專利名稱：：中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因及其編碼蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別地，本發(fā)明涉及一種中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因及其編碼蛋白。更具體地說，本發(fā)明涉及中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7(Mainroyaljellyprotein)基因的cDNA序列，該cDNA序列編碼的AccMRJP7是西方蜜蜂"/w'5/ze"j'/era)AmcMRJP-7蛋白的同系物，該AccMRJP7經(jīng)過翻譯后加工所得到的蛋白是西方蜜蜂AmcMRJP7蛋白(AmcMRJP7)的同系物。本發(fā)明還涉及有該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和蛋白的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述蛋白的制備方法。
背景技術(shù)：
：蜂王漿(RJ)是由成年工蜂頭部的外分泌腺體分泌的一種化合物，它是蜂群用于哺育蜂幼蟲的食物的重要組分，是促進(jìn)幼蟲產(chǎn)生級型分化的最重要的營養(yǎng)因素。蛋白質(zhì)是蜂王漿最主要的組分之一，占王漿干重的50y。(Klaudiny"a/.1994,JApicRes.33:105-111.)。一般王漿蛋白由水溶性蛋白(WSPs)和非水溶性蛋白組成，其中水溶性蛋白占總蛋白含量的46%-89%CTomodawW.1977,/z'c16:125-130;TakenakaandEchigo1983,A^ppowiVoge汰(3gaA:wXa油..57:1203-1209)，為王漿蛋白的主要部分，稱MajorRoyalJellyProteins(MRJPs)(LenskyandRakover1983,0附;？尸/j^z'o/.75:607-615)。此外，Schmitzova等根據(jù)研究結(jié)果推測蜂王漿蛋白中MRJPs的含量可能達(dá)到90%(Schmitzovada/.1998,Ce〃Mo/h/e54(9):1020-1030)。Drapeau等通過對西方蜜蜂基因組研究確定，西方蜜蜂MRJPs家族有9個成員，即MRJP1MRJP9(Drapeau"a/.2006，GenomeResearch，16:1385-1394)。王漿酸(10-羥基-2-癸烯酸)曾是歷史上最早明確具有抗菌活性和抗腫瘤作用的王漿活性成分，迄今一直作為國際貿(mào)易中鑒別王漿質(zhì)量的特征指標(biāo)應(yīng)用。隨白組分具有護(hù)肝、免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞等功能。據(jù)報道Watanabe等報道，西方蜜蜂MRJP1能無血清培養(yǎng)中人淋巴細(xì)胞生長(Watanabewa/.1998.Cyotec/wo/ogy.26:23-27.);Kamakura等發(fā)現(xiàn)分子量為57kD的MRJP1蛋白具有促進(jìn)小鼠原代肝細(xì)胞DNA合成和抗疲勞作用(Kamakura"a/，2001，JNutrSciVitaminol(Tokyo).47(6):394-401.);Majtan等發(fā)現(xiàn)體外表達(dá)的MRJP1具有刺激老鼠巨噬細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子"(TNF")，提高肝細(xì)胞的增殖功能，對老鼠還有抗疲勞的作用(Majtan"a/,2005，IntImmunopharmacol.6(2):269-278)。Okamoto等報道MRJP3具有抗過敏和免疫調(diào)節(jié)功能，可能是王漿中的抗炎因子(Okamoto"a/2003，LifeSci.73(16):2029-2045)。因此，MRJPs蛋白己顯示出重要的營養(yǎng)學(xué)價值。在目前全世界己報道的9個蜜蜂屬(j;^)成員中，只有西方蜜蜂(j;^swe仏/era,分布最廣的常見亞種為意大利蜜蜂Ame//^ra^/^)和東方蜜蜂04.cem^)是得到人工馴化和規(guī)?；斯ゐB(yǎng)殖，并用于蜂蜜生產(chǎn)。相對于西方蜜蜂來說，東方蜜蜂，包括我國特有的亞種中華蜜蜂(Acera"acera"a)因生產(chǎn)性能低，蜂群數(shù)量在原產(chǎn)地處于萎縮狀態(tài)。但國內(nèi)外研究表明，因中華蜜蜂因長期適應(yīng)于我國地理氣候，具有西方蜜蜂所不具備的抗病性、耐寒性等抗逆性能，其生物學(xué)特點(diǎn)也多不同于前者,在蜜蜂育種和生態(tài)多樣性保護(hù)等方面具有非常重要的利用價值。根據(jù)Pothichot等研究發(fā)現(xiàn)，東西方蜜蜂的王漿營養(yǎng)功能存在差異把東西方蜜蜂1日齡以內(nèi)的幼蟲轉(zhuǎn)移到西方蜜蜂蜂群中培育王臺，初始的王臺接受率無明顯差異，均接受良好，到3-4日齡時中蜂王臺中的幼蟲出現(xiàn)死亡而被意蜂清除，死亡率很高，而意蜂王臺則一切正常(PothichotandWongsiri.1993，AsianApic.128-133);東方蜜蜂和西方蜜蜂王漿中各組分的含量以及蜂王交叉詞養(yǎng)試驗(yàn)也驗(yàn)證了東方蜜蜂和西方蜜蜂的王漿成分不同這一觀點(diǎn)(TakenakaandTakenaka1996,BiosciBiotechBiochem.60:518-520)。蜜蜂種間蜂王漿，包括蛋白營養(yǎng)功能差異客觀存在，對西方蜜蜂MRJPs的廣泛研究不能取代東方蜜蜂MRJPs的相關(guān)研究和開發(fā)利用。泰國學(xué)者近年來從分布于泰國的另一個東方蜜蜂亞種印度蜜蜂04.cemmZm^'ca)王漿腺cDNA文庫中克隆到了主要王漿蛋白AcMRJPl、AcMRJP2、AcMRJP5基因序列，未能得到AcMRJP4、AcMRJP6AcMRJP8基因序列(Srisuparbh&<2/2003，JBiochemMolBiol.36(6):572-579;Imjongjiraketal2005,JBiochemMolBiol.38(1):49-57)。近年來我國蘇松坤等從構(gòu)建的中華蜜蜂8曰齡工蜂頭部的cDNA文庫中獲得了中華蜜蜂編碼AccMRJPl、AccMRJP2、AccMRJP3和AccMRJP5的完整cDNA序列(蘇松坤等2004，遺傳學(xué)報；31(11):1248-1253;蘇松坤等2005，中國農(nóng)業(yè)科學(xué).38(3):612-618;Suda/.2005.Apidologie.36:389-401)，并發(fā)布于國際GenBank。蘇松坤等已申報了關(guān)于AccMRJPl的兩項(xiàng)發(fā)明專利(1)中華蜜蜂AccMRJPl表達(dá)產(chǎn)物酶解制備抗高血壓多肽的方法(申請?zhí)?00810061679.X)，(2)促進(jìn)細(xì)胞生長的中華蜜蜂AccMRJPl真核表達(dá)產(chǎn)物的制備方法(申請?zhí)?00810061679.X)。但是，對于AccMRJPs中cDNA含量相對較少的基因，如AccMRJP4，一直未克隆成功，AccMRJP6和AccMRJP7均只有獲得部分序列(Su"a/.2005.Apidologie.36:389-401)，因技術(shù)原因未能得到全長基因序列。如他們在GenBank中只公布了編碼AccMRJP7蛋白的220個氨基酸序列的核苷酸序列(GenBank序列號GI:AY862496)，而根據(jù)發(fā)明人研究結(jié)果，AccMRJP7的完整蛋白實(shí)際全長有449個氨基酸，即蘇松坤等發(fā)布的蛋白序列缺少249個個氨基酸，而這部分序列是不可能在科研和應(yīng)用中實(shí)現(xiàn)重組表達(dá)的。本發(fā)明獲得完整的AccMRJP7基因序列，為實(shí)現(xiàn)其生物工程利用提供了技術(shù)關(guān)鍵，具有十分重要的創(chuàng)新價值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因及其編碼蛋白。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種中華蜜峰王漿主蛋白AccMRJP7基因，它具有SEQIDNo.5所示的序列。一種上述中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因的編碼蛋白，它具有SEQIDNo.6所示的氨基酸序列。上述中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因的編碼蛋白在制備抗體方面的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明首次提取分離中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的基因，該基因所編碼的AccMRJP7蛋白是一種生物活性物質(zhì)，可應(yīng)用于功能或營養(yǎng)食品，可作為抗原用于蜂王漿質(zhì)量快速檢測試劑的制備，用其作為抗原制備的抗體適合于作蜜蜂MRJPs家族蛋白的分子生物學(xué)科研，為開發(fā)蜂王漿蛋白深加工和營養(yǎng)產(chǎn)品開發(fā)提供新的依據(jù)。圖1是中華蜜蜂頭部cDNA文庫克隆內(nèi)擴(kuò)增出的AccMRJPs家族及相關(guān)王漿多肽PCR產(chǎn)物片斷瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，其中，15-16泳道為AccMRJP7;圖2是中華蜜蜂AccMRJP7的PCR擴(kuò)增結(jié)果及重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，其中，A圖為AccMRJP7PCR產(chǎn)物；B圖為pMD18-T-AccMRJP7雙酶切(Sam/H&J^oI)瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖；C圖為pGEX-4T-2-AccMRJP7雙酶切(SflmT/I&^/zoI)瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖；M為DNAMarker;箭頭所示為目的基因片段；圖3是不同IPTG濃度下中華蜜蜂AccMRJP7基因重組表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析電泳圖；其中，M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量Marker;泳道1為未轉(zhuǎn)化任何載體的大腸桿菌BL21(DE3);泳道2為質(zhì)粒pGEX-4T-2在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)；泳道3-6為GST-AccMRJP7融合蛋白(箭頭所示)在不同濃度IPTG(0.004g/L、0.04g/L、0.08g/L、0.32g/L)誘導(dǎo)下的表達(dá)情況；圖4是中華蜜蜂GST-AccMRJP7多克隆抗體與西方蜜蜂王漿蛋白樣品和中華蜜AccMRJP5和AccMRJP3a真核表達(dá)產(chǎn)物的Westernblot印跡分析電泳圖；其中，圖A為西方蜜蜂王漿蛋白樣品的SDS-PAGE電泳圖，M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量Marker,RJ所示為西方蜜蜂王漿蛋白樣品。圖B和C為Westemblot印跡分析結(jié)果；RJ所示為西方蜜蜂王漿蛋白；泳道1和2為對照，分別為正常粉紋夜蛾(7hWz印/,'am',Tn)細(xì)胞抽提物和Tn細(xì)胞感染對照病毒后抽提物；泳道3為Tn細(xì)胞感染Accmrjp5重組病毒后的表達(dá)產(chǎn)物；泳道4為Tn細(xì)胞感染AccMRJP3a重組病毒后的表達(dá)產(chǎn)物。箭頭所示為AccMRJP5和AccMRJP3a表達(dá)產(chǎn)物的位置AmMRJPs各成員位置的標(biāo)示參照Schmitzova等發(fā)表的西方蜜蜂蜂王漿(Schmitzova"a/1998,CellMolLifeSci.54(9):1020-1030)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提取分離的中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因全長為1350個核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQIDNo.5，開放讀框位于11350位核苷酸。在本發(fā)明中，"分離的"、"純化的"或"基本純的"DNA是指，該DNA或片段己從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來；還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。在本發(fā)明中，術(shù)語"中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7編碼序列"指編碼具有中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的核苷酸序列，如SEQIDNo.5中11350位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指位于SEQIDNo.5序列的編碼框11350位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQIDNo.5中11350位核苷酸序列同源性低至約70%簡并序列也能編碼出SEQIDNo.6所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更佳地在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與SEQIDNo.5中從核苷酸11350位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQIDNo.5中從核苷酸1234位的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%的核苷酸序列。該術(shù)語還包括能編碼具有與中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7相同功能蛋白的、SEQIDNo.6序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個核苷酸的缺失、插入和或取代，以及在5'和/或3'端添加數(shù)個核苷酸。在本發(fā)明中，"基本純的"蛋白質(zhì)是指其占樣品總物質(zhì)的至少20%，較佳地至少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90%(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層折、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。在本發(fā)明中，術(shù)語"中華蜜蜂王槳主蛋白AccMRJP7"指具有中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7活性的SEQIDNo.6序列1-439的多肽。該術(shù)語還包括具有與中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7相同功能的、SEQIDNo.6序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7蛋白的活性片段和活性衍生物。該蛋白的變異形式包括:同源序列、等位變異體、天然突變體，誘導(dǎo)突變體，在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的抗血清獲得的蛋白。本發(fā)明還提供了其他蛋白，如包含中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7蛋白片段的融合蛋白。發(fā)明還提供中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的類似物，這些類似物與天然中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些蛋白包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、Y氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的蛋白并不限于上述例舉的代表性的蛋白。修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括；體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中.或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的蛋白。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的蛋白。本發(fā)明還包括中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7編碼序列及其片段的反義序列，這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的表達(dá)。本發(fā)明還包括一種探針分子，該分子通常具有中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7編碼序列的8100個，較佳地150個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7核苷酸分子。本發(fā)明還包括檢測中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合，較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間，引物長度一般為1550個核苷酸。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。在本發(fā)明中，術(shù)語"宿主細(xì)胞"包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌，枯草芽孢桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞，較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如Tn細(xì)胞、CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。另一方面，本發(fā)明還包括對中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，"特異性"是指抗體能結(jié)合于中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的分子，也包括那些并不影響中華蜜蜂王槳主蛋白AccMRJP7功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的中華蜜蜂王槳主蛋白AccMRJP7基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladneretal，美國專利No.4，946，778);或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自中華蜜蜂王漿主蛋白的抗體部分的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備，例如，純化的中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來制備抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohlera/1975，Nature256:495，；Kohler"1976，Eur丄Immimol,6:511;Kohleretal1976,Eur.J.Immunol，6:292;Hammerlinge"/1981,InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas，Elsevier,N.Y.)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7功能的抗體以及不影響中華蜜蜂王槳主蛋白AccMRJP7功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)而獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如五.co/f)中制備的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以在1、3、4、5、7、9、12、15、18、21、24、27和30日齡的中華蜜蜂工蜂頭部混合樣本(每個日齡各取IO個頭)抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA建立文庫，通過文庫大規(guī)模表達(dá)序列片斷(EST)的DNA測序，用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行有效性處理、功能基因序列拼接和功能注釋，建立EST數(shù)據(jù)庫。獲得AccMRJP家族成員，包括2個AccMRJP7功能基因的完整編碼序列。然后根據(jù)功能基因的EST來源和編號，從EST數(shù)據(jù)庫查出具有5'端起始序列EST的30個對應(yīng)克隆，抽提目標(biāo)質(zhì)粒作為模板，用載體中的一對M13通用引物，艮卩5，端引物GTAATACGACTCACTATAGGGCG，3，端引物GGAAACAGCTATGACCATGA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳鑒定，對其中2個AccMRJP7克隆測定cDNA全長，將所得DNA序列與AmMRJP7和拼接序列AccMRJP7進(jìn)行比對和同源分析獲得編碼完整AccMRJP7蛋白序列的開放閱讀框(ORF)，其擴(kuò)增產(chǎn)物測序后得到的全長cDNA序列見SEQIDNo.5。以一個具有完整AccMRJP7核苷酸序列的克隆為模板，用一對根據(jù)AccMRJP7核苷酸序列設(shè)計(jì)的一對寡核苷酸為引物，即5'端引物5，-GGATCCATGGCCATTGTTCGAAAAAATTC-3，，3，端弓|物5'-CTCGAGCTAATTAATTAAAGAGTTTATTG-3'，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物插入pMD18-T載體，進(jìn)行陽性克隆測序后確認(rèn)得到SEQIDNo.5的全長cDNA序列。引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pGEX-4T-3上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。將從pMD18-T載體雙酶切獲得的AccMRJP7基因片斷插入PGEM-4T-2(帶GST編碼序列)載體，陽性克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得分子量為66kDa的AccMRJP7-GST融合表達(dá)蛋白，將誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物用超聲波破碎后，取沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳。用GST單克隆抗體對AccMRJP7-GST融合表達(dá)蛋白SDS-PAGE膠進(jìn)行Western-blot檢測，66kDa蛋白印跡呈特異性條帶。從SDS-PAGE凝膠中切下特異性表達(dá)的蛋白條帶，進(jìn)行透析，冷凍干燥，用生理鹽水溶解純化蛋白作為抗原免疫白毛黑眼兔，6.1周后，從兔頸動脈收集血液，制取抗血清，-70'C保存?zhèn)溆谩２捎瞄g接ELISA法。以免疫前采集的正常兔血清為陰性對照，經(jīng)高速離心的西方蜜蜂蜂王槳溶液上清為抗原，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG做酶標(biāo)二抗，對所制備多克隆抗體進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，OPD顯色后在492nm下測定OD值，確定抗體的效價正常。用AccMRJP7-GST多克隆抗體作為一抗，對西方蜜蜂王漿蛋白，以及同中華蜜蜂AccMRJP-3a和AccMRJP-5基因的重組桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)蛋白SDS-PAGE膠進(jìn)行Westernblot檢測，西方蜜蜂分泌王漿中的AmMRJPl、AmMRJP2、AmMRJP3和AmMRJP5，重組表達(dá)中華蜜蜂AccMRJP-3a和AccMRJP-5蛋白印跡均有特異性條帶，提供了用一種MRJP成員抗體檢測MRJP家族多種蛋白的新方法。中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7為中華蜜蜂王漿腺表達(dá)的蛋白，本發(fā)明的中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7為研究中華蜜蜂王漿主要蛋白，乃之西方蜜蜂主要蛋白相關(guān)的分子機(jī)理提供了基礎(chǔ)。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1:中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因的克隆和測定1.cDNA文庫構(gòu)建用油漆筆標(biāo)記當(dāng)日羽化的中蜂工蜂，在1、3、4、5、7、9、12、15、18、21、24、27和30日齡期進(jìn)行回捕，-8(TC保存。分別從每個日齡工蜂樣品取10個頭部，加液氮勻漿，加TRIZOL進(jìn)行總RNA提取。用試劑盒分步純化出mRNA，合成cDNA第一鏈和第二鏈。然后用末端補(bǔ)平酶將雙鏈cDNA末端補(bǔ)平，加上五"iI接頭并將其磷酸化，再經(jīng)屈ol酶切處理，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，再用MinEluteGelExtraction試劑盒進(jìn)行凝膠回收。將cDNA與載體pBluescriptIISK(+)相連，用電擊反應(yīng)法轉(zhuǎn)化￡.co//DH10B感受態(tài)菌，加SOC培養(yǎng)基，3'7"C搖床復(fù)蘇1h，取50菌液涂布含有IPTG/X-gal的LB培養(yǎng)基，37'C培養(yǎng)過夜。從生長轉(zhuǎn)化菌的平板上隨機(jī)挑取若干個菌落，培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，采用M13通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定文庫質(zhì)量。2.cDNA文庫測序從文庫挑取單克隆接種在含LB培養(yǎng)基的96孔板，37'C培養(yǎng)18小時左右，提取質(zhì)粒作為模板，用通用引物M13進(jìn)行PCR擴(kuò)增，樣品經(jīng)純化后放入Megabace1000中進(jìn)行測序，得到SEQIDNo.5所示的基因序列。3.EST功能注釋、芯片用EST篩選與數(shù)據(jù)庫構(gòu)建利用浙江大學(xué)生物信息服務(wù)平臺服務(wù)器進(jìn)行EST片段處理和拼接，phrap軟件作有效性處理.。選出具有獨(dú)立功能的Contig、Siglet序列，用Ontology(GO)和Blast軟件進(jìn)行功能注釋。用DNAstar軟件選出與Contig、Siglet序列相匹配的EST代表性序列。從中選出代表性AccMRJP家族成員，包括AccMRJP7功能基因的完整編碼序列。然后根據(jù)功能基因的EST來源和編號，從EST數(shù)據(jù)庫查出具有5'端起始序列王漿腺分泌的AccMRJP家族成員及相關(guān)多肽的EST對應(yīng)克隆，抽提目標(biāo)質(zhì)粒作為模板，用載體中的一對M13通用引物，即5'端引物GTAATACGACTCACTATAGGGCG,3，端引物GGAAACAGCTATGACCATGA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳鑒定，所選30個克隆有29個呈現(xiàn)0.5-2.5kb的DNA片斷(見附圖l)。其中2個AccMRJP7克隆顯示大小為1.5kb的DNA片斷。對2個AccMRJP7克隆測定cDNA全長，將所得DNA序列與AmMRJP7和拼接序列AccMRJP7進(jìn)行比對和同源分析，均顯示編碼完整AccMRJP7蛋白序列的開放閱讀框，其擴(kuò)增產(chǎn)物測序后得到的全長cDNA序列見SEQIDNo.5。根據(jù)得到的全長cDNA序列推導(dǎo)出中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的氨基酸序列，共449個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQIDNo.6。實(shí)施例2:同源比較用本發(fā)明的中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的全長cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中，用Blast程序進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它與西方蜜蜂王槳主蛋白AmMRJP7(GenBank發(fā)布的序列號GI:40949636)有顯著的同源性。AccMRJP7與AmMRJP7的氨基酸序列聯(lián)配結(jié)果(見表1)。AccMRJP7與AmMRJP7氨基酸序列的長度分別為449aa和443aa，兩者的同源性為84.2%，AmMRJP7中一些對應(yīng)于AccMRJP7Asn位點(diǎn)的序列由Asp取代，但是AccMRJP7氨基酸序列中Asp的含量(6.4%)只是較AmMRJP7中偏低(8.1%)。兩個氨基酸序列C末端的差異較大，AmMRJP7氨基酸序列較AccMRJP7在426aa-431aa位點(diǎn)間缺失了NQNNNI六個氨基酸。從序列整體上看，AccMRJP7中多個Asn(N)位點(diǎn)在AmMRJP7中被Asp(D)位點(diǎn)取代。對AccMRJP7的氨基酸組成進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，整個序列中Asn含量高達(dá)13.6%，而AmMRJP7中Asn含量僅為9.5%。另外，引起兩者中Asn含量差異懸殊的原因可以由AccMRJP7C末端出現(xiàn)的多個Asn位點(diǎn)來解釋。如前所述，東西方蜜蜂的王漿成分不同，相對應(yīng)的單個MRJPs成員也存在或多或少的差異，兩MRJP7氨基酸序列C末端的不同，AccMRJP7的氨基酸序列中的RGD位點(diǎn)在AmMRJP7中也不存在。同時用本發(fā)明的中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的全長cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中，用Blast程序進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘇松昆提交的編碼中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的部分核苷酸的蛋白序列的氨基酸序列的長度為220aa(在GenBank發(fā)布的序列號GI:AY862496),該序列是參考意大利蜜蜂王漿主蛋白AmMRJP7核苷酸序列，由不同王漿腺cDNA文庫克隆的測序獲得的6個EST拼接而成，而不是一個連續(xù)而完整的cDNA序列。相對于本發(fā)明的完整蛋白序列，蘇松昆的序列缺少了第110和300-449氨基酸序列，且其中兩者還有3個氨基酸不同(見表2)。其序列比完整序列缺少50%以上，如應(yīng)用于重組表達(dá)將缺乏生物不能顯示生活活性，因而不能應(yīng)用于科研和應(yīng)用。表1:中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7與意大利蜜蜂主蛋白AccMRJP7(GenBank發(fā)布的序列號GI:40949636)的比較進(jìn)行同源比較的兩個序列是:AccMRJP7與AmMRJP7AccMRJP7殘基總數(shù)449AmMRJP7殘基總數(shù)443表示一致殘基的符號為AccMRJP7AmMrjp7AccMRJPAraMrjp7AccMRJP7AmMRJP7AccMRP7AmMRJP7AccMRJP7Am服JP7AccMRjP7AmMRJP7AccM!UP7AmMRJP77i:MTKWLFMVVCLGIACQGAIVRKNSARNLENSLNVLHEWKYIDYDFGSEERRQAAIQSGEYDHTKNYPFDV701:MTRWLFMVACLGIACQGAILRENSA亂KNSLKVMHEWKYIDYDFGSEEK職AIQSDEYDHTKNYPFDV70*************************************************************771:DQWRDKTFVTVLRYDGVPSSLNVISDKTGNGG虹QPYP亂沐TKYKDCSGI糧而AVmYDRLWVLD140771:DQ卿KTFVTVLRYDGVPSSLNVISEKTGNGGRLLQPYPDWSWTKYKDCSGIVSAYSIA皿FDRLWVLD140****************************************************************141:SGLINNIQPMCSPKLLVFDL,NSSQLLKQVDIPHDIAVNTTTENGRLASLVVQAMNPMNTLVYLSDNRGDA210211:LIVYQNSDDSFHRLTSNTFNYDPRYTKMTVEGESFTVQDGIYGMALSPMTNNLYYSPLASRDLYYVNTKP280***************************************************************281:FMKSEYGE麗QYKGVQNIFNTQSTAKAVS跳VLFFGLV麗AVGCWNEHQTLQRENTDMVAQNEETLQ350281:FIKSEYGENKVQYNGVQDVFNTQTTAKAVSKNGILFFGL麗TAVGCWNEHQT攀NT麗AQNEETLQ350***************************************************************351:MIVGMKIKELLPHIVIIDINNIINNEYMLVLSNRMQKILNNDLNFNDINFRILIGGVTDLLENTRCANSN420351:MIVGMKIKQLLPHIVIIDIDNIINDEYMLVLTNRMQKILNNDLNFNDINFRILIGGVSDLLENTRCTNFN420***************************************************************421:IQNNNNQNNNI,QNNDNNLKITINSLIN449421:IQNDDSDENNDD------SIRITIDASFN443由表1可見，中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7與意大利蜜蜂主蛋白AccMRJP7的同源性為84.2%。表2:本發(fā)明中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7(Shen7)與蘇松昆在GenBank發(fā)布的中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7部分氨基酸序列(Su-7)，在GenBank發(fā)布的序列號GI:AY862496)的比較進(jìn)行比較的兩個序列是Shen7與Su-7Shen7殘基總數(shù)449Su-7殘基總數(shù)220表示一致殘基的符號為Shen71:MTKWLFMVVCLGIACQGAIVRKNSARNLENSLNVLHEWKYIDYDFGSEERRQAAIQSGEYDHTKNYPFOT70Su-71:C---------LGIACQGAIVRKKSARNLENSLNVLHEWKYIDYDFGSEERRQMIQSGEYDHTKNYPFDV61*氺氺氺*氺水氺氺*氺*氺*氺*氺氺*氺氺氺氺氺氺氺氺氺**氺*氺氺氺氺氺氺*氺氺氺氺氺;{:氺氺氺氺氺氺*氺氺*氺氺氺氺Shen7Su-7Shen7Su-7Shen7Su-7211:LIVYQNSDDSFHRLTSNTFDYDPKY麗TIEGESFTTQNGISG亂SPLTNNLYYSPLASRDLYYVNTKP280202:LIVYQNSDDSF亂SSNTL---------------------------------------------------220281221Shen7Su-7Shen7351Su-7221Shen7421Su-7221FMKSEYGENNVQYKGVQNIFNTQSTAKAVSKNGVLFFGLVNNTAVGCWNEHQTLQRENTDMVAQNEETLQ350----------------------------------------------------------------------221MIVGMKIKELLPHIVIIDINNIINNEYMLVLSNRMQKILNNDLNFNDINFRILIGGVTDLLENTRCANSN420----------------------------------------------------------------------221IQNNNNQN,INNQNNDNNLRITINSLIN449實(shí)施例3，中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中具有完整AccMRJP7核苷酸序列的克隆為模板，用一對根據(jù)AccMRJP7核苷酸序列設(shè)計(jì)的一對寡核苷酸為引物擴(kuò)增的AccMRJP7基因在在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)。PCR反應(yīng)中使用的5'寡核苷酸引物序列為5，端弓l物5，-GATCCATGGCCATTGTTCGAAAAAATTC-3，(SEQIDNo.1)，該引物含有Bam/fl限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，翻譯起始密碼子和AccMRJP7的部分編碼序列；3'端引物序列為3'端引物5'畫TCGAGCTAATTAATTAAAGAGTTTATTG-3'(SEQIDNo.2)該引物含有XhoI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，翻譯終止子和AccMRJP7的部分編碼序列。引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pGEX-4T-2上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(Ori)、一個IPTG可調(diào)啟動子/操縱子(P/0)，一個凝血酶識別位點(diǎn)，一個谷光甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)融和蛋白標(biāo)記物以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。以具有完整AccMRJP7核苷酸序列的克隆AccMRJP7為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測，得到如圖2A所示的目的DNA片斷。陽性克隆測序后測序得到SEQIDNo.5的全長cDNA序列。將擴(kuò)增產(chǎn)物純化，插入pMD18-T載體。對連至pMD18-T載體的連接產(chǎn)物pMD18-T-Accm咖7用萬amHI和WoI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見前者在約2700bp和1300bp處(圖7-lB)與預(yù)期載體和目的片段大小相符的片段。用I禾H屈oI消化pMD18-T載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pGEX-4T-2載體并保持開放讀框在凝血酶識別位點(diǎn)起始點(diǎn)(Ori)。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化商品名為BL21的￡.//菌株，BL21含有多拷貝的重組質(zhì)粒，其表達(dá)laclq阻遏物并攜帶抗性(Ampr)，在含有Ampr的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒。用萬amHI和loI雙酶切所得質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在約4900bp和1300bp處有與預(yù)期載體和目的片段大小相符的片段(圖2C)。測序驗(yàn)證中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的cDNA片段，該序列為SEQIDNo.5序列的11350，與已正確插入了載體。將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化人BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布菌液于含IOO"g/mlAmp的LB平板中，挑取白色菌落，接種于含同等質(zhì)量濃度Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37"C振蕩培養(yǎng)過夜活化。按每支試管6ml含Amp的LB液體培養(yǎng)基加入IOOul菌液的量，轉(zhuǎn)接活化菌液，共接四支試管，37°C、220r/min振蕩培養(yǎng)至OD600:0.6-1.0，按一定濃度梯度加入IPTG(每支試管中加入IPTG的終濃度分別為0.004g/L、0.04g/L、0.08g/L、0.32g/L，)，37。C、180r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。每個濃度梯度下分別取1ml菌液，8000r/min離心5min收集菌體，棄上清后，加入PBS200tU震蕩懸浮沉淀，8000r/min離心5min，棄上清，再加入等體積的PBS和2XSDS凝膠加樣緩沖液，混勻后IOO°C煮沸10min，12000r/min離心1min，取其上清液。誘導(dǎo)產(chǎn)物經(jīng)10%的SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色2h后，室溫?fù)u床上脫色至背景色脫盡觀察。鑒定表達(dá)該蛋白的分子量大小為約66kDa。SDS-PAGE和薄層掃描結(jié)果顯示，不同IPTG濃度下表達(dá)量不同，在IPTG終濃度為0.08g/L條件下，表達(dá)量最高，此時，表達(dá)產(chǎn)物占細(xì)胞總蛋白的22.8%(圖3，泳道5)。實(shí)施例4:制備抗體將實(shí)施例3中獲得的重組蛋白親和層析法進(jìn)行分離，或SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離用來免疫動物以產(chǎn)生抗體。具體方法如下將誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物用超聲波破碎后，取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物主要在沉淀中，即主要以包涵體形式存在。沉淀經(jīng)SDS-PAGE電泳后，從凝膠中切下特異性表達(dá)的蛋白條帶，裝入透析帶中，置于透析槽透析過夜，將透析液轉(zhuǎn)入1.5mleppendorf管中，冷凍干燥，用0.9%的生理鹽水溶解純化的蛋白，從而完成GST-AccMRJP7抗原的制備。具體抗體制備步驟如下(1)選取14-16周齡的健康白毛黑眼兔，每次注射0.5mg左右純化的融合蛋白抗原。免疫前，從兔耳抽取血樣，作為陰性對照。(2)融合蛋白抗原溶于700pl生理鹽水，加700pl弗氏完全佐劑和適量青霉素、鏈霉素溶液乳化，皮下多點(diǎn)注射免疫。(3)3.3周后，融合蛋白抗原溶于700)il生理鹽水，加700pl弗氏不完全佐劑和適量青霉素、鏈霉素溶液乳化，皮下多點(diǎn)注射免疫。(4)4.2周后，融合蛋白抗原溶于1ml生理鹽水肌肉注射免疫。(5)5.1周后，再次用1ml溶有融合蛋白抗原的生理鹽水加強(qiáng)免疫。同時，從兔耳抽血樣，采用間接ELISA方法進(jìn)行多抗血清效價測定。(6)6.l周后，頸動脈收集血液，置室溫下使其凝固。(7)將凝固的血液放入37。C溫箱內(nèi)半小時，再置4'C冰箱過夜，使血塊收縮，抗血清析出；(8)吸出抗血清，3000r/min離心10min，吸上清液分裝，-70T保存?zhèn)溆?。采用間接ELISA法。以免疫前采集的正常兔血清為陰性對照，經(jīng)高速離心的蜂王漿溶液上清為抗原，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG做酶標(biāo)二抗，對所制備多克隆抗體進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，OPD顯色后在492nm下測定OD值，確定抗體效價。多克隆抗體的稀釋采用倍半法，第一次稀釋100倍，第二次200倍，依次類推。所表達(dá)蛋白在抗體稀釋倍數(shù)為1.024X1()S時，多克隆抗體OD492平均值仍大于陰性對照OD492值的兩倍(表3)。為MRJPs的研究和檢測提供了材料。表3:本發(fā)明中GST-AccMRJP7融合蛋白多克隆抗體效價的ELISA檢測<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例5:以中華蜜蜂王漿主蛋白GST-AccMRJP7抗體檢測MRJPs將實(shí)施例4中獲得的-GSTAccMRJP7抗體，通過Westernblot檢測在桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)的AccMRJP-3a和AccMRJP-5蛋白。具體方法如下在無血清條件下，用Lipofectin介導(dǎo)重組的Bacmid-AccMRJP-3a和Bacmid-AccMRJP-5基因組DNA轉(zhuǎn)染生長狀態(tài)良好的粉紋夜蛾細(xì)胞Tn-5Bl-4。轉(zhuǎn)染72h后收獲呈球形的細(xì)胞，進(jìn)行蛋白樣品SDS-PAGE電泳。將實(shí)施例4中制備的GST-AccMRJP7多抗與西方蜜蜂王漿蛋白樣品和中蜂主要王漿蛋白基因AccMRJP5和AccMRJP3a的真核表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Westernblot分析。方法如下1.蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE后，剪取與分離膠相同大小的PVDF膜，將分離膠、3MM濾紙及PVDF膜置Transferbuffer中平衡1520min。2.將3MM濾紙、PVDF膜、分離膠和3MM濾紙依次裝入轉(zhuǎn)移夾中，用Bio-RadTrans-BlotCell半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，轉(zhuǎn)移條件為恒電壓15V20min。3.帶樣品的PVDF膜用封閉液(用lxPBST溶解的4%脫脂奶粉)室溫封閉lh。4.棄封閉液，加入一抗于4y。脫脂奶粉中室溫反應(yīng)lh或4t:反應(yīng)過夜；5.洗滌液洗滌3次，每次10min;6.加HRP酶標(biāo)二抗于lxPBST中室溫反應(yīng)lh。7.洗滌液洗滌3次，每次10min;8.將PVDF膜置于10mlHRP反應(yīng)底物DAB溶液中顯色，待陽性條帶顯示后用ddH20中止反應(yīng)，PVDF膜自然干燥后保存或拍照留作數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示AccMRJP-5多克隆抗體能與西方蜂王漿蛋白樣品中多種主要王漿蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)，如顯示出明顯的AmMRJPl、AmMRJP2、AmMRJP3、AmMRJP5印跡，與在真核系統(tǒng)中表達(dá)的AccMRJP5和AccMRJP3a蛋白特異性結(jié)合(圖4)。在NCBI中對AccMRJP7蛋白序列進(jìn)行BLAST搜索后發(fā)現(xiàn)，AccMRJP7與西方蜜蜂四種主要王漿蛋白AmMRJPl、AmMRJP2、AmMRJP3和AmMRJP5的氨基酸序列同源性分別為67%、72%、66%和78%，與已報道的AccMRJP5蛋白序列的同源性為73%。本發(fā)明利用GST-AccMRJP7多克隆抗體成功檢測了多個西方蜜蜂MRJPs成員，以及中華蜜蜂AccMRJP5和AccMRJP3a的真核表達(dá)產(chǎn)物，也進(jìn)一步證明了蜂王漿主要蛋白各成員之間具有較高的同源性。提供了用一種MRJP成員抗體檢測MRJP家族多種蛋白的新方法。實(shí)施例6:中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7在真核細(xì)胞(Tn細(xì)胞株，即粉紋野蛾細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以AccMRJP7的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為插入片段。PCR反應(yīng)中使用的5'寡核苷酸引物序列為5'陽CTCGAGATGAAGAACTATTCAAAAAATGCA-3'(SEQIDNo.3)，該引物含有屈ol限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是起始密碼子開始的中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7編碼序列的24個核苷酸；3'端引物序列為5，-AAGCTTCTAATTAATTAAAGAGTTTATTG-3'(SEQIDNo.4),該引物含有w/""m限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，翻譯終止子和中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的部分編碼序列。引物上限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)對應(yīng)于Tn細(xì)胞表達(dá)載體pBacFastHTb上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Gm1)，一個噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(Ori)、一個病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)，一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應(yīng)的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應(yīng)的polyA順序。用^70//和歷^/III消化pBacFastHTa載體及插入片段，隨后用連結(jié)混合物轉(zhuǎn)化ETGI菌株，在含有Ampr和Gmf的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，補(bǔ)加Ampr和Gmr的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆，抽提質(zhì)粒，測序驗(yàn)證大中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的cDNA片段已正確插入了載體。隨后用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Eco//DH10Bac菌株，在含有Amp\Gmf、四環(huán)素的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Ampr、Gmr、四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(0/N)含所需構(gòu)建物的克隆，抽提質(zhì)粒，經(jīng)Sepharose2B柱純化，回收質(zhì)粒-70'C保存。2B柱純化，回收質(zhì)粒-7(TC保存。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Tn細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin(GiBcoLife)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時后，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清，含重組病毒粒子的細(xì)胞上清用于下一輪感染。經(jīng)2-3周的TC-100連續(xù)傳代培養(yǎng)，收集細(xì)胞，用超聲裂解法破碎細(xì)胞，以含NaCl0.5mM、imidazola5mM、PMSF1mM的20mMTris-CI(PH8.0)溶液為平衡液及洗脫液，蛋白液用經(jīng)預(yù)平衡的Ni2+Sepharose6B柱過柱；再用含imdazola50mM、NaC10.5mM、PMSFlmM的20mMTris-CI(PH8.0)的溶液，洗去雜蛋白，專一性的吸附的6XHis的融合蛋白，再用含imdazola500mM、NaCl0.5mM、PMSFlmM的20mMTris-CI(PH8.0)的溶液進(jìn)行洗脫.然后以PBS(PH7.4)為透析液對表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。用10%的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定的6XHis的融合蛋白的分子量大小約為51KDa。用6XHis單克隆抗體和GST-AccMRJP7多抗進(jìn)行Westernblot檢測，均顯示51KDa印跡。中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因及其編碼蛋白基因序列表SEQUENCELISTING<110〉浙江大學(xué)<120〉中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因及其編碼蛋白<160〉6〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉28〈212〉腿<213〉A(chǔ)pisceranacerariamainRoyaljellyprotein7〈400〉1gatccatggccattgttcgaaaaaattc28〈210〉2<211〉28〈212〉DNA〈213〉A(chǔ)pisceranaceranamainroyaljellyprotein7<400>2tcgagctaattaattaaagagtttattg28<210〉3〈211〉30〈212〉DNA<213〉A(chǔ)pisceranaceranamainroyaljellyprotein7<400>3ctcgagatgaagaactattcaaaaaatgca30〈210>4<211〉29〈212〉■<213〉A(chǔ)pisceranaceranamainroyaljellyprotein7<400〉4aagcttctaattaattaaagagtttattg29〈210〉5〈211〉1350〈212〉腿〈213>Apisceranaceranamainroyaljellyprotein7〈400〉5atgacaaagtggttgtttatggtggtatgccttggcatagcttgtcaaggcgccattgtt60cgaaaaaattctgcacgaaacttggaaaattcgttgaacgtacttcacgaatggaaatat120atcgattatgatttcggtagcgaagaaagaagacaagctgcgattcaatctggcgaatac1.80gatcatacgaaaaattatcccttcgatgtcgatcaatggcgtgataagacttttgtcacc240gtattaagatacgatggtgtgccttcttctttgaacgtgatatctgataaaactggcaac300ggtggacgacttctacaaccgtatcctgattggttgtggacgaaatataaagattgctct360ggaatcgtgaacgcttacaatattgcggtcgataaatacgELcagattgtgggttttggat420tcaggtcttatcaacccatgtgttccccaaaattgcttgtctttgatcta480aattgctcaagcaagtggatataccgcsLCgatattgccgtaaataccacc540acagaaaacggaagattagcatctttagttgtccaagctatgaatcctatgaatactctg600gtgtatttgtcagacaacagaggtgacgctttaatcgtctaccaaaattccgacgattcc660ttccatcgattgacttccaacactttcgattacgatcccaaatataccaaaatgacgatt720gtttcacaaca_C3￡L3￡Ltggaatttctggaatggctcttagtcccctgaca780aacaatctttattacagtcctctcgcttctcgcgatttgt840ttcatgaaatcagaatatggagaaaataatgtccaatataaaatattttc■caaccgctaaagcggtatcg3a^6Ltggcgttcttttcttcggtctcgtg960ctgttggttgttggaacgag1020atggtcgctcaaaatg犯g3atgatcgttgt犯gg^tt6L1080cttccacatatcgtcattattatgttagta1140g3atgc犯a^aatattaaacaBtgELtCtt3tattaacttc1200cga^ttttgattggaggtgtgaccgacttgctcgttgcgc1260ataacaatcaaaataacaatattaacaatctaacaat11a1320agaatcacaataaactctttaMtaattag1350〈210>6〈211〉449〈212〉PRT〈213〉A(chǔ)pis〈400〉6MetThrLys1GlyAlalieAsnValLeu35GluArgArg50AsnTyrPro65ValLeuArgLysThrGlyTrpThrLys115AlaValAsp130AsnAsnlie145AsnSerSerceranaceranamainroyaljellyprotein7TrpLeuPheMetValValCysLeuGlyVal20HisGinPheTyrAsn100TyrLysGinGinLeu5ArgGluAlaAspAsp85GlyLysTyrProLeu165LysTrpAlaVal70GlyGlyAspAspMet150LeuAsnLyslie55AspValArgCysArg135CyslysSerTyr40GinGinProLeuSer120LeuSerGinAla25lieSerTrpSerLeu105GlyTrpProValCys10ArgAspGlyArgSer90GinlieValLysAsp170AsnTyrGluAsp75LeuProValLeuLeu155lieLeuAspTyr60LysAsnTyrAsnAsp140LeuProlieAlaCysGin15GluAsnSerLeu30PheGlySerGlu45AspHisThrLysThrPheValThr80VallieSerAsp95ProAspTrpLeu110AlaTyrAsnlie125SerGlyLeulieValPheAspLeu160HisAsplieAla175ValAsnAlaMetAspAla210ThrSer225GluGlySerProLeuTyrAsnAsn290ThrAla305AsnAsnGluAsnValGlylieAsn370MetGin385ArglieAlaAsnAsnGinAsnThrAsn195LeuAsnGluLeuTyr275ValLysThrThrMet355AsnLysLeuSerAsn435Thr180ProlieThrSerThr260ValGinAlaAlaAsp340LyslielielieAsn420AsnThrMetValPhePhe245AsnAsnTyrValVal325MetlielieLeuGly405lieAspGluAsnTyrAsp230ThrAsnThrLysSer310GlyValLysAsnAsn390GlyGinAsnAsnThrGin215TyrThrLeuLysGly295LysCysAlaGluAsn375AsnValAsnAsnGlyLeu200AsnAspGinTyrPro280ValAsnTrpGinLeu360GluAspThrAsnLeu440Arg185ValSerProAsnTyr265PheGinGlyAsnAsn345LeuTyrLeuAspAsn425LeuTyrAspLysGly250SerMetAsnValGlu330GluProMetAsnLeu410AsnlieAlaSerLeuSerAspSer220TyrThr235lieSerProLeuLysSerliePhe300LeuPhe315HisGinGluThrHislieLeuVal380PheAsn395LeuGluGinAsnThrlieUuValValGin190AspAsnArgGly205PheHisArgLeuLysGlyAlaGlu285AsnPheThrLeuVal365LeuAspAsnAsnAsn445MetMetSer270TyrThrGlyLeuGin350lieSerlieThrAsn430SerThrlie240AlaLeu255ArgAspGlyGluGinSerLeuVaJ320GinArg335MetlielieAspAsnArgAsnPhe400ArgCys415lieAsnLeulie權(quán)利要求1.一種中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因，其特征在于，它具有SEQIDNo.5所示的序列。2.—種權(quán)利要求1所述中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因的編碼蛋白，其特征在于，它具有SEQIDNo.6所示的氨基酸序列。3.—種權(quán)利要求2所述中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因的編碼蛋白在制備抗體方面的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因及其編碼蛋白，該基因具有SEQIDNo.5所示的DNA序列；該基因的編碼蛋白具有SEQIDNo.6所示的氨基酸序列，該編碼蛋白能制備抗體；本發(fā)明為MRJP7的生物工程應(yīng)用奠定了一定基礎(chǔ)，特別是提供了一種用一種MRJPs成員抗體檢測MRJP家族蛋白的新方法，在蜂王漿科研和生產(chǎn)領(lǐng)域具有廣泛用途。本發(fā)明為進(jìn)一步研究MRJP相關(guān)的蛋白活性分子機(jī)理，開發(fā)與MRJPs相關(guān)的功能食品、診斷試劑及生物試劑打下了基礎(chǔ)。文檔編號C07K14/435GK101434954SQ20081016361公開日2009年5月20日申請日期2008年12月22日優(yōu)先權(quán)日2008年12月22日發(fā)明者張傳溪,艷李,沈立榮,程家安,邢麗蘋申請人:浙江大學(xué)