專利名稱：水稻蛋白OsCSP1及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及功能基因組學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種水稻蛋白a csP7及其 編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
土壤鹽漬化對農(nóng)業(yè)的威脅是一個(gè)全球性的問題。全世界共有10億公 項(xiàng)的鹽堿地，約占世界陸地面積7.6%，我國鹽堿地近1億多公項(xiàng)，農(nóng)業(yè) 耕地因鹽漬化引起的減產(chǎn)、棄耕地就近333.5萬公項(xiàng)。近年來，我國設(shè)施 農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，特別是蔬菜和花卉大棚生產(chǎn)面積不斷擴(kuò)大，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2005 年全國蔬菜、花卉、瓜果等作物設(shè)施栽培面積達(dá)210萬公項(xiàng)。設(shè)施農(nóng)業(yè)的 發(fā)展為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)結(jié)構(gòu)調(diào)整和提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效益發(fā)揮了重要作用，但是隨著 設(shè)施栽培時(shí)間延長，土壤次生鹽漬化的問題日益加劇，嚴(yán)重影響了設(shè)施栽 培作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，效益也隨之下降，從而影響設(shè)施農(nóng)業(yè)的健康發(fā)展。 解決設(shè)施栽培土壤鹽漬化一般釆取以下兩種措施， 一是用石膏和硫磺等化 學(xué)方法或用排水和灌溉洗鹽等物理方法改良土壤；二是通過常規(guī)育種或生 物技術(shù)手段培育耐鹽作物品種，而前者投入成本高。通過培育適宜在鹽堿 地區(qū)栽培和設(shè)施栽培的農(nóng)作物抗鹽新品種將不僅能有效解決設(shè)施栽培土 壤鹽漬化問題，而且還能通過有效利用部分鹽漬化土地而大大地緩解我國 土地資源匱乏的問題。
近年來，隨著模式植物擬南芥和水稻基因組測序完成，植物基因組學(xué) 研究已轉(zhuǎn)入到功能基因組學(xué)。目前一些研究功能基因組學(xué)的新方法和實(shí)驗(yàn) 技術(shù)體系如cDNA^t陣列、基因芯片、基因表達(dá)系統(tǒng)分析(serial analysis of gene expression, SAGE )、基因敲除(gene knockout)和RNAi分析均能有 效分析大量基因的表達(dá)和功能模式，并在耐鹽性相關(guān)功能基因資源發(fā)掘上 取得了一定進(jìn)展。 一些與滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因已從不同植物種類中被成功克 隆并轉(zhuǎn)化應(yīng)用，如脯氨酸合成相關(guān)基因P5CS (Kishor PBK， Hong Z, Miao G H， Hu CAA, Verma DPS. Overexpression of P5CS increases proline
3production and confers osmotolerance in transgenic plants.尸/awf
1995, 108: 1387-1394)和甜菜堿脫氫酶BADH基因(肖崗，張耕耘，劉鳳
華等，山菠菜甜菜堿醛脫氫酶基因研究，科學(xué)通報(bào)，1995， 40(8): 741-745)。
植物體內(nèi)Na+離子平衡是植物自身耐鹽調(diào)節(jié)的重要機(jī)制。朱健康研究 小組發(fā)現(xiàn)擬南芥SOS基因系列的調(diào)控信號是植物自身調(diào)節(jié)Na+離子平衡的 重要途徑之一。2005年，林鴻宣研究小組與美國欒升教授合作，成功克隆 了水稻耐鹽相關(guān)的數(shù)量性狀基因SKC1。該基因能控制水稻植抹地上部鈉 離子和鉀離子的含量，維持鈉和鉀離子平衡，使過量鈉離子不在莖葉等部 位積累，并使鈉離子回流到根部，減輕鈉離子毒害，同時(shí)增加營養(yǎng)元素鉀 離子，從而增加水稻耐鹽性。
眾所周知，水稻的基因圖譜已經(jīng)繪制完成，也就是說大部分水稻基因 序列是公開的，但是具體涉及到某個(gè)基因的功能是未知的，特別是某個(gè)基 因編碼的蛋白以及該蛋白的對水稻產(chǎn)生的功能影響也是未知的。直接鑒定 某個(gè)基因的功能是非常困難的，現(xiàn)有手段往往是先分離出植物蛋白，檢測 該蛋白的氨基酸序列，然后再通過氨基酸序列來比對公用數(shù)據(jù)庫中的某個(gè) 基因序列，從而確定該基因的功能以及該基因的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種水稻蛋白，名稱為OsCSPl,它是一個(gè)受鹽誘導(dǎo)表 達(dá)方式的蛋白，有助于提高水稻耐高鹽和耐低溫性能。
一種水稻蛋白，具有序列表中SEQIDNO.l所述的氨基酸序列。
該蛋白能夠上調(diào)超氧物歧化酶、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶等
抗氧化酶活性，清除因高鹽或低溫脅迫產(chǎn)生過多的活性氧(超氧離子或過
氧化氫)，維持細(xì)胞體內(nèi)活性氧水平在正常范圍內(nèi)，保護(hù)幼苗、植抹免遭
因高鹽或低溫引發(fā)的氧化損傷，提高植物抗逆能力。
根據(jù)上述水稻蛋白OsCSPl的氨基酸序列，通過NCBI和TIGER數(shù)據(jù) 庫搜索，比對到編碼水稻冷激蛋白的基因QyCS尸7( O，Cold Shock ￡rotein 1 )，基因OsCSP/的基因號為Os08g0129200 (ID 4344581 )。該基 因的開放閱讀框(ORF)為594 bp,具有序列表中SEQIDN0.2所述的核 苷酸序列；mRNA長度為982 bp,具有序列表中SEQIDNO.3所述的核苷酸序列。
上述基因可以應(yīng)用于提高植物耐鹽和耐低溫性能，具體方法如下
a. 將基因OsCSP/連接到Superl300載體中，當(dāng)然也可選擇其它載體， 如pCAMBIA1300等；
b. 將重組的Superl300載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)導(dǎo)入植物；
c. 以潮霉素B為抗性標(biāo)記，結(jié)合高鹽(200 mM NaCl以上)和低溫 (4°C)處理進(jìn)行篩選，得到具有耐高鹽和耐低溫能力的植^^。
本發(fā)明水稻蛋白可以提高水稻耐高鹽和耐低溫性能，若將編碼該蛋白 的基因?qū)肫渌参锂?dāng)中，如草莓、辣椒、茄子、 一串紅、非洲菊等，也 有可能提高這些植物的耐高鹽和耐低溫性能。通過上述手段， 一方面可以 增加作物在鹽堿地上的產(chǎn)量，提高我國濱海地區(qū)的鹽堿地的利用；另一方 面可以克服設(shè)施條件下蔬菜、花卉等植物因土壤返鹽和季節(jié)變化降溫(冬 季和早春)引起的生育障礙，提高其產(chǎn)量和品質(zhì)，增加農(nóng)民收入。
具體實(shí)施方式
基因的獲得
(1 )以雜交水稻耐鹽組合汕優(yōu)10號和鹽敏感組合兩優(yōu)培九為材料， 將它們的種子播在含100 mM NaCl溶液浸濕濾紙培養(yǎng)皿中，置于3(TC培 養(yǎng)箱中發(fā)芽，每天更換鹽溶液，以保持鹽濃度基本一致。待幼苗生長至10 d，分別收集汕優(yōu)10號和兩優(yōu)培九幼苗的葉片。
(2 )用冷丙酮/三氯乙酸沉淀法(Salekdeh G H, Siopongco J， Wade L J, Ghareyazie B, Bennett丄A proteomic approach to analyzing drought- and salt-responsiveness in rice. F/eW Oqp i es， 2002, 76 ( 2-3 ) : 199-219 )快速 提取葉總蛋白，具體操作如下
1)水稻葉片用液氮研磨成細(xì)粉，分裝入1.5 ml離心管中，加入1 ml 蛋白提取液I (含10%三氯乙酸和0.07。/。p-巰基乙醇的丙酮溶液)在-20。C 沉淀粗蛋白lh,在4。C、 13000rpm下離心20min,取沉淀，棄上清；
2 )然后往沉淀中加入1 ml蛋白提取液II (含0.07% |3-巰基乙醇的丙 酮溶液)，在-20。C懸浮粗蛋白丸1 h,在4。C、 13000 rpm下離心20min,
5取沉淀，棄上清，再重復(fù)用蛋白提取液II,在相同條件下懸浮提取3次后， 真空抽干沉淀；
3 )用裂解液(含7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% Chaps (Ameresco 公司，美國)、50 mmol / L DTT ( Promega公司，美國)和0.5% pH3-10 的40%兩性電解質(zhì))溶解沉淀，裂解液用量為25pl裂解液/mg沉淀，然后 在室溫下放置1 h，裂解期間不斷渦旋5-6次。
(2 )才艮據(jù)Bradford法(Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976, 72:248-54)用考馬斯亮蘭G-250 (Sigma公司)測定上述裂解液中的蛋白含量，上述裂解液中的蛋白用雙 向凝膠電泳(第一向采用17 cm pH7-10的IPGs干膠條(Bio-Rad公司) 聚焦，第二向釆用變性/SDS-2D-PAGE分離)分離。
第一向等電聚焦分四步進(jìn)行，第一步，電壓250V15min;第二步， 電壓10000V5h;第三步，電壓10000V, 60000 Vh;第四步，電壓500 V直到結(jié)束。
在第一向等電聚焦向第二向轉(zhuǎn)換時(shí)，需要平衡膠條，分兩步進(jìn)行，第 一步，在平衡液I (含6.0mol/L尿素、2%SDS (Promega公司，美國)、 0.375mol /L pH 8.8 Tris-HCl (Promega公司，美國)、20%甘油和130 mmol/L DTT ( Promega公司，美國))中平衡10 miiv， 第二步,在平衡液 II (含6.0 mol/L尿素、2% SDS ( Promega公司，美國)、0.375 mol /L pH 8.8 Tris-HCl (Promega公司，美國)、20%甘油和135 mmol /L碘乙酰胺)中 平衡10min，然后轉(zhuǎn)移到第二向SDS-2D-PAGE膠，跑膠采用恒流，每塊 膠的電流24mA,運(yùn)行5-6h。
用500 ml固定液(40%曱醇和10%乙酸)固定30min,然后用500 ml 銀氨染色液(含有3.6%氫氧化鈉10.5 ml、 20%硝酸銀9ml和5 ml氨水) 染色32-33 min,用雙蒸水沖洗4次，然后用500ml顯色液(含有1%檸檬 酸2.5ml和曱醛250 pl)顯色5-12min,最后用500 ml 5%醋酸終止反應(yīng)5 min。
掃描后用PDQUEST (Bio-Rad公司)軟件分析膠圖匹配情況，結(jié)果 發(fā)現(xiàn)在汕優(yōu)10號幼苗葉片中一個(gè)高表達(dá)蛋白點(diǎn)，估測其等電點(diǎn)和分子量分別為pI6.5和19 KD左右。
(3 )在膠上切下該高表達(dá)蛋白點(diǎn)，加入8pl 10 ng4d胰蛋白酶(Trypsin, Roche,美國)進(jìn)行膠內(nèi)消化，然后置于4"C冰箱放置40 min使膠片完全 吸收酶液，再補(bǔ)加10 |ul 25 mM碳酸氬銨緩沖液(pH 8.0),于37。C溫育 12 h，膠內(nèi)蛋白質(zhì)被酶解成肽段混合物。
(4)在上述肽段混合物中加入30-50^1 5% TFA (Merk公司，德國) 于40。C提取上述酶切肽段1小時(shí)一次，再用相同體積的50% CAN和 2.5%TFA (Merk公司，德國)溶液于30。C提取1小時(shí)一次，最后用25 pl CAN (Fischer公司，美國)超聲提取一次，合并3次提取液。真空干燥， 然后用4 ^ 0.5%三氟乙酸溶解，將0.6^1溶解物用基質(zhì)輔助激光解吸離子 化飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS )分析，獲得肽質(zhì)量指紋(Peptide Mass Fingerprint, PMF)圖譜，查詢Mascot數(shù)據(jù)庫，以較高分值(84)顯著(比 對分高于60)比對到水稻OsC5P7蛋白，匹配序列占總氨基酸序列49%。 根據(jù)已有的水稻OsGS尸7蛋白的氨基iM^列，通過NCBI和TIGER 數(shù)據(jù)庫搜索，比對到編碼水稻冷激蛋白基因，基因號為Os08g0129200。 該基因的開放閱讀框(ORF )為594 bp， mRNA長度為982 bp。
基因克隆與轉(zhuǎn)化
以汕優(yōu)10號幼苗(播后10天)總mRNA為模板，利用RT-PCR方法 擴(kuò)增到(9sGSP7基因的編碼序列。
具體操作如下首先，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA,所用反轉(zhuǎn)錄 試劑盒為TaKaRa公司的High Fidelity PrimerScript RT-PCR Kit,反應(yīng)體 系20 pi,依次加入1 |xl 20M隨才/U引物(Random 6 mers )、 1 ^ 10 mM dNTP、 2^1總RNA和DEPC水至10 pl，在65"C變性5分鐘，迅速在冰上冷卻2 分鐘，稍《效離心，然后依次加入4 (xl 5x PrimerScript RT buffer、 0.5jJ RNase inhibitor 、 PrimerScript RTase和5(il DEPC水。輕《鼓混合均勻，30°C 反應(yīng)10分鐘，42。C反應(yīng)30分鐘，95°C 5分鐘使酶失活。為了去掉與cDNA 互補(bǔ)的RNA鏈，加入1 ^ RNase H在37。C溫育20min， -20°(3保存。然后 以第一鏈cDNA為摸板擴(kuò)增目的基因OsGSP7，所用擴(kuò)增配對引物
OsCSPl-F， 5'-TCTAGAATGGCGTCGGAGAGGGTGA畫3，，
7OsCSP 1-R， 5 ，-GGTACCCTAGTAGGTCTTGCTGGGGC-3 ，， PCR反應(yīng)體系為50 依次加入2x PCR buffer 25 |il、 2.5 mM dNTPs 4^1、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2pl、 20ixM正向引物(OsCSPl-F) 1 (il 、 20^M反向 引物(OsCSPl國R) lpl、 2.5U/|il Tag DNA聚合酶0.5pl,最后加水至50 pl。 PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94。C3min，變性98。C10s，退火55°C 15s,延伸 72。C30s， 30個(gè)循環(huán)，最后延伸72°C 10min， 4。C保存。
擴(kuò)增后將QsCS757基因裝入pMD19-T載體中pMD19-T載體由 TakaRa公司生產(chǎn)。將回收純化的QsCS尸7基因的DNA與pMD19-T載體 進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系10 [il，各組分分別為0.5 |il pMD19-T載體、4.5 pl 純化的OsC5P/基因的DNA、 5 pi Solution I。在14。C-16。C下連接8-12小 時(shí)，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中。將OsGS尸7基 因裝入pMD19-T載體后經(jīng)測序正確，用TakaRa 7>司生產(chǎn)的EcoRI和 HindIII酶切，操作如下酶切體系40 pl，包括4 jal 10xbuffer、 8 pl已插 入OsCS757基因的pMD19-T載體、1 pl Xbal、 1 pl Kpnl和26^1水，在37°C 水浴中溫育6h。
用北京博大泰克生物技術(shù)公司生產(chǎn)的Glassmilkkit回收基因片段，操 作如下上述混合DNA經(jīng)凝膠電泳以后，從凝膠上切下所需DNA片段， 放在1.5 ml的Eppendorf管中。加入3倍體積的溶膠液，室溫下放置5 min， 期間輕搖Eppendorf管幾次使膠完全溶化。加入10pl玻璃奶，顛倒混勻， 冰浴下放置10 min。每隔2-3 min混勻1次，12000 rpm離心30 s,吸棄上 清。加入250pl漂洗液，用移液器吹打漂洗液，輕柔地將玻璃奶懸浮混勻， 12000 rpm離心30 s，吸棄上清。重復(fù)漂洗1次。用4倉頭將剩余的漂洗液 吸干凈。然后，放置于37。C溫箱干燥15-20 min。加入20 pl的無菌蒸餾水， 混勻，60。C水浴5min, 12000 rpm離心1 min，回收上清液，即為純化的 基因OsGST^。
將回收的基因片段連入Superl300載體中，操作如下連接體系10 包括2nlSuperl300載體、6pl純化的基因的DNA、1 pl 10xT4連接酶buffer 和1 jil T4連接酶，在4-10。C下連接12 h，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿 菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。
基因片段連入Superl300載體后再轉(zhuǎn)入EHA105農(nóng)桿菌中，操作如下
8取200iul農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加入5-10iul構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA, 3(TC冰浴 30 min，液氮中速凍1 min, 37。C水浴5 min,然后加入1 ml YEB培養(yǎng)基 (1升YEB培養(yǎng)基含1 g酵母提取物、5g牛肉浸膏、5g蛋白胨、5g蔗 糖和0.5gMgSO4.7H20, pH7.0)， 28。C恢復(fù)培養(yǎng)4h; 10000 g離心30 s, 棄上清，加入O.l mlYEB培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，涂布于含有100嗎/ml卡 那霉素和125 fig/ml利福平的YEB平板(1升YEB培養(yǎng)基含1 g酵母提取 物、5g牛肉浸膏、5g蛋白胨、5g蔗并唐、0.5gMgSCV7H20和12g瓊脂， pH7.0)上，28。C培養(yǎng)約48h。
經(jīng)鑒定正確后(挑取陽性克隆作為模板，用菌落PCR方法進(jìn)行鑒定)， 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化模式植物水稻，操作如下接種含有目的質(zhì)粒的農(nóng)桿 菌菌落于10 ml YEB培養(yǎng)基(含0.1%酵母提取物、0.5%牛肉浸膏、0.5% 蛋白胨、0.5%蔗糖、0.05%MgSO47H2O、 1.2%瓊脂、100 |ug/ml卡那霉素 和125 |ig/ml利福平)中28°C 、 200 rpm震蕩培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)化前一天按1:50 接種于200 ml含相同抗生素的YEB培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)至OD6()()為0.6-0.8。 取菌液，按1 % ~ 2 %的比例，轉(zhuǎn)入新配制的無抗生素的YEB液體培養(yǎng)基 中，6小時(shí)后，菌液OD6oo為0.2~0.5時(shí)即可用于轉(zhuǎn)化。
取粳稻品種愛知旭(CVyza sarira L cv Aichi Asahi)幼胚，用70%酒精浸 泡lmin，然后用0.1%升汞溶液滅菌30min，再用無菌水沖洗3次，置無 菌濾紙上吸干，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基外加2 mg丄—12, 4-D)上 誘導(dǎo)愈傷組織11-13 d后繼代，繼代后4 d用于共培養(yǎng)。愈傷組織在含有 100 moLL"乙酰丁香酮和含目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 20 min,用濾紙吸去多余的菌液后，轉(zhuǎn)到含乙酰丁香酮的固體培養(yǎng)基上 26。C暗培養(yǎng)2 d， 經(jīng)共培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基外 加2 mg丄'12, 4國D 、 50 mg丄"潮霉素B和頭300 mg.L"頭孢瘞將)上。 10 d后挑選成活的愈傷組織進(jìn)行復(fù)篩，抗性愈傷轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基(NB 培養(yǎng)基外加2 mg丄"2， 4-D 、 3 mg丄"、6-BA、 0.5 mg丄"NAA、 4 mg丄"KT、 50 mg丄"潮霉素B和頭300 mg丄"頭孢瘞將)上誘導(dǎo)出苗。培養(yǎng)溫度26°C , 每天光照15 h。抗性植抹轉(zhuǎn)到含1/2 N6大量元素(1415 mg丄"KN03、 231.5 mg丄"NH4S04、 83 mg丄"CaCl2.2H20、 92.5 mg丄-1 MgSO4.7H20、 200 mg丄" KH2P04、 200 mg丄"FeSO4'7H20和2.2 mg丄"MnS04.4H20 )的無激素培養(yǎng)基上使其生根。當(dāng)試管苗長到約8cm高并有發(fā)達(dá)的根系時(shí)，即可移栽入 土。單株收獲T1代種子。繁種并鑒定至T3代，獲得純合的轉(zhuǎn)基因52個(gè) 抹系。
通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)浸花法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，操作如下接種含有目 的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌落于10mlYEB培養(yǎng)基(含0.1%酵母提取物、0.5% 牛肉浸膏、0.5%蛋白胨、0.5%蔗糖、0.05%MgSO4'7H2O、 1.2%瓊脂、100 pg/ml卡那霉素和125 |ug/ml利福平)中28°C、 200 rpm震蕩培養(yǎng)過夜， 轉(zhuǎn)化前一天按1:50接種于200 ml含相同抗生素的YEB培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng) 至OD600為1.2-1.6,約6h， 5000 g離心15 min集菌，重懸于滲透緩沖 液，使OD600為0.8， 200 ml重懸液可使用3次。轉(zhuǎn)化所用浸泡液含有 0.5xMS大量元素、0.5xMS微量元素、0.5mg/LVB5、5。/。嚴(yán)糖、44nM6-BA (Sigma公司，美國)和0,03% Silwet L-77 (LEHLE SEEDS公司，美國)。 將200 ml含目的農(nóng)桿菌的滲透轉(zhuǎn)化液置于一容器中，翻轉(zhuǎn)種有擬南芥的 花盆，使植林浸入含有待轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的滲透緩沖液中，浸5分鐘，緩慢取 出花盆，側(cè)放于托盤中，蓋上黑塑料布避光24小時(shí)，第二天取下塑料布， 直立放置花盆。
制備MS篩選平板(MS培養(yǎng)基外加80 g/ml潮霉素和50 g/ml氨千青 霉素)，轉(zhuǎn)化收獲的Tl代種子經(jīng)消毒后播種于篩選平板，每15 cm的平板 上可以篩選lOOpg左右的擬南芥種子。4。C春化3天，平放在生長箱中培 養(yǎng)(22。C恒溫，24h光照)，7-10天后挑選在篩選培養(yǎng)基上根系和地上部 生長正常的陽性植抹，移入正常MS培養(yǎng)基緩苗3-5天后移植入土壤，單 抹收獲T2代種子。繁種并鑒定至T3代，獲得純合的轉(zhuǎn)基因52個(gè)林系。 基因功能鑒定
(1)耐高鹽性鑒定 取T3代純合轉(zhuǎn)基因抹系和野生型(粳稻品種愛知旭)種子，均勻放 在兩層用蒸餾水潤濕的發(fā)芽紙上，在25"光照條件下培養(yǎng)10d,觀察幼苗 生長情況。然后將轉(zhuǎn)基因抹系和野生型的水稻幼苗分別移入含200 mM NaCl或正常清水的發(fā)芽盒內(nèi)，置于相同光溫條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后，觀察轉(zhuǎn)基因抹系與野生型幼苗在高鹽脅迫下的表型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在200 mM NaCl處理下，野生型水稻幼苗葉片出現(xiàn)白化表型，嚴(yán)重時(shí)幼苗白化死亡，而轉(zhuǎn)C^GS戶7基因林系葉片仍保持綠色。葉片最大光化學(xué)效率測定 (Fv/Fm)結(jié)果表明，在200mMNaCl下，野生型幼苗地上部最大光化學(xué) 效率顯著降低，而轉(zhuǎn)C^GS尸7基因抹系幼苗地上部最大光化學(xué)效率未出現(xiàn) 明顯變化，說明C^CS尸7基因在水稻中超量表達(dá)可以提高水稻幼苗耐鹽性。
T3代純合轉(zhuǎn)基因林系和野生型((ecotype Columbia))擬南芥種子用 1%次氯酸鈉消毒，在4。C冰箱中春化3天，然后置于溫度22°C 、濕度50%、 連續(xù)24h光照的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7d后，觀察幼苗生長情況。待幼苗 子葉完全展開后，將轉(zhuǎn)基因抹系和野生型幼苗移入含200 mM NaCl和正常 的MS固體培養(yǎng)基(含lx大量元素、lx微量元素、lx鐵鹽、3%蔗糖和0.8% 瓊脂)上，然后置于相同光溫條件(22°C、濕度50%、連續(xù)24 h光照) 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)12-15d后，觀察轉(zhuǎn)基因林系與野生型幼苗在高鹽 脅迫下的表型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在200mMNaCl下，野生型幼苗全部白化死亡， 轉(zhuǎn)OsGS尸7基因抹系幼苗葉片仍保持綠色，說明OsGS7^基因超量表達(dá)可 以緩解擬南芥鹽害。 (2 )耐低溫性鑒定
取T3代純合轉(zhuǎn)基因株系和野生型(粳稻品種愛知旭)種子，均勻放 在兩層用蒸餾水潤濕的發(fā)芽紙上，在25。C光照條件下培養(yǎng)10d,觀察幼苗 生長情況。然后將轉(zhuǎn)基因林系和野生型的水稻幼苗移入4。C低溫培養(yǎng)箱， 處理16h后，再放回到25。C光照條件下培養(yǎng)，4-5 d后野生型幼苗葉片出 現(xiàn)失水巻曲，嚴(yán)重時(shí)幼苗葉片開始白化，而轉(zhuǎn)OyCSP7基因抹系葉片仍保 持正常綠色。葉片最大光化學(xué)效率測定(Fv/Fm)結(jié)果表明，野生型幼苗 地上部最大光化學(xué)效率顯著降低，而轉(zhuǎn)OsCS尸7基因株系幼苗地上部最大 光化學(xué)效率未出現(xiàn)明顯變化，說明OyGSP7基因在水稻中超量表達(dá)可以提 高水稻幼苗耐低溫性能。
取T3代純合轉(zhuǎn)基因林系和野生型擬南芥種子，播在塑料土盆中，在 22。C溫室內(nèi)培養(yǎng)，取生長到4周的轉(zhuǎn)基因抹系和野生型幼苗，在4。C低溫 培養(yǎng)箱中處理16h，再放回到22。C溫室內(nèi)培養(yǎng)，3-4 d后野生型幼苗葉片 出現(xiàn)失水巻曲，嚴(yán)重時(shí)幼苗葉片開始白化，而轉(zhuǎn)(9sGS尸7基因抹系葉片仍 保持正常綠色說明OsCS尸7基因在擬南芥中超量表達(dá)可以提高擬南齊幼苗 耐低溫性能。SEQUENCE LISTING <110>杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 <120> 水稻蛋白OsCSPl及其編碼基因與應(yīng)用 <130> <160> 3
< 170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 197
<212> PRT
<213> 水稻
<400> 1
Met Ala Ser Glu Arg Val Lys Gly Thr Val Lys Tip Phe Asp Ala Thr 15 10 15
Lys Gly Phe Gly Phe lie Thr Pro Asp Asp Gly Gly Glu Asp Leu Phe
20 25 30
Val His Gin Ser Ser Leu Lys Ser Asp Gly Tyr Arg Ser Leu Asn Asp
35 40 45
Gly Asp Val Val Glu Phe Ser Val Gly Ser Gly Asn Asp Gly Arg Thr
50 55 60
Lys Ala Val Asp Val Thr Ala Pro Gly Gly Gly Ala Leu Thr Gly Gly 65 70 75 80
Ser Arg Pro Ser Gly Gly Gly Asp Arg Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly 85 90 95Gly Gly Arg Tyr Gly Gly Asp Arg Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Tyr Gly Gly Gly Asp Arg Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Arg Ala Cys Tyr Lys Cys Gly Glu Glu Gly
130 135 140
His Met Ala Arg Asp Cys Ser Gin Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr 145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Cys Tyr Asn Cys Gly Glu Thr Gly His lie Ala Arg Glu Cys
180 185 l卯
Pro Ser Lys Thr Tyr 195
<210> 2 <211> 594 <212> DNA <213> 水稻
<400> 2
atggcgtcgg agagggtgaa ggggacggtg aagtggttcg acgccaccaa ggggttcggc 60
ttcatcaccc ccgacgacgg cggcgaggat ctcttcgtcc accaatcctc gctcaagtcc 120
gacggctacc gcagcctcaa cgacggcgac gtcgtcgagt tctccgtcgg atccggcaac 180
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tcccgtccca gcggcggcgg ggaccgcggc tacggcgggg gcggaggcgg cggccgctac 300
ggcggtgacc gcggctacgg cggcggtggc ggcggctacg gcgggggcga ccgcggctac 360
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13<210> 3
<211> 922
<212> RNA
<213> 水稻
<400〉 3
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ugagagacaa gccauggauu ugcacugucu gaucuaucua ugaaucuauc uauuaugaac900
cgagaagaaa auauucauca gc92權(quán)利要求
1、一種水稻蛋白，具有序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列。
2、 一種編碼權(quán)利要求1所述的水稻蛋白的基因，具有序列表中SEQ ID N0.2所述的核香酸序列。
3、 編碼權(quán)利要求1所述的水稻蛋白的基因在提高植物耐鹽和耐低溫 性能中的應(yīng)用。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，包括以下步驟(1) 將編碼所述的水稻蛋白的基因連接到載體中，得到重組載體；(2) 將重組載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到植物中；(3) 篩選得到具有耐高鹽和耐低溫性能的植抹。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的載體為Superl300 載體。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的植物為水 稻、草莓、辣椒、茄子、 一串紅和非洲菊。
全文摘要
本發(fā)明提供公開了一種水稻蛋白OsCSP1，具有序列表中SEQ IDNO.1所述的氨基酸序列。本發(fā)明蛋白在水稻幼苗中過量表達(dá)，可以提高水稻幼苗耐高鹽和低溫能力。若將編碼該蛋白的基因轉(zhuǎn)化擬南芥、辣椒、茄子、草莓、一串紅、非洲菊等蔬菜、花卉等植物，有助于提高其耐高鹽和低溫性能，不僅可以增加蔬菜、花卉在鹽堿地上的產(chǎn)量，提高我國濱海地區(qū)的鹽堿地的利用；而且克服設(shè)施條件下因土壤返鹽或低溫引起的生育障礙，提高蔬菜、花卉等植物的產(chǎn)量和品質(zhì)，促進(jìn)農(nóng)業(yè)增效和農(nóng)民增收。
文檔編號C07K14/415GK101475633SQ20081016381
公開日2009年7月8日 申請日期2008年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月18日
發(fā)明者何俊平, 雅 忻, 來文國, 王世恒, 王淑珍, 童建新, 鄭桂珍, 阮松林, 馬華升 申請人:杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院