專利名稱：一種狗用的轉(zhuǎn)移因子及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域中一種用來提高狗免疫力的轉(zhuǎn)移因子， 特別涉及一種在狗上應(yīng)用的轉(zhuǎn)移因子溶液及其制備方法及在狗上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著人們生活工作節(jié)奏的不斷加快，人與人之間的交流變得越來越少， 因此寵物成了人們理想的精神寄托，并且隨著寵物在人們心目中地位的不 斷提升， 一些寵物福利也跟著提高，所以寵物疾病是我們刻不容緩要加強(qiáng) 重視的問題。目前狗的一些病毒性疾病已成為困擾人們的一大難題?，F(xiàn)有 的普遍的解決方法就是打疫苗，然而由于種種原因，有時難免會造成免疫 失敗，爆發(fā)疾病，給診斷和治療帶來一定困難。在免疫失敗后往往依賴抗 生素治療，造成了耐藥菌株的增加和交叉感染的產(chǎn)生。
轉(zhuǎn)移因子(TF， Transfer Factor)是從淋巴細(xì)胞中提取的一類低分子肽 與核苷酸復(fù)合物，具有傳遞免疫信息、激發(fā)免疫細(xì)胞活性、調(diào)節(jié)免疫功能、 增強(qiáng)機(jī)體非特異性細(xì)胞免疫功能等作用，被譽(yù)為T細(xì)胞活性的觸發(fā)劑，細(xì) 胞免疫的增強(qiáng)劑、細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)劑及干擾素產(chǎn)生啟動劑。轉(zhuǎn)移因子分子量 .小、無毒、無抗原性、不起過敏反應(yīng)，不產(chǎn)生對抗抗體且可超越種系界限 應(yīng)用等優(yōu)點。自美國著名的免疫學(xué)專家Lawrence發(fā)現(xiàn)和研究轉(zhuǎn)移因子以來， 世界各國不但進(jìn)行了許多理論研究，而且進(jìn)行了大量的臨床應(yīng)用研究，使 得轉(zhuǎn)移因子成為目前應(yīng)用廣泛的增強(qiáng)免疫制劑。
目前現(xiàn)有的轉(zhuǎn)移因子技術(shù)，將去凈脂肪和門靜脈的動物脾冷凍后一次 絞碎，然后加入室溫生理鹽水進(jìn)行組織搗碎，裝入透析袋內(nèi)置于盛有室溫
3生理鹽水的不銹鋼桶內(nèi)，蓋上蓋后放入4'C冰箱內(nèi)透析24小時。這種方法 的不足之處是，受透析液腐敗因素的制約，透析時間短，透析液中轉(zhuǎn)移因 子含量低，僅為每毫升0.4至0.5毫克。
另外，常規(guī)采用Laurence方法，即利用兩次透析法回收轉(zhuǎn)移因子此法 操作簡單，但生產(chǎn)周期長工序繁瑣(生產(chǎn)周期約需要20天)，耗時長，浪 費大量人力物力。因此這些方法都難以進(jìn)行工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
因此，需要一種在狗上應(yīng)用的轉(zhuǎn)移因子溶液及其制備方法及在狗上的 應(yīng)用，以滿足目前的寵物狗市場，有效鞏固狗打疫苗后的免疫效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明原理基于LibuidEM等(1972)發(fā)現(xiàn)，TF的作用不受種屬的 限制，即豬的TF能將其免疫活性轉(zhuǎn)移給牛、羊、犬、雞和人。因此，為使 轉(zhuǎn)移因子在寵物中得以廣泛應(yīng)用，同時避免豬、狗、牛等其他動物脾臟成 本過高等問題，本發(fā)明采用肉雞脾臟提取轉(zhuǎn)移因子，并對傳統(tǒng)轉(zhuǎn)移因子的 提取工藝進(jìn)行比較優(yōu)化，設(shè)計出出產(chǎn)率高、生產(chǎn)成本低且延長透析時間， 提高透析液中轉(zhuǎn)移因子的含量的方法。
本發(fā)明的第一個目的是提供一種在寵物狗上應(yīng)用的轉(zhuǎn)移因子溶液的制 備方法，步驟包括
(1) 將冷凍的雞脾臟lkg，去除脂肪、被摸和大的血管，用去熱原蒸餾水洗 凈后切成小塊，加入1L無菌生理鹽水； '
(2) 用高壓勻制機(jī)(100Mpa)進(jìn)行細(xì)胞破碎，混勻后制成勻漿；
(3) 置-2(TC冷凍和室溫融化，反復(fù)凍融8次；
(4) 然后在4。C，以6000rpm離心并取上清液，反復(fù)3次后，將上清置于透 析袋中并將透析袋放入盛有無菌生理鹽水的容器內(nèi)，置于0-4'C透析 72h;(5) 用4% MaHC03調(diào)整透析液PH值至中性，并加入0.3%的氯仿作防腐劑；
(6) 將透析液通過微孔濾膜進(jìn)行過濾，然后用超濾膜進(jìn)行超濾，即為含有 轉(zhuǎn)移因子的原液；
(7) 在原液中加入穩(wěn)定劑后，通過0.25pm微孔濾膜除菌過濾，然后加入耐 熱保護(hù)劑，直接分裝，即得到轉(zhuǎn)移因子溶液。
'在一個具體實施方案中，透析液用無菌過濾，微孔濾膜可用0.45jim， 然后用截留分子量為5000道爾頓超濾膜進(jìn)行超濾，即為原液。
在另一個具體實施方案中，所述的穩(wěn)定劑是濃度范圍為1%-2%的硬脂 酸鋅2ml，所述的耐熱保護(hù)劑是5ml甘油。
在一個具體實施方美中，所述的蒸餾水是去熱原的蒸餾水。
在另一個具體實施方案中，步驟(2)中同時加入240ml的1%絮凝劑，
其中所述的絮凝劑是殼聚糖溶液。
本發(fā)明的第二個目的是提供通過上述方法所制備的狗用的轉(zhuǎn)移因子溶液。
由于轉(zhuǎn)移因子是從淋巴細(xì)胞中提取的一類低分子肽與核苷酸復(fù)合物， 目前并沒有明確的組分或結(jié)構(gòu)，制備方法的不同，所得的轉(zhuǎn)移因子也會差 異，因此通常在生產(chǎn)過程中是通洋限定制備方法的參數(shù)來明確轉(zhuǎn)移因子。 在本發(fā)明中，由于限定了具體的制備方法，因此所得到的轉(zhuǎn)移因子具有組 分穩(wěn)定、純度高、活性好等特點，具有很好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明的第三個目的是提供所制備的轉(zhuǎn)移因子在寵物狗疾病預(yù)防和治 療上的用途。
術(shù)語
"熱原"系指由微生物產(chǎn)生的能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質(zhì)。 它包括細(xì)菌性熱原、內(nèi)源性高分子熱原、內(nèi)源性低分子熱原及化學(xué)熱原等。這里所指的"熱原"，主要是指細(xì)菌性熱原，是某些細(xì)菌的代謝產(chǎn)物、細(xì)菌尸 體及內(nèi)毒素。致熱能力最強(qiáng)的是革蘭氏陰性桿菌的產(chǎn)物，其次是革蘭陽性 桿菌類，革蘭陽性球菌則較弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能產(chǎn)生熱原。 熱原通常是磷脂多醇與蛋白質(zhì)結(jié)合而成的復(fù)合物。磷脂多醇是復(fù)合物的活 性中心，致熱作用最強(qiáng)。其化學(xué)組成因菌種不同而有所差異。分子量為
5xl04 5x105，分子量越大致熱作用也越強(qiáng)。
去熱原的方法包括
1. 高溫法熱原的耐熱性能良好，6(TC加熱lh不被分解破壞，IO(TC不 降解，但180。C3 4h、 20(TC60min或25(TC30 45min可使熱原徹底破壞。
因此耐熱物品如玻璃制品、金屬制品、生產(chǎn)過程中所用的容器和其它用具 以及注射時使用的注射器等，均可采用此法破壞熱原。但在通常使用的注 射劑熱壓滅菌條件下不足以破壞熱原。
2. 吸附法熱原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。 由于活性炭性質(zhì)穩(wěn)定、吸附性強(qiáng)兼具助濾和脫色作用，故廣泛用于注射劑 生產(chǎn)，但應(yīng)注意吸附藥液所造成的主藥的損失。
3. 超濾法熱原分子量為"106左右，體積較小，約1 5nm，可以通 過一般濾器和微孔濾膜，但采用超濾法如用3.0 15nm超濾膜可將其除去。
4. 蒸餾法熱原能溶于水但不揮發(fā)，但可隨水蒸氣的霧滴進(jìn)入注射用水 中，因此制備注射用水時，原水中的熱原可經(jīng)蒸餾除去，但需多次蒸餾，， 并加有隔沫裝置，單次蒸餾往往效果不理想。
5. 酸堿法熱原能被強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、強(qiáng)氧化劑破壞。玻璃容器及用具如配 液用玻璃器皿、輸液瓶等可用重鉻酸鉀硫酸清潔液或稀氫氧化鈉處理，破 壞熱原。
6. 其它包括離子交、換法、凝膠濾過法、反滲透法等。有益效果
1. 本發(fā)明在提取過程中，破碎后使用高壓均質(zhì)機(jī)再次進(jìn)行破壁，使得組織 或細(xì)胞內(nèi)容物充分被釋放，同時節(jié)約了大量的人力和物力，提高了提取
率。
2. 在破壁同時中加入了絮凝劑，使得溶液中的蛋白質(zhì)沉淀，溶液變澄清， 在超濾的過程中減少了堵塞中空纖維超濾柱的可能；
3. 采用本發(fā)明生產(chǎn)轉(zhuǎn)移因子，生產(chǎn)周期大大縮短，使得按傳統(tǒng)反復(fù)凍融的 方法進(jìn)行細(xì)胞破壁、半透膜進(jìn)行透析的方法，生產(chǎn)周期縮短20天左右； 而采用本發(fā)明方法制備的轉(zhuǎn)移因子生產(chǎn)周期只需要7天左右，節(jié)省了大 量的人力物力；
4. 提高了轉(zhuǎn)移因子的生產(chǎn)效率，傳統(tǒng)反復(fù)凍融的方法進(jìn)行細(xì)胞破壁、半透 膜進(jìn)行透析的方法，生產(chǎn)的轉(zhuǎn)移因子原液，每1000g脾臟約生產(chǎn)含量為 2.0mg/mL左右的原液2000ml，而采用本發(fā)明生產(chǎn)每1000g脾臟約生產(chǎn) 含量為7.0mg/mL左右的原液1000ml，折合產(chǎn)量增加175%。
5. 在0-4'C低溫透析環(huán)境，透析時間延長，透析液中轉(zhuǎn)移因子的含量提高， 達(dá)到每毫升0.8毫克多，比己有技術(shù)提高40%以上，轉(zhuǎn)移因子活性也有 所提高。
6. 把耐熱保護(hù)技術(shù)與轉(zhuǎn)移因子相結(jié)合，使轉(zhuǎn)移因子的保存溫度由:15。C提 高到常溫，實現(xiàn)了轉(zhuǎn)移因子的常溫保存，該技術(shù)既適應(yīng)了實際的需要， 使轉(zhuǎn)移因子在運輸和使用中再無須低溫環(huán)境，同時轉(zhuǎn)移因子作為一種細(xì) 胞免疫反應(yīng)增強(qiáng)劑，提高了機(jī)體抗病能力，解除了機(jī)體的免疫抑制和免 疫耐受性，對患病狗可產(chǎn)生緊急輔助治療的作用，也彌補(bǔ)了疫苗接種后 抗體產(chǎn)生前的免疫空白。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。 實施例l:轉(zhuǎn)移因子的制備
(1) 將冷凍的雞脾臟lkg，去除脂肪、被摸和大的血管，用去熱原蒸餾水洗 凈后切成小塊，加入1L無菌生理鹽水；
(2) 用高壓勻制機(jī)(100Mpa)進(jìn)行細(xì)胞破碎，同時加入240ml的1%殼聚 糖溶液作為絮凝劑，混勻后制成勻漿；
(3) 置-2(TC冷凍和室溫融化，反復(fù)凍融8次；
(4) 然后在4。C，以6000rpm離心并取上清液，反復(fù)3次后，將上清置于透 析袋中并將透析袋放入盛有無菌生理鹽水的容器內(nèi)，置于0-4"C透析 72h; -
(5) 用4% MaHC03調(diào)整透析液PH值至中性，并加入0.3%的氯仿作防腐劑；
(6) 將透析液通過0.45pm微孔濾膜進(jìn)行過濾，然后用截留分子量為5000 道爾頓超濾膜進(jìn)行超濾，即為含有轉(zhuǎn)移因子的原液；
(7) 在原液中加入濃度為1.5%的硬脂酸鋅的2ml穩(wěn)定劑后，通過0.25pm 微孔濾膜除菌過濾，然后加入5ml甘油的耐熱保護(hù)劑，直接分裝，即 得到轉(zhuǎn)移因子溶液。
實施例2:對本發(fā)明所述工藝制備的轉(zhuǎn)移因子的檢測
對實施例1所述工藝制備的轉(zhuǎn)移因子原液按照國家藥品監(jiān)督管理局、 國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS,-XG-036-2000進(jìn)行以下檢測
1、 外觀性狀為微黃色澄明液體，符合轉(zhuǎn)移因子溶液的外觀性狀。
2、 氨基酸鑒別反應(yīng)為正反應(yīng)。
3、 紫外分光光度測定上述所得樣品在251±2nm處有一吸收峰，且 ABS250/ABS280>2.0。4、 pH值在6.0 7.5之間。
5、 20%磺基水％酸檢測上述所得樣品無渾濁及沉淀現(xiàn)象，說明蛋白 反應(yīng)均成陰性，其不含大分子蛋白質(zhì)。
6、 高分子量物質(zhì)檢測，在胰島素出峰時間之前無吸收峰，說明本品中 無高于分子量6000的大分子。
7、 游離氨基酸檢測每lml中本品氨基酸含量10mg。
7、 轉(zhuǎn)移因子活性測定根據(jù)轉(zhuǎn)移因子可使脫E受體后的胸腺T細(xì)胞恢 復(fù)其受體功能，從而反應(yīng)轉(zhuǎn)移因子的生物活性。上述所得樣品形成E玫瑰 花結(jié)的百分率分別為31.2%、 29.6°/。，比對照組分別增加17.8°/。、 16.9%
(P^0.01)。
8、 細(xì)菌學(xué)檢驗上述所得樣品中無需氧、厭氧、腐生菌和真菌存在。
9、 過敏性、毒性試驗:取健康小白鼠10只，雌雄各半，口服本品濃 縮液，相當(dāng)于正?？诜┝康?00倍，觀察小白鼠的生存能力的變化，結(jié) 果無任何過敏、毒性反應(yīng)，也無任何死亡出現(xiàn)，說明本品是安全的，無 任何毒性和副作用。
10、 核酸含量測定上述所得樣品經(jīng)地衣酚法測定核酸含量分別為
621.05pg/mL、 599,89pg/mL。 .
11、 多肽含量測定上述所得樣品經(jīng)Lowry法測定多肽含量分別為 7.12mg/mL、 6.98mg/mL。
12、 用豬偽狂犬病病毒抗原做皮試檢測，有弱的陽性反應(yīng)，說明本品 具有良好的轉(zhuǎn)移活性和特異性。
通過上述實施例，我們發(fā)現(xiàn)所提取的雞脾臟轉(zhuǎn)移因子含量高，生產(chǎn)工 序簡單，生產(chǎn)效率高。同時所生產(chǎn)轉(zhuǎn)移因子原液符合國家法典的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。 因此本發(fā)明所采用的生產(chǎn)方法可以進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)推廣。實施例3:本轉(zhuǎn)移因子對在狗上的應(yīng)用
對實施例1所述工藝制備的轉(zhuǎn)移因子，按照農(nóng)業(yè)部公告第442號發(fā)布
的獸用生物制品臨床試驗研究資料要求進(jìn)行以下研究
1、 試驗動物45日齡健康小狗6只，均斷奶，常規(guī)方式飼喂。
2、 攻毒對6只小狗攻等量犬細(xì)小病毒弱毒，均致發(fā)病。.
3、 試驗方法待癥狀出現(xiàn)，立即進(jìn)行臨床治療試驗。隨機(jī)分為3組，
每組2只。低劑量組肌注轉(zhuǎn)移因子溶液劑量為0.3ml/kg;中劑量組肌注轉(zhuǎn)移 因子溶液劑量為0.6ml/kg;高劑量肌注轉(zhuǎn)移因子溶液劑量為1.0ml/kg。均一 日一次，連續(xù)3天。
4、 試驗結(jié)果低劑量組癥狀減輕，精神、食欲等均好轉(zhuǎn)；中劑量組跟 高劑量組均恢復(fù)健康，精神、食欲等恢復(fù)正常。
通過上述實施例，我們發(fā)現(xiàn)所提取的雞脾臟轉(zhuǎn)移因子對于犬的病毒病 起到治療作用。因此本發(fā)明可以進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)推廣。
權(quán)利要求
1、一種在用于寵物的轉(zhuǎn)移因子溶液的制備方法，包括(1)將冷凍的雞脾臟1kg，去除脂肪、被摸和大的血管，用去熱原蒸餾水洗凈后切成小塊，加入1L無菌生理鹽水；(2)用高壓勻制機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎，同時加入240ml的1％殼聚糖溶液作為絮凝劑，混勻后制成勻漿；(3)置-20℃冷凍和室溫融化，反復(fù)凍融8次；(4)然后在4℃，以6000rpm離心并取上清液，反復(fù)3次后，將上清置于透析袋中并將透析袋放入盛有無菌生理鹽水的容器內(nèi)，置于0-4℃透析72h；(5)用4％MaHCO3調(diào)整透析液PH值至中性，并加入0.3％的氯仿作防腐劑；(6)將透析液通過微孔濾膜進(jìn)行過濾，然后用超濾膜進(jìn)行超濾，即為含有轉(zhuǎn)移因子的原液；(7)在原液中加入濃度為1.5％的硬脂酸鋅的2ml穩(wěn)定劑后，通過0.25μm微孔濾膜除菌過濾，然后加入5ml甘油的耐熱保護(hù)劑，直接分裝，即得到轉(zhuǎn)移因子溶液。
2、 權(quán)利要求1的方法，其中所述的高壓細(xì)胞破碎機(jī)的工作參數(shù)，優(yōu)選100Mpa、 50Hz。
3、 權(quán)利要求1或2的方法，其中使用0.45拜的微孔濾膜和截留分子量為 5000道爾頓的超濾膜。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或3任一項所述的在寵物上應(yīng)用的轉(zhuǎn)移因子溶液在狗上 的應(yīng)用，其特征在于可與疫苗配合使用以鞏固疫苗效果，還可治療細(xì) 菌與病毒的混合性感染。用量45日齡，0.6-lml/kg。
全文摘要
一種在寵物上應(yīng)用的轉(zhuǎn)移因子溶液的制備方法，包括將冷凍的雞脾臟用蒸餾水洗凈后切成小塊，加入無熱源質(zhì)蒸餾水，用高壓勻制機(jī)破碎細(xì)胞，制成勻漿，加無熱源質(zhì)蒸餾水，混勻，置-20℃反復(fù)凍融8次；將凍融的勻漿離心，去沉淀，留上清液用微孔濾膜進(jìn)行過濾，然后用超濾膜進(jìn)行超濾得到原液；去除病毒后配制加入1％-2％的硬脂酸鋅作為穩(wěn)定劑，用微孔濾膜除菌過濾；過濾后加入甘油作為耐熱保護(hù)劑，直接分裝。本方法所制備的轉(zhuǎn)移因子，可用于寵物狗的疾病預(yù)防和治療，節(jié)約人力和物力，提高了提取率。
文檔編號C07K1/00GK101492492SQ200810154199
公開日2009年7月29日 申請日期2008年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月17日
發(fā)明者李旭東, 王小娥, 蘇建東 申請人:天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司