專利名稱：一種抗農(nóng)藥溴氰菊酯的特異性抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)藥小分子化合物(分子量小于1000道爾頓)免疫化學(xué)和殘留分析 技術(shù)領(lǐng)域涉及有機(jī)合成，免疫化學(xué)，生物化學(xué)技術(shù)等，特別涉及具有二溴菊酸結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥 溴氰菊酯小分子化合物人工半抗原合成和免疫動物特異性抗體制備及其在建立免疫分析 方法方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
擬除蟲菊酯(Pyrethroids)是一類重要的仿生性殺蟲劑，是國家提倡推廣的農(nóng)藥 產(chǎn)品，據(jù)專家預(yù)測，仿生農(nóng)藥仍將是21世紀(jì)新農(nóng)藥開發(fā)的熱點(diǎn)。我國從20世紀(jì)70年代就 開始對這類殺蟲劑進(jìn)行研制，它的合成和應(yīng)用是繼有機(jī)氯殺蟲劑、有機(jī)磷殺蟲劑、氨基甲酸 酯殺蟲劑之后的一個新突破，也是殺蟲劑史上的第三個重要的里程碑。它是目前使用面積 廣、用量大的農(nóng)用及衛(wèi)生殺蟲劑，占?xì)⑾x劑總產(chǎn)量的20%，占整個殺蟲劑使用面積的25%。 隨著其使用量和品種的不斷增加，這類農(nóng)藥的殘留問題已引起人們的廣泛關(guān)注。為此，對農(nóng) 藥溴氰菊酯的殘留限制也越來越嚴(yán)格。 目前對于溴氰菊酯農(nóng)藥檢測的方法主要為氣相色譜法、正相高效液相色譜法和微 型層析柱凈化毛細(xì)管氣相色譜法。但這些方法都存在檢測時間長，前處理復(fù)雜，消耗大量溶 劑，需昂貴儀器等缺點(diǎn)，并且不能進(jìn)行現(xiàn)場在線檢測或跟蹤監(jiān)測。因此，迫切需要發(fā)明一種 簡便，快速，靈敏的檢測方法。 酶聯(lián)免疫吸附分析即ELISA法，它利用酶標(biāo)記物同抗原抗體復(fù)合物的免疫反應(yīng)與 酶的催化放大作用相結(jié)合，即保持了酶催化反應(yīng)的敏感性，又保持了抗原抗體的特異性，因 而極大的提高了靈敏度。同時它又是一種非均相免疫分析，即在反應(yīng)中的每一步都有洗滌 過程，因而除去了未反應(yīng)物質(zhì)和干擾物質(zhì)。 半抗原是指只有反應(yīng)原性，不具免疫原性的物質(zhì)，又稱不完全抗原。通常，具有免 疫原性的物質(zhì)分子量應(yīng)大于10000，而農(nóng)藥的分子量一般均小于1000，一般不能剌激機(jī)體 產(chǎn)生針對農(nóng)藥抗原決定簇的特異性抗體，因此農(nóng)藥屬于半抗原，必須與大分子載體偶聯(lián)后 才具有免疫原性，這也是小分子免疫分析的基本模式。半抗原的結(jié)構(gòu)對抗體的特異性至關(guān) 重要，半抗原分子的設(shè)計(jì)與合成是小分子免疫分析技術(shù)的關(guān)鍵所在。半抗原分子的設(shè)計(jì)應(yīng) 以農(nóng)藥親體以及有毒理學(xué)意義的代謝產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)為目標(biāo)化合物，針對被測定對象是單 一農(nóng)藥或某一類農(nóng)藥，設(shè)計(jì)中應(yīng)相應(yīng)地突出特定農(nóng)藥的分子結(jié)構(gòu)或一類農(nóng)藥中共有的基本 分子構(gòu)架(即母核)。對不具備活性基團(tuán)的農(nóng)藥分子通常以直接衍生化或者以原料合成，也 可用待測農(nóng)藥代謝或降解產(chǎn)物作為半抗原。對于某些分子太小和不穩(wěn)定的農(nóng)藥，可合成其 衍生化的半抗原。 一般理想的半抗原分子應(yīng)盡量具備與待測物類似的立體化學(xué)特征，以減 少免疫交叉反應(yīng)性，提高抗體的特異性；同時，要保證半抗原與載體的大分子復(fù)合后，半抗 原的特征結(jié)構(gòu)能最大限度地被免疫活性細(xì)胞所識別，以制備出具有預(yù)期選擇性和高親和力 的抗體。 人工抗原是半抗原與大分子載體蛋白偶聯(lián)得到的完全抗原。使用載體不是簡單地增加半抗原的分子量，更重要的是利用其較強(qiáng)的免疫原性誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而使 機(jī)體產(chǎn)生針對半抗原及人工抗原的特異性抗體。 免疫分析技術(shù)的關(guān)鍵是半抗原的分子設(shè)計(jì)，合成和人工全抗原及抗體的制備。因 此，目標(biāo)分析物分子免疫學(xué)特性，以及如何通過化學(xué)或生化技術(shù)突出和利用這些特性，是該 領(lǐng)域重要的研究內(nèi)容。 由于菊酯類農(nóng)藥同分異構(gòu)體較多，制備特異性抗體較為困難，菊酯類農(nóng)藥的免疫 快速檢測一直是一個比較困難的問題。本發(fā)明的目的是通過設(shè)計(jì)合成具有二溴菊酸結(jié)構(gòu) 的農(nóng)藥溴氰菊酯的半抗原和人工抗原；獨(dú)特之處在于突出了這類農(nóng)藥分子特異性抗原決定 簇，又克服了化學(xué)合成的困難，免疫動物產(chǎn)生親和性很高的特異性抗體；并以此為基礎(chǔ)建立 了快速免疫方法，準(zhǔn)確檢測農(nóng)藥溴氰菊酯。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明設(shè)計(jì)合成了小分子目標(biāo)分析物半抗原，并與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)，制備有效人 工抗原，免疫動物制備對小分子分析物特異性抗體，利用抗原抗體的特異性免疫學(xué)反應(yīng)和 易被檢測識別的標(biāo)記物的放大作用，從而定性定量的檢測樣本中超微量小分子目標(biāo)物，可 用于樣本測定。該技術(shù)研究的關(guān)鍵是半抗原的分子設(shè)計(jì)、合成和全抗原及抗體的制備。
溴氰菊酯的結(jié)構(gòu)如圖所示
Br O CN
為了突出該農(nóng)藥分子特異性抗原決定簇，本發(fā)明選擇二溴菊酸結(jié)構(gòu)
為半抗原的基本結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)半抗原的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的所設(shè)計(jì)的半抗原結(jié)構(gòu)為
用此半抗原與載體蛋白連接合成人工抗原與HRP連接合成酶標(biāo)抗原
HRP


1農(nóng)藥溴氰菊酯半抗原的合成 (1)合成6-氨基己酸甲酯(AME)
<formula>formula see original document page 6</formula>
稱量400 410mg氨基己酸溶于4mL甲醇之中，冰浴下攪拌，緩慢滴加氯化亞砜， 至不溶物完全溶解后繼續(xù)冰浴下攪拌30min 40min，減壓下脫去溶劑后即得AME。
(2)合成6- {[3- (2， 2- 二溴-乙烯基)-2， 2- 二甲基-環(huán)丙基羰基]-氨基 甲酯(DAE)
反應(yīng)式
<formula>formula see original document page 6</formula> 稱量二溴菊酸80 82mg溶解于6mL無水二氯甲烷中，冰浴攪拌反應(yīng)30min ;再依 次加入1.0 2. 0mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)和69 72mg N，N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)， 氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫攪拌4 5h ;加入43 44mg AME，攪拌，反應(yīng)過夜。濾去反應(yīng)液中沉淀， 再依次使用0. lmol/L鹽酸、飽和碳酸氫鈉、蒸餾水和飽和氯化鈉溶液洗滌即得6-([3-(2， 2- 二溴-乙烯基)-2， 2- 二甲基-環(huán)丙基羰基]_氨基} _己酸甲酯。 (3)合成6- {[3- (2， 2_ 二溴-乙烯基)_2， 2_ 二甲基-環(huán)丙基羰基]_氨基} _己酸 (DA)
反應(yīng)式
<formula>formula see original document page 6</formula>
稱取128 130mg DAE溶于裝有2. 62mL無水乙醇中，邊攪拌邊滴加2mol/L NaOH3. 25mL，加熱回流3h。然后減壓除去乙醇，用鹽酸酸化至pH 3，再加入氯仿使其溶解， 去除溶劑后即得農(nóng)藥溴氰菊酯半抗原DA。 (4)合成6- {[3- (2， 2_ 二溴-乙烯基)_2， 2_ 二甲基-環(huán)丙烷羰基]_氨基} _己酸_2，5
二氧吡咯烷-1-基酯(DHAE)
反應(yīng)式 稱量72-73mg 6_{[3_(2， 2_ 二溴-乙烯基)_2， 2_ 二甲基-環(huán)丙基羰基]-氨 基} _己酸和25-26mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺溶于2. 2mL無水四氫呋喃，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加 45-46mg N， N_ 二環(huán)己基碳二亞胺；室溫反應(yīng)過夜，過濾，除去溶劑，即得農(nóng)藥溴氰菊酯半抗 原的活化酯。 2人工抗原的合成 取農(nóng)藥溴氰菊酯半抗原的活化酯1. 6mg溶于2ml 二甲基甲酰胺配成溶液A，O. 86mg 血藍(lán)蛋白溶于2mlpH 7. 4的0. 2mol/L磷酸緩沖液配成溶液B，然后在冰浴下將溶液A緩慢 的加入溶液B中，經(jīng)攪拌后在4t:下反應(yīng)過夜，最后將反應(yīng)液置入透析袋中，在4t:下用pH 7. 4的0. 2M磷酸緩沖液透析三天即可得到人工抗原。
3酶標(biāo)抗原的合成取農(nóng)藥溴氰菊酯半抗原的活化酯1. 9mg溶于2ml 二甲基甲酰胺配成溶液A，O. 54mg 辣根過氧化物酶溶于2mlpH 7. 4的0. 2mol/L磷酸緩沖液中配成溶液B，然后在冰浴下將溶 液A緩慢的加入溶液B中，經(jīng)攪拌后在fC下反應(yīng)過夜，最后將反應(yīng)液置入透析袋中，在4°C 下用pH7. 4的0. 2M磷酸緩沖液透析三天即可得到酶標(biāo)抗原，用于顯色反應(yīng)。
4免疫和特異性抗體的制備 免疫動物選用雌性新西蘭大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后進(jìn)行 四次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫分別于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后間隔一個月， 第五次免疫完后9天時由兔子的耳緣靜脈取血，進(jìn)行效價檢測，具體做法是
初次免疫取lmg按照權(quán)利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶 液和弗氏完全佐劑等體積所配制的溶液中，進(jìn)行動物免疫； 加強(qiáng)免疫用0. 5mg上述人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體 積所配制的溶液，進(jìn)行動物免疫； 抗體純化定時監(jiān)測動物抗體效價，當(dāng)抗體對一定的包被抗原達(dá)到適宜效價時，采 集血液，并離心獲得抗血清，使用G-S印harose蛋白親和層析柱對抗血清進(jìn)行純化，獲得抗 農(nóng)藥溴氰菊酯的特異性抗體。
有益效果 與其他同類方法相比，本發(fā)明具有特異、靈敏、準(zhǔn)確、快速、方便、廉價等特點(diǎn)。該 設(shè)計(jì)、合成的半抗原與目標(biāo)待測物相似程度高，對待測物的特征結(jié)構(gòu)保留特異性較強(qiáng)部分， 為制備特異性良好的抗體奠定了基礎(chǔ)。其抗體具有良好的特異性和靈敏度，檢測極限達(dá)到 0. 6ng/ml，而且酶標(biāo)抗原的稀釋度可達(dá)到1 X 106。 經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，上述半抗原，其合成方法簡便，且所用主要原料如二溴菊酯、二甲氨 基吡啶價格較為低廉、容易獲得，在一般化學(xué)試劑公司都可購買。由于合成效率高、反應(yīng)步驟少，從而提高了反應(yīng)的可控性，反應(yīng)產(chǎn)率分別達(dá)到了90%以上。另外，合成產(chǎn)物的提取、純 化方法簡便，只需要對合成產(chǎn)物進(jìn)行重結(jié)晶，即可獲得高純度的目的產(chǎn)物。因此，本發(fā)明合 成半抗原的方法與其他方法相比較，更加易于推廣普及。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 一種抗農(nóng)藥溴氰菊酯的特異性抗體 1人工抗原合成 (1)合成6-氨基己酸甲酯 稱量400mg氨基己酸溶于4mL甲醇之中，冰浴下攪拌，緩慢滴加氯化亞砜，在冰浴 下繼續(xù)攪拌40min，減壓下脫去溶劑后即得6-氨基己酸甲酯； (2)合成6- {[3- (2， 2_ 二溴-乙烯基)_2， 2_ 二甲基-環(huán)丙基羰基]-氨基}-己酸 甲酯 稱量二溴菊酯80mg溶解于6mL無水二氯甲烷中，冰浴攪拌反應(yīng)30min ;再依次加 入1. 0mg4- 二甲氨基吡啶和69mg N， N- 二環(huán)己基碳二亞胺，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫攪拌4h ;加入 43mg 6-氨基己酸甲酯，攪拌，反應(yīng)過夜，濾去反應(yīng)液中沉淀，再依次使用0. lmol/L鹽酸、飽 和碳酸氫鈉、蒸餾水和飽和氯化鈉溶液洗滌即得6-{[3-(2， 2- 二溴-乙烯基)_2，2- 二甲 基_環(huán)丙基羰基]_氨基} _己酸甲酯； (3)合成6- {[3- (2， 2_ 二溴-乙烯基)_2， 2_ 二甲基-環(huán)丙基羰基]-氨基}-己酸
稱取128mg 6_ {[3-(2， 2_ 二溴-乙烯基)_2， 2_ 二甲基-環(huán)丙基羰基]-氨基}-己 酸甲酯溶于2. 62mL無水乙醇中，邊攪拌邊滴加2mol/L NaOH溶液3. 25mL，加熱回流3h，然 后除去乙醇，用鹽酸酸化至pH 4，再加入氯仿使其溶解，減壓去除溶劑即得農(nóng)藥溴氰菊酯半 抗原； (4)合成6- {[3- (2， 2_ 二溴-乙烯基)_2， 2_ 二甲基-環(huán)丙烷羰基]_氨基} _己 酸-2，5-二氧吡咯烷-l-基酯 稱量72mg 6_ {[3-(2， 2_ 二溴-乙烯基)_2， 2_ 二甲基-環(huán)丙基羰基]-氨基}-己 酸和25mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺溶于2. 2mL無水四氫呋喃，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加45mg N，N-二 環(huán)己基碳二亞胺；室溫反應(yīng)過夜，過濾，除去溶劑，即得農(nóng)藥溴氰菊酯半抗原的活化酯；
(5)人工抗原的合成 取步驟4所合成的半抗原的活化酯1.6mg溶于2ml二甲基甲酰胺配成溶液A， 0. 86mg血藍(lán)蛋白溶于2mlpH 7. 4的0. 2mol/L磷酸緩沖液中配成溶液B，然后在冰浴下將溶 液A緩慢的加入溶液B中，經(jīng)攪拌后在fC下反應(yīng)過夜，最后將反應(yīng)液置入透析袋中，在4°C 下用pH 7. 4的0. 2mol/L磷酸緩沖液透析三天即可得到人工抗原；
2農(nóng)藥溴氰菊酯抗體的制備方法 免疫動物選用雌性新西蘭大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后進(jìn)行 四次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫分別于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后間隔一個月， 第五次免疫完后9天時由兔子的耳緣靜脈取血，進(jìn)行效價檢測，具體做法是
初次免疫取lmg按照權(quán)利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶 液和弗氏完全佐劑等體積所配制的溶液中，進(jìn)行動物免疫； 加強(qiáng)免疫用0. 5mg上述人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體
8積所配制的溶液，進(jìn)行動物免疫； 抗體純化定時監(jiān)測動物抗體效價，當(dāng)抗體對一定的包被抗原達(dá)到適宜效價時，采 集血液，并離心獲得抗血清，使用G-S印harose蛋白親和層析柱對抗血清進(jìn)行純化，獲得抗 農(nóng)藥溴氰菊酯的特異性抗體。 實(shí)施例2 —種抗農(nóng)藥溴氰菊酯的特異性抗體 1人工抗原的合成 (1)合成6-氨基己酸甲酯 稱量410mg氨基己酸溶于4mL甲醇之中，冰浴下攪拌，緩慢滴加氯化亞砜，在冰浴 下繼續(xù)攪拌40min，減壓下脫去溶劑后即得6-氨基己酸甲酯。 (2)合成6- {[3- (2， 2- 二溴-乙烯基)_2， 2_ 二甲基-環(huán)丙基羰基]_氨基} _己酸 甲酯 稱量二溴菊酯82mg溶解于6mL無水二氯甲烷中，冰浴攪拌反應(yīng)30min ;再依次加 入2. 0mg4- 二甲氨基吡啶和72mg N， N- 二環(huán)己基碳二亞胺，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫攪拌5h ;加入 49mg 6-氨基己酸甲酯，攪拌，反應(yīng)過夜，濾去反應(yīng)液中沉淀，再依次使用0. lmol/L鹽酸、飽 和碳酸氫鈉、蒸餾水和飽和氯化鈉溶液洗滌即得6-{[3-(2， 2- 二溴-乙烯基)_2，2- 二甲
基_環(huán)丙基羰基]_氨基} _己酸甲酯。 (3)合成6- {[3- (2， 2_ 二溴-乙烯基)_2， 2_ 二甲基-環(huán)丙基羰基]_氨基} _己酸
稱取130mg 6_ {[3-(2， 2_ 二溴-乙烯基)_2， 2_ 二甲基-環(huán)丙基羰基]-氨基}-己 酸甲酯溶于2. 62mL無水乙醇中，邊攪拌邊滴加2mol/L NaOH溶液3. 25mL，加熱回流3h，然 后除去乙醇，用鹽酸酸化至pH 4，再加入氯仿使其溶解，減壓去除溶劑即得農(nóng)藥溴氰菊酯半 抗原。 (4)合成6- {[3- (2， 2- 二溴-乙烯基)_2， 2_ 二甲基-環(huán)丙烷羰基]-氨基}-己 酸-2，5-二氧吡咯烷-l-基酯 稱量72-73mg 6_{[3-(2， 2_ 二溴-乙烯基)_2， 2_ 二甲基-環(huán)丙基羰基]-氨 基}_己酸和26mgN-羥基硫代琥珀酰亞胺溶于2. 2mL無水四氫呋喃，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加46mg N， N-二環(huán)己基碳二亞胺；室溫反應(yīng)過夜，過濾，除去溶劑，即得農(nóng)藥溴氰菊酯半抗原的活化酯。 (5)人工抗原的合成 取上述步驟所合成的半抗原的活化酯1. 6mg溶于2ml 二甲基甲酰胺配成溶液A， 0. 86mg血藍(lán)蛋白溶于2mlpH 7. 4的0. 2mol/L磷酸緩沖液中配成溶液B，然后在冰浴下將溶 液A緩慢的加入溶液B中，經(jīng)攪拌后在fC下反應(yīng)過夜，最后將反應(yīng)液置入透析袋中，在4°C 下用pH 7. 4的0. 2mol/L磷酸緩沖液透析三天即可得到人工抗原；
2農(nóng)藥溴氰菊酯抗體的制備 免疫動物選用雌性新西蘭大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后進(jìn)行 四次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫分別于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后間隔一個月， 第五次免疫完后9天時由兔子的耳緣靜脈取血，進(jìn)行效價檢測，具體做法是
初次免疫取lmg按照權(quán)利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶 液和弗氏完全佐劑等體積所配制的溶液中，進(jìn)行動物免疫； 加強(qiáng)免疫用0. 5mg上述人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體積所配制的溶液，進(jìn)行動物免疫； 抗體純化定時監(jiān)測動物抗體效價，當(dāng)抗體對一定的包被抗原達(dá)到適宜效價時，采 集血液，并離心獲得抗血清，使用G-S印harose蛋白親和層析柱對抗血清進(jìn)行純化，獲得抗 農(nóng)藥溴氰菊酯的特異性抗體。
權(quán)利要求
農(nóng)藥溴氰菊酯的人工抗原和抗體其特征在于使用分子式為的6-{[3-(2，2-二溴-乙烯基)-2，2-二甲基-環(huán)丙基羰基]-氨基}-己酸作為半抗原與血藍(lán)蛋白連接合成人工抗原，與辣根過氧化物酶連接合成酶標(biāo)抗原，其中人工抗原再經(jīng)過免疫新西蘭大白兔，取血，分離出抗血清純化制得抗體F2008101537583C0000011.tif
2. 權(quán)利要求1所述的農(nóng)藥溴氰菊酯人工抗原的制備方法，其特征在于是用下述步驟制得(1) 合成6-氨基己酸甲酯稱量400-410mg氨基己酸溶于4mL甲醇之中，冰浴下攪拌，緩慢滴加氯化亞砜，在冰浴 下繼續(xù)攪拌30min-40min，減壓下脫去溶劑后即得6-氨基己酸甲酯；(2) 合成6- {[3- (2， 2- 二溴-乙烯基)-2， 2- 二甲基-環(huán)丙基羰基]_氨基} _己酸甲酯 稱量二溴菊酯80-82mg溶解于6mL無水二氯甲烷中，冰浴攪拌反應(yīng)30min ;再依次加入1.0-2.0mg 4-二甲氨基吡啶和69-72mgN， N-二環(huán)己基碳二亞胺，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫攪 拌4-5h ;加入43-49mg 6-氨基己酸甲酯，攪拌，反應(yīng)過夜，濾去反應(yīng)液中沉淀，再依次使用 0. lmol/L鹽酸、飽和碳酸氫鈉、蒸餾水和飽和氯化鈉溶液洗滌即得6-([3-(2，2-二溴-乙烯 基)-2， 2- 二甲基-環(huán)丙基羰基]_氨基} _己酸甲酯；(3) 合成6- {[3- (2， 2- 二溴-乙烯基)-2， 2- 二甲基-環(huán)丙基羰基]_氨基} _己酸 稱取128-130mg 6- {[3- (2， 2- 二溴-乙烯基)-2， 2- 二甲基-環(huán)丙基羰基]-氨基}-己酸甲酯溶于2. 62mL無水乙醇中，邊攪拌邊滴加2mol/LNaOH溶液3. 25mL，加熱回流3h，然后 除去乙醇，用鹽酸酸化至pH 4，再加入氯仿使其溶解，減壓去除溶劑即得溴氰菊酯半抗原；(4) 合成6- {[3- (2， 2- 二溴-乙烯基)-2， 2- 二甲基-環(huán)丙烷羰基]_氨基} _己酸_2， 5-二氧吡咯烷-l-基酯稱量72-73mg 6-{[3-(2，2-二溴-乙烯基)-2，2-二甲基-環(huán)丙基羰基]-氨基}-己 酸和25-26mgN-羥基硫代琥珀酰亞胺溶于2. 2mL無水四氫呋喃，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加45_46mg N， N-二環(huán)己基碳二亞胺；室溫反應(yīng)過夜，過濾，除去溶劑，即得農(nóng)藥溴氰菊酯半抗原的活化 酯；(5) 人工抗原的合成取上述方法合成的半抗原活化酯1. 6mg溶于2ml 二甲基甲酰胺配成溶液A，O. 86mg血 藍(lán)蛋白溶于2mlpH 7. 4的0. 2mol/L磷酸緩沖液配成溶液B，然后在冰浴下將溶液A緩慢的 加入溶液B中，經(jīng)攪拌后在4°C下反應(yīng)過夜，最后將反應(yīng)液置入透析袋中，在4°C下用pH 7. 4 的0. 2mol/L磷酸緩沖液透析三天即可得到人工抗原。
3. 權(quán)利要求1所述的農(nóng)藥溴氰菊酯酶標(biāo)抗原的制備方法，其特征在于是用下述步驟制得取上述方法合成的半抗原活化酯1. 9mg溶于2ml 二甲基甲酰胺配成溶液A， 0. 54mg辣 根過氧化物酶溶于2ml pH 7.4的0.2mol/L磷酸緩沖液中配成溶液B，然后在冰浴下將溶液 A緩慢的加入溶液B中，經(jīng)攪拌后在fC下反應(yīng)過夜，最后將反應(yīng)液置入透析袋中，在4t:下用pH7. 4的0. 2mol/L磷酸緩沖液透析三天即可得到酶標(biāo)抗原，用于顯色反應(yīng)
4.權(quán)利要求1所述的農(nóng)藥溴氰菊酯抗體的制備方法，其特征在于是用下述步驟制得 免疫動物選用雌性新西蘭大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后進(jìn)行四次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫分別于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后間隔一個月，進(jìn)行第五次免疫，9天后由兔子的耳緣靜脈取血，進(jìn)行效價檢測，具體做法是初次免疫取lmg按照權(quán)利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和弗氏完全佐劑等體積所配制的溶液中，進(jìn)行動物免疫；加強(qiáng)免疫用0. 5mg上述人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體積所配制的溶液，進(jìn)行動物免疫；抗體純化定時監(jiān)測動物抗體效價，當(dāng)抗體對一定的包被抗原達(dá)到適宜效價時，采集血液，并離心獲得抗血清，使用G-S印harose蛋白親和層析柱對抗血清進(jìn)行純化，獲得抗農(nóng)藥溴氰菊酯的特異性抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗農(nóng)藥溴氰菊酯的特異性抗體。農(nóng)藥溴氰菊酯人工半抗原及抗體及其制備方法與應(yīng)用，涉及具有二溴菊酸結(jié)構(gòu)的溴氰菊酯人工半抗原，抗原和抗體的制備及其在建立免疫分析方面的應(yīng)用。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)的理化分析方法繁瑣復(fù)雜，成本較高，分析速度較慢的問題，提供了簡潔，快速，靈敏，準(zhǔn)確的免疫分析技術(shù)。它以6-{[3-(2，2-二溴-乙烯基)-2，2-二甲基-環(huán)丙基羰基]-氨基}-己酸為半抗原，分別與KLH和HRP連接合成人工抗原和酶標(biāo)抗原。人工抗原再經(jīng)動物免疫，取血，分出抗血清，純化制的抗體。該抗體穩(wěn)定，具有良好的特異性和靈敏度，且合成方法簡單，可用于農(nóng)藥溴氰菊酯的快速免疫檢測，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C07C233/63GK101747428SQ200810153758
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月5日
發(fā)明者劉冰, 王俊平, 王碩, 陸旸 申請人:天津科技大學(xué)