專利名稱：：一種朝藿定c化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種從淫羊藿提取物中分離獲得純度大于98X的朝藿定C化學(xué)對(duì)照品的制備方法。主要包括柱分離濃縮富集以及快速的高效液相制備方法除雜及精制。
背景技術(shù)：
：淫羊藿(HerbaEpimedii)是我國使用最為悠久的中藥之一，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效?，F(xiàn)代研究表明，淫羊藿具有抗骨質(zhì)疏松、增強(qiáng)性功能、增加心腦血管血流量等多方面藥理作用。朝藿定C是淫羊藿藥材中除淫羊藿苷外含量較高的成分，在某些品種中朝藿定C含量甚至高于淫羊藿苷(謝娟平等，中草藥，2007，38(4):613-614)。朝藿定C是淫羊藿苷的鼠李糖取代物，隨著其藥理活性的逐漸闡明及越來越多的企業(yè)采用淫羊藿苷和朝藿定C共同作為淫羊藿及其制劑的質(zhì)控指標(biāo)成分，其成為廣泛接受的質(zhì)控指標(biāo)成分應(yīng)是未來發(fā)展的必然方向。朝藿定C的結(jié)構(gòu)式如下OHOH朝藿定C的分離制備方法主要有郭寶林等(中國專利CN2007100002610.5，2007年公開)采用乙酸乙酯-甲醇萃取、硅膠柱粗分、C18反相制備(40-60%甲醇-水)、S印hadexLH40凝膠層析、C18反相制備(40-60%乙腈-水)等工藝分離朝藿定C，雖然可制得純度大于98X的朝藿定C，但主要工藝步驟有五步之多。王曉春等(中國專利CN200610101222.5，2007年公開)采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇溶劑萃取獲得正丁醇部位的朝藿定C粗浸膏，然后依次過硅膠、聚酰胺柱獲得朝藿定C對(duì)照品。后者的工藝相對(duì)簡單，但系統(tǒng)溶劑萃取及柱分離過程中大量使用揮發(fā)性強(qiáng)的有毒溶劑(如氯仿等)，不利于其大規(guī)模推廣應(yīng)用。目前，工藝簡便的高效液相制備色譜方法用于大規(guī)模(克級(jí)以上)制備98%含量朝藿定C的工作還未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明在整合各種朝藿定C制備方法基礎(chǔ)上，通過原料藥優(yōu)選、目標(biāo)對(duì)照品富集方法研究及對(duì)照品精制高效液相方法開發(fā)等多方面研究，發(fā)明了一種低成本、快速的高效液相制備色譜方法，制備規(guī)模可達(dá)5g/月并且保證純度(>98%)及產(chǎn)品色澤。本發(fā)明的目的是開發(fā)出一種可以獲得克級(jí)規(guī)模并且純度在98X以上的朝藿定C甙化學(xué)對(duì)照品的新方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案1.—種朝藿定C化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法，其特征在于以質(zhì)量含量為10-50%的淫羊藿苷提取物為原料，經(jīng)初步柱分離，以制備型高效液相色譜為主要分離手段，通過兩步高效液相制備，提取液直接減壓濃縮至干即可獲得月產(chǎn)5克級(jí)規(guī)模且純度大于98%的朝藿定C化學(xué)對(duì)照品；具體步驟如下1)初步柱分離淫羊藿苷提取物用水或體積濃度40-80%乙醇水溶液溶解，樹脂柱或聚酰胺柱分離，乙醇_水溶液梯度洗脫，其中乙醇的體積濃度從0%_80%變化，收集20%_70%乙醇洗脫物，濃縮干燥得黃色粉末I;2)黃色粉末I用體積濃度40-80%乙醇水溶液溶解，配置成濃度為50150mg/ml的供試品溶液，經(jīng)0.45iim微孔濾膜過濾；采用柱長10-50cm、直徑l-10cm的高效液相制備色譜柱進(jìn)行分離，六通閥或泵進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為l-50ml，以體積濃度為45-60%的甲醇-水或體積濃度為20-40%的乙腈-水溶液為洗脫體系，流速控制在10-400ml/min，在線紫外檢測，收集含有朝藿定C的洗脫液，減壓濃縮干燥得黃色粉末II;3)第二步高效液相制備黃色粉末II以體積濃度為20_40%的含乙腈水溶液為洗脫體系進(jìn)行第二次高效液相制備，其它條件同步驟2)，收集純度大于98%的含有朝藿定C的流份；4)朝藿定C化學(xué)對(duì)照品的獲得上述流份直接濃縮至干即可得到純度大于98X的朝藿定C對(duì)照品，其為亮黃色粉末。上述方法中，初步柱分離用樹脂以非極性大孔吸附樹脂較好。高效液相制備過程采用的流動(dòng)相為體積濃度為20_40%的含乙腈水溶液；高效液相制備柱的填料為C6、C8或C18鍵合相填料，其粒徑為520iim，紫外檢測波長優(yōu)選270nm、318nm或349nm，具體檢測波長根據(jù)樣品中朝藿定C信號(hào)的超載情況而定。以本發(fā)明從淫羊藿提取物中分離朝藿定C化學(xué)對(duì)照品具有如下優(yōu)點(diǎn)和進(jìn)步1.本發(fā)明以制備型高效液相為分離手段，使朝藿定C得到高效分離的同時(shí)避免了大量使用有毒揮發(fā)性流動(dòng)相及開口柱。2.本發(fā)明通過柱分離對(duì)目標(biāo)對(duì)照品進(jìn)行初步富集，然后采用兩步高效液相制備方法分別進(jìn)行除雜和精制，工藝較簡單。3、本發(fā)明發(fā)展的高效液相制備方法為快速制備方法，單針分離時(shí)間在10-30分鐘之間，非常適合大批量化學(xué)對(duì)照品的制備；同時(shí)加上制備溶劑的回收再利用，可實(shí)現(xiàn)批量制備的低成本。4.本發(fā)明采用紫外檢測器在線檢測，朝藿定C的分離情況可以直接檢測，可直接選擇性收集高純度樣品，從而實(shí)現(xiàn)純度保證下的高回收率。4總之，本發(fā)明工藝步驟簡單、純度高、色澤好，并且可大規(guī)模生產(chǎn)。圖1為朝藿定C的HPLC分析圖譜(270nm)，其積分報(bào)告如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>具體實(shí)施例方式現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，實(shí)施例僅限于說明本發(fā)明，而非對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例1本實(shí)施例中，以含量為20%的淫羊藿苷提取物為原料，初步柱分離采用HPD柱，高效液相制備以10ymC18鍵合相填料為吸附劑，經(jīng)兩步高效液相制備獲得朝藿定C對(duì)照品。具體工藝步驟如下1)初步柱分離淫羊藿苷提取物用40-80%乙醇水溶液溶解，HPD-100樹脂柱分離，乙醇_水溶液梯度洗脫，收集20%_70%乙醇洗脫物，濃縮干燥得黃色粉末I。2)第一步高效液相制備黃色粉末I用40-80%乙醇水溶液溶解，配置成濃度為150mg/ml的供試品溶液，經(jīng)0.45m微孔濾膜過濾；制備型高效液相柱填料品牌為ChromatorexC18鍵合相填料；粒徑為10iim，柱長22cm、直徑7.5cm;六通閥進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為10ml，以60%甲醇-水溶液為洗脫體系，流速控制在160ml/min，在線紫外檢測，收集含有朝藿定C的洗脫液，減壓濃縮干燥得黃色粉末II。3)第二步高效液相制備黃色粉末II以體積濃度28%的含乙腈水溶液為洗脫體系進(jìn)行第二次高效液相制備，其余條件同步驟2)，收集含有朝藿定C的高純流份。4)朝藿定C化學(xué)對(duì)照品的獲得上述高純流份直接濃縮至干即可得到純度大于98X的朝藿定C對(duì)照品(亮黃色粉末)(圖l)。實(shí)施例2本實(shí)施例中，以含量為20%的淫羊藿苷提取物為原料，初步柱分離采用HPD柱，高效液相制備以10ymC18鍵合相填料為吸附劑，經(jīng)兩步高效液相制備獲得朝藿定C對(duì)照品。具體工藝步驟如下1)初步柱分離淫羊藿苷提取物用水溶液溶解，HPD-100樹脂柱分離，乙醇_水溶液梯度洗脫，收集20%_70%乙醇洗脫物，濃縮干燥得黃色粉末I。2)第一步高效液相制備黃色粉末I用40-80%乙醇水溶液溶解，配置成濃度為100mg/ml的供試品溶液，經(jīng)O.45iim微孔濾膜過濾；制備型高效液相柱填料品牌為ChromatorexC18鍵合相填料；粒徑為10iim，柱長19、直徑7.5cm;泵進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為20ml，以50%甲醇-水溶液為洗脫體系，流速控制在140ml/min，在線紫外檢測，收集含有朝藿定C的洗脫液，減壓濃縮干燥得黃色粉末II。3)第二步高效液相制備黃色粉末II以體積濃度25%的含乙腈水溶液為洗脫體系進(jìn)行第二次高效液相制備，條件同步驟2)，收集含有朝藿定C的高純流份。4)朝藿定C化學(xué)對(duì)照品的獲得上述高純流份直接濃縮至干即可得到純度大于98X的朝藿定C對(duì)照品(亮黃色粉末)。實(shí)施例3本實(shí)施例中，以含量為15%的淫羊藿苷提取物為原料，初步柱分離采用聚酰胺柱，高效液相制備以5ymC18鍵合相填料為吸附劑，經(jīng)兩步高效液相制備獲得朝藿定C對(duì)照品。具體工藝步驟如下1)初步柱分離淫羊藿苷提取物用40-80%乙醇水溶液溶解，聚酰胺柱分離，乙醇_水溶液梯度洗脫，收集20%_70%乙醇洗脫物，濃縮干燥得黃色粉末I。2)第一步高效液相制備黃色粉末I用40-80%乙醇水溶液溶解，配置成濃度為120mg/ml的供試品溶液，經(jīng)0.45iim微孔濾膜過濾；制備型高效液相柱填料品牌為McirosorbC18鍵合相填料，粒徑為5iim;柱長17cm、直徑5cm;六通閥進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為8ml，以55%甲醇-水溶液為洗脫體系，流速控制在180ml/min，在線紫外檢測，收集含有朝藿定C的洗脫液，減壓濃縮干燥得黃色粉末II。3)第二步高效液相制備黃色粉末II以體積濃度30%的含乙腈水溶液為洗脫體系進(jìn)行第二次高效液相制備，條件同步驟2)，收集含有朝藿定C的高純流份。4)朝藿定C化學(xué)對(duì)照品的獲得上述高純流份直接濃縮至干即可得到純度大于98%的朝藿定C對(duì)照品。實(shí)施例4本實(shí)施例中，以含量為25%的淫羊藿苷提取物為原料，初步柱分離采用聚酰胺柱，高效液相制備以5ymC18鍵合相填料為吸附劑，經(jīng)兩步高效液相制備獲得朝藿定C對(duì)照品。具體工藝步驟如下1)初步柱分離淫羊藿苷提取物用40-80%乙醇水溶液溶解，聚酰胺柱分離，乙醇_水溶液梯度洗脫，收集20%_80%乙醇洗脫物，濃縮干燥得黃色粉末I。2)第一步高效液相制備黃色粉末I用40-80%乙醇水溶液溶解，配置成濃度為80mg/ml的供試品溶液，經(jīng)0.45iim微孔濾膜過濾；制備型高效液相柱填料品牌為McirosorbC18鍵合相填料，粒徑為5iim;柱長17cm、直徑5cm;泵進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為20ml，以48%甲醇-水溶液為洗脫體系，流速控制在180ml/min，在線紫外檢測，收集含有朝藿定C的洗脫液，減壓濃縮干燥得黃色粉末II。3)第二步高效液相制備黃色粉末II以體積濃度32%的含乙腈水溶液為洗脫體系進(jìn)行第二次高效液相制備，條件同步驟2)，收集含有朝藿定C的高純流份。4)朝藿定C化學(xué)對(duì)照品的獲得上述高純流份直接濃縮至干即可得到純度大于98%的朝藿定C對(duì)照品。權(quán)利要求一種朝藿定C化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法，其特征在于以質(zhì)量含量為10-50％的淫羊藿苷提取物為原料，經(jīng)初步柱分離，以制備型高效液相色譜為主要分離手段，通過兩步高效液相制備，提取液直接減壓濃縮至干即可獲得純度大于98％的朝藿定C化學(xué)對(duì)照品；具體步驟如下1)初步柱分離淫羊藿苷提取物用水或體積濃度40-80％乙醇水溶液溶解，樹脂柱或聚酰胺柱分離，乙醇-水溶液梯度洗脫，其中乙醇的體積濃度從0％-80％變化，收集20％-70％乙醇洗脫物，濃縮干燥得黃色粉末I；2)第一步高效液相制備黃色粉末I用體積濃度40-80％乙醇水溶液溶解，配置成濃度為50～150mg/ml的供試品溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾；采用柱長10-50cm、直徑1-10cm的高效液相制備色譜柱進(jìn)行分離，六通閥或泵進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為1-50ml，以體積濃度為45-60％的甲醇-水或體積濃度為20-40％的乙腈-水溶液為洗脫體系，流速控制在10-400ml/min，在線紫外檢測，收集含有朝藿定C的洗脫液，減壓濃縮干燥得黃色粉末II；3)第二步高效液相制備黃色粉末II以體積濃度為20-40％的含乙腈水溶液為洗脫體系進(jìn)行第二次高效液相制備，其它條件同步驟2)，收集純度大于98％的含有朝藿定C的流份；4)朝藿定C化學(xué)對(duì)照品的獲得上述流份直接濃縮至干即可得到純度大于98％的朝藿定C對(duì)照品，其為亮黃色粉末。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離制備方法，其特征在于柱分離過程采用的樹脂柱為非極性樹脂柱。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離制備方法，其特征在于第一步或第二步高效液相制備過程采用的制備柱的填料為C6、C8、或C18鍵合相填料，粒徑為5-20ym。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離制備方法，其特征在于高效液相制備過程采用的流動(dòng)相為體積濃度為22-35%的含乙腈水溶液。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離制備方法，其特征在于高效液相制備過程采用在線紫外檢測，其檢測波長優(yōu)選270nm、318nm或349nm。全文摘要本發(fā)明涉及一種朝藿定C化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法。以含量為10％-50％的淫羊藿苷提取物為原料，經(jīng)初步柱分離，以制備型高效液相色譜為主要分離手段，通過兩步高效液相制備，提取液直接減壓濃縮至干即可獲得純度大于98％的朝藿定C化學(xué)對(duì)照品。相比已報(bào)道朝藿定C的分離制備方法，本發(fā)明工藝步驟簡單、純度高、色澤好，并且可大規(guī)模生產(chǎn)。文檔編號(hào)C07H17/07GK101747392SQ20081022988公開日2010年6月23日申請日期2008年12月17日優(yōu)先權(quán)日2008年12月17日發(fā)明者左愛華,王莉,肖紅斌申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所