專利名稱：一種抗農(nóng)藥亞胺硫磷的特異性抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)藥小分子化合物(分子量小于1000道爾頓)免疫化學(xué)和農(nóng)藥殘 留分析技術(shù)領(lǐng)域涉及有機(jī)合成，免疫化學(xué)，生物化學(xué)及物化測(cè)試技術(shù)等，特別涉及半抗原 N-鄰苯二甲酰亞胺基_6-氨基己酸的設(shè)計(jì)合成和特異性抗體的制備。
背景技術(shù)：
亞胺硫磷是一種非內(nèi)吸性廣譜殺螨劑和殺蟲(chóng)劑。具有觸殺，胃殺活性，適用于防治 水稻，棉花，果樹(shù)，蔬菜等多種作物害蟲(chóng)并兼治葉螨，殘效期長(zhǎng)，是代替敵百蟲(chóng)，久效磷，對(duì)硫 磷，甲胺磷等高毒農(nóng)藥的理想藥劑。但農(nóng)藥的不合理使用也導(dǎo)致了嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留超標(biāo)問(wèn) 題，影響人們的身體健康和農(nóng)產(chǎn)品出口貿(mào)易。我國(guó)對(duì)亞胺硫磷在農(nóng)產(chǎn)品的殘留量有著嚴(yán)格 的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)糧食《lmg/kg，蔬菜《lmg/kg，水果《lmg/kg，茶葉《lmg/kg。自90年代， 基于抗原抗體免疫反應(yīng)農(nóng)藥殘留的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)(ELISA)得到了全面迅速的發(fā) 展。利用酶促反應(yīng)顯示抗原抗體的定量結(jié)合，操作簡(jiǎn)單，又具有相當(dāng)?shù)撵`敏度，近年來(lái)發(fā)展 很快。80年代以來(lái)發(fā)展起來(lái)的農(nóng)藥ELISA和簡(jiǎn)易酶免疫EIA技術(shù)，使農(nóng)藥殘留分析在方法 上獲得很大的突破，對(duì)樣品的快速分析起到了極大的推動(dòng)作用。 小分子酶聯(lián)免疫分析方法的開(kāi)發(fā)，因?yàn)樾》肿颖旧聿痪哂忻庖咴?，必須與大分 子載體蛋白交聯(lián)才能剌激動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生針對(duì)小分子目標(biāo)物的特異性抗體，為其 免疫分析方法的建立提供必要條件，因此小分子免疫分析的半抗原合成和人工抗原合成是 關(guān)鍵步驟。

發(fā)明內(nèi)容
當(dāng)前急需一種簡(jiǎn)易，快速，有效的檢測(cè)亞胺硫磷方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)設(shè)計(jì)合 成針對(duì)有機(jī)磷亞胺硫磷的半抗原N-鄰苯二甲酰亞胺基-6-氨基己酸，制得人工抗原，制備 對(duì)亞胺硫磷有高度特異性的抗體。本發(fā)明的獨(dú)特之處在于半抗原只具有鄰苯二甲酰亞胺基 半族的特異性結(jié)構(gòu)，與亞胺硫磷的特異性結(jié)構(gòu)非常相似，合成方法簡(jiǎn)單快速，所制得的抗體 針對(duì)亞胺硫磷有著很高的特異性和靈敏度，并以此建立了 ELISA在水果和果汁等樣品快速 免疫分析方法。 本發(fā)明設(shè)計(jì)合成了小分子目標(biāo)分析物亞胺硫磷的半抗原，并與載體蛋白偶聯(lián)，制
備了有效的人工抗原，免疫動(dòng)物制備對(duì)亞胺硫磷的特異性抗體，利用抗原抗體特異性免疫
反應(yīng)和易被檢測(cè)識(shí)別的標(biāo)記物的放大作用，從而定性定量的檢測(cè)超微量亞胺硫磷。 該技術(shù)研究的關(guān)鍵是半抗原的設(shè)計(jì)合成、人工抗原和抗體的制備。 亞胺硫磷結(jié)構(gòu)如下
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亞胺硫磷的分子結(jié)構(gòu)可以分為兩個(gè)結(jié)構(gòu)單元一部分是磷酸酯部分，另一部分是 鄰苯二甲酰亞胺基部分。從免疫學(xué)的角度分析，鄰苯二甲酰亞胺基部分的空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分 子量較大，可以作為抗原決定簇，而磷酸酯部分可以在總體結(jié)構(gòu)上視為一個(gè)線性長(zhǎng)鏈分子， 可以作為與載體蛋白連接的臂。因此在合成半抗原時(shí)，必須保留鄰苯二甲酰亞胺基結(jié)構(gòu)，而 可以對(duì)鄰苯二甲酰亞胺基的結(jié)構(gòu)鏈進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?，形成可以與載體蛋白連接的臂。因此， 本發(fā)明在設(shè)計(jì)合成亞胺硫磷半抗原時(shí)，采用N-鄰苯二甲酰亞胺基甲酯與氨基己酸反應(yīng)，引 入結(jié)構(gòu)不同的活性側(cè)鏈的合成方法來(lái)合成亞胺硫磷半抗原，這樣既保持了亞胺硫磷半抗原 與亞胺硫磷在結(jié)構(gòu)上的相似性，又使半抗原分子具有了與載體蛋白連接的合適結(jié)構(gòu)。
半抗原的設(shè)計(jì)、合成是本方法成敗的關(guān)鍵所在。為突出該類(lèi)農(nóng)藥分子特異性抗原 決定簇，本發(fā)明選擇N-鄰苯二甲酰亞胺基甲酯與6-氨基己酸為原料合成半抗原，半抗原分 子量麗為261
<formula>formula see original document page 5</formula> 半抗原與血蘭蛋白KLH連接合成人工抗原
<formula>formula see original document page 5</formula> 其中人工抗原再經(jīng)動(dòng)物免疫，取血，分出抗全血清，純化制得抗體。
農(nóng)藥亞胺硫磷半抗原的合成及抗體制備的方法
(1)N-鄰苯二甲酰亞胺基-6-氨基己酸的合成準(zhǔn)確稱取0. 1250g的氨基己酸，O. 0960g的無(wú)水Na2C03溶于5. OmL蒸餾水中，加入 0. 255gN_鄰苯二甲酰亞胺基甲酯，室溫?cái)嚢柚镣耆芙?，約1小時(shí)反應(yīng)終止，過(guò)濾，濾液酸 沉至沉淀完全，乙酸乙酯提取，無(wú)水Na2S04干燥，制得半抗原。
(2)亞胺硫磷半抗原活化酯的合成稱取0. 5000g半抗原，O. 2400gN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于3ml無(wú)水四氫呋喃 中，N2保護(hù)下，滴加溶有0. 4500g DCC的無(wú)水四氫呋喃溶液2ml，攪拌過(guò)夜。過(guò)濾除去白色 沉淀，旋蒸除去有機(jī)溶劑，經(jīng)硅膠柱純化得到白色固體即為亞胺硫磷半抗原的活化酯。
(3)人工抗原和包被抗原的合成 用半抗原N-鄰苯二甲酰亞胺基-6-氨基己酸的活性酯，以酰胺基CONH為橋梁， 通過(guò)活性酯法，分別連接到卵清蛋白(ovalbumin, OVA)合成包被抗原和血藍(lán)蛋白(keyhole limpethemocyanin， KLH)上合成人工抗原，具體做法是 取所述半抗原的活化酯溶于DMF配成溶液A， KLH或OVA溶于磷酸緩沖溶液中配成 溶液B?；罨ズ偷鞍椎哪柋?3 : 1 40 : l然后在冰浴下將溶液A緩慢的加入溶液 B中。經(jīng)攪拌后在fC下反應(yīng)過(guò)夜，最后將反應(yīng)液置入透析袋中，在4°C ， ph = 7. 4的PBS溶 液中透析三天。精確量取蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液的體積，測(cè)定濃度和結(jié)合比，分裝，_201:下貯藏。 (4)酶標(biāo)抗原的制備 用半抗N-鄰苯二甲酰亞胺基_6-氨基己酸的活性酯與辣根過(guò)氧化物酶連接即制 成酶標(biāo)抗原，用于顯色反應(yīng)，具體做法是 取所述半抗原的活化酯溶于DMF配成溶液A， HRP溶于磷酸緩沖溶液中配成溶液B。 活化酯和蛋白的摩爾比10-13 : l，然后在冰浴下將溶液A緩慢的加入溶液B中。經(jīng)攪拌后 在4t:下反應(yīng)過(guò)夜，最后將反應(yīng)液置入透析袋中，在4t:，ph = 7.4的PBS溶液中透析三天。 精確量取蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液的體積，測(cè)定濃度和結(jié)合比，分裝，-2(TC下貯藏。
(5)免疫和制備特異性抗體 免疫免疫動(dòng)物選用雌性大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后進(jìn)行四 次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫分別于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后間隔一個(gè)月，第 五次免疫完后9天時(shí)由兔子的耳緣靜脈取血，進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)；具體做法是
初次免疫取lmg上述人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和弗氏完全佐劑等體積所 配制的溶液中，進(jìn)行動(dòng)物免疫； 加強(qiáng)免疫用0. 5mg上述人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體 積所配制的溶液，進(jìn)行動(dòng)物免疫； 抗體純化定時(shí)監(jiān)測(cè)動(dòng)物抗體效價(jià)，當(dāng)抗體對(duì)一定的包被抗原達(dá)到適宜效價(jià)時(shí)，采 集血液，并離心獲得抗血清，使用G-S印harose蛋白親和層析柱對(duì)抗血清進(jìn)行純化，制備亞 胺硫磷抗體。
有益效果 與其他同類(lèi)方法相比，本發(fā)明具有特異、靈敏、準(zhǔn)確、快速、方便、廉價(jià)等特點(diǎn)。該 設(shè)計(jì)、合成的半抗原與目標(biāo)待測(cè)物相似程度高，對(duì)待測(cè)物的特征結(jié)構(gòu)保留特異性較強(qiáng)部分，為制備特異性良好的抗體奠定了基礎(chǔ)。其抗體具有良好的特異性和靈敏度，檢測(cè)極限達(dá)到 0. 6ng/ml，而且酶標(biāo)抗原的稀釋度可達(dá)到1X106。 經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，上述半抗原，其合成方法簡(jiǎn)便，且所用主要原料如N-鄰苯二甲酰亞 胺基甲酯、6-氨基己酸價(jià)格較為低廉、容易獲得，在一般化學(xué)試劑公司都可購(gòu)買(mǎi)。由于合成 效率高、反應(yīng)步驟少，半抗原只需一步反應(yīng)既可合成，從而提高了反應(yīng)的可控性，反應(yīng)產(chǎn)率 分別達(dá)到了 90%以上。另外，合成產(chǎn)物的提取、純化方法簡(jiǎn)便，只需要對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行重結(jié) 晶，即可獲得高純度的目的產(chǎn)物。因此，本發(fā)明合成半抗原的方法與其他方法相比較，更加 易于推廣普及。
具體實(shí)施例方式
半抗原的合成與抗體的制備 (1)N-鄰苯二甲酰亞胺基-6-氨基己酸的合成 準(zhǔn)確稱取0. 1250g的氨基己酸，O. 0960g的無(wú)水Na2C03溶于5. 0mL蒸餾水中，加入 0. 255gN-鄰苯二甲酰亞胺基甲酯，室溫?cái)嚢柚镣耆芙?，約1小時(shí)反應(yīng)終止。過(guò)濾，濾液酸 沉至沉淀完全，乙酸乙酯提取，無(wú)水化2504干燥，蒸發(fā)溶劑即可得到白色固體，其總產(chǎn)率為 90%。； (2)亞胺硫磷半抗原活化酯的合成 稱取0. 5000g半抗原，0. 2400g N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于3ml無(wú)水四氫呋喃 中，N2保護(hù)下，滴加溶有0. 4500g DCC的無(wú)水四氫呋喃溶液2ml，攪拌過(guò)夜。過(guò)濾除去白色 沉淀，旋蒸除去有機(jī)溶劑，經(jīng)硅膠柱純化得到白色固體即為亞胺硫磷半抗原的活化酯，其總 產(chǎn)率為93%。 (3)人工抗原的合成 取半抗原的活化酯0. 1000g溶于DMF2ml配成溶液A， 0. 1000gKLH溶于2ml磷酸 緩沖溶液中配成溶液B。活化酯和蛋白的摩爾比13 : 1，即在2mlB液中加入0. 128ml的A 液，加入時(shí)在冰浴下將溶液A緩慢的加入溶液B中。經(jīng)攪拌后在fC下反應(yīng)過(guò)夜，最后將反 應(yīng)液置入透析袋中，在4t:，ph二 7.4的PBS溶液中透析三天。精確量取蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液 的體積，測(cè)定濃度和結(jié)合比，分裝，-20°C下貯藏。
(4)酶標(biāo)抗原的制備 取半抗原的活化酯0. 1000g溶于DMF2ml配成溶液A， HRP0. 0300g溶于2ml磷酸緩 沖溶液中配成溶液B?；罨ズ虷RP的摩爾比11 : 1，即在2mlB液中加入0. 332ml的A液， 加入時(shí)在冰浴下將溶液A緩慢的加入溶液B中，經(jīng)攪拌后在fC下反應(yīng)過(guò)夜，最后將反應(yīng)液 置入透析袋中，在4t:，ph二 7.4的PBS溶液中透析三天。精確量取蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液的體 積，測(cè)定濃度和結(jié)合比，分裝，_201:下貯藏。
(5)免疫和制備特異性抗體 免疫免疫動(dòng)物選用雌性大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后進(jìn)行四 次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫分別于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后間隔一個(gè)月，第 五次免疫完后9天時(shí)由兔子的耳緣靜脈取血，進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)；具體做法是
初次免疫取lmg上述人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和弗氏完全佐劑等體積所 配制的溶液中，進(jìn)行動(dòng)物免疫；
加強(qiáng)免疫用0. 5mg上述人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體 積所配制的溶液，進(jìn)行動(dòng)物免疫； 抗體純化定時(shí)監(jiān)測(cè)動(dòng)物抗體效價(jià)，當(dāng)抗體對(duì)一定的包被抗原達(dá)到適宜效價(jià)時(shí)，采 集血液，并離心獲得抗血清，使用G-S印harose蛋白親和層析柱對(duì)抗血清進(jìn)行純化，制備亞 胺硫磷抗體。
權(quán)利要求
抗農(nóng)藥亞胺硫磷的抗體其特征在于使用N-鄰苯二甲酰亞胺基-6-氨基己酸作為半抗原與血藍(lán)蛋白KLH連接合成人工抗原，免疫新西蘭大白兔，取血，分離出抗血清純化制得。
2.權(quán)利要求1所述的農(nóng)藥亞胺硫磷半抗原其特征在于使用N-鄰苯二甲酰亞胺基甲都 和6-氨基己酸為原料合成分子式為的化合物作為半抗原。
3.權(quán)利要求1所述的農(nóng)藥亞胺硫磷的人工抗原其特征在于使用半抗原N-鄰苯二甲酰 亞胺基_6-氨基己酸與血蘭蛋白合成。
4. 權(quán)利要求1所述的農(nóng)藥亞胺硫磷半抗原N-鄰苯二甲酰亞胺基_6-氨基己酸其特征 在于是用下述步驟制得準(zhǔn)確稱取0. 1250g的氨基己酸，O. 0960g的無(wú)水Na2C03溶于5. OmL 蒸餾水中，加入O. 2550g N-鄰苯二甲酰亞胺基甲酯，室溫?cái)嚢柚镣耆芙?，約1小時(shí)終止反 應(yīng)，反應(yīng)液過(guò)濾后用乙酸乙酯提取，提取液用無(wú)水Na2S04干燥，制得半抗原。
5. 權(quán)利要求1所述的免疫動(dòng)物制備特異性抗體的方法如下免疫動(dòng)物選用雌性新西蘭大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后進(jìn)行四次 加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫分別于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后間隔一個(gè)月進(jìn)行第 五次免疫，9天后由兔子的耳緣靜脈取血，進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)，具體做法是初次免疫取lmg按照權(quán)利要求3所述方法合成的人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和 弗氏完全佐劑等體積所配制的溶液中，進(jìn)行動(dòng)物免疫；加強(qiáng)免疫用0. 5mg上述人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體積所 配制的溶液，進(jìn)行動(dòng)物免疫；抗體純化定時(shí)監(jiān)測(cè)動(dòng)物抗體效價(jià)，當(dāng)抗體對(duì)一定的包被抗原達(dá)到適宜效價(jià)時(shí)，采集血 液，并離心獲得抗血清，使用G-S印harose蛋白親和層析柱對(duì)抗血清進(jìn)行純化，制備獲得抗 農(nóng)藥亞胺硫磷的特異性抗體。
6. 用權(quán)利要求1所述的農(nóng)藥亞胺硫磷半抗原N-鄰苯二甲酰亞胺基_6-氨基己酸分別 與卵清蛋白OVA和辣根過(guò)氧化物酶HRP連接，合成包被抗原和酶標(biāo)抗原用于建立亞胺硫磷 的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。<formula>formula see original document page 3</formula>
全文摘要
本發(fā)明涉及亞胺硫磷人工抗原的合成方法與抗體制備過(guò)程。本發(fā)明屬于農(nóng)藥小分子化合物免疫化學(xué)和殘留分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及有機(jī)合成，免疫化學(xué)，生物化學(xué)等。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)的理化分析方法繁瑣復(fù)雜，成本較高，分析速度較慢的問(wèn)題，提供了簡(jiǎn)潔，快速，靈敏，準(zhǔn)確的免疫分析技術(shù)。設(shè)計(jì)和合成的半抗原N-鄰苯二甲酰亞胺基-6-氨基己酸分別與血藍(lán)蛋白載體蛋白，辣根過(guò)氧化物酶連接合成人工抗原和酶標(biāo)抗原。人工抗原再經(jīng)過(guò)動(dòng)物免疫，取血，提取抗血清，純化制得抗體。該抗體由于穩(wěn)定性好，特異性和靈敏度高，可用于農(nóng)藥有機(jī)磷的快速免疫檢測(cè)，且有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K16/06GK101747436SQ200810153759
公開(kāi)日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2008年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月5日
發(fā)明者劉冰, 宋洋, 王俊平, 王碩 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)