專利名稱：：植物調節(jié)花色素苷合成的轉錄因子-myb編碼基因的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及與植物花色素苷形成相關的酶編碼基因與應用。
背景技術：
：轉錄因子也稱為反式作用因子，是指能夠與真核基因的順式作用元件發(fā)生特異性相互作用，并對轉錄有激活或抑制作用的DNA結合蛋白(王希慶，陳柏君,印莉萍.植物中的MYB轉錄因子，生物技術通報,2003，2:22~25.)。根據(jù)與DNA結合的方式可以把TF分為兩類:普遍性轉錄因子(generaltranscriptionfactor,GTF)和特異性轉錄因子(s叫uence-specifictranscriptionfactor)(吳乃虎.《基因工程原理》(下冊),北京:科學出版社2001,88~97.)。GTF能和啟動子的核心序列TATA框結合，可以激活所有基因的轉錄，而特異性轉錄因子和DNA序列上的其它調節(jié)元件結合，只能激活特定的基因。MZB基因是最大的植物轉錄因子基因家族之一，它們都具有高度保守的DNA結合域一MYB結構域。每個MYB結構域約含有50-53個氨基酸殘基，其中，有3個保守的色氨酸殘基，其間隔為18-19個氨基酸，是疏水核心的重要成分，對于維持螺旋-轉角-螺旋(HTH)的構型起著非常重要的作用。MYB蛋白借助此結構插入靶DNA分子火溝與目的DNA結合，研究表明，每一重復子的C-端螺旋是結合DNA的識別螺旋，而R3的識別螺旋特異性地與其識別序列的核心結合，而R2的識別螺旋與核苷酸的結合專一性較差(OgataK,MorikawaS,AmetaniYetal.ComparisonofthefreeandDNAcomplexedformsoftheDNA2bindingdomainofc-MYB.NatureStructBiol,1995，2:309-320.)，有時色氨酸殘基會被某個芳香族氨基酸或疏水氨基酸所取代;植物MYB蛋白R3重復子中第一個色氨酸殘基通常為苯丙氨酸(Phe)或異亮氨酸(ILeu)所代替。MYB相關基因的調節(jié)活性是自然界中植物著色模式多變的主要原因(SchwinnK,Venail.J，ShangY.etal.Asmallfamilyof]VfYB-regulalorygenescontrolsfloralpigmentationintensityandpatterninginthegenusj"rt>r/w'M.Plant.Cell18:831—851.)，其中MYBR2R3家族與類黃酮和花色素昔生物合成途徑調控緊密相關。如玉米的C7，所編碼的蛋白具有一個堿性N-端，包含2個重復結構域(R2R3)，和酸性的C-端則具有轉錄激活因子的特征。屬于該類轉錄因子還包括玉米的C〃尸/家族與P基因，擬南芥的rr丄PAP1/PAP2,矮牽牛的J"么金魚草的爿wMyB305，與^mJW7fi340,紫蘇的MyS-尸/(R3)。3近年來，許多類黃酮代謝途徑中的轉錄因子基因已從擬南芥、番茄等模式植物中被克隆出來，根據(jù)其結構特點可以分為兩個轉錄因子家族:一類是與脊椎動物原發(fā)癌基因c-7W7S編碼蛋白同源的MYB轉錄因子，它們都具有相似的螺旋一轉角一螺旋(Helix-Turn-Helix，HTH)結構，多數(shù)MYB轉錄閑子都具有兩個相關的HTH結構，參與靶序列的結合。在每個MYB區(qū)域中，一般都含有3個保守的色氨酸殘基，其間隔18-19氨基酸，是疏水核心的重要成分，對于維持HTH的構型起著非常重要的作用;另一類是與脊椎動物原發(fā)癌基因c-M7C編碼蛋白同源的MYC轉錄因子，它們具有共同的螺旋一環(huán)一螺旋(basicHelix-Lo叩-Helix，bHLH)結構，可與MYB轉錄因子相互作用，共同調節(jié)類黃酮的代謝(GandikotaM,deKochkoA,ChenLetal.Developmentoftransgeneticriceplantsexpressingmaizeanthocyaningenesandincreasedblastresistance.MolBreed,2001,7:73-83.)。Moyano等發(fā)現(xiàn)金魚草AmMYB305與AmMYB304共同調控苯丙烷代謝途徑的第一個酶PAL(phenylalanineammonia-lyase)的合成(MoyanoE,Martinez-GarciaJF,MartinC.ApparentRedundancyinMYBGeneFunctionprovidesGearingforthecontrolofFlavonoidBiosynthesisinAntirrhinumFlowers.Plantcell,1996，8:1519-1532.)，當AmMYB305與AmMYB304在同一細胞中表達時，AmMYB305優(yōu)先結合在目的基因的啟動于，從而減弱了AmMYB304的激活效率，因此，它們之間通過一種內部協(xié)調機制共同參與苯丙烷代謝。矮牽牛的^V2基因只在花瓣中表達，編碼一個含有MYB結構的蛋自(F.Quattrocchio，J.Wing,K.V.D.Woude,etal.Molecularanalysisofthea"f/ioqy咖力2geneof尸ef畫'aanditsroleintheevolutionofflowercolor.Plantcell,1999,l1:1433-1444.)。在功能上，它能與玉米的C/互換，并且可能與擬南芥04ra6Wo/w'sftoato'wa)外種皮透明基因2(rra似pareW7^to2,7T2)或花青素合成基因1(iVodwcft.owo/awfAocjKw/"p/g7weM〃,iM尸7)禾口2同、源(N.Nesi，C.Jond,I.Debeaujonetal..TheJra6/c/o/w/sTT2geneencodesanR2R3mybdomainproteinthatactsasakeydeterminantforproanthocynaidinaccumulationindevelopingseed.PlantCell,2001,13:2099-2114.)。Elomaa等在非洲菊(Ge/"6era/如nVfa)中發(fā)現(xiàn)了一種R2R3型MYB因子^GMYB10。它同以前在矮牽牛和擬南芥中發(fā)現(xiàn)的誘導花青素合成的調控因子有高度的同源性。GMYB10能誘導轉基因煙草花青素的合成，特別是在幼嫩組織和花粉囊中著色顯著。在非洲菊中，GMYB10參與花青素合成基因在葉子、花梗和花朵中的誘導表達。在花朵中，它的表達被限制在花瓣表皮細胞層，并與花瓣的花青素積累模式相關。通過酵母(Saccharomyecescerevisiae)雙雜交分析發(fā)現(xiàn)，GMYB10能與先前分離出的bHLH型轉錄因子GMYC1相互作用。利用轉基因分析還表明，GMYB10/GMYC1是晚期花青素合成基因PGDFR2啟動子轉錄激活所必須的調控因子(P,Elomaa,A.Uimari,M.Mehto,etal.ActivationofanthocyaninbiosynthesisinGenera/^6"'(sto(Asteraceae)suggestsconservedprotein-proteinandprotein-promoterinteractionsbetweentheancientlydivergedmonocotsandeudieots.plnatphysiol.,2003,133(4):1831-1842.)。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種與植物花色素苷形成相關的酶編碼基因與.本發(fā)明所提供的與植物花色素苷形成相關的酶，名稱為MYB，來源于蘋果屬王族海棠(Ma/w/qya卸)，是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物花色素苷形成相關的由l)衍生的酶。上述與植物花色素苷形成相關的酶的cDNA基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。與植物花色素苷形成相關的酶的cDNA基因具體可為如下l)-4)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第948位脫氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列l(wèi);3)在嚴格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼上述與植物花色素苷形成相關的酶的DNA分子；4)與l)的基因具有95%以上的同源性，且編碼上述與植物花色素苷形成相關的酶的DNA分子。序列表中的序列1由948個堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5'末端第l-948位堿基，編碼氨基酸序列是序列表中序歹U2的MYB。擴增上述A^S基因全長或任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物合成及測序工作均由上海生工生物技術服務有限公司完成。限制性內切酶EcoRl、HindIII和Taq酶，WDNA連接酶均購自大連寶生物工程有限公司，pUC18-TVector購自寶生物工程公司，BDSMARTRACEcDNAAmplificationKit購自Clontech公司。Amp抗生素、Tris飽和酚、水飽和酚、DEPC、DL2000DNAMarker、瓊脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨均購自北京鼎國生物技術有限公司。一、A^W75基因3'端序列的獲得以王族海棠(M"/mJoya卸)(北京農(nóng)學院海棠種質資源圃)為實驗材料，提取其根的總RNA，將提取得到的總RNA用50nl的DEPC水溶解，電泳檢測。經(jīng)甲醛變性凝膠電泳分析，結果如圖1所示。從圖中可以清晰地看到28SrRNA和18SrRNA兩條帶，且28SrRNA和18SrRNA含量之比大約為1:1-2:1。結果表明，提取得到的RNA是完整的，染色結果顯示，提取得到的總RNA可以用來進行反轉錄。以上述提取得到的根總RNA為模板，將其反轉錄為cDNA。再以此cDNA為模板，跟據(jù)近緣物種植物MYB基因保守區(qū)段序列，設計3'race上游引物MYB3F擴增MWW75基因的3'端序列。MasterMix預混物體系如下預混物_體積(nL)ddH2025.810PCR緩沖液4dNTPMixture(2.5mM)3.2T叫酶(5U/1)1總體積34pL，將上述MasterMix預混物平均分成2管，按照下表加入引物雙引物對照樣品3R(序列表中序列3)1^1l(JMYB3F(序列表中序列4)lpllpl模板一1^1PCR反應條件先95。C預變性3min;然后95。C變性15S;68。C退火6min，共30個循環(huán)；最后72。C延伸10min。取10nLPCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖3所示，其中，M為DL2000的DNA分子量標準，1為樣品組的PCR擴增結果，2為MYB3F(序列表中序列4)和3R雙引物對照。結果表明，雙引物對照組沒有擴增出特異條帶，只有樣品組擴增得到670bp左右的片段。切下目的條帶，純化回收后按照pBS-T-VectorKit載體試劑盒(天為時代生物公司)說明書將PCR產(chǎn)物連接到pBS-T載體上，進行測序。經(jīng)同源性比較分析后確定獲得的778bp片段即是MF￡基因的3'端序列。二、MJ^基因5'端序列的獲得以步驟一獲得的保守序列為模板，在其5'端設計引物，進行PCR反應，擴增AfrM75基因的5'端序列。MasterMix預混物體系如—K:預混物_體積(^L)ddH2025.810PCR緩沖液4dNTPMixture(2.5mM)3.2T叫酶(5U/1)1總體積34^L,將上述MasterMix預混物平均分成2管，按照下表加入引物:雙引物對照樣品5F(序列表中序列3)lplMYB5R2(序列表中序列5)模板_1^1PCR反應條件先95'C預變性3min;然后95'C變性15S;58'C退火6min，共30個循環(huán)；最后72'C延伸7min。將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋1000倍，取lpL作為模板，以MYB5R1和MYB5R2(序列表中序列5和6)為引物，進行巢式PCR反應，PCR反應條件與第一輪相同。取10nL第二輪PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示，其中，M為MARKERII的DNA分子量標準，1為樣品組的PCR擴增結果，2為MYB5R2和5F雙引物對照。結果表明，雙引物對照組沒有擴增出特異條帶，只有樣品組擴增得到680bp左右的片段。切下目的條帶，純化回收后按照pBS-T-VectorKit載體試劑盒(天為時代生物公司)說明書將PCR產(chǎn)物連接到pBS-T載體上，進行測序。經(jīng)同源性比較分析后確定獲得的700bp片段即是Mr^ZS基因的5'端序列。三、MrM7S基因全長cDNA序列的獲得將上述PCR擴增獲得的A^MK5基因5'端序列以及3'端序列進行同源性比較，利用DNAMAN等生物軟件進行拼接校正，拼接出MrM75基因全長cDNA序列。根據(jù)拼接的基因全長cDNA序列設計引物MYBF和MYBR(序列表中序列7和序列8)，提取王族海棠葉的總RNA，反轉錄為cDNA,用高保真Pfu酶替換r叫酶，PCR反應混合物如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>PCR反應條件先94。C預變性3min;然后94°C50S，60°Clmin,72°C2min，共35個循環(huán)；再72'C延伸7min，4'C保存。PCR產(chǎn)物進行P/。瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖4所示，其中，M為MARKERII的DNA分子量標準，1為A/WWZB基因全長cDNA序列的PCR產(chǎn)物。結果表明獲得約1000bp的條帶。切下該目的條帶，純化回收后按照pBS-T-VectorKit載體試劑盒(天為時代生物公司)說明書將PCR產(chǎn)物連接到pBS-T載體上。對擴增得到的Mr7WT5基因全長cDNA序列進行測序，測序結果表明，獲得948bp的條帶，該948bp的核苷酸片段即為7WWW7S，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列2所示。圖1為王族海棠葉總RNA的提取結果圖2為MrMK5基因的5'RACEPCR擴增結果圖3為MrM75基因的3'RACEPCR擴增結果圖4為Ma"M^基因全長cDNA序列的PCR擴增結果序列表序列一DNA蘋果屬王族海棠(Afa/w5icya&)9481CCCAAGCAAGAGAGCAGCTATGGCCGCTCCTACAACCCCTGAAGAAAATGAGTTCAGAAG61AGGGCCATGGACTCTTGAGGAAGACAATCTGCTTATACATTACATCGTGAACCACGGCGA121AGGCCATTGGAATTCTTTAGCAAAACTTGCAGGATTGAAGAGGACCGGAAAAAGCTGCAG181ATTGAGATGGCTAAATTACTTAAAACCCGACATTAAGCGCGGGAACCTTACTCCGCAAGA241ACAGCTCATGATCCTTGAACTCCACTCCAAGTGGGGTAACAGGTGGTCTAAAATTGCGCA301GCATTTGCCGGGAAGAACAAACAATGAGATAAAGAACTATTGGAGAACAAGGGTGCAAAA361ACAGGCGCGCCAACTGAACATCGAGTCGAACAGCGAGCAATTTCTCGATGCAGTTCGGGG421TTTCTGGGTGCCGACTCTGCTGCAAAAAATGGAGCAATCTTCTTCTTCTTGTTCTTCAAC481CAGCTCTTTC541ATTATCACAT601ATTCTTTTGT661ATTACCGACT721TGGCTACAGCAGCTTAAGTCCAGATGGCAGTCACTACGTG9GACAGCAGTAGCTATGACGT781GGAGGGTCTCAGCCTGGACCCTGTTTCGGCAATGGGCAATCTTGGCAA，CACAGTTTGA841TTGCCAGATGGGGGGAAATGATTGGATGTTGGACAATGTGACTGACAGTTTATGGAACAT901GGATGGGCCGTGACAACCTAGAAAGTTAGAAGATTTTCAGGGGATTCC序列二PRT蘋果屬王族海棠(Afa/wsito_ya/i[y)3141PSKRAAMAAPTTPEENEF.RR21GPWTLEEDNLLIHYIVNHGE41GH麗SLAKLAGLKRTGKSCR61LRWLNYLKPDIKRGNLTPQE81QLMILELHSKWGNRWSKIAQ101HLPGRTNNEIKNYWRTRVQK121QARQLNIESNSEQFLDAVRG141FWVPTLLQKMEQSSSSCSST161LSTSQNSASPCLSPNHAALS181VPLSTSPPSNATNVLDNYHI201SGNSNLATWSNILSADSFV221SHVPQMAEPSTSFPPAYYRL241GYSSLSPDGSHYVDSSSYDV261EGLSLDPVSAMGNLGNSQFD281CQMGGND麗LDNVTDSL額M301DGP*QPRKLEDFQGI序列三DNA人工序列3R和5F:Long(0.4nM):5'"<:TAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCACGCAGAGT_3'Short(2pM):105'"CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'序列四DNA人工序列MYB3F:5，-GGGTCTWCCRGGWAGAACAG-3，。序列五DNA人工序列MYB5R1:5'-GATTGAGATGGCTAAATTACTTAAAAC-3，。序列六DNA人工序列MYB5R2:5'-GACATTAAGCGCGGGAACCT—3'序列七DNA人工序列MYBF:5，-GGAATCCCCTGAAAATCTTCT-3'序列八DNA人工序列MYBR:5，-CCCAAGCAAGAGAGCAGCTAT-3，權利要求1、一種蛋白，是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物花色素苷形成相關的由1)衍生的蛋白質。2、權利要求l所述蛋白的編碼基因。3、根據(jù)權利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的cDNA基因為如下l)-4)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第l一948位脫氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列l(wèi);3)在嚴格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼權利要求1所述蛋白的DNA分子；4)與l)的基因具有95X以上的同源性且編碼編碼權利要求1所述蛋白的DNA分子。全文摘要本發(fā)明公開了一種植物調節(jié)花色素苷合成的轉錄因子的編碼基因與應用。該蛋白，是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且能改變植物花色或葉色的由1)衍生的蛋白質。文檔編號C07K14/415GK101580543SQ20081022558公開日2009年11月18日申請日期2008年11月6日優(yōu)先權日2008年11月6日發(fā)明者姚允聰,宋婷婷,沈紅香,佶田申請人:北京農(nóng)學院;姚允聰