專利名稱：：苦木中的β-卡巴林類生物堿及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及苦木中的P-卡巴林類生物堿及其制備方法和用途，屬于中藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：炎癥是機(jī)體對(duì)各種致炎因子引起的損傷所發(fā)生的以防御為主的反應(yīng)，常引起全身反應(yīng)，常見以發(fā)熱、血液中白細(xì)胞數(shù)目增多以及心、肝、腎等器官出現(xiàn)不同程度的變性、壞死等為特征。急性炎癥表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛及功能障礙，是人體防御反應(yīng)的一部分。然而，慢性炎癥則可能導(dǎo)致癌癥、糖尿病、肺部疾病、心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的疾病，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生非常嚴(yán)重的危害，甚至威脅到患者的生命安全。致炎因子的持續(xù)存在并且不斷損傷組織是發(fā)生慢性炎癥的根本原因。有些致炎因子可直接損傷內(nèi)皮，引起血管通透性升高。但許多致炎因子并不直接作用于局部組織，而主要是通過內(nèi)源性化學(xué)因子的作用而導(dǎo)致炎癥，這些化學(xué)因子在炎癥發(fā)生發(fā)展過程中起著介導(dǎo)作用，故又稱之為炎癥介質(zhì)。炎癥介質(zhì)的釋放及調(diào)控機(jī)制是炎癥研究的重大課題，也是抗炎藥物設(shè)計(jì)的主要靶點(diǎn)。炎癥介質(zhì)主要由巨噬細(xì)胞分泌，包括N0、TNF-a、IL-1a、IL-1P、IL-2、IL-6、IL-8等。一氧化氮(N0)是由精氨酸胍基氮經(jīng)過一氧化氮合成酶(N0S)的催化氧化而形成的。NO既兼有第二信使和神經(jīng)遞質(zhì)的功能，又是效應(yīng)分子，介導(dǎo)和調(diào)節(jié)包括炎癥在內(nèi)的多種生理和病理過程。一氧化氮合成酶(N0S)可分為兩類，即結(jié)構(gòu)型N0S(cN0S)和誘導(dǎo)型N0S(iN0S)，cN0S根據(jù)產(chǎn)生部位不同，又可分為神經(jīng)型NOS(nN0S)和內(nèi)皮型NOS(eN0S)。在細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)型(cN0S)和誘導(dǎo)型(iN0S)N0合成酶中，cN0S在正常情況下可持續(xù)表達(dá)，而iN0S只有在某些細(xì)胞因子，如脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子(TNF-a)等誘導(dǎo)下才表達(dá)其活性。一般認(rèn)為由iNOS產(chǎn)生的NO可能參與多種疾病發(fā)生的病理過程，對(duì)細(xì)胞有毒性作用。NO不但參與了炎癥疾病的發(fā)生，而且能夠促進(jìn)前列腺素E2等炎癥介質(zhì)的釋放。除此之外，NO代謝異常還能導(dǎo)致哮喘、中風(fēng)、早老性癡呆等嚴(yán)重疾病的發(fā)生。腫瘤壞死因子(TNF-ci)是一種內(nèi)源性化學(xué)因子，主要是由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。受到刺激后，T細(xì)胞能夠活化自然殺傷細(xì)胞(M細(xì)胞)和肥大細(xì)胞并使其分泌TNF-a。血管內(nèi)皮細(xì)胞在一定條件下也具有產(chǎn)生和釋放TNF-a的能力。TNF-a參與多種炎癥反應(yīng)的過程，而且許多報(bào)道顯示TNF-a誘導(dǎo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變、聚合和腫瘤的發(fā)生。白細(xì)胞介素-6(IL-6)也是一種內(nèi)源性化學(xué)因子，它是急性炎癥反應(yīng)的一種重要介質(zhì)，而且是一種多功能的細(xì)胞因子。IL-6不僅可作為造血源細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、破骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等的分化和生長(zhǎng)因子，而且在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、再生和降解中扮演著非常重要的角色。然而，IL-6的異常表達(dá)與許多自身免疫性疾病和腫瘤的發(fā)病機(jī)制及發(fā)展進(jìn).程相關(guān)。抑制N0、TNF-a、IL-6等炎癥介質(zhì)的釋放可以治療多種疾病，包括全身炎癥反應(yīng)綜合癥、多器官功能障礙綜合癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎、'脊柱關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、心力衰竭、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎、銀屑病、急性髓性白血病、帕金磁癥、早老性癡呆、抑郁癥、敗血病、慢性阻塞性肺病、哮喘、急性胰腺炎、中樞神經(jīng)損傷等。炎癥介質(zhì)已經(jīng)成為研究炎癥最重要的藥物耙點(diǎn)之一，尋找活性強(qiáng)、毒性小的炎癥介質(zhì)抑制劑日益成為人們開發(fā)新的抗炎藥物所關(guān)注的熱點(diǎn)。苦木(/^c2^/z7awaMi'wVe5)為苦木科苦樹屬植物，主要分布于河北、河南、山東、湖南、湖北、云南、廣西、廣東、四川等省。以其樹皮、樹根及莖木入藥。性寒，味苦，具有清熱燥濕、解毒殺蟲等功效，臨床上用于治療胃腸炎、膽道感染、急性膿性感染等疾病。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所于上世紀(jì)70年代對(duì)苦木進(jìn)行過深入的藥物資源學(xué)、化學(xué)成分、藥物毒理學(xué)等方面的研究，發(fā)現(xiàn)生物堿是其主要有效成分并開發(fā)了苦木總生物堿的針劑，臨床應(yīng)用證明苦木總生物堿對(duì)呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)的各種炎癥具有較好的療效?？嗄局械纳飰A可分為三類，分別為3-卡巴林類、鐵屎米-6-酮類和P-卡巴林二聚體類。國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過體外抗菌實(shí)驗(yàn)證實(shí)了苦木生物堿的抗菌作用和對(duì)心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)的作用。但是本專利公開的新化合物抑制NO、TNF-a和IL-6等炎癥介質(zhì)釋放的抗炎作用還未見諸報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的首要目的在于提供一種3-卡巴林類生物堿。本發(fā)明的另一目的在于提供上述卡巴林類生物堿作為制備抗炎藥物本發(fā)明的再一目的在于提供一種制備上述e-卡巴林類生物堿的方法。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種卡巴林類生物堿，具有如下式(I)的結(jié)構(gòu)所述卡巴林類生物堿R為甲醛基(CH0)、甲酸基(C00H)、乙氧基乙基(CH(0H)CH20Et)、，二羥基乙基(GH(0H)CH20H)、羥基乙基(CH2CH2OH)、結(jié)構(gòu)式(A)、結(jié)構(gòu)式(B)或結(jié)構(gòu)式(C);R2為氫(H)或甲氧基(0CH3);R3為氫(H)或羥基(OH);&為氫(H)或甲氧基(0CH》；Rs為氫(H)或結(jié)構(gòu)式(B);所述0-卡巴林類生物堿是4,8-二甲氧基-l-醛基-P-卡巴林(4，8-dimethxoy-l-formyl-刀-carboline，式1)、4，8-二甲氧基-卩-卡巴林-l-甲酸(4，8-dimethxoy-》-carboline-l-carboxylicacid，式2)、4-甲氧基-(3-卡巴林-l-甲酸(4-methxoy-》-carboline-1-carboxylicacid，式3)、4-甲氧基-l-(l-羥基-2-乙氧基乙基)-卩-卡巴林(4-methoxy-1-(1-hydroxyl-2-ethoxyl-ethyl)-》-carboline，式4)、4,8畫二甲氧基-1-(1，2-二羥基乙基)曙卩-卡巴林(4，8-dimethoxy-1-(1,2-dihydroxyl-ethyl)-萬-carboline，式5)、4，8-二甲氧基-1-(2-羥基乙基)-卩-卡巴林(4，8-dimethoxy-1-(2-hydroxy1-ethyl)-^-carboline,式6)、鐵屎米_6-酮-4-丁酸(canthin-6-one-4-butanoicacid，式7)、4,5隱二甲氧基-10-羥基鐵屎米-6-酮(4,5-dimethoxy-10-hydroxy-canthin-6-one，式8)、U-的用途?？ò土?3-(4-甲氧基卡巴林)_丙基-1-酮(P-caxboline-l-yl4-methoxy-3-caxboline-l-ylethylketone,式9)、1-萬-卡巴林-3-(4，8-二甲氧基-3-卡巴林)-丙基-1-酮(P-carboline_1-yl4，8-dimethoxy-P-carboline-l-ylethylketone,式10)、1-》-卡巴林-3-(4-甲氧基-8_羥基-卡巴林)-丙基-1-酮(P-carboline-1-y14-methoxy-8-hydroxy-P-carboline-l_ylethylketone,式11)中的至少一種。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>(式9)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>(式10)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>(式11)上述P-卡巴林類生物堿可以作為制備抗炎藥物應(yīng)用。所述抗炎藥物是用于預(yù)防或治療由一氧化氮、腫瘤壞死因子-cx和白細(xì)胞介素-6炎癥介質(zhì)的釋放導(dǎo)致的炎癥。所述抗炎藥物含有治療有效量的上述P-卡巴林類生物堿和藥學(xué)上可接受的載體。所述P-卡巴林類生物堿的制備方法，包括以下操作步驟采用植物苦木為原料，用有機(jī)溶劑和/或水進(jìn)行提取并且進(jìn)行分離。所述有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯中的一種或幾種；所述提取的提取溫度為20-100°C，提取時(shí)間為1-48小時(shí)；所述分離是采用層析分離法和/或萃取法進(jìn)行分離。含有本發(fā)明生物堿的抗炎藥物可以為適用于口服應(yīng)用的形式，例如，可為片劑、藥片、錠劑、含水或者含油混懸劑、可分散性粉劑或者粒劑、乳劑、液劑、硬膠囊或者軟膠囊、或者糖漿劑或者酏劑。本發(fā)明相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果(1)提供了一種結(jié)構(gòu)新穎的P-卡巴林類生物堿；(2)運(yùn)用體外抗炎活性篩選體系進(jìn)行活性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明p-卡巴林類生物堿能有效地抑制小鼠巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮(N0)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)等炎癥介質(zhì)的釋放，表明本發(fā)明生物堿具有預(yù)防和治療炎癥的作用，并具有良好的研究開發(fā)前景。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:苦木中生物堿的提取分離取苦木科植物苦樹屬植物苦木(尸i'crs柳a^/a"j'w'Gfes)干燥根10kg，用60%乙醇加熱回流提取，濃縮提取物至干燥，得到IOOg干燥提取物，用氯仿等體積萃取3次，合并氯仿萃取部位，減壓濃縮至干燥，稱重為64g，將氯仿萃取部位用環(huán)己垸-乙酸乙酯(50:50-0:100)梯度洗脫，得到10個(gè)餾分PQC1至PQCIO，對(duì)PQC7(環(huán)己垸-乙酸乙酯30:70，18.1g)進(jìn)行0DS中低壓柱色譜分離，得到9個(gè)亞餾分PQC7-1至PQC7-9。運(yùn)用制備液相，從亞餾分PQC7-6(甲醇-水50:50，650mg)分離得到了生物堿1-6，從亞餾分PQC7-8(甲醇-水60:40，845mg)分離得到了生物堿7和8，從亞餾分PQC7-9(甲醇-水70:30，920mg)從分離得到了生物堿9，lO和ll。其中，化合物1-6為3-卡巴林類生物堿，化合物7和8為鐵屎米-6-酮類生物堿，化合物9-11為p-卡巴林二聚體類生物堿。經(jīng)SciFinder檢索發(fā)現(xiàn)這些化合物均為未見文獻(xiàn)報(bào)道的新化合物。所獲得的各化合物的結(jié)構(gòu)式如下表1所示表l.苦木中分離得到的新生物堿結(jié)構(gòu)編號(hào)結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>56<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>7891011所得各新生物堿的物理化學(xué)常數(shù)如下化合物l(4，8-二甲氧基-l-醛基-P-卡巴林)淡黃色無定型粉末，碘化鉍鉀反應(yīng)顯陽性。UV(CHCL)入，(logO244(3.29)，284(3,20)，376(2.76)nm;IR(KBr)「，3309，1672，1578，1490，1259，1060cnf1;ESIMS/zz/z279[M+Na]+;HRESIMS/z/A279.0733[M+Na]+(calcdforC"H12N203Na，279.0746)，確認(rèn)化合物1的分子式為C14H12N203;13C和'H麗R數(shù)據(jù)見表2?；衔?(4，8-二甲氧基-卡巴林-卜甲酸)淡黃色無定型粉末，碘化鉍鉀反應(yīng)顯陽性。UV(CHC1》入隨(log￡)246(3.49),266(sh)(3.40)，304(sh)(2.99)，361(2.86)nm;IR(KBr)^x3310，2924,1710，1585,1274cm—';ESIMS/z//z295[M+Na]+，567[2M+Na]+;HRESIMS295.0679[M+Na]+(calcdforCMH12NANa,279.0695)，確認(rèn)化合物2的分子式為C"H識(shí);13C和'H麗R數(shù)據(jù)見表2?；衔?(4-甲氧基-卡巴林-1-甲酸)淡黃色無定型粉末，碘化鉍鉀反應(yīng)顯陽性。UV(CHC13)Aax(kgO239(3.42)，265(sh)(3.21)，357(2.78)nm;IR(KBr)r咖3404，1673，1611，1568，1542,1434，1265,1196，1112，726cm—'。ESIMS歷/z241[M-H]-;HRESIMS歷/z241.0620[M-H]-(calcdforC13H9N203，241.0613)，確認(rèn)化合物3的分子式為CuH^^;13C和'HNMR數(shù)據(jù)見表2?；衔?(4-甲氧基-1-(1-羥基-2-乙氧基乙基)-卡巴林)淡黃色無定型粉末，碘化鉍鉀反應(yīng)顯陽性。[a]246。-8.6°。0.2，CHC13);UV(CHC13)"ax(loge)248(3.52),284(3.14)，332(2.83)，345(2.89)nm;IR(KBr)2934，2877,1588，1452,1105，749cm.1;ESIMS309[M+Na]\287[M+H]+;HRESIMSyz/z287.1389[M+H]+(calcdforClfiH19N203，287.1396)，確認(rèn)化合物4的分子式為C16H18N203;13C和'H麗R數(shù)據(jù)見表3?；衔?(4,8-二甲氧基-l-(2-二羥基乙基)-e-卡巴林)淡黃色無定型粉末，碘化鉍鉀反應(yīng)顯陽性。[a]23'5D-11.8°(c0.4，CHC13);UV(CHC13)入眼OgO246(3.34)，286(2.66)，350(2.53)，347(2.92)nm;IR(KBr)rmax3420，3158,2929，1625，1557,1505，1444，1291，1250，1050,985，732cm—1;ESIMS/z/z289[M+H]+，287[M-H]—:HRESIMS仿/z289.1181[M+H]+(calcdforC15H17N204,289.1188)，確認(rèn)化合物5的分子式為C15H16NA;"C和'HNMR數(shù)據(jù)見表3?；衔?(4，8-二甲氧基-1-(2-羥基乙基)-卡巴林)淡黃色無定型粉末，碘化鉍鉀反應(yīng)顯陽性。UV(CHC13)入隨(logO245(3.76)，285(3.29),336(3.05)nm;IR(KBr)Kmax3419，2933,1660,1630，1505'1268,735cm—1;ESIMSyz/z273[M+H]+，271[M-H]—;HRESIMS/z/z273.1230[M+H]+(calcdforC15H17N203，273.1239)，確定化合物6的分子式為C15H16N203;':〗C和'H麗R數(shù)據(jù)見表3?；衔?(鐵屎米-6-酮-4-丁酸)淡黃色無定型粉末，碘化鉍鉀反應(yīng)顯陽性。UV(CHC13)Amax(loge)242(3.34)，281(2.66)nm;IR(KBr)k隨3432，2935，1660，1634，1594，1422，1330，1125，1039,732cm—1;ESIMS/z/z305[M-H]—;HRESIMS/s/z305.0930[M-H]_(calcdforC18H13N203，305.0926)，確認(rèn)化合物7的分子式為C18H14N203;13C和〖H麗R數(shù)據(jù)見表4。化合物8(4，5-二甲氧基-10-羥基鐵屎米-6-酮)淡黃色無定型粉末，碘化鉍鉀反應(yīng)顯陽性。UV(CHC13)入隱(logO243(3.75)，282(3.48)，356(3.19)ran;IR(KBr)「max3420，2925，1698，1644，1597，1518，1458，1385，1209cm—';ESIMS/z/z297[M+H]+;HRESIMStz/z297.0894[M+H]+(calcdforC16H13NA，297.0875)，確認(rèn)化合物8的分子式為C16H12N204;13C和'HNMR數(shù)據(jù)見表4?；衔?(P-carboline-l-yl4-methoxy-P-carboline-l-ylethylketone):淡黃色無定型粉末，碘化鉍鉀反應(yīng)顯陽性。UV(CHC13)入，(logO244(3.38)，285(2.18)，331(1.76)，343(1.77)，380(1.62)nm;IR(KBr)3160，1673，1623，1592，1517，1493，1300，1252，741cm—1;ESIMS歷/z421[M+H]+;HRES頂S/z/z421.1681[M+H]+(calcdforC26H21N402，421.1665),確認(rèn)化合物9的分子式為C26H2。N402;13C和麗R數(shù)據(jù)見表5?；衔?0(P-carboline_l_yl4,8-dimethoxy-P-carboline_l_ylethylketone):淡黃色無定型粉末，碘化鉍鉀反應(yīng)顯陽性。UV(CHC13)入■(logO244(3,38)，285(2.18)，331(1.76)，343(1.77)，380(1.62)nm;IR(KBr)7,3160，1673，1623,1592,1517，1493，1300,1252,741cm—1;ESIMS歷/z451[M+H]+;HRESIMStt/z451.1927[M+H]+(calcdforC27H23N403,451.1920)，確認(rèn)化合物10的分子式為C27H22N403;13C和'H麗R數(shù)據(jù)見表5?；衔?1(P-carboline-1-y14-methoxy-8-hydroxy-3-carboline-1-ylethylketone):淡黃色無定型粉末，碘化鉍鉀反應(yīng)顯陽性。UV(CHC13)入隨(loge)245(3.75)，286(3.39)，349(3.03)nm;IR(KBr)「，3420，2925，1657，1626，1560，1541，1495，1456，1126,968，371cm—1;ESIMStz/z435.[M-H]—;HRESIMS435.1480[M-H]—(calcdforC26Hl9N403,435.1457)，確認(rèn)化合物11的分子式為C26H2。N403;13C和H麗R數(shù)據(jù)見表5。表2.化合物1-3的碳譜和氫譜數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注化合物1所用溶劑為CDC13，化合物2和3溶劑為匿SO-4氫譜測(cè)試(400MHz)，碳譜譜測(cè)試(100MHz)。表3.化合物4-6的碳譜和氫譜數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注溶劑為DMS0-4氫譜測(cè)試(400MHz)，碳譜譜測(cè)試(lOOMHz)。表4.化合物7和8的碳譜和氫譜數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注溶劑為DMS0-4氫譜測(cè)試(400函z)，碳譜譜測(cè)試(100MHz實(shí)施例2:苦木生物堿1-ll對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放一氧化氮(NO)的抑制活性實(shí)驗(yàn)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7(ATCCTIB-71)培養(yǎng)于含10%熱滅活(56°C，30min)胎牛血清(FBS)、100U/raL青霉素鈉(Gibco)、100yg/raL鏈霉素(Gibco)的RPMI1640(Gibco)培養(yǎng)液中，37。C，5%0)2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育生長(zhǎng)。由于N0極不穩(wěn)定，在細(xì)胞培養(yǎng)上清液內(nèi)很快代謝成亞硝酸基(N02—)，故采用Griess法測(cè)定樣品中N(V的濃度作為衡量N0水平的指標(biāo)。Griess試劑A:0.1%N-萘乙二胺鹽酸鹽(naphthylethylenediaminedihydrochloride)溶于水中；Griess試劑B:1%對(duì)氨基苯磺酰胺(sulphanilamide)溶于5%H3P04中。使用前等體積混合試劑A和B。用RPMI1640培養(yǎng)液將RAW264.7細(xì)胞稀釋至5X105cells/mL濃度，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200UL細(xì)胞懸浮液。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lh后，每孔加入脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(Sigma)(終濃度lug/mL)和DMS0溶解的不同濃度的測(cè)試樣品0.4uL，同時(shí)設(shè)LPS組(加入LPS，但不加入測(cè)試樣品，對(duì)N0釋放的抑制率為090和空白對(duì)照組(不加入LPS和測(cè)試樣品，僅加入0.4pLDMSO，對(duì)N0釋放的抑制率為10090，每個(gè)樣品設(shè)4個(gè)平行孔。在37°C，5%C02恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，吸取IOOuL培養(yǎng)液上清至酶標(biāo)板中，離心(1000Xg，4。C，3min)，加入IOOPLGriess試劑，室溫避光反應(yīng)10min，于酶標(biāo)儀測(cè)定其540nm處的吸光值。用濃度分別為l、5、10、50Mmol/L的NaN02繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)NaN02標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)上清液中N(V的濃度進(jìn)而計(jì)算測(cè)試樣品對(duì)NO釋放的抑制率?；钚越Y(jié)果如下表6.苦木生物堿1-11對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮(NO)的抑制活性結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例3:苦木生物堿1-11對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放腫瘤壞死因子-a(TNF-a)的抑制活性實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)同NO釋放抑制活性測(cè)試。對(duì)TNF-a的抑制活性測(cè)試使用mouseTNF-aELISAkit試劑盒(R&D)。用RPMI1640培養(yǎng)液將RAW264.7細(xì)胞稀釋至5X105cells/mL濃度，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200iiL細(xì)胞懸浮液。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lh后，每孔加入脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(Sigma)(終濃度lUg/mL)和DMS0溶解的不同濃度的測(cè)試樣品0.4uL，同時(shí)設(shè)LPS組(加入LPS，但不加入測(cè)試樣品，對(duì)TNF-ci釋放的抑制率為0%)和空白對(duì)照組(不加入LPS和測(cè)試樣品，僅加入0.4uLDMSO，對(duì)TNF-a釋放的抑制率為10(m)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行孔。在37。C，5。/。C02恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后吸取培養(yǎng)液上清，按照ELISA試劑盒說明書方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和TNF-a的測(cè)定，計(jì)算抑制率?；钚越Y(jié)果如下表7.苦木生物堿l-ll對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子-a(TNF-a)的抑制活性結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實(shí)施例4:苦木生物堿1-ll對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放白細(xì)胞介素-6(IL-6)的抑制活性實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)同NO釋放抑制活性測(cè)試。對(duì)IL-6的抑制活性測(cè)試使用mouseIL-6ELISAkit試劑盒(R&D)。用RPMI1640培養(yǎng)液將RAW264.7細(xì)胞稀釋至5X105cells/mL濃度，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200uL細(xì)胞懸浮液。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lh后，每孔加入脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(Sigma)(終濃度l"g/mL)和DMS0溶解的不同濃度的測(cè)試樣品0.4uL，同時(shí)設(shè)LPS組(加入LPS，但不加入測(cè)試樣品，對(duì)IL-6釋放的抑制率為090和空白對(duì)照組(不加入LPS和測(cè)試樣品，僅加入0.4uLDMSO，對(duì)IL-6釋放的抑制率為100%)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行孔。在37°C，5%C(V恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后吸取培養(yǎng)液上清，按照ELISA試劑盒說明書方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和IL-6的測(cè)定，計(jì)算抑制率。表8.苦木生物堿l-ll對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素-6(IL-6)的抑制活性結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>權(quán)利要求1.一種β-卡巴林類生物堿，具有如下式(I)的結(jié)構(gòu)2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的p-卡巴林類生物堿，其特征在于所述P-卡巴林類生物堿A為甲醛基、甲酸基、乙氧基乙基、二羥基乙基、羥基乙基、結(jié)構(gòu)式(A)、結(jié)構(gòu)式(B)或結(jié)構(gòu)式(C);R2為氫或甲氧基；R3為氫或羥基；R4為氫或甲氧基；Rs為氫或結(jié)構(gòu)式(B);<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的P-卡巴林類生物堿，其特征在于所述e-卡巴林類生物堿是4，8-二甲氧基-l-醛基-P-卡巴林、4,8-二甲氧基-P-卡巴林小甲酸、4-甲氧基-P-卡巴林-l-甲酸、4-甲氧基-1-(1-羥基-2-乙氧基乙基)-卩-卡巴林、4,8-二甲氧基-1-(1,2-二羥基乙基)-(3-卡巴林、4,8-二甲氧基-1-(2-羥基乙基)-(3-卡巴林、鐵屎米-6-酮-4-丁酸、4,5-二甲氧基-10-羥基鐵屎米-6-酮、1-^-卡巴林-3-(4-甲氧基-日-卡巴林)-丙基-l-酮、1-》-卡巴林_3-(4，8-二甲氧基-P-卡巴林)-丙基-l-酮、卜"-卡巴林-3-(4-甲氧基-8-羥基-P-卡巴林)-丙基-l-酮中的至少一種。4、如權(quán)利要求13任一項(xiàng)所述的P-卡巴林類生物堿作為制備抗炎藥物的用途。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所述抗炎藥物是用于預(yù)防或治療由一氧化氮、腫瘤壞死因子-a和白細(xì)胞介素-6炎癥介質(zhì)的釋放導(dǎo)致的炎癥。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所述抗炎藥物含有治療有效量的權(quán)利要求13任一項(xiàng)所述的e-卡巴林類生物堿和藥學(xué)上可接受的載體。7、如權(quán)利要求1所述的P-卡巴林類生物堿的制備方法，其特征在于包括以下操作步驟采用植物苦木為原料，用有機(jī)溶劑和/或水進(jìn)行提取并且進(jìn)行分離。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的3-卡巴林類生物堿的制備方法，其特征在于:所述有機(jī)溶劑是甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中的一種或幾種；所述提取的提取溫度為20-100°C，提取時(shí)間為1-48小時(shí)；所述分離是采用層析分離法和/或萃取法進(jìn)行分離。全文摘要本發(fā)明提供了苦木中的β-卡巴林類生物堿及其制備方法和用途。該生物堿具有如下式(I)的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明β-卡巴林類生物堿采用植物苦木為原料，用有機(jī)溶劑和/或水進(jìn)行提取并且采用層析分離法和/或萃取法進(jìn)行分離得到。該β-卡巴林類生物堿作為抗炎藥物用于預(yù)防或治療由一氧化氮、腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-6炎癥介質(zhì)的釋放導(dǎo)致的炎癥。文檔編號(hào)C07D519/00GK101367802SQ200810198870公開日2009年2月18日申請(qǐng)日期2008年9月27日優(yōu)先權(quán)日2008年9月27日發(fā)明者葉文才,周光雄,姚新生,毅戴,李晨陽,焦偉華,飛賀,峰趙,昊高申請(qǐng)人:暨南大學(xué)