專利名稱：一種水稻耐冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于作物遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及一種與水稻耐冷相關(guān)的基因， 以及將該基因轉(zhuǎn)化到擬南芥植物中，提高植物的耐冷能力的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干旱、高鹽和低溫是諸多非生物逆境中對(duì)作物危害最為嚴(yán)重的自然災(zāi)害， 它嚴(yán)重影響了作物的產(chǎn)量和種植區(qū)域。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界干旱、半干旱地區(qū)占地球
陸地面積的33%，鹽堿地占地球陸地面積的7.6%，另外還有很多地區(qū)常年受 低溫冷害的影響。而在我國(guó)干旱和半干旱耕地面積為5. 7億畝，占全國(guó)總耕地 面積的38%。干旱少雨導(dǎo)致大批植被死亡，土壤風(fēng)化，土地荒漠化加劇，導(dǎo) 致境內(nèi)沙塵暴頻繁發(fā)生，這不僅嚴(yán)重制約了糧食生產(chǎn)，而且日益惡化人們的生 存環(huán)境。低溫冷害是我國(guó)南北方農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見(jiàn)的自然災(zāi)害之一，嚴(yán)重限制著 早春作物的種植和晚秋作物的收獲。除此之外，我國(guó)還有大片的鹽漬土壤等待 進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用。因此，長(zhǎng)期以來(lái)，人們都非常關(guān)注對(duì)干旱、高鹽和低溫等 非生物脅迫的研究。目前，植物與非生物逆境之間的關(guān)系在細(xì)胞分子水平上已 進(jìn)行了一定的研究(Xkmg， etal.2002)。研究植物抗非生物逆境的分子機(jī)理和 克隆與抗逆相關(guān)的基因，對(duì)植物抗逆性能的提高具有重要的指導(dǎo)意義。
干旱、高鹽和低溫都會(huì)造成植物不同程度的脫水，形成水分脅迫逆境，引 起一系列的生理代謝變化，所以我們又將干旱、高鹽和低溫等非生物脅迫稱為 水分脅迫，或滲透脅迫。在逆境條件下，植物感受水分脅迫并通過(guò)一系列的信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，植物細(xì)胞開(kāi)始合成一些新的與抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)增強(qiáng)已有的逆 境相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來(lái)調(diào)控其它抗逆功能基因的作用，再由這些功能基因去 執(zhí)行各種各樣的生理功能，如轉(zhuǎn)變細(xì)胞代謝，合成脯氨酸、多胺等抗?jié)B透物質(zhì)， 調(diào)節(jié)離子平衡，調(diào)控基因表達(dá)等(Bohnert, etal. 1995)。在各個(gè)物種中都已發(fā)
現(xiàn)大量的水分脅迫應(yīng)答基因，通過(guò)與己知蛋白質(zhì)的同源序列比較，己推測(cè)出這些基因所編碼蛋白的功能。水分脅迫誘導(dǎo)的基因不僅通過(guò)生成重要的蛋白質(zhì)保 護(hù)植物細(xì)胞不受水分缺失的影響，并能夠調(diào)控水分脅迫應(yīng)答中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基
因。根據(jù)這個(gè)區(qū)別，可將這些基因產(chǎn)物分成兩類，即功能蛋白(functional proteins)和調(diào)節(jié)蛋白(regulatory proteins)。前者包括在滲透脅迫作用的諸多 蛋白如與細(xì)胞膜水分運(yùn)輸相關(guān)的水分通道蛋白，各種滲透保護(hù)劑(糖，脯氨 酸，甜菜堿)合成所需的酶蛋白，大分子滲透保護(hù)蛋白(LEA，滲透蛋白，抗 凍蛋白，伴侶蛋白以及mRNA結(jié)合蛋白)，解毒酶類(谷胱甘肽一S—轉(zhuǎn)移酶、 超氧化物歧化酶和抗壞血酸過(guò)氧化氫酶等)，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換的蛋白酶類(巰基蛋 白酶、泛醌蛋白質(zhì))等。后者包括與調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)相關(guān)的蛋白因子， 如蛋白激酶(MAPK:活化絲裂素的蛋白激酶，MAPKK:磷酸化的MAPK激 酶，MAPKKK:磷酸化的MAPKK激酶，S6K:核糖體S6蛋白激酶，CDPK: 依賴Ca2+的蛋白激酶)，轉(zhuǎn)錄因子(CBF、 bZIP、 MYB、 MYC等等)，PLC及 14一3—3蛋白等，這些調(diào)節(jié)蛋白對(duì)進(jìn)一步了解水分脅迫反應(yīng)顯得尤為重要。
當(dāng)前，有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究，已成為植物逆境調(diào)控領(lǐng)域的熱門課題。應(yīng) 用DNA芯片研究基因的表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，受低溫、干旱和高鹽逆境調(diào)控的基因非 常多(Bohnert， etal. 2001; Kawasaki， etal. 2001; Sedi， etal. 2001)，盡管 其中大部分基因的功能及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑還不清楚，但有些逆境響應(yīng)基因已得 到了深入的研究，最有代表性的是W"A COi 7S/i:7777S等，這些基因的啟 動(dòng)子區(qū)包含有ABRE和DRE/CRT順式元件(Yamaguchi-Shinozaki, 1994)。這 些DRE/CRT順式元件幾乎都有一個(gè)保守的由5個(gè)堿基對(duì)組成的核心序列 CCGAC。結(jié)合DRE/CRT順式元件的轉(zhuǎn)錄因子己得到分離，如屬于EREBP/AP2 類轉(zhuǎn)錄因子的CBF1/DREB1B、 CBF2/DREB1C、 CBF3/DREB1A (Stockinger， etal. 1997; Gilmour,etal. 1998; Medina, etal. 1999)等。這些于轉(zhuǎn)錄相關(guān)的 CSF基因一起串聯(lián)排列在擬南芥的第四號(hào)染色體上，組成一個(gè)小基因家族。 CBF基因?yàn)榈蜏卣T導(dǎo)后迅速表達(dá)的基因，其編碼的轉(zhuǎn)錄激活子控制著包括 DRE/CRT調(diào)節(jié)因子基因的表達(dá)。JagloOttosen等(1998)將CBF7基因?qū)霐M 南芥，不需低溫刺激就可誘導(dǎo)一系列C(9i 基因的表達(dá)，如C(9i M.6 ,Q9i 7"",CC^"7和CO及7S等，使未經(jīng)低溫馴化的植株就有較高的抗凍性。 C3F3也可誘導(dǎo)低溫調(diào)節(jié)的靶基因(COi )表達(dá)。擬南芥CBF3基因的過(guò)度表達(dá) 提高了耐低溫脅迫能力,且導(dǎo)致許多與低溫脅迫有關(guān)的生理生化變化，如脯氨 酸和可溶性糖(蔗糖、棉籽糖、葡萄糖和果糖等)含量提高。擬南芥C^i^基因 的過(guò)度表達(dá)提高了耐低溫和耐干旱的能力。
目前有關(guān)CBFs類植物抗逆有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究大部分來(lái)自擬南芥，而其 它物種的研究報(bào)道不多。水稻中的Z)i^萬(wàn)L4基因的過(guò)量表達(dá)能提高植物的低 溫、干旱和高鹽的耐受性(Yusuke Ito, et al, 2006; Joseph, et al， 2003)。對(duì)水稻 CBF基因家族的功能研究還比較少，存在很多問(wèn)題沒(méi)有解決。如這些轉(zhuǎn)錄因 子的功能是什么？他們是如何參與逆境誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑？各種轉(zhuǎn)錄因子 在逆境應(yīng)答過(guò)程中是如何分工協(xié)作的？通過(guò)轉(zhuǎn)基因擬南芥來(lái)研究水稻CBF類 轉(zhuǎn)錄因子的功能，可能對(duì)這些問(wèn)題的解決有所幫助。
酵母單雜交體系含有兩個(gè)質(zhì)粒，其中一個(gè)為含物種cDNA庫(kù)的酵母表達(dá) 質(zhì)粒，用于表達(dá)cDNA與GAL4激活功能域的融合蛋白；另一個(gè)質(zhì)粒將含cis 盒的DNA片段(即魚(yú)餌)與帶有基本啟動(dòng)子的/^Z報(bào)告基因相連，構(gòu)建魚(yú) 餌質(zhì)粒。當(dāng)這兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母中后，若cDNA庫(kù)中有一個(gè)cDNA克隆所 編碼的DNA結(jié)合蛋白能識(shí)別cis盒的DNA片段，并與之結(jié)合，則融合蛋白 中的GAL4激活功能域能激活與魚(yú)餌連接的基本啟動(dòng)子，而使/"cZ基因表達(dá)， 菌落在X-gal平板上顯現(xiàn)藍(lán)色。
本發(fā)明以水稻為研究材料，構(gòu)建一個(gè)含水稻cDNA庫(kù)的酵母表達(dá)質(zhì)粒 pPC86 (Cheway,et al. 1992)。為了克隆水稻中的抗逆相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因， 首先合成了相關(guān)的順式元件，將它們插入到大腸桿菌-酵母穿梭質(zhì)粒 pLGA-265UPl中(Guarente，et al. 1983)，構(gòu)建魚(yú)傳質(zhì)粒，將兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化 酵母，通過(guò)/"cZ基因的表達(dá)來(lái)篩選轉(zhuǎn)錄因子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種水稻中與耐冷相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因。 所說(shuō)的水稻耐冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因，是i C萬(wàn)i^，它具有SEQIDNO.l的序列。
上述的轉(zhuǎn)錄因子基因編碼的蛋白質(zhì)，它具有SEQIDN0.2的氨基酸序列。 能與CCGAC順式元件結(jié)合。
上述的轉(zhuǎn)錄因子基因AC^^V能用于植物轉(zhuǎn)化，提高植物的耐冷和耐高鹽 的能力?？稍谂嘤屠浜湍透啕}的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
上述所說(shuō)的水稻耐冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因及CSiW，是通過(guò)以下方法得到-
(1) 合成一個(gè)具有SEQ IDNO.3序列的順式元件；將該順式元件通過(guò)^0 I和位點(diǎn)插入到pG221質(zhì)粒(引自上海農(nóng)科院)，該質(zhì)粒是來(lái)自大腸桿 菌-酵母穿梭質(zhì)粒pLGA-265UPl(Guarente， etal. 1983)，替換其中的CCAAT盒， 構(gòu)建用于酵母單雜交篩選的魚(yú)餌質(zhì)粒pLG cold;
(2) 采用SMARTcDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒構(gòu)建水稻冷害誘導(dǎo)的表達(dá)文庫(kù)； 將cDNA連接到經(jīng)酶切處理好的pPC86載體(Chevray， etal. 1992)，連接產(chǎn) 物利用電擊儀高效轉(zhuǎn)化DH5(x感受態(tài)中；
(3) 采用酵母單雜交方法將以上(1)和(2)的兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母， 通過(guò)/acZ基因的表達(dá)篩選轉(zhuǎn)錄因子。
(4) 通過(guò)核苷酸序列測(cè)定篩選的水稻cDNA的表達(dá)質(zhì)粒，獲得插入載體 中的水稻序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，搜索到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中CBF/DREB類 轉(zhuǎn)錄因子的核苷酸序列與其同源關(guān)系最近，二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖(圖3)顯示其 氨基酸序列與AP2類轉(zhuǎn)錄因子保守的DNA結(jié)合域同源關(guān)系很近，說(shuō)明其屬 于AP2類轉(zhuǎn)錄因子。進(jìn)化樹(shù)(圖4)分析則表明其是屬于AP2類轉(zhuǎn)錄因子的 亞族DREB類轉(zhuǎn)錄因子。CBF/DREB類轉(zhuǎn)錄因子為一類耐冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子， 因此將其歸入CBF類轉(zhuǎn)錄因子，并命名為RCBF4。認(rèn)為其為水稻中與耐冷相 關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2;編碼該轉(zhuǎn)錄因子的基因的堿 基序列如SEQIDNO.l。
本發(fā)明獲得的耐冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ACSF4基因，分別用^W2M和&cl進(jìn) 行雙酶切后，通過(guò)T4 DNA連接酶將它與含有雙35S啟動(dòng)子的pCAMBIA1301(BioForge公司)植物表達(dá)載體連接，經(jīng)酶切鑒定和序列測(cè)定獲得了含有目 的基因及C^i^的重組質(zhì)粒pCAM RCBF4。該表達(dá)載體還包含Gf/S報(bào)告基因 和潮霉素抗性標(biāo)記基因。
本發(fā)明利用電擊法將重組質(zhì)粒pCAMRCBF4導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中，根癌農(nóng) 桿菌菌株包括EHA105， LBA4404, GV3101， AGL-1 (Sambrook， etal. 1989; 本實(shí)驗(yàn)室保存)。通過(guò)農(nóng)桿菌蘸花法將耐冷相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及CS7^基因轉(zhuǎn)化 到擬南芥中(Clough，etal. 1998)，然后驗(yàn)證了轉(zhuǎn)基因植物提高了對(duì)冷和高鹽 的耐受性。
本發(fā)明的耐冷基因是能夠針對(duì)性獲得調(diào)控植物耐冷和耐高鹽的轉(zhuǎn)錄因子 基因；且該抗逆基因來(lái)自植物本身，對(duì)環(huán)境影響較小。


圖1用于篩選耐冷轉(zhuǎn)錄因子基因的酵母魚(yú)餌質(zhì)粒的構(gòu)建。
圖2耐冷轉(zhuǎn)錄因子基因i C^F4與冷應(yīng)答順式元件的結(jié)合特性。
其中，A為結(jié)合前；B為結(jié)合后。
圖3為RCBF4與AP2類轉(zhuǎn)錄因子保守的DNA結(jié)合域比對(duì)以后所作的二級(jí)結(jié) 構(gòu)示意圖
圖4為RCBF4與AP2類轉(zhuǎn)錄因子保守的DNA結(jié)合域比對(duì)以后所作的進(jìn)化樹(shù) 圖5擬南芥轉(zhuǎn)化ACBi^基因后表現(xiàn)出耐冷性提高的實(shí)驗(yàn) 圖6擬南芥轉(zhuǎn)化7 GBi^基因后表現(xiàn)出耐鹽性提高的實(shí)驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明， 一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解 的含義。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為 了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述 的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。
以下為所用到的生物材料
pLGA-265UPl(G彥nte， 1983);
pG221(由上海農(nóng)科院生物中心提供)；根癌農(nóng)桿菌EHA105 (Hood, Gelvin， 1993); LBA4404(Holtorf， et al. 1995); GV3101 ( Koncz and Schell, 1986); AGL-1 (Lazo, et al. 1991)(本實(shí)驗(yàn)室保存， 可向公眾提供20年)
實(shí)施例l:冷應(yīng)答順式元件的全合成及魚(yú)餌質(zhì)粒構(gòu)建
利用PCR將兩個(gè)完全一樣的順式元件串聯(lián)。在串聯(lián)的順式元件5'端加入 Iol酶切位點(diǎn)，3'端加入^m/ZI位點(diǎn)。串聯(lián)后的順式元件長(zhǎng)度為107bp。 該順式元j牛序歹U為ACCCTCGAGTCTAGAGTCGACATATGCCGCGGA
GCGGCCGCATGCATCCCGGGATCCTG。 ( SEQ ID NO.3 )
構(gòu)建策略如圖1，以pG221為出發(fā)質(zhì)粒，pG221質(zhì)粒是由帶有/acZ報(bào)告 基因、URA選擇標(biāo)記和2u復(fù)制序列的大腸桿菌一釀酒酵母穿梭質(zhì)粒 pLGA-265UPl改造而來(lái)，細(xì)菌/acZ報(bào)告基因由釀酒酵母Cyc/的基本啟動(dòng)子 控制，順式元件的DNA片段作為魚(yú)餌置于qyc/的基本啟動(dòng)子上游，調(diào)節(jié)/acZ 基因的表達(dá)。將順式元件的DNA片段插入到質(zhì)粒pG221中，替換其中的 CCAAT盒，構(gòu)建用于酵母單雜交篩選的魚(yú)餌質(zhì)粒pLGcold。 實(shí)施例2:水稻cDNA庫(kù)構(gòu)建。
取15天苗齡的水稻幼苗，品種為IR36，經(jīng)0'C低溫處理8小時(shí)后，液氮 速凍，放置-70'C冰箱中保存以備提取總RNA。酵母表達(dá)載體質(zhì)粒pPC86購(gòu) 自Invitrogen公司；cDNA建庫(kù)試劑盒SMART cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒為 Clontech公司產(chǎn)品；DNA柱回收試劑盒購(gòu)置Amersham公司；總RNA抽提 采用QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini Kit提取；各種限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶均購(gòu)自上海Takara公司。
水稻cDNA的合成及cDNA文庫(kù)的構(gòu)建按Clontech公司SMART cDNA Library Construction Kit說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行第一鏈合成。
以合成的cDNA第一鏈為模板，以GAL4 5'AAAGTCGACGGATGTT TAATACCACT和TAD4 5,AAAGCGGCCGCTTGATTGGAGACTTGACC為 引物，利用LD-PCR進(jìn)行cDNA擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)熱1 min; 94°C, 30 s， 60°C， 30 s， 72°C, 3 min。共20個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后，酚氯仿 抽提，再加入2倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀。沉淀用30^1水溶解，各加入lpl 和7W^I酶切消化，DNA柱回收大于400 bp的cDNA。將cDNA連接 到經(jīng)上述酶切處理好的pPC86載體，連接產(chǎn)物利用電擊儀高效轉(zhuǎn)化DH5a感 受態(tài)中。
實(shí)施例3:水稻中與冷應(yīng)答順式元件DNA結(jié)合蛋白cDNA篩選 將魚(yú)餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞 EGY48 ( MATa,his3 trpl ura3-521eu::pLeu2-LexA叩6)，轉(zhuǎn)化子在無(wú)尿嘧啶的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)(Ito ,et al. 1983; Gietz，eta1.2006)。
制備含魚(yú)餌質(zhì)粒的酵母感受態(tài)細(xì)胞，每次將50pg含水稻cDNA庫(kù)的 pPC86質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到感受態(tài)酵母細(xì)胞中，在不含尿嘧啶和色氨酸的SC培 養(yǎng)基上培養(yǎng)，從而選擇帶有魚(yú)餌質(zhì)粒和插入有水稻cDNA的pPC86質(zhì)粒的酵 母轉(zhuǎn)化子。3(TC培養(yǎng)48小時(shí)后，利用硝酸纖維素膜將生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子影印到含 有X-gal的平板上進(jìn)行顯色反應(yīng)(如圖2，圖中B顯示，結(jié)合后出現(xiàn)藍(lán)色菌落)， 挑取藍(lán)色的酵母菌落。
實(shí)施例4:酵母陽(yáng)性克隆中帶水稻cDNA的pPC86質(zhì)粒的鑒定 為了排除初篩得到的藍(lán)色酵母中存在的假陽(yáng)性現(xiàn)象，抽提每一個(gè)酵母陽(yáng) 性菌落的DNA，用電擊法將酵母DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MC8菌株(氨基酸缺 陷型thi-，trp-, ura-，leu-,his-)細(xì)胞中(Qin, et al. 2007)，先在含氨芐青霉素的 2YT平板上培養(yǎng)，然后影印到不含色氨酸的M9培養(yǎng)基上培養(yǎng)。由于pPC86 質(zhì)粒上帶有編碼TRP合成酶的標(biāo)記基因，因此在不含色氨酸的平板上生長(zhǎng)的 細(xì)菌為含有插入水稻cDNA的pPC86載體。從大腸桿菌MC8菌株中抽提質(zhì) 粒DNA，將其轉(zhuǎn)化含有魚(yú)餌質(zhì)粒的酵母菌株EGY48，轉(zhuǎn)化子置于X-gal平板 上進(jìn)行顯色反應(yīng)，挑選能重復(fù)變藍(lán)色的酵母菌落。
水稻轉(zhuǎn)錄因子cDNA的核苷酸順序測(cè)定，推測(cè)氨基酸順序和功能分析。 抽提確認(rèn)為陽(yáng)性菌落的酵母菌株DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5oc，抽提其中的質(zhì) 粒(含有插入水稻cDNA的pPC86載體)，利用pPC86載體上的通用引物進(jìn)行序列測(cè)定。根據(jù)DNA測(cè)序結(jié)果，到數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI里進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這 個(gè)基因跟CBF/DREB類轉(zhuǎn)錄因子同源關(guān)系最近，因此我們將其歸入CBF類轉(zhuǎn)錄 因子，因這個(gè)基因是從水稻中克隆出來(lái)的，因此將其命名為沉SW 。 RCBF4 與AP2類轉(zhuǎn)錄因子保守的DNA結(jié)合域比對(duì)以后所作的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖及進(jìn)化 樹(shù)如圖3和圖4。最終獲得與冷應(yīng)答順式元件結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子基因RCBF4， 氨基酸順序?yàn)镾EQ IDN0.2。
實(shí)施例5:轉(zhuǎn)錄因子基因7 C萬(wàn)i^植物表達(dá)載體構(gòu)建
首先通過(guò)PCR方法將i C^^基因擴(kuò)增，并在基因的兩端加入BamM和 ^cl酶切位點(diǎn)，將PCR片段回收，進(jìn)行T/A克隆和序列測(cè)定，獲得含有i CBi^ 基因片段的質(zhì)粒pRCBF4。抽提pRCBF4質(zhì)粒，分別用5amM和5WcI進(jìn)行 雙酶切，分別回收DNA片段，通過(guò)T4DNA連接酶將AC57^基因與含有雙 35S啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體pCAMBIA1301質(zhì)粒連接(Ohta,etal. 1990)，酶切 鑒定和序列測(cè)定獲得了含有目的基因i C^i^的重組質(zhì)粒pCAM RCBF4。該 表達(dá)載體還包含Gt/S報(bào)告基因和潮霉素抗性標(biāo)記基因。
實(shí)施例6:農(nóng)桿菌培養(yǎng)和植物轉(zhuǎn)化 農(nóng)桿菌菌株為根癌農(nóng)桿菌EHA105， LBA4404， GV3101， AGL-1菌株。質(zhì)粒 pCAM RCBF4經(jīng)電擊法導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。挑取單菌到25 ml YEB培養(yǎng)基(50mg/1 利福平)培養(yǎng)過(guò)夜，取5ml菌液轉(zhuǎn)接到100mlYEB培養(yǎng)基(50mg/1利福平)， 培養(yǎng)至OD600 = 0.7-0.8，菌液冰上放置10 min， 5000 rpm離心10 min ， 4°C ， 收集菌體，加入100ml無(wú)菌雙蒸水清洗兩次。加入4mll0y。甘油懸浮菌體， 轉(zhuǎn)到50 ml離心管。5500 rpm離心10 min ， 4°C 。收集菌體，加入500 pl 10°/。 甘油懸浮菌體，轉(zhuǎn)到1.5ml離心管。取70nl感受態(tài)細(xì)胞，加入lpl重組質(zhì)粒 pCAM RCBF4。用去頭的槍頭混勻，轉(zhuǎn)到O.lcm電擊杯中。電擊參數(shù)200 Q， 1.7 KV， 2.5F，電擊后立即加入800nlSOC培養(yǎng)液。培養(yǎng)1小時(shí)后，取 100pl涂抗性板篩選轉(zhuǎn)化子，28'C培養(yǎng)。
植物轉(zhuǎn)化采用蘸花法將含目的質(zhì)粒的不伺菌株的農(nóng)桿菌單菌落接種在5 ml含各菌株相對(duì)應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中28'C培養(yǎng)2天。取5 ml菌液轉(zhuǎn)到500 ml的液體LB培養(yǎng)基中28'C培養(yǎng)16-24 h (OD=1.5-2.0).液體可以在4'C 保存30天。室溫下離心收集菌體，4000 g離心10min。用等體積5%的新鮮 蔗糖溶液懸浮。加入0.02y。的Silwet-77混勻后置于燒杯中。轉(zhuǎn)化時(shí)將擬南芥 倒置后浸入菌液中約10 s，蓮座和花序都要侵染，侵染后使吸附于植株上的 菌液空氣干燥3-5秒，用保鮮膜罩住擬南芥，以保持濕潤(rùn)環(huán)境，水平放置22'C 下避光培養(yǎng)，24 h后去掉保鮮膜直立培養(yǎng)。每個(gè)菌株用300 ml轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)2-3 盆。隔7天后再轉(zhuǎn)化1次。轉(zhuǎn)化后不要放置在高溫和強(qiáng)光下，揭開(kāi)保鮮膜后 要保持一定濕度，再生長(zhǎng)1個(gè)月后收種子。利用50 pg/mL潮霉素進(jìn)行轉(zhuǎn)化 植株篩選。
實(shí)施例7:轉(zhuǎn)錄因子基因WCSi^轉(zhuǎn)化植物后的抗逆分析 將轉(zhuǎn)基因擬南芥自交純合3代，獲得3個(gè)純合轉(zhuǎn)化株系(8217-l，-2，-4)的種 子。播種后，幼苗生長(zhǎng)10-20天，轉(zhuǎn)入4'C低溫馴化24h，然后轉(zhuǎn)入一20'C處 理30min，然后再移置到正常溫度，觀察植物的耐冷效果。如圖5所示，正 常溫度下生長(zhǎng)的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥在長(zhǎng)勢(shì)和長(zhǎng)相上沒(méi)有明顯差別，而在 -2(TC生長(zhǎng)30 min后轉(zhuǎn)入正常溫度生長(zhǎng)時(shí),野生型對(duì)照和轉(zhuǎn)化株系的表現(xiàn)都有 不同程度的死亡和復(fù)活，但存活率明顯不同,野生型只有33.3%，而轉(zhuǎn)化株系 表現(xiàn)58.3-75%的存活率。結(jié)果表示轉(zhuǎn)基因系植株提高了耐冷能力。
將轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代純合種子分別鋪在含有OmM NaCl、 75mM NaCl、 lOOmMNaCl的培養(yǎng)基上，每天統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，觀察植物的耐高鹽效果。如圖6 所示，在無(wú)外加NaCl的情況下,野生型和轉(zhuǎn)基因系的萌發(fā)率沒(méi)有差別，在5 天后均達(dá)到95%以上。在75mMNaCl濃度下，野生型與轉(zhuǎn)基因系的萌發(fā)率則 表現(xiàn)明顯差別，野生型5天后萌發(fā)率僅40%,而轉(zhuǎn)基因系為65-80%, 10天后 野生型為60%，轉(zhuǎn)基因系為90%以上。100mMNaCl濃度下，野生型5天后 萌發(fā)率僅20%，而轉(zhuǎn)基因系為38-52%， 10天后野生型為50%,轉(zhuǎn)基因系為 90%。可見(jiàn)轉(zhuǎn)基因系植株明顯提高了耐鹽能力。SEQUENCE LISTING 〈110〉揚(yáng)州大學(xué)
〈120〉一種水稻耐冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因及其應(yīng)用 <160〉3
<210>1
<211〉762
<212〉DNA
〈213>水稻(O，爐-vo! L.)
<400〉1
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3g762
〈210〉2
〈211>254
〈212>PRT
〈213〉水稻(C^ya rf/va L.) 〈400〉2<formula>formula see original document page 13</formula>Leu Thr Met lie Thr His His Leu Phe Gin Trp Arg Arg 241 245 250
<210〉3 〈211>107 <212〉DNA <213〉人工序列
〈400〉1
accctcgagt ctagagtcga catatgccgc ggatatctag aggccgacct gatggccgac 60 ctgatggccg atcgatccat ggcggccgca tgcatcccgg gatcctg 10權(quán)利要求
1、一種水稻耐冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因，其特征在于，它具有SEQ ID NO.1的堿基序列。
2、 一種由權(quán)利要求l所述的轉(zhuǎn)錄因子基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于， 它具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
3、 權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子基因用于植物轉(zhuǎn)化，提高植物的耐冷和耐 高鹽的能力。
全文摘要
本發(fā)明屬于作物遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及一種與水稻耐冷相關(guān)的基因及其應(yīng)用。所說(shuō)的水稻耐冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因，它具有SEQ ID NO.1的堿基序列。該轉(zhuǎn)錄因子基因RCBF4能用于植物轉(zhuǎn)化，提高植物的耐冷和耐高鹽的能力。該抗逆基因來(lái)自植物本身，對(duì)環(huán)境影響較小。
文檔編號(hào)C07K14/415GK101429511SQ200810243070
公開(kāi)日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2008年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月28日
發(fā)明者姚泉洪, 揚(yáng) 張, 彭日荷, 洪義歡, 熊愛(ài)生, 陳建民 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)