專利名稱：：重樓皂苷i的制備方法及其抑制血管生長的用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種從重樓中提取分離得到的重樓皂苷I，即(25R)-A5(6)-烯-螺甾-3-(Ha-L-呋喃阿拉伯糖(1—4)Ha-L-吡喃鼠李糖基(1—2)]-3-0-P-D-吡喃葡萄糖苷(CAS號為76296-72-5)的制備方法，及其在抑制血管生長方面的用途。
背景技術：
：重樓(RhizomaParidis)，又稱七葉一支花，是百合科重樓屬植物的泛稱,以蚤休之名首載于《神農本草經》。重樓屬植物全世界共有24種,我國種類最多，擁有19種，其中西南各省區(qū)種類和資源極為豐富。常見的品種有華重樓、滇重樓和七葉一支花。藥用的有華重樓、云南重樓、七葉一支花、狹葉重樓、長藥隔重樓、海南重樓、凌云重樓、南重樓?！吨袊幍洹?005年版中記載，重樓白勺來、源應為云南重t婁ParispolyphyllaSmithvar.yunnanensis(Franch.)Hand.一Mazz.和七葉一枝花P.DphyllaSmithvar.chinensis(Franch.)Hara的干燥根莖。味苦，性微寒，有小毒，歸肝經,具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效,用于癰瘡、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛、涼風抽搐等癥。(國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2005年版)一部，化學工業(yè)出版社，183.)至今尚未見關于抑制血管方面的報道。(張樹潘.重樓屬植物的化學成分及其藥理活性研究進展.海峽藥學，2007，19(6):4-7;康利平,馬百平,張潔,等.重樓中甾體皂苷的分離與結構鑒定.中國藥物化學雜志,2G05,15(l):26-30;王羽，張彥軍，高文遠，等.滇重樓的抗腫瘤活性成分研究.中國中藥雜志，2007，32(14):1425-1428;HUANGYun，WANGQiang,CUILi~jian.PrimaryCommentsonChemotaxonomyofspp，BasedonSaponinsAnalysis.JournalofChinesePhar-maceuticaliences2005,14(3):176—180.)腫瘤是目前危害人類健康的主要疾病之一。居各類疾病死亡率的第二位。大量臨床治療證明，化療和放療在殺傷腫瘤細胞的同時，對正常細胞也有極大的破壞效應。這些療法使得人體的造血系統(tǒng)和免疫功能遭受嚴重的損害，極易導致病人死亡。對血管的依賴性是一切腫瘤細胞所共有的，血管生成是腫瘤生長和轉移中的一個重要步驟，無論原發(fā)性腫瘤和繼發(fā)性腫瘤，一旦生長直徑超過2mm，都會有血管生成，隨之將是腫瘤迅速生長，轉移發(fā)生。(F。lkmaiU.whatistheevidencethattumorsareangiogenesisdepartmentJNatlCancerInst.1990，82:4-6.)目前對腫瘤的治療主要有三大類藥物，分別為細胞毒藥物，放、化療輔助類藥物，血管生長抑制劑。目前血管生長抑制劑是一類非常有前途的抗腫瘤藥物。在以雞胚絨毛尿囊膜為模型，篩選對血管生長有抑制作用的化合物的實驗中，從重樓中獲得的重樓皂苷I一即(25R)-A5(6)-烯-螺甾-3-0-(a-L-呋喃阿拉伯糖(1—4)Ha-L-吡喃鼠李糖基(1—2)]-3-0-P-D-吡喃葡萄糖苷表現(xiàn)出了較好的血管生長抑制作用。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的之一是提供重樓皂苷I的制備方法，及其在抑制血管生長方面的用途。本發(fā)明涉及從重樓中提取分離得到的重樓皂苷I即(25R)-A5(6)-烯-螺甾-3-(Ma-L-呋喃阿拉伯糖(1—4)Hct-L-吡喃鼠李糖基(1—2)]-3-Op-D-吡喃葡萄糖苷(化學結構如式l)的制備方法。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式1重樓皂苷I的化學結構式其制備方法如下(l)取重樓，依次用6-15倍量的石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇、80%乙醇、60%乙醇、水進行超聲提取，提取3-5次，每次20min-100min，過濾后，上清液減壓濃縮后得到各部位。(2)將步驟(1)得到的取乙酸乙酯部位用適量乙醇分散后，1-3倍量的硅膠拌樣，10-50倍量硅膠裝柱，上樣，依次用石油醚、石油醚乙酸乙酉旨、乙酸乙酯、乙酸乙酯乙醇、乙醇洗脫得到重樓皂苷I即(2511)-/\5(6)-烯-螺甾-3-0-KL-呋喃阿拉伯糖(1—4)}-[a-L-吡喃鼠李糖基G—2)]-3-0-P-D-吡喃葡萄糖苷粗品。(3)將步驟(2)得到的重樓皂苷I粗品用硅膠、反相硅膠法進行進一步純化。得到式(1)所示的重樓皂苷I即(25R)-△5(6)-烯-螺甾-3-0-{a-L-呋喃阿拉伯糖(1—4"-[a-L-吡喃鼠李糖基(1—2)]-3-0+D-口比喃葡萄糖苷純品。其實施例如下實施例1重樓皂苷I即(25R)-A5(6)-烯-螺甾-3-(Ha-L-呋喃阿拉伯糖(1—4)Ha-L-吡喃鼠李糖基(1—2)]-3-0-P-D-吡喃葡萄糖苷的制備取2kg重樓，依次用10倍量的石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇、80%乙醇、60%乙醇、水分3次超聲提取，每次30min,過濾后，上清液減壓濃縮后得到各部位。收集乙酸乙酯提取物，在硅膠(200300目)柱上，先用石油醚洗脫，然后用體積比為l:l的石油醚、乙酸乙酯、乙醇的混合液洗脫。收集用體積比為l:l的石油醚、乙酸乙酯、乙醇的混合液洗脫后得到的洗脫液，減壓濃縮，得到粗品，用硅膠、反相硅膠法進行進一步純化結晶，得到10克單體化合物，經結構解析，確定結構為重樓皂苷I。重褸皂苷I物理性質及波譜數(shù)據(jù)如下無色透明針晶或白色粉末，易溶于氯仿、甲醇。ESI-MS分子量:854.466分子式C"H7016ESI-MS(m/z):855(M+)，722(M-Arb)，576(M-Arb-Rha)，415(M-Arb-Rha-Glu)，397(M-Arb-Rha-Glu-H20)，379(M-Arb-Rha-Glu-2H20)，283，271，253，251，213，199，173，159，147，139，129，107，93，85，69，55(100%)。'HNMR(DMS0-d6)Sppm:5.391(1H，d，J二5.0Hz)，5,245(1H，d，J二5,4Hz),2.43,2.15(H-l)，1.8(H—2)，3.48(H-3)，1.8(H-4)，5.336(1H，br，H-6)，1.53(H-8)，0.9(H-9)，4.88(H-IO)，1.5(H-ll)，1.16(H-12)，1.8(H-13)，1.14(H-14)，1.93,1.90(H-15，17)，4.27(H-16)，3.4(H-17)，0.739(s，H-18)，0.964(H—19)，3.8(H-20)，1.82(H-20)，0.915(d，J=6.7Hz'H—21)，1.53-1.60(H-24)，3.42,3.21(H-26)，0.739(d，H-27)。4.43(d，J=7.8Hz，H-l')，3.35(H-2')，3.23(H-3')，3.26(H-4')，3.47(H-5')，3.60(H-6')，5.037(s，H-l")，3.64(H-2")，3.41(H-3")，3.19(H—4")，3.99(H-5")，1.089(d，J=6.0Hz,H-6〃)，4.88(H-r,)，3.68(H-3〃0，3.86(H-4辨)，3.67(H-5"。"CNMR(DMS0-d6)5卯m:38.1(C-1)，29.5(C-2)，76.5(C-3)，37.3(C-4)，140.7(C-5)，121.7(C-6)，32.0(C-7)，30.3(C-8)，50.0(C-9)，36.9(C-10)，20.8(C—11)，39.9(C-12)，40.5(C—13)，56.2(C—14)，32.0(C-15)，80.7(C-16)，62.2(C-17)，16.5(C-18)，19.4(C-19)，41.6(C-20)，15.1(C-21),108.9(C-22)，31.4(C-23)，28.9(C-24)，31.4(C-25)，66.4(C-26)，17.6(C-27)，98.4(C-l')，81.8(C-2')，76.4(C-3')，75.4(C-4')，76.1(C-5')，61.8(C-6')，100.5(C-l〃)，70.9(C-2")，71.0(C-3")，72.3(C-4")，68.4(C-5〃)，18.2(C-6〃)，108.2(C-1〃')，82.4(C-2"，76.8(C-3〃0，84.9(C-4'"，60.4(C-5"0。本發(fā)明還涉及結構式如下式所示的重樓皂苷I抑制血管生長的用途。實驗例重樓皂苷I即(25R)-A5(6)-烯-螺甾-3-0-{a-L-呋喃阿拉伯糖(1—化-a-L-吡喃鼠李糖基(1—2)-3-0-P-D-吡喃葡萄糖苷的抑制血管生長的實驗研究1模型名稱雞胚絨毛尿囊膜模型2試驗方法精密稱取重樓皂苷I，用乙醇溶解，配制成濃度約為0.4mg/ml的溶液，備用。選擇體質量相近(50.4-5)g，表皮無污染、無破損的新鮮種蛋，置于溫度37.8±0.5°C、相對濕度65%-70%的中孵育7日，每日早中晚各翻轉一次。將明膠海綿用打孔器制成直徑約為6mm的圓形小塊，無菌環(huán)境下用微量進樣器向小塊內加藥。陽性藥和樣品均加5^d。待明膠海綿將藥物完全吸收干燥后，置于紫外燈下消毒風干。種蛋消毒后放入37'C孵化箱，氣室向上，至孵蛋第7天，將種蛋隨機分為6組，每組15枚。在超凈臺上將蛋胚用酒精消毒后用牙科鉆在蛋胚頂端鉆一小孔，然后小心地去掉周圍的蛋殼和殼膜，使開口約為1.2cmxl.2cm大??；確定加樣部位后小心地用注射針頭從氣室與卵黃分隔處挑破氣室膜，注入12滴無菌水，使氣室膜與CAM膜分開，然后用鑷子輕輕去除上層的氣室膜，暴露下層的CAM膜。將加藥并消毒后的明膠海綿小塊置于近胚頭lcm處兩條前卵黃靜脈之間的相對無血管區(qū)。用透明膠紙封閉卵殼口，37.8士0.5"C孵育2d。給藥后的雞胚在37.8i0.5'C的恒溫孵化箱中孵育2日后，取出，撕去透明膠紙，用甲醇-丙酮(1:1)將加藥的雞胚尿囊膜血管固化10min，小心剝下CAM膜，用眼科剪將雞胚尿囊膜以明膠海綿為圓心剪成直徑約為2cm的圓，置于載玻片上，在顯微鏡下觀察、照相。數(shù)據(jù)以均數(shù)i標準差(IiS〉表示，應用非參數(shù)檢驗，應用SAS統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析比較各組間差異。3試驗結果將血管按照直徑進行統(tǒng)計，將數(shù)據(jù)分為大、中、小三個等級。數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準誤(i士S)表示。實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注與空白組比較**P<0.01由于大血管和中血管在給藥之前就己經形成，因此，我們在分析數(shù)據(jù)時，主要對小血管進行分析。試驗結果表明給藥組與空白組比較差異有顯著性意義(P〈0.01)。4試驗結論藥效學實驗表明，本發(fā)明化合物重樓皂苷I有良好的抑制血管生長的活性，具備制備成具有抑制血管生長作用的抗腫瘤藥物應有的活性，具有廣闊的應用前景。權利要求1重樓皂苷I即(25R)-Δ5(6)-烯-螺甾-3-O-{α-L-呋喃阿拉伯糖(1→4)}-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化學結構如下所示)，其特征在于其制備方法如下(1)取重樓，依次用6-15倍量的石油醚、乙酸乙酯、95％乙醇、80％乙醇、60％乙醇、水進行超聲提取，提取3-5次，每次20min-100min，過濾后，上清液減壓濃縮后得到各部位。(2)將步驟(1)得到的取乙酸乙酯部位用適量乙醇分散后，1-3倍量的硅膠拌樣，10-50倍量硅膠裝柱，上樣，依次用石油醚、石油醚乙酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸乙酯乙醇、乙醇洗脫得到重樓皂苷I即(25R)-Δ5(6)-烯-螺甾-3-O-{α-L-呋喃阿拉伯糖(1→4)}-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷粗品。(3)將步驟(2)得到的重樓皂苷I粗品用硅膠、反相硅膠法進行進一步純化。得到式(1)所示的重樓皂苷I即(25R)-Δ5(6)-烯-螺甾-3-O-{α-L-呋喃阿拉伯糖(1→4)}-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷純品。2.權利要求1所述的重樓皂苷I，抑制血管生長的用途。全文摘要本發(fā)明涉及重樓皂苷I即(25R)-Δ5(6)-烯-螺甾-3-O-{α-L-呋喃阿拉伯糖(1→4)}-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制備方法及其抑制血管生成的用途，通過有劑溶劑提取重樓后，以硅膠及反相硅膠色譜法制備重樓皂苷I，可作為抗腫瘤藥物應用。文檔編號C07J71/00GK101597317SQ20081017241公開日2009年12月9日申請日期2008年11月10日優(yōu)先權日2008年6月5日發(fā)明者強李,葳畢,雷海民申請人:雷海民