專利名稱：一種抗農(nóng)藥速滅威的特異性抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)藥小分子化合物(分子量小于1000道爾頓)免疫化學(xué)和農(nóng)藥殘留 分析技術(shù)領(lǐng)域涉及有機合成，免疫化學(xué)，生物化學(xué)等學(xué)科知識，特別涉及具有P _丙氨酸 結(jié)構(gòu)的氨基甲酸酯類農(nóng)藥速滅威人工半抗原、特異性抗原的設(shè)計合成和特異性抗體的制 備。
背景技術(shù)：
20世紀70年代以來，由于有機氯農(nóng)藥品種相繼被不同國家禁用或者限制使用，以 及抗有機磷農(nóng)藥的昆蟲品種的日益增多，氨基甲酸酯類農(nóng)藥的使用量逐年增加。隨著生活 水平和健康意識的提高，人們越來越重視農(nóng)藥殘留問題，對氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的測定 也給予了越來越多的關(guān)注。 速滅威屬于氨基甲酸酯類農(nóng)藥，是農(nóng)作物保護中廣泛使用的農(nóng)藥，主要用于防治 水稻、棉花、茶樹、柑橘等農(nóng)作物的害蟲。該農(nóng)藥純品為白色晶體，難溶于水，易溶于甲醇、 丙酮、二氯甲烷、乙睛等有機溶劑，在堿性和高溫條件下容易分解，并且具有分解快、殘留期 短、低毒、高效、選擇性強等特點。雖然研究表明速滅威的毒性小于同類農(nóng)藥西維因、克百威 等，但畢竟存在一定毒性，在食物中殘留可能對人造成危害，因而迫切需要開發(fā)對速滅威殘 留檢測技術(shù)。 目前對于速滅威農(nóng)藥檢測的方法主要是色譜法，但這些方法都存在檢測時間長， 前處理復(fù)雜，消耗大量溶劑，需昂貴儀器等缺點，并且不能進行現(xiàn)場在線檢測或跟蹤監(jiān)測。 因此，迫切需要一種簡便，快速，靈敏的檢測方法。 酶聯(lián)免疫吸附分析即ELISA法，利用了抗原抗體復(fù)合物的免疫反應(yīng)與酶的催化放 大作用，即保持了酶催化反應(yīng)的敏感性，又保持了抗原抗體的特異性，因而極大的提高了靈 敏度。同時它又是一種非均相免疫分析，即在反應(yīng)中的每一步都有洗滌過程，因而除去了未 反應(yīng)物質(zhì)和干擾物質(zhì)。利用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)方法不僅可以定性而且可以定量 檢測樣品中的農(nóng)藥殘留，這種分析方法對儀器設(shè)備要求不高，快速簡便，一般無需對樣品進 行復(fù)雜的預(yù)處理，靈敏度高，特異性強，而且價格便宜，適于大容量樣本分析。20世紀80年 代后，免疫化學(xué)分析技術(shù)已成為優(yōu)先研究、開發(fā)和利用的農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)，美國化學(xué) 學(xué)會將免疫分析方法與GC、HPLC方法一起列為化學(xué)農(nóng)藥殘留分析的三大支柱技術(shù)，是21世 紀最具竟?fàn)幮院吞魬?zhàn)性的超微量檢測技術(shù)。 半抗原是指只有反應(yīng)原性不具免疫原性的物質(zhì)，又稱不完全抗原。通常，具有免 疫原性的物質(zhì)分子量應(yīng)大于10000，而農(nóng)藥的分子量一般均小于IOOO，一般不能剌激機體 產(chǎn)生針對農(nóng)藥抗原決定簇的特異性抗體，因此必須與大分子載體偶聯(lián)后才具有免疫原性， 這也是小分子免疫分析的基本模式。半抗原的結(jié)構(gòu)對抗體的特異性至關(guān)重要，半抗原分子 的設(shè)計與合成是小分子免疫分析技術(shù)的關(guān)鍵所在。半抗原分子的設(shè)計應(yīng)以農(nóng)藥親體以及 有毒理學(xué)意義的代謝產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)為目標(biāo)化合物，針對被測定對象是單一農(nóng)藥或某一類 農(nóng)藥，設(shè)計中應(yīng)相應(yīng)地突出特定農(nóng)藥的分子結(jié)構(gòu)或一類農(nóng)藥中共有的基本分子構(gòu)架(即母核)。一般理想的半抗原分子應(yīng)盡量具備與待測物類似的立體化學(xué)特征，以減少免疫交叉反 應(yīng)性，提高抗體的特異性；同時，要保證半抗原與載體的大分子復(fù)合后，半抗原的特征結(jié)構(gòu) 能最大限度地被免疫活性細胞所識別，以制備出具有預(yù)期特異性和高親和力的抗體。
人工抗原是半抗原與大分子載體蛋白偶聯(lián)得到的完全抗原。使用載體不是簡單地 增加半抗原的分子量，更重要的是利用其較強的免疫原性誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而使 機體產(chǎn)生針對半抗原及人工抗原的特異性抗體。 免疫分析技術(shù)的關(guān)鍵是半抗原的分子設(shè)計、合成、人工抗原及抗體的制備。因此， 目標(biāo)分析物免疫學(xué)特性，以及如何通過化學(xué)或生化技術(shù)突出和利用這些特性，是該領(lǐng)域重 要的研究內(nèi)容。 目前在農(nóng)產(chǎn)品和食品監(jiān)管中急需一種簡易快速有效的檢測農(nóng)藥速滅威殘留的方 法。本發(fā)明的目的是通過設(shè)計合成具有3_甲基苯結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥速滅威的半抗原和人工抗原 制備高特異性的抗體，進而建立免疫檢測方法，實現(xiàn)速滅威的快速檢測。本發(fā)明的獨特之處 在于突出了這類農(nóng)藥分子特異性抗原決定簇，又克服了化學(xué)合成的困難，免疫動物產(chǎn)生親 和性很高的特異性抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明設(shè)計合成了小分子目標(biāo)分析物的半抗原，并與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)，制備人工
抗原，免疫動物制備對小分子分析物有高度特異性抗體，利用抗原抗體的特異性免疫學(xué)反 應(yīng)和易被檢測識別的標(biāo)記物的放大作用，定性定量的檢測樣本中超微量小分子目標(biāo)物。該 技術(shù)研究的關(guān)鍵是半抗原的分子設(shè)計，合成人工抗原及抗體的制備。 速滅威的結(jié)構(gòu)如圖所示
從免疫學(xué)角度分析，3_甲基苯的空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子量較大，可以作為抗原決定
簇，因而在合成半抗原時，為了突出該農(nóng)藥分子特異性抗原決定簇，本發(fā)明選擇具有甲酰基
團的含3-甲基苯化合物與|3 _丙氨酸來合成速滅威半抗原，這樣既保持了速滅威半抗原與
速滅威在結(jié)構(gòu)上的相似性，又使半抗原分子具有了與載體蛋白連接的合適結(jié)構(gòu)。 本發(fā)明的半抗原結(jié)構(gòu)為
9—C —N『CH3
麗CONH(CH 2)2COOH 半抗原與載體蛋白連接形成人工抗原
5<formula>formula see original document page 6</formula>0019]
半抗原與HRP連接形成酶標(biāo)抗原
CONH(CH 2)2C —N —HRP 1農(nóng)藥速滅威半抗原合成技術(shù)路線 (1)半抗原l-(3-羧乙基)-3-間甲苯基脲的合成(SN)
+
'COOH
HNCONH(CH 2)2COOH稱取445-460mg P -氨基丙酸和665_675mg 1-間甲苯異氰酸酯置于lOOmL圓底 燒瓶中，加入50mL無水四氫呋喃溶液，室溫攪拌反應(yīng)過夜，過濾，所得濾液過硅膠柱，用比 例為1 : 40的甲醇二氯甲進行洗脫1小時，然后將洗脫液換為純甲醇，沖洗柱子0. 5小 時，收集全部洗脫液，真空干燥即得速滅威半抗原1-(3-羧乙基)-3-間甲苯基脲.
(2) 1- (3-羧乙基)-3-間甲苯基脲活化酯的合成
O II
HNCONH(CH 2)2C—O—N
CONH(CH2)2COOH
+ HO一N
DCC 取上述方法合成的半抗原1_(3-羧乙基)-3-間甲苯基脲110-120mg，71-73mg的 N-羥基琥珀酰亞胺置于25ml圓底燒瓶并加入3ml無水四氫呋喃，在氮氣保護下逐滴加入 4ml溶有120mg N， N_ 二環(huán)己基碳二亞胺的無水四氫呋喃溶液，邊滴邊攪拌，室溫下攪拌反 應(yīng)4小時，將反應(yīng)體系置于-2(TC冰箱內(nèi)18小時，過濾除去白色沉淀，旋蒸除有機溶劑，再以 少許乙酸乙酯溶解，_201:結(jié)晶，即可得到白色針狀半抗原活化酯。
2人工抗原的合成(SN-KLH) 半抗原1- (3-羧乙基)-3-間甲苯基脲以酰胺基為橋梁，通過活化酯法連接到血藍
6蛋白上，合成人工抗原。
<formula>formula see original document page 7</formula>
精確稱取2. 16mg 1_ (3_羧乙基)_3_間甲苯基脲活化酉旨，溶解于2mL N， N_ 二甲基 甲酰胺(DMF)中，另取1. 26mg血藍蛋白(KLH)溶于2ml pH值為7. 4的KH2P04溶液中，冰浴
下，i-(3-羧乙基)-3-間甲苯基脲活化酯緩慢逐滴加入蛋白溶液中，邊滴邊搖勻，4t:旋轉(zhuǎn)
放置過夜，將反應(yīng)液裝入透析袋，4t:條件下pH 7. 4的0. 2mol/L磷酸緩沖液透析三天，透析 液冷凍干燥得到白色粉末，貯于-2(TC下備用。
3酶標(biāo)抗原的合成 取半抗原1_(3-羧乙基)-3-間甲苯基脲活化酯1. 19mg溶于2ml 二甲基甲酰胺配 成溶液A， 0. 51mg辣根過氧化物酶溶于2ml pH 7. 4的0. 2mol/L磷酸緩沖液配成溶液B，然 后在冰浴下將溶液A緩慢的加入溶液B中，經(jīng)攪拌后在fC下反應(yīng)過夜，最后將反應(yīng)液置入 透析袋中，在4t:下用pH7.4的0. 2mol/L磷酸緩沖液透析三天即可得到酶標(biāo)抗原，用于顯色 反應(yīng)。 4特異性抗體的制備 免疫動物選用雌性新西蘭大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后進行 四次加強免疫，加強免疫分別于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后間隔一個月， 進行第五次免疫，9天后由兔子的耳緣靜脈取血，進行效價檢測，具體做法是
初次免疫取lmg按照權(quán)利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶 液和弗氏完全佐劑等體積所配制的溶液中，進行動物免疫； 加強免疫用0. 5mg上述人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體 積所配制的溶液，進行動物免疫； 抗體純化定時監(jiān)測動物抗體效價，當(dāng)抗體對一定的包被抗原達到適宜效價時，采 集血液，并離心獲得抗血清，使用G-S印harose蛋白親和層析柱對抗血清進行純化，獲得抗 農(nóng)藥速滅威的特異性抗體。
有益效果 與其他同類方法相比，本發(fā)明具有特異、靈敏、準確、快速、方便、廉價等特點。設(shè)
計、合成的半抗原與目標(biāo)待測物相似程度高，對待測物的特征結(jié)構(gòu)保留特異性較強部分，為
制備特異性良好的抗體奠定了基礎(chǔ)。其抗體具有良好的特異性和靈敏度。 經(jīng)試驗驗證，上述半抗原，其合成方法簡便，且所用主要原料3-甲基苯化合物與
P -丙氨酸價格低廉、容易獲得，在一般化學(xué)試劑公司都可購買。由于合成效率高、反應(yīng)步驟
少，從而提高了反應(yīng)的可控性，反應(yīng)產(chǎn)率分別達到了96%以上。另外，合成產(chǎn)物的提取、純化
方法簡便，只需要對合成產(chǎn)物進行重結(jié)晶，即可獲得高純度的目的產(chǎn)物。因此，本發(fā)明合成 半抗原的方法與其他方法相比較，更加易于推廣普及。
具體實施例方式
實施例1速滅威人工抗原和抗體制備
1農(nóng)藥速滅威半抗原合成 (1)半抗原l-(3-羧乙基)-3-間甲苯基脲的合成(SN)
HNCONH(CH2)2COOH
'COOH
H,N'稱取445mg P-氨基丙酸和665mg 1_間甲苯異氰酸酯置于lOOmL圓底燒瓶中，加 入50mL無水四氫呋喃溶液，室溫攪拌反應(yīng)過夜，過濾，所得濾液過硅膠柱，用比例為1 : 40 的甲醇二氯甲進行洗脫1小時，然后將洗脫液換為純甲醇，沖洗柱子0. 5小時，收集全部 洗脫液，真空干燥即得速滅威半抗原1_(3-羧乙基)-3-間甲苯基脲.
(2) 1- (3-羧乙基)-3-間甲苯基脲活化酯的合成
O II
HNCONH(CH 2)2C — O _N
HNCONH(CH 2)2COOH
+ HO—N
DCC 取上述方法合成的半抗原1_(3-羧乙基)-3-間甲苯基脲110mg，71mg的N_羥基 琥珀酰亞胺置于25ml圓底燒瓶并加入3ml無水四氫呋喃，在氮氣保護下逐滴加入4ml溶有 120mgN， N-二環(huán)己基碳二亞胺的無水四氫呋喃溶液，邊滴邊攪拌，室溫下攪拌反應(yīng)4小時， 將反應(yīng)體系置于-2(TC冰箱內(nèi)18小時，過濾除去白色沉淀，旋蒸除有機溶劑，再以少許乙酸 乙酯溶解，_201:結(jié)晶，即可得到白色針狀半抗原活化酯。
2人工抗原的合成(SN-KLH) 半抗原1- (3-羧乙基)-3-間甲苯基脲以酰胺基為橋梁，通過活化酯法連接到血藍
蛋白上，合成人工抗原。
O
HNCONH(CH 2)2C—O-N
卄f
HNCONH(CH 2)2C —N—Protein
NH7-Protein
" \^^~^H3
精確稱取2. 16mg 1_ (3_羧乙基)_3_間甲苯基脲活化酉旨，溶解于2mL N， N_ 二甲基 甲酰胺(DMF)中，另取1. 26mg血藍蛋白(KLH)溶于2ml pH值為7. 4的KH2P04溶液中，冰浴
下，i-(3-羧乙基)-3-間甲苯基脲活化酯緩慢逐滴加入蛋白溶液中，邊滴邊搖勻，4t:旋轉(zhuǎn)
8放置過夜，將反應(yīng)液裝入透析袋，4t:條件下pH 7. 4的O. 2mol/L磷酸緩沖液透析三天，透析 液冷凍干燥得到白色粉末，貯于-2(TC下備用。
3酶標(biāo)抗原的合成 取半抗原1_(3-羧乙基)-3-間甲苯基脲活化酯1. 19mg溶于2ml 二甲基甲酰胺配 成溶液A， 0. 51mg辣根過氧化物酶溶于2ml pH 7. 4的0. 2mol/L磷酸緩沖液配成溶液B，然 后在冰浴下將溶液A緩慢的加入溶液B中，經(jīng)攪拌后在fC下反應(yīng)過夜，最后將反應(yīng)液置入 透析袋中，在4t:下用pH7.4的0. 2mol/L磷酸緩沖液透析三天即可得到酶標(biāo)抗原，用于顯色 反應(yīng)。 4特異性抗體的制備 免疫動物選用雌性新西蘭大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后進行 四次加強免疫，加強免疫分別于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后間隔一個月進 行第五次免疫，9天后由兔子的耳緣靜脈取血，進行效價檢測，具體做法是
初次免疫取lmg按照權(quán)利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶 液和弗氏完全佐劑等體積所配制的溶液中，進行動物免疫； 加強免疫用0. 5mg上述人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體 積所配制的溶液，進行動物免疫； 抗體純化定時監(jiān)測動物抗體效價，當(dāng)抗體對一定的包被抗原達到適宜效價時，采 集血液，并離心獲得抗血清，使用G-S印harose蛋白親和層析柱對抗血清進行純化，獲得抗 農(nóng)藥速滅威的特異性抗體 實施例2速滅威人工抗原和抗體制備 1農(nóng)藥速滅威半抗原合成技術(shù)路線 (1)半抗原l-(3-羧乙基)-3-間甲苯基脲的合成(SN)<formula>formula see original document page 9</formula>稱取460mg P-氨基丙酸和675mg 1_間甲苯異氰酸酯置于100mL圓底燒瓶中，加 入50mL無水四氫呋喃溶液，室溫攪拌反應(yīng)過夜，過濾，所得濾液過硅膠柱層析凈化用比例 為1 : 40的甲醇二氯甲進行洗脫1小時，然后將洗脫液換為純甲醇，沖洗柱子0. 5小時， 收集全部洗脫液，真空干燥即得速滅威半抗原1_(3-羧乙基)-3-間甲苯基脲.
(2) 1- (3-羧乙基)-3-間甲苯基脲活化酯的合成
<formula>formula see original document page 9</formula>
取上述方法合成的半抗原1_(3-羧乙基)-3-間甲苯基脲120mg，73mg的N_羥基 琥珀酰亞胺置于25ml圓底燒瓶并加入3ml無水四氫呋喃，在氮氣保護下逐滴加入4ml溶有 120mgN， N-二環(huán)己基碳二亞胺的無水四氫呋喃溶液，邊滴邊攪拌，室溫下攪拌反應(yīng)4小時， 將反應(yīng)體系置于-2(TC冰箱內(nèi)18小時，過濾除去白色沉淀，旋蒸除有機溶劑，再以少許乙酸 乙酯溶解，_201:結(jié)晶，即可得到白色針狀半抗原活化酯。
以下步驟與實施例1完全相同。
權(quán)利要求
農(nóng)藥速滅威的人工抗原和抗體其特征在于使用分子式為的1-(3-羧乙基)-3-間甲苯基脲作為半抗原與血藍蛋白連接合成人工抗原，與辣根過氧化物酶連接合成酶標(biāo)抗原，其中人工抗原再經(jīng)過免疫新西蘭大白兔，取血，分離出抗血清純化制得抗體。F2008101538389C0000011.tif
2. 權(quán)利要求1所述的農(nóng)藥速滅威人工抗原的制備方法，其特征在于是用下述步驟制得(1) 半抗原l-(3-羧乙基)-3-間甲苯基脲的合成稱取445-460mg P -氨基丙酸和665_675mg 1-間甲苯異氰酸酯置于lOOmL圓底燒瓶 中，加入50mL無水四氫呋喃溶液，室溫攪拌反應(yīng)過夜，過濾，所得濾液過硅膠柱，用比例為 1 : 40的甲醇二氯甲進行洗脫1小時，然后將洗脫液換為純甲醇，沖洗柱子0. 5小時，收 集全部洗脫液，真空干燥即得速滅威半抗原1- (3-羧乙基)-3-間甲苯基脲；(2) 半抗原l-(3-羧乙基)-3-間甲苯基脲活化酯的合成取上述方法合成的半抗原1_(3-羧乙基)-3-間甲苯基脲110-120mg， 71-73mg的N-羥 基琥珀酰亞胺置于25ml圓底燒瓶并加入3ml無水四氫呋喃，在氮氣保護下逐滴加入4ml溶 有120mg N， N-二環(huán)己基碳二亞胺的無水四氫呋喃溶液，邊滴邊攪拌，室溫下攪拌反應(yīng)4小 時，將反應(yīng)體系置于-2(TC冰箱內(nèi)18小時，過濾除去白色沉淀，旋蒸除去有機溶劑，再以少 許乙酸乙酯溶解，_201:結(jié)晶，即可得到白色針狀半抗原活化酯；(3) 人工抗原的合成取上述方法合成的半抗原活化酯2. 16mg溶于2ml 二甲基甲酰胺配成溶液A， 1. 26mg血 藍蛋白溶于2ml pH 7. 4的0. 2mol/L磷酸緩沖液中配成溶液B，然后在冰浴下將溶液A緩慢的加入溶液B中，經(jīng)攪拌后在4t:下反應(yīng)過夜，最后將反應(yīng)液置入透析袋中，在4t:下用pH7. 4的0. 2mol/L磷酸緩沖液透析三天即可得到人工抗原。
3. 權(quán)利要求1所述的農(nóng)藥速滅威酶標(biāo)抗原的制備方法，其特征在于是用下述步驟制得取權(quán)利要求2中所合成的半抗原活化酯1. 19mg溶于2ml 二甲基甲酰胺配成溶液A， 0. 51mg辣根過氧化物酶溶于2ml pH 7. 4的0. 2mol/L磷酸緩沖液配成溶液B，然后在冰浴 下將溶液A緩慢的加入溶液B中，經(jīng)攪拌后在fC下反應(yīng)過夜，最后將反應(yīng)液置入透析袋中， 在4t:下用pH7. 4的0. 2mol/L磷酸緩沖液透析三天即可得到酶標(biāo)抗原，用于顯色反應(yīng)。
4. 權(quán)利要求1所述的農(nóng)藥速滅威抗體的制備方法，其特征在于是用下述步驟制得 免疫動物選用雌性新西蘭大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后進行四次加強免疫，加強免疫分別于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后間隔一個月進行第 五次免疫，免疫后9天由兔子的耳緣靜脈取血，進行效價檢測，具體做法是初次免疫取lmg按照權(quán)利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和 弗氏完全佐劑等體積所配制的溶液中，進行動物免疫；加強免疫用0. 5mg上述人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體積所配制的溶液，進行動物免疫；抗體純化定時監(jiān)測動物抗體效價，當(dāng)抗體對一定的包被抗原達到適宜效價時，采集血 液，并離心獲得抗血清，使用G-S印harose蛋白親和層析柱對抗血清進行純化，獲得抗農(nóng)藥 速滅威的特異性抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗農(nóng)藥速滅威的特異性抗體。氨基甲酸酯類農(nóng)藥速滅威人工抗原和抗體的制備，涉及具有3-甲基苯分子結(jié)構(gòu)的氨基甲酸酯類農(nóng)藥速滅威半抗原、人工抗原及抗體的制備。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)的理化分析方法繁瑣復(fù)雜、成本較高、分析速度慢的問題，提供了簡便、快速、靈敏、準確的免疫分析技術(shù)。它以1-(3-羧乙基)-3-間甲苯脲為半抗原，分別與血藍蛋白等載體蛋白、辣根過氧化物酶連接合成人工抗原和酶標(biāo)抗原。人工抗原合成方法簡單，具有較好的穩(wěn)定性。人工抗原再經(jīng)免疫動物、取血、抗血清分離、純化制得抗體。該抗體穩(wěn)定、具有良好的特異性和靈敏度，可用于氨基甲酸酯類農(nóng)藥速滅威的快速免疫檢測，應(yīng)用前景良好。
文檔編號C07K16/44GK101747429SQ200810153838
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月9日
發(fā)明者孫晶瑋, 張燕, 王俊平, 王碩 申請人:天津科技大學(xué)