有效量的^[4-(1-氰基環(huán)戊基)苯基]-2-(4-吡啶甲基)氨基-3-吡啶甲酰胺的可藥用鹽，其中，該藥物組合物中還可以含有一種或者多種可藥用載體。本發(fā)明第四方面涉及N-[4-(l-氰基環(huán)戊基)苯基]-2-(4-吡啶甲基)氨基-3-吡啶甲酰胺的可藥用鹽在制備治療抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。圖1:化合物A的甲磺酸鹽、PTK787對人結(jié)腸癌Lsl74t裸小鼠移植瘤的療效。圖2:化合物A的甲磺酸鹽、PTK787對人結(jié)腸癌HT-29裸小鼠移植瘤的療效。圖3:大鼠口服化合物A的鹽酸鹽(Rat13),化合物A的磷酸鹽(Rat46),化合物A的馬來酸(Rat79)，和化合物A的甲磺酸(Rat1012)20mg/kg藥一時曲線圖。具體實施例方式一、化合物A可藥用鹽的制備制備實施例l、化合物A的鹽酸鹽制備5.049g化合物A(12.7mmo1)懸浮于120ml乙醇中，滴加鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5322mol/L)23.89ml，加熱至回流，固體溶清(如有不溶物可以熱過濾)，自然冷至室溫(23eC)有晶狀固體析出。抽濾，濾餅用乙醇(20mlx2)洗滌，抽干后轉(zhuǎn)至真空干燥箱中(CaCl2)80°C水泵抽干5h，得化合物A的鹽酸鹽3.619g(65.7%)。熔程200202.5。C。水分5.1%。溶劑殘留0.025%。制備實施例2、化合物A的硫酸鹽制備3.092g化合物A(7.778mmol)懸浮于120ml乙醇中，滴加硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5234mol/L)14.89ml(7.793mmol)，加熱至回流，固體溶清(如有不溶物可以熱過濾)，減壓濃縮至lOOml，自然冷至室溫(23°C)有晶狀固體析出。抽濾，濾餅用乙醇(8mlx2)洗滌，抽干后轉(zhuǎn)至真空干燥箱中(CaCl2)80°C水泵抽干5h，得化合物A的硫酸鹽2.662g(據(jù)游離堿含量計算產(chǎn)率57.7%)。熔程199.5230°C(未熔清)。制備實施例3、化合物A的磷酸鹽制備1.910g化合物A(4.805mmol)與225ml乙醇、磷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5008mol/L)9.29ml(4.803mmol)，加熱至回流，4h后固體溶清，自然冷至室溫(25°C)有晶狀固體析出。抽濾，濾餅用乙醇(5mlx2)洗滌，抽干后轉(zhuǎn)至真空干燥箱中(CaCl2)80°C水泵抽干6h，得化合物A磷酸鹽1.150g(據(jù)游離堿含量計算產(chǎn)率46.1%)。熔程205258°C(未熔清)。制備實施例4、化合物A的甲磺酸鹽在5L反應(yīng)瓶中，投入化合物A170g(0.428mo1)，甲垸磺酸42.5g(0.442mol)，95y。異丙醇水溶液2.55L，在氮?dú)獗Ｗo(hù)并避光條件下攪拌加熱至全溶，得淡黃色透明溶液，趁熱過濾，冷卻析晶至室溫后過濾，異丙醇洗，真空干燥，得白色針狀晶體180.2g(0.365mo1)，收率85.4%。在5L反應(yīng)瓶中，投入化合物A的甲磺酸鹽180.2g,95。/。異丙醇水溶液2.52L，氮?dú)獗Ｗo(hù)并避光條件下攪拌加熱至全溶，趁熱過濾，濾液冷卻析晶至室溫，過濾，異丙醇洗，真空干燥，得白色針狀晶體161.5g，收率89.6%。熔程193.5195°C。制備實施例5、化合物A的檸檬酸鹽2.886克化合物A游離堿，0.522克檸檬酸與80mL乙醇混合加熱近沸，固體溶清成無色清亮溶液，冷至室溫，析出白色晶狀固體，抽濾，濾餅用乙醇洗滌(3mLx2)，于真空干燥箱中80°(:抽6小時，得白色針狀固體2.283克，收率79%。熔程160.5~162.0。C。6制備實施例6、化合物A的馬來酸鹽2.508克化合物A游離堿，0.351克馬來酸與U0mL乙醇混合加熱回流，固體溶清成淺黃色溶液，有少量絮狀不溶物加活性炭煮沸后熱過濾除去，濾液稍濃縮至90mL，冷至室溫，析出淺黃色晶狀固體，抽濾，濾餅用少量乙醇洗滌，于真空千燥箱中80。C抽6小時，得淺黃色針狀固體1.009克，收率40%。熔程115~160°C。制備實施例7、化合物A的琥珀酸鹽2.827克化合物A游離堿，0.401克琥珀酸與70mL乙醇混合加熱回流，固體溶清，有少量絮狀不溶物加活性炭煮沸10分鐘后熱過濾除去，濾液濃縮至25mL，冷至室溫，析出白色晶狀固體，抽濾，濾餅用少量乙醇洗滌，于真空干燥箱中80。C抽6小時，得淺黃色針狀固體1.009克，收率77%。熔程117-161.5°C。二、化合物A可藥用鹽的相關(guān)性質(zhì)1、性狀化合物A化合物A的鹽酸鹽化合物A的馬來酸鹽化合物A的磷酸鹽化合物A的甲磺酸鹽性狀類白色固體淡黃色結(jié)晶白色細(xì)長針狀結(jié)晶白色粒狀結(jié)晶白色細(xì)短針狀結(jié)晶2、熔點(diǎn)化合物A化合物A的鹽酸鹽化合物A的馬來酸鹽化合物A的硫酸鹽化合物A的磷酸鹽化合物A的甲磺酸鹽熔點(diǎn)158.5161.5。C(15CTC開始有發(fā)毛現(xiàn)象)200202.5。C159.5160.5'C熔融分解199.5230°C(未熔清)205258°C(未熔清)193.5195°C73、溶解性化合物A化合物A的鹽酸鹽化合物A的馬來酸鹽化合物A的磷酸鹽化合物A的甲磺酸鹽水溶性不溶極微溶解，有乳光不溶不溶不溶乙醇溶解度0.1g/23ml微溶0.1g/40ml微溶0.1g/25ml微溶0.1g/49ml微溶0.1g/20ml微溶4、穩(wěn)定性化合物A的不同種類的可藥用鹽在不同條件下的穩(wěn)定性(原料起始純度99.6%，采用HPLC法測定含量)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>結(jié)論從上述穩(wěn)定性試驗的結(jié)果可以看出鹽酸鹽和甲磺酸鹽的穩(wěn)定性最令人滿意，特別是甲磺酸鹽具有非常好的穩(wěn)定性。三、化合物A可藥用鹽的相關(guān)藥理活性研究實施例1:化合物A的甲磺酸鹽對受體蛋白酪氨酸激酶的抑制作用(一)方法ELISA法(IPosner等，J.Biol.Chem.,Oct,1992,Vol.267，Issue29:20638-20647):將酶反應(yīng)底物Poly(Glu，Tyr)4:1包被酶標(biāo)板，加入酶、樣品、ATP等反應(yīng)，用抗磷酸化酪氨酸的單抗(PY99)檢測底物磷酸化，再加HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，OPD顯色檢測底物磷酸化程度；同時設(shè)無酪氨酸激酶的對照和相應(yīng)DMSO濃度的對照孔；加入2MH2S0450^1/孔中止反應(yīng)，用可調(diào)波長式微孔板酶標(biāo)儀VERSAmax(Sunnyvale,CA，USA)讀數(shù)，比色反應(yīng)，觀察OD490nm值?；衔颫D值—無酶對照孔OD值抑制率=(1—-)xi00%陰性對照組OD值一無酶對照孔OD值測定藥物對酪氨酸激酶蛋白的相對抑制率。根據(jù)各濃度抑制率，采用LOGIT法計算半數(shù)抑制濃度ICM)。以上每個實驗重復(fù)3次，求出3次實驗的平均ICso值作為抑制能力的最終指標(biāo)。(二)結(jié)果化合物A的甲磺酸鹽以及陽性對照化合物PTK787對八種酪氨酸激酶抑制作用的檢測結(jié)果見表1。結(jié)果顯示化合物A的甲磺酸鹽在分子水平對KDR、Fltl、PDGFRp、c-Kit、c-Src的激酶活性呈明顯的抑制作用，其半數(shù)抑制濃度(IC5o)分別為2.43nM、70.08nM、537.31nM、420.31nM、348.53nM;陽性對照化合物PTK787對KDR、Fltl、PDGFRf3、c-Kit的激酶活性抑制的ICso分別為33.30nM、84.69nM、416.51nM、606.11nM。結(jié)果表明，化合物A的甲磺酸鹽對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體l、2(Fltl/VEGFR1、KDR/VEGFR2)的激酶活性都有很強(qiáng)的抑制作用，其中對KDR激酶的抑制作用明顯強(qiáng)于其對Fltl的抑制作用，并且對KDR激酶的IC50比陽性對照化合物低了13.7倍，即化合物A的甲磺酸鹽對KDR的抑制作用強(qiáng)于PTK787。同時化合物A的甲磺酸鹽對第三類受體酪氨酸激酶的其它成員血小板衍生生長因子受體P(PDGFRP)、干細(xì)胞生長因子受體(c-Kit)也有相當(dāng)?shù)囊种谱饔茫跤谄鋵ρ軆?nèi)皮細(xì)胞生長因子受體的抑制作用。陽性化合物PTK787對非受體酪氨酸激酶c-Src當(dāng)濃度上升到104nM時無抑制作用，而化合物A的甲磺酸鹽對c-Src激酶活性抑制的ICso為348.53nM。而當(dāng)濃度上升到104nM時，化合物A的甲磺酸鹽對來自其它家族激酶如表皮細(xì)胞生長因子受體EGFR1和ErbB2、成纖維細(xì)胞生長因子受體FGFR1的激酶活性無抑制作用。同時實驗結(jié)果還表明化合物A的甲磺酸鹽在分子水平上對于KDR激酶活性的抑制作用強(qiáng)于陽性化合物PTK787，對所測酪氨酸激酶Fltl、PDGFR、c-Kit的抑制作用基本一致，抑制強(qiáng)度處于同一水平，化合物A的甲磺酸鹽在選擇性上比PTK787范圍廣，它對非受體酪氨酸激酶c-Src的激酶活性也有抑制作用。綜上所述，化合物A的甲磺酸鹽是一個對KDR具有明顯選擇性抑制作用的酪氨酸激酶抑制劑，同時伴有對Fltl、PDGFR、c-Kit、c-Src等激酶的抑制作用。表l.化合物A的甲磺酸鹽對酪氨酸激酶的作用*KinasePTK787(IC50±SDnM)化合物A的甲磺酸鹽(IC5()±SDnM)KDR33.30±14.452.43±1.30Fltl84.69±20.6570.08±29.36PDGFRp416.51±143.73537.31±跳46c-Kit606.11±77.93420.31±40.37EGFR1>10,000>10,000ErbB2>10,000>10,000FGFR1>10,000>10,000c-Src>10,000348.53±194.42實施例2:化合物A的甲磺酸鹽對人結(jié)腸癌Lsl74t裸小鼠移植瘤的療效(一)實驗動物BALB/cA-nude裸小鼠，？，5-6周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。合格證號SCXK(滬)2004—0005。飼養(yǎng)環(huán)境SPF級。(二)實驗歩驟動物經(jīng)l周適應(yīng)后，皮下接種人結(jié)腸癌Lsl74t瘤塊組織，待腫瘤生長至100-300mm3后，將動物隨機(jī)分組(d0)。給藥劑量化合物A的甲磺酸鹽50mg/kg，100mg/kg，200mg/kg;PTK78750mg/kg，100mg/kg,200mg/kg。均口服給藥(灌胃)，d0-dl3天，每天1次，共14次。每周測2—3次瘤體積，稱鼠重，記錄數(shù)據(jù)。腫瘤體積(V)計算公式為V=l/2xaxb2其中a、b分別表示長、寬。(三)結(jié)果10酶學(xué)及細(xì)胞水平實驗證明了化合物A的甲磺酸鹽的主要作用耙點(diǎn)為VEGFR2/KDR(IC5Q為2.43±1.30nM);國際上作用靶點(diǎn)類似而且臨床試驗開展較早的化合物是諾華公司的PTK787(對KDR的IC5o為33.30士14.45nM);因此，本實驗選用PTK787作為陽性化合物。根據(jù)化合物A的甲磺酸鹽的預(yù)初試驗以及PTK787的文獻(xiàn)報道[1]，我們選用50、100、200mg/kg三個劑量，采用等劑量、相同給藥方案的方式進(jìn)行療效評價和比較，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，化合物A的甲磺酸鹽劑量依賴性地抑制人結(jié)腸癌Lsl74t的生長；200mg/kg給藥時，T/C。/。達(dá)到16.3%;而PTK787200mg/kg給藥雖也能明顯抑制Lsl74t生長，但T/C。/。只有60.2%，療效明顯不及化合物A的甲磺酸鹽。文獻(xiàn)(IPosner等，J.Biol.Chem.,Oct,1992，Vol.267,Issue29,20638-20647)報道PTK78775mg/kg給藥時，T/C。/。最好時可以達(dá)到40%，而我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTK787100mg/kg給藥時沒有明顯的作用，T/Cy。只有71.5%。對照文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)他們給藥時的起始腫瘤體積較小(25-100mm3),比我們開始給藥時的起始腫瘤體積至少小1.5-6倍；他們給藥時間較長達(dá)28天或以上；還有他們的T/cy。是挑選整個實驗中最好的T/C%，并不是實驗結(jié)束時的T/C%,我們本次實驗時的最佳T/C。/。在給藥后的第10天，此時PTK787100、200mg/kg給藥時的丁/。％分別為60.7%和45.8%，與文獻(xiàn)較為接近。另夕卜，還要強(qiáng)調(diào)的是，由于影響實驗療效的因素很多，只有在同一系統(tǒng)才能比較，本實驗的PTK787療效雖與文獻(xiàn)報道不是很一致，但不影響化合物A的甲磺酸鹽與它的療效比較。從表2可以算出，化合物A的甲磺酸鹽對結(jié)腸癌Lsl74t的ED50為97.2mg/kg，而PTK787的ED50為458.7mg/kg，說明化合物A的甲磺酸鹽對Lsl74t的療效明顯優(yōu)于PTK787。還需要指出的是，我們曾經(jīng)把化合物A的甲磺酸鹽和PTK787的劑量上推到400mg/kg進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)小鼠對以上二個化合物雖然仍能耐受，但療效并沒有明顯增加，量一效關(guān)系不是很明顯，結(jié)果類似于另一個血管生成抑制劑SU11248,因此，在以后的實驗中，我們主要選用化合物A的甲磺酸鹽200、100、50mg/kg劑量對其進(jìn)行療效評價。按照本實驗方案，荷瘤小鼠連續(xù)給藥14天，小鼠對二個化合物均能很好地耐受，沒有明顯的體重下降，并且在本實驗方案下，二個化合物的毒性相差不大。表2.口服(p.o)化合物A的甲磺酸鹽、PTK787對人結(jié)腸癌Lsl74t裸小鼠移植瘤的療效組別劑量動物數(shù)去瘤后體重TVRTVT/C(%)(mg/kg)(克)x±SDx±SDdOdndOdndOdn對照121218.616.6165±321978±44512.3±3.4化合物A的506619.116.8155±331452±1499.8±3.079.7甲破酸鹽化合物A的1006619.018.516士44931±1966.4±3.152.0a甲磺酸鹽化合物A的2006618.618.5158±20310±1142.0±0.916.3a甲磺酸鹽PTK787506619.517.6171±391425±6139.4±5.976.4PTK7871006619.317.3175±431538±4028.8±3.571.5PTK78720066]8.817.1150±251076±1987.4±2.060.2a'bdO:分籠給藥時間；dn:第1次給藥后14天。aP<0.01vs對照；bP<0.01vs化合物A的甲磺酸鹽200mg/kg組。實施例3:化合物A的甲磺酸鹽對人結(jié)腸癌HT-29裸小鼠移植瘤的療效(一)實驗動物BALB/cA-nude裸小鼠，$，5-6周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。合格證號SCXK(滬)2004—0005。飼養(yǎng)環(huán)境SPF級。(二)實驗步驟動物經(jīng)1周適應(yīng)后，皮下接種人結(jié)腸癌HT-29瘤塊組織，待腫瘤生長至100-300mmS后，將動物隨機(jī)分組(dO)。給藥劑量化合物A的甲磺酸鹽50mg/kg，100mg/kg，200mg/kg;PTK787200mg/kg。均口服給藥(灌胃)，d0-d20，每天1次，共21次。每周測2_3次瘤體積，稱鼠重，記錄數(shù)據(jù)。腫瘤體積(V)計算公式為V=l/2xaxb2其中a、b分別表示長、寬。(三)結(jié)果(見表3):結(jié)果表明，化合物A的甲磺酸鹽明顯抑制人結(jié)腸癌HT-29的生長，抑制作用具有明顯的劑量依賴性。PTK787也有較好的療效，但不及化合物A的甲磺酸鹽，200mg/kg給藥時，化合物A的甲磺酸鹽和PTK787的T/C。/。分別為25.5%和56.5%,二者有顯著性差異(P〈0.01)，說明化合物A的甲磺酸鹽對結(jié)腸癌HT-29的療效明顯優(yōu)于PTK787。另夕卜，荷瘤小鼠對化合物A的甲磺酸鹽和PTK787均能較好地耐受，二者毒性相當(dāng)。12表3.口服(p.o)化合物A的甲磺酸鹽、PTK787對人結(jié)腸癌HT-29裸小鼠移植瘤的療效￥1ii^~~動物數(shù)~去瘤后體重^S;F^T/C(%)量(克)x±SDx士SD(mg/kg)d0dnd0dndOdn對照121216.814.1229±381945±4998.67±2.41化合物A的506616.114.3239±491250±2565.42±1.5562.5甲磺酸鹽化合物A的訓(xùn)6617.016.4272±37998±2963.78±1.4643.6a甲磺酸鹽化合物A的2006616.315.6260±39571±1472.21±0.5225.5a甲磺酸鹽56.5a'bPTK7872006615.913.9252±431185±1434.9士1.36dO:分籠給藥時間；dn:第1次給藥后21天。aP<0.01vs對照；bP<0.01vs化合物A的甲磺酸鹽200mg/kg組。實施例4:化合物A口服生物利用度的研究(一)試驗動物雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(體重~250g，實驗動物質(zhì)量合格證號0006473)由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司(許可證號SCXK滬2003-0003))由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供。外購SD大鼠到達(dá)后，首先對實驗動物的有關(guān)證明材料和健康情況進(jìn)行檢査，合格后進(jìn)入上海藥物研究所動物中心清潔級大鼠房。(二)試驗儀器液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng)(LC/MS/MS)包括美國AgilentllOO系列二元泵、在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱，以及美國ThermoFinnigan公司TSQQuantum三重四極桿質(zhì)譜儀，系統(tǒng)工作軟件為Xcalibur和Chemstation(美國)。其它試驗用儀器包括Techne氮?dú)獯蹈裳b置(德國)；_80°C超低溫SANYO冰箱(日本)；VibraxVXR小型搖床(德國)；MS1渦旋混合器(德國)；92-2定時恒溫磁力攪拌器(上海)；METTLERAE240雙量程電子分析天平(0.01mg/41g，0.1mg/205g)(德國)。EPPENDORF連續(xù)加液器(德國)等。(三)實驗方法1、LC/MS/MS分析條件液相色譜分析條件色譜柱AgilentZorbaxSB-Cl8柱(50mmx2.1mmID);柱溫25°C;流動相A:H2O-CH3CN(2:98,v/v),B:H2O-CH3CN(10:90，v/v)A:25%+B:75%,等梯度洗脫；流速0.25mL/min;進(jìn)樣量10HL;分析時間3min。2、大鼠試驗清潔級大鼠房為12/12h白天/黑夜循環(huán)，其濕度和溫度分別為40-60%和20-24°C。每4只大鼠飼養(yǎng)在一個大小為36x24x19cm3的不銹鋼鼠籠中。自由飲水并每天一次定時喂食專門的大鼠飼料。大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，方可用于開展藥代動物實驗。Sprague-Dawley大鼠3只，分別口服給藥化合物A，劑量為20mg/kg。精確稱取化合物A粉末24mg，先用4mL水溶解，置于研缽中，研磨均勻，再用8mL水洗至15mL試管中，得到濃度2mg/mL的混懸液，供動物試驗用。于給藥前Oh和給藥后0.083、0.25、0.5、1.0、2、4、6、及8h采血。采血前用乙醚呼吸麻醉后(嚴(yán)格控制麻醉程度)，從眼后靜脈竇采血250300nL/時間點(diǎn)，并收集于事先加入肝素的試管中。采血后離心制備血槳，并按50nL分裝成二份，于-70。C保存直至分析。按LC/MS/MS方法分析各動物不同時間點(diǎn)的血樣中化合物A的濃度。使用過的大鼠用C02氣體使其安樂死。各組動物試驗的藥動學(xué)參數(shù)用InnaPhaseKinetica軟件(美國)計算。3、大鼠試驗結(jié)果表4、SD大鼠口服化合物A(20mg/kg)后的藥動學(xué)參數(shù)(非室模型分析)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>色譜柱AgilentZorbaxSB-Cl8柱(50mmx2.1mmID);柱溫25°C;流動相A:H2O-CH3CN(2:98,v/v),B:H2O-CH3CN(10:90,v/v)A:25%+B:75%,等梯度洗脫；流速0.25ml7min;進(jìn)樣量10nL;分析時間3min。2、大鼠試驗清潔級大鼠房為12/12h白天/黑夜循環(huán)，其濕度和溫度分別為40-60%和20-24°C。每4只大鼠飼養(yǎng)在一個大小為36x24xl9cmS的不銹鋼鼠籠中。自由飲水并每天一次定時喂食專門的大鼠飼料。大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，方可用于開展藥代動物實驗。Sprague-Dawley大鼠12只，分成4組，每組動物數(shù)為3，四組分別口服給藥化合物A的鹽酸鹽、磷酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽，劑量均為20mg/kg。精確稱取化合物A的鹽酸鹽、磷酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、粉末24mg，先用4mL水溶解，置于研缽中，研磨均勻，再用8mL水洗至15mL試管中，得到濃度2mg/mL的混懸液，供動物試驗用。于給藥前Oh和給藥后0.083、0.25、0.5、1.0、2、4、6、及8h采血。采血前用乙醚呼吸麻醉后(嚴(yán)格控制麻醉程度)，從眼后靜脈竇采血250300^L/時間點(diǎn)，并收集于事先加入肝素的試管中。采血后離心制備血漿，并按50pL分裝成二份，于-70。C保存直至分析。按LC/MS/MS方法分析各動物不同時間點(diǎn)的血樣中化合物A的濃度。使用過的大鼠用C02氣體使其安樂死。各組動物試驗的藥動學(xué)參數(shù)用InnaPhaseKineticaTM軟件(美國)計算。3、大鼠試驗結(jié)果化合物A的鹽酸鹽、磷酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽四組大鼠口服給藥20mg/kg后不同時間點(diǎn)的血藥濃度，分別列于表5和6，相對應(yīng)的血藥濃度-時間曲線分別見圖3。藥動學(xué)參數(shù)見表7和8。表5大鼠口服化合物A的鹽酸鹽和化合物A的磷酸鹽20mg/kg后化合物A的不同時間血藥濃度16血藥濃度(ng/mL)米皿叮問磷酸鹽(h)大鼠1大鼠2大鼠3大鼠4大鼠5大鼠600000000.08354.621.6ND30.623.31.880,258432701422181153750.549133619922295.0188149313317992.873.9212211011121219.856.418442.9071.81145.8819.167.861.8838.265.20.14422.00,7358ND15.960.40.42124.7ND表6大鼠口服化合物A的馬來酸鹽和化合物A的甲磺酸鹽20mg/kg后化合物A的不同時間血藥濃度采血時間血藥濃度(ng/mL)馬來酸鹽甲磺酸鹽(h)大鼠7大鼠8大鼠9大鼠10大鼠11大鼠1200000000.08318.012.23.7913.226.915.70.2533.91861647944002040,559.7126149672469203144.817627.125237094.4236.074.022411622886.9414.030.716430.554.633.565.128.4946.10.卯73.248.6580.4620.7753.67NDND29.9藥代參表7大鼠口服單劑量化合物A的鹽酸鹽和化合物A的磷酸鹽(均為20mg/kg)后化合物A的藥動學(xué)參數(shù)(非室模型分析)±卜齢±卜磷酸鹽大鼠1大鼠2大鼠3Mean士SD大鼠4大鼠5大鼠6Mean±SD336212463±334221.71114.55375.42237±1310.502.000.92±0.950.500.250.250.33±0.14669967814±149224.83214.30659.67366±2541.983.201.96±1.250.811.510.751.02±0.430.350.160.50±0.430.860.460.920.75±0.2517//隱t、843(ng/mL)r薩(h)0.25，卩"h、805(ng.h/mL)o9爐7"(h)CX(L/h/kg)(L/kg)0.983.086.243.43±2.641.012.341.831.73±0.6724.827.915.022.6±6.788.977.630.265.6±31.124.485.993.567.9±37.989.8181.355.3108.8±65.1Cn時的時間；Jf/C(o—8h):血槳藥物濃度-時間曲線下面積(0至8小時)；JC/A/CQ》8h:一階矩-時間曲線下面積(0至8小時)；r1/2:半衰期；Kd:消除速率常數(shù)；Afir:一個分子在體內(nèi)的平均駐留時間；C丄血槳藥物總清除率；Fd:建立在血漿濃度基礎(chǔ)上的表觀分布體積。表8大鼠口服單劑量化合物A的馬來酸鹽和化合物A的甲磺酸鹽(均為20mg/kg)后化合物A的藥動學(xué)參數(shù)(非室模型分析)藥代參馬來酸鹽甲磺酸鹽5、J1Vj鄉(xiāng)數(shù)大鼠7大鼠8大鼠9Mean±SD大鼠10大鼠11大鼠12Mean±SD(ng/mL)59.68186.39224.42156±86794.42468.62203.86489±296Tmax(h)0.500.252.000.92±0.940.250.500.250.33±0.14(ng,h/mL)151.13388.28827.22456±343784.11925.94380.10697±2830.810.750.730.77±0.040.630.651.320.87±0.39《el(h-1)0.850.920.950.91±0.051.101.060.530.90±0.32(h)2.201.913.092.40±0.611.181.612.131.64±0.48c丄(L臘g)131.751.424.069.1±5625.521.550.232.4±15.5(L/kg)290.298.374.3154.2±118.330.134.7107.057.3±43.2cmax:血管外給藥后血漿最高藥物濃度；rmax:血管外給藥時，達(dá)到最大血藥濃度時的時間；Jf/C(o—8h):血漿藥物濃度-時間曲線下面積(0至8小時)；JMWCo^h:一階矩-時間曲線下面積(0至8小時)；71/2:半衰期；JQ:消除速率常數(shù)；ik漢7:一個分子在體內(nèi)的平均駐留時間；CZ:血漿藥物總清除率；建立在血漿濃度基礎(chǔ)上的表觀分布體積。表9化合物A的可藥用鹽制劑大鼠試驗相對口服生物利用度_鹽酸鹽磷酸鹽馬來酸鹽甲磺酸鹽433.93495.47513.54493.5818C隨(ng/mL)T隨(h)v4f/C04h(ng'h/mL)jVC。h'她,(ng-h/mL)RelativeF2046463±3340.92±0.95814±14940237±1310.33±0.14366±25439156±860.92±0.94456±34341489±2960.33±0.14697±28317653±32329074±629211697±880717194±6984鹽酸鹽>甲磺酸鹽〉馬來酸鹽>磷酸鹽*Cmax:血管外給藥后血漿最高藥物濃度；Tmax:血管外給藥時，達(dá)到最大血藥濃度時的時間；AUC(0—8h):血漿藥物濃度-時間曲線下面積(0至8小時)；AUC0—8hMoldose(ng.h/mL):給藥lmmol/kg時血漿藥物濃度-時間曲線下面積(0至8小時);RelativeF:相對生物利用度。結(jié)論通過比與實施例4測定的化合物A的生物利用度比較，發(fā)現(xiàn)本申請所提供的化合物的鹽大大改善了化合物A的生物利用度，特別是鹽酸鹽和甲磺酸鹽。四、制劑制備實施例l:片劑處方化合物A的甲磺酸鹽淀粉2%淀粉漿硬脂酸鎂100g20g適量0.5g1000片制備工藝化合物A的可藥用鹽過100200目篩，與淀粉混勻，加2%淀粉漿制粒，干燥，加硬脂酸鎂混勻，壓片，檢測，合格，包裝。制備實施例2:膠囊處方化合物A的甲磺酸鹽淀粉50g10g微晶纖維素5g1%淀粉漿適量0.25g1000粒膠囊制備工藝常規(guī)制粒，裝膠囊，檢測，包裝。權(quán)利要求1、N-[4-(1-氰基環(huán)戊基)苯基]-2-(4-吡啶甲基)氨基-3-吡啶甲酰胺的可藥用鹽。2、權(quán)利要求1的化合物，其中所述的可藥用鹽為無機(jī)鹽。3、權(quán)利要求l的化合物，其中所述的可藥用鹽為有機(jī)鹽。4、權(quán)利要求l的化合物，其中所述的可藥用鹽為甲磺酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、醋酸鹽、三氟醋酸鹽、富馬酸鹽、檸檬酸鹽、枸櫞酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、萘磺酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽。5、權(quán)利要求1的化合物，其中所述的可藥用鹽為鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、甲磺酸酸鹽以及磷酸鹽。6、權(quán)利要求l的化合物，其中所述的可藥用鹽為甲磺酸鹽。7、權(quán)利要求1的化合物，其中所述的可藥用鹽為鹽酸鹽。8、一種藥物組合物，含有治療有效量的權(quán)利要求1-7任意一項所述的化合物和一種或多種可藥用載體。9、權(quán)利要求l-7任意一項所述化合物在制備治療抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。10、制備權(quán)利要求l-7任意一項所述化合物的方法，所述方法包括將>^-[4-(1-氰基環(huán)戊基)苯基]-2-(4-吡啶甲基)氨基-3-吡啶甲酰胺與相應(yīng)的酸成鹽的步驟。全文摘要本發(fā)明涉及N-[4-(1-氰基環(huán)戊基)苯基]-2-(4-吡啶甲基)氨基-3-吡啶甲酰胺的鹽，尤其是其鹽酸鹽和甲磺酸鹽，及所述鹽在制備治療抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。文檔編號C07D213/82GK101676267SQ20081014965公開日2010年3月24日申請日期2008年9月16日優(yōu)先權(quán)日2008年9月16日發(fā)明者周云曙,孫飄揚(yáng),袁開紅,陳永江申請人:江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司