專利名稱：：新型抗微生物肽的制作方法新型抗微生物肽相關(guān)申請的交叉參考本申請要求2007年1月16日提交的USSN60/880,783的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過參考結(jié)合于此。國立資助的研究與開發(fā)下進行的發(fā)明權(quán)利的聲明本發(fā)明部分地得到國立衛(wèi)生研究院(NationalInstituteofHealth)的資助，授權(quán)號為MD01831。政府在本發(fā)明中擁有一定的權(quán)益。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及抗微生物化合物領(lǐng)域。具體說，本發(fā)明涉及能夠有效對抗變異鏈球菌0^"印tococc^m"tora)及其他細菌的新型抗微生物肽的鑒別。發(fā)明背景近年來，由于抗微生物肽(AMPs)具有針對包括耐藥菌在內(nèi)的廣譜菌屬的強效殺傷活性而成為抗生素替代品的最前沿。AMPs是在單細胞和多細胞生命型中發(fā)現(xiàn)的一類具有內(nèi)在免疫性的遺傳共同分子(Tossi等，(2000)55:4-30;Diamond(2001)fi/o/og/W(London)48:209-212;Lehrer和Ganz(2002)C群.(9一./麗腳/.14:96-102;Brogden等，(2003)M.J.愈/w/cr凌」ge;^22:465-478)。雖然它們在肽序列和翻譯后修飾(線性，環(huán)狀等)方面存在顯著不同，大多數(shù)AMPs能夠通過破壞脂質(zhì)膜而殺傷細菌，雖然該機制的細節(jié)似乎存在很大差異(Shai(2002)5/o;o(yme"66:236-248;Brogden(2005)Ato.Tev.M/croWo/.3:238-250)。過去的研究已經(jīng)證明AMP功能中基本疏水和正電荷特性的關(guān)鍵作用，包括在許多AMPs中發(fā)現(xiàn)的芳族Trp和正電荷Arg殘基的顯著貢獻(Chan等，(2007)S/o//zj^51(4):1351-1359;Wei等，(2006)乂5"cfe〃》/.188:328-334)。雖然AMP較小(大多數(shù)AMP不到50個氨基酸)，但其二級結(jié)構(gòu)似乎也對其活性發(fā)揮重要作用。某些線性AMP與類似細菌膜的疏水環(huán)境(例如去污劑或脂質(zhì)囊泡)相互作用時可能采取OC-螺旋或P-折疊構(gòu)型，提示這種構(gòu)型變化是抗微生物功能所必需的(Kiyota等，(1996)35:13196-13204;Wei等，(2006)188:328-334;Wimmer等，(2006)5/oc/em/^o;45:481-497)。此外，膜-活性a-螺旋(及其他結(jié)構(gòu))似乎要求殘基的兩性空間排列，即在肽表面兩側(cè)的疏水性梯度(Kiyota等，(1996)35:13196-13204;Shai(1999)歷ocA/m5/0;7/y^1462:55-70;Lee(2002)C^r尸/zwmZ)^8:795-813)。過去，抗微生物肽的合理設(shè)計主要集中在改變現(xiàn)有的天然序列，或者通過大型組合文庫開發(fā)新型肽(Kiyota等，(1996)5/oc/zem/Wo;35:13196-13204;Blondelle禾卩Lohner(2000)所opo/jwe"55:74-87;Hong等，(2001)尸e/"tfey22:1669-1674;Sawai等，(2002)尸她/"15:225-232)。這些努力提供了關(guān)于AMP構(gòu)效關(guān)系的有價值信息。變異鏈球菌是一種常見的口腔病原體，可導(dǎo)致齲齒，即使不斷努力去除或根除，它們?nèi)匀槐Ａ粼谘例X上，甚至越發(fā)繁茂。非常需要對抗該生物體的新型治療劑，因為飲食中糖的存在使得變異鏈球菌成為牙齒表面的頑固菌落，即使專用機械去除(刷牙)和一般抗菌努力，它們?nèi)匀槐Ａ粼诳谇晃⑸锶?稱為牙菌斑)中(Keene和Shklair(1974)i仏53:1295)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及新型抗微生物肽的發(fā)現(xiàn)。在某些實施方式中，這些肽具有對抗革蘭氏陽性菌的顯著活性，尤其是對抗口腔中的革蘭氏陽性菌(》/7，^異鏈五，熟。這些肽可用于配制各種抗微生物組合物和/或用于與預(yù)防或減少齲齒的發(fā)生。因此，在某些實施方式中，本發(fā)明提供了一種抗微生物肽，該肽包含以下氨基酸基序或以下氨基酸基序的環(huán)狀變換(1^C'(^tftfcSl^HS(^cS)n，其中n為1-5并以0.1為單位遞增；H1，H2，H3，114和115獨立地選自疏水性或親水性氨基酸；C1，C2，C3，d和CS獨立地選自不帶電的氨基酸、正電荷氨基酸或負電荷氨基酸；該肽形成a螺旋；并且，該肽能有效殺傷或抑制培養(yǎng)物中變異鏈球菌的生長和/或增殖。在某些實施方式中，C1、C2、C3、d和(35獨立地選自正電荷氨基酸，或負電荷氨基酸。在某些實施方式中，不帶電的氨基酸獨立地選自S，T和Y(或其類似物、衍生物或保守取代)，和/或正電荷氨基酸獨立地選自K，R和H(或其類似物、衍生物或保守取代)，和/或負電荷氨基酸s獨立地選自N，Q，D和E(或其類似物、衍生物或保守取代)，和/或疏水性或親水性氨基酸獨立地選自L、I、V、W和F(或其類似物、衍生物或保守取代)。在某些實施方式中，該肽在生理學pH下具有至少+3的凈正電荷。在某些實施方式中，n為1.1;所述肽包含基序H^cWtfcWHVcSH6,其中HM蟲立地選自疏水性氨基酸。示例性的n=l.l的肽包括但不限于FKKFWKWFRRF(SEQIDNO:31)(B-33)，LKRFLKWFKRF(SEQIDNO:32)(B陽34)，KLFKR籃HLFR(SEQIDNO:33)(B-35)，RLLKRFKHLFK(SEQIDNO:34)(B-36)，F(xiàn)KTFLKWLHRF(SEQIDNO:35)(B-37)，IKQLLHFFQRF(SEQIDNO:36)(B-38)，KLLQTFKQIFR(SEQIDNO:37)(B陽39)，RILKELKNLFK(SEQIDNO:38)(B-40)，LKQFVHFIHRF(SEQIDNO:39)(B-41)，VKTLLHIFQRF(SEQIDNO:40)(B-42)，KLVEQLKEIFR(SEQIDNO:41)(B-43),RVLQEIKQILK(SEQIDNO:42)(B-44)，VKNLAELVHRF(SEQIDNO:43)(B-45)，ATHLLHALQRF(SEQIDNO:44)(B-46),KLAENVKEILR(SEQIDNO:45)(B-47)，RALHEAKEALK(SEQIDNO:46)(B-48)，F(xiàn)HYFWHWFHRF(SEQIDNO:47)(B-49)，LYHFLHWFQRF(SEQIDNO:48)(B-50),YLFQTWQHLFR(SEQIDNO:49)(B-51)，YLLTEFQHLFK(SEQIDNO:50)(B-52)，F(xiàn)KTFLQWLHRF(SEQIDNO:51)(B-53)，IKTLLHFFQRF(SEQIDNO:52)(B-54)，KLLQTFNQIFR(SEQIDNO:53)(B-55)，TILQSLKNIFK(SEQIDNO:54)(B-56)，LKQFVKFIHRF(SEQIDNO:55)(B-57)，VKQLLKIFNRF(SEQIDNO:56)(B-58)，KLVQQLKNIFR(SEQIDNO:57)(B-59)，RVLNQVKQILK(SEQIDNO:58)(B-60)，VKKLAKLVRRF(SEQIDNO:59)(B-61)，AKRLLKVLKRF(SEQIDNO:60)(B-62)，KLAQKVKRVLR(SEQIDNO:61)(B-63)和RALKRIKHVLK(SEQIDNO:62)(B-64)。在某些實施方式中n為1.4;所述肽包含基序HWC2112113(^114115(34(]^6(36(^117，其中116和Hl蟲立地選自疏水性氨基酸，C614和d獨立地選自正電荷或負電荷氨基酸。示例性的n=1.4的肽包括但不限于KLKKLLKKLKKLLK(SEQIDNO:64)(a-5)，LKLLKKLLKLLKKF(SEQIDNO:65)(a陽6)，LQLLKQLLKLLKQF(SEQIDNO:66)(a-7)，RWRRWWRHFHHFFH(SEQIDNO:68)(a隱9)，KLKKLLKRWRRWWR(SEQIDNO:69)(a-10)，RWRRLLKKLHHLLH(SEQIDNO:70)(a-11)禾口KLKKLLKHLHHLLH(SEQIDNO:71)(a-12)。在某些實施方式中，抗微生物肽(AMP)是包括7個毗連氨基酸的肽，其中除兩個氨基酸外的所有其他氨基酸均為Arg或Trp、或其衍生物或類似物；兩個非-Arg或Trp氨基酸是Lys或Phe、或其衍生物或類似物；N-末端殘基是Arg或其衍生物或類似物。在各個實施方式中，除兩個氨基酸外的所有其他氨基酸均為Arg或Trp(或其衍生物或類似物)；兩個非-Arg或Trp氨基酸是Lys或Phe(或其衍生物或類似物)；N-末端殘基是Arg(或其衍生物或類似物)。在某些實施方式中，肽包含選自下組的氨基酸序列RRRRWWW(SEQIDNO:72)(IC-I)，RRWWRRW(SEQIDNO:73)(1C曙2)，RRRWWWR(SEQIDNO:74)(1C-3),RWRWRWR(SEQIDNO:75)(lC-4)，RRRFW徵(SEQIDNO:76)(2C-1)，RRWWRRF(SEQIDNO:77)(2C-2)，RRRWWWF(SEQIDNO:78)(2C-3)，RWRWRWF(SEQIDNO:79)(2C-4)，RRRRWWK(SEQIDNO:80)(3C-1)，RRWWRRK(SEQIDNO:81)(3C-2)，RRRWWWK(SEQIDNO:82)(3C-3)，RWRWRWK(SEQIDNO:83)(3C-4)，RRRKWWK(SEQIDNO:84)(4C-1)，RRWKRRK(SEQIDNO:85)(4C陽2)，RRRKWWK(SEQIDNO:86)(4C-3沐RWRKRWK(SEQIDNO:87)(4C-4)。還提供了酸活化的抗微生物肽(AMP)，包括長度約7-11個氨基酸的兩性螺旋肽，其中大多數(shù)帶電殘基(超過一半)是在酸性pH下具有正電荷的His或其衍生物或類似物，這些pH下該肽基本上沒有抗微生物活性，但在酸性pH下具有針對變異鏈球菌的抗微生物活性。在某些實施方式中，所有帶電殘基是在酸性pH(例如pH6或更低)下具有正電荷的His或其衍生物或類似物。在某些實施方式中，肽包括HH和FF的交替重復(fù)。在某些實施方式中，肽的一端或兩端包括氨基酸序列KLLK(SEQIDNO:166)。在一端或兩端具有KLLK(SEQIDNO:166)的某些實施方式中，KLLK通過接頭(如，GAT，SEQIDNO:167)連接于末端。在某些實施方式中，肽包含氨基酸序列FHFFHHFFHFFHHF(SEQIDNO:168)。示例性的酸活化AMP包括但不限于HHFFHHFHHFFHHF(SEQIDNO:109)(AA-l)，F(xiàn)HFFHHFFHFFHHF(SEQIDNO:110)(AA-2)，KLLKGATFHFFHHFFHFFHHF(SEQIDNO:111)(AA-3)，KLLKFHFFHHFFHFFHHF(SEQIDNO:112)(AA-4)，F(xiàn)HFFHHFFHFFHHFKLLK(SEQIDNO:113)(AA-5)，F(xiàn)HYFWHWFHRF(SEQIDNO:114)(AA-6)禾口LYHFLHWFQRF(SEQIDNO:115)(AA-7)。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了殺傷文庫#7AMP。這些肽包括LKQKLKILF(SEQIDNO:116(S6L1-2)，LKQLKAGIY(SEQIDNO:117)(S6Ll-3)，VGKCVKLLY(SEQIDNO:118)(S6Ll-4)，KFVKLILAY(SEQIDNO:119)(S6Ll-5)，KLVKLVFLY(SEQIDNO:120)(S6Ll-6)，IKVFAKQKY(SEQIDNO:121)(S6Ll-7)和RFRHFQERY(SEQIDNO:122)(S6L1陽8)。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了(3-缺失文庫AMP。這些肽包括FVFRHKWVWKHRFLF(SEQIDNO:123)(S3L8-1)，VFIVWVHKHVLF(SEQIDNO:124)(S3L8-2)，WRWRARWRWRLRWRF(SEQIDNO:125)(S3L8-3)，WR1HLRARLHVKFRF(SEQIDNO:126)(S3L8-4)，LRIHARFKVHIRLKF(SEQIDNO:127)(S3L8-5)，F(xiàn)HIKFRVHLKVRFHF(SEQIDNO:128)(S3L8-6)，F(xiàn)HVKIHFRLHVKFHF(SEQIDNO:129)(S3L8陽7)，LHIHAHFHVHIHLHF(SEQIDNO:130)(S3L8-8)，F(xiàn)KIHFRLKVHIRFKF(SEQIDNO:131)(S3L8-9)，F(xiàn)KAHIRFKLRVKFHF(SEQIDNO:132)(S3L8-10)，LKAKIKFKVKLKIKF(SEQIDNO:133)(S3L8-11)，WIWKHKFLHRHFLF(SEQIDNO:134)(S3L8-12)，VFLHRHVIKHKLVF(SEQIDNO:135)(S3L8-13)，F(xiàn)LHKHVLRHRIVF(SEQIDNO:136)(S3L8-14),VFKHKIVHRHILF(SEQIDNO:137)(S3L8-15),FLFKHLFL服FF(SEQIDNO:138)(S3L8-16)，LFKHILIHRVIF(SEQIDNO:139)CS3L8-17)，F(xiàn)LHKHLFKHKLF(SEQIDNO:140)(S3L8-18)，VFRHRFIHRHVF(SEQIDNO:141)(S3L8-19)，F(xiàn)IHKLVHKHVLF(SEQIDNO:142)(S3L8-20)，VLRHLFRHRIVF(SEQIDNO:143)(S3L8-21)，LVHKLILRHLLF(SEQIDNO:144)(S3L8-22)，VFKRVLIHKLIF(SEQIDNO:145)(S3L8-23)，IVRKFLFRHKVF(SEQIDNO:146)(S3L8-24)，VLKHVIAHKRLF(SEQIDNO:147)(S3L8-25)，F(xiàn)IRKFLFKHLF(SEQIDNO:148)(S3L8-26)，VIRHVWVRKLF(SEQIDNO:149)(S3L8-27)，F(xiàn)LFRHRFRHRLW(SEQIDNO:150)(S3L8-28)，LFLHKHAKHKFLF(SEQIDNO:151)(S3L8-29)，F(xiàn)KHKFKHKFIF(SEQIDNO:152)(S3L8-30)，LRHRLRHRLIF(SEQIDNO:153)(S3L8-31),LILKFLFKFVF(SEQIDNO:154)(S3L8-32)，VLIRILVRVIF(SEQIDNO:155)(S3L8-33)，F(xiàn)RHRFRHRF(SEQIDNO:156)(S3L8-34)，LKHKLKHKF(SEQIDNO:157)(S3L8-35),FKFKHKLIF(SEQIDNO:158)(S3L8-36)，LRLRHRVLF(SEQIDNO:159)(S3L8-37)，F(xiàn)KFLFKFLF(SEQIDNO:160)CS3L8-38)，LRLFLRWLF(SEQIDNO:161)(S3L8-39),FKFLFKHKF(SEQIDNO:162)(S3L8-40),LRLFLRHRF(SEQIDNO:163)(S3L8-41),FKFLFKF(SEQIDNO:164)(S3L8-42)和LRLFLRF(SEQIDNO:165)(S3L8-43)。在某些實施方式中，本文所述的任意肽連接第二抗微生物肽(AMP)從而形成化合抗微生物肽。兩個肽可以是直接化學偶聯(lián)或通過接頭基團化學連接，或者以有或沒有肽接頭的融合蛋白的形式表達(或合成)。在某些實施方式中，第二抗微生物肽是包含以下氨基酸基序的肽或以下氨基酸基序的環(huán)狀變換(H'C^2h2h3c3h4h5c4c、，其中n為1-5，以0.1為單位遞增；h1、h2、h3、114和Hs獨立地選自疏水性或親水性氨基酸；禾nc1，c2，c3，d和cs獨立地選自中性氨基酸、正電荷氨基酸或負電荷氨基酸；或者包含7個毗連氨基酸的肽，其中除兩個氨基酸外的所有其他氨基酸為Arg或Trp、或其衍生物或類似物；兩個非-Arg或Trp氨基酸是Lys或Phe、或其衍生物或類似物；N-末端殘基是Arg或其衍生物或類似物。在某些實施方式中，第二抗微生物肽如表6、表10、表11或表12所示。在某些實施方式中，本文所述的任意肽或化合AMP還在羧基末端包含游離(例如，來自精氨酸或賴氨酸，或來自酰胺化的非-正電荷殘基)。在某些實施方式中，本文所述的任意肽或化合AMP經(jīng)聚乙二醇化。在某些實施方式中，本文所述的任意肽或化合AMP具有一個或多個保護基(^7，乙?；?、酰胺以及3-20個碳的烷基、Fmoc、Tboc、9-芴乙?；?、l-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-1-羧基、芐氧基羰基、咕噸基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧基三苯甲基(Mmt)、4-甲氧基-2,3,6-三甲基-苯磺酰基(Mtr)、均三甲基苯-2-磺?；?Mts)、4,4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)、甲苯磺?；?Tos)、2,2,5,7,8-五甲基色滿-6-磺酰基(Pmc)、4-甲基芐基(MeBzl)、4-甲氧基芐基(MeOBzl)、芐氧基(BzlO)、芐基(Bzl)、苯甲酰基(Bz)、3-硝基-2-吡啶次磺酰基(Npys)、l-(4,4-二甲基-2,6-二氧雜環(huán)亞己基(diaxocyclohexylidene))乙基(Dde)、2,6-二氯節(jié)基(2,6-DiCl-Bzl)、2-氯芐氧基羰基(2-Cl-Z)、2-溴芐氧基羰基(2-Br-Z)、芐氧基甲基(Bom)、叔丁氧基羰基(Boc)、環(huán)己氧基(cHxO)、叔丁氧基甲基(Bum)、叔丁氧基(tBuO)、叔丁基(tBu)、乙?；?Ac)和三氟乙?；?TFA)等)。在某些實施方式中，本文所述的任意肽或化合AMP中的氨基酸都是天然產(chǎn)生的氨基酸。在某些實施方式中，本文所述的任意肽包含一個或多個"D"氨基酸和/或一個或多個(3氨基酸。在某些實施方式中，用可檢測的標記(例如，酶標記、熒光標記、比色標記、自旋標記、反射性標記等)標記本文所述的任意肽或化合AMP。還提供了藥物制劑，其包含任意一種或多種本文所述抗微生物肽或化合AMP以及藥學上可接受的賦形劑。在某些實施方式中，所述制劑是單位劑量制劑。在某些實施方式中，賦形劑適合口腔粘膜給藥。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了一種健康護理產(chǎn)品，例如家用、旅行中、工作中、在牙科診所、醫(yī)院等場所使用的處方藥或非處方藥，其包含本文所述的任意一種或多種抗微生物肽或化合AMP，其中抗微生物肽和/或化合AMP包含在選自下組的產(chǎn)品中牙膏、漱口劑、牙齒增白條或溶液、隱形眼鏡儲存液、潤濕劑、或清潔溶液、牙線、牙簽、牙刷刷毛、口腔噴霧劑、口腔錠劑、鼻腔噴霧劑、口腔和/或鼻腔應(yīng)用的粉霧劑以及傷口敷料。還提供了抑制細菌(或其他病原體)的生長和/或增殖的方法。該方法通常包括使細菌或其他病原體與一種或多種本文所述的抗微生物肽和/或化合AMP相接觸，所述抗微生物肽和/或化合AMP的量足以抑制所述細菌或其他病原體的生長和/或增殖。在某些實施方式中，所述用量足以殺傷細菌。在某些實施方式中，細菌是革蘭氏陽性菌。在某些實施方式中，細菌是革蘭氏陽性口腔細菌(如，鏈球菌屬(^r印tococc^w.力。在某些實施方式中，接觸步驟包括接觸粘膜表面(例如，口腔粘膜、鼻粘膜等)。還提供了抑制齲齒形成的方法。該方法通常包括使牙齒和/或口腔粘膜與一種或多種本文所述的抗微生物肽和/或化合AMP接觸，所述抗微生物肽和/或化合AMP的量足以抑制變異鏈球菌的生長和/或增殖。在某些實施方式中，接觸步驟包括使牙齒和/或口腔粘膜與選自下組的組合物相接觸牙膏、漱口劑、增白條或溶液、錠劑、氣溶膠和拭子。在某些實施方式中，本發(fā)明的肽和/或類別通式顯然不包括肽B-33(FKKFWKWFRRF，SEQIDNO:31)。定義本文所用術(shù)語"肽"表示長度通常約為2-50個殘基的氨基酸殘基的聚合物。在某些實施方式中，肽的長度約為2、3、4、5、7、9、10或11個殘基到約50、45、40、45、30、25、20或15個殘基。在某些實施方式中，肽的長度約為8、9、10、11或12個殘基到約15、20或25個殘基。在某些實施方式中，構(gòu)成肽的氨基酸殘基是"L-型"氨基酸殘基，然而也認識到在各種實施方式中，肽中也可包含"D型"氨基酸。肽還可包括氨基酸聚合物，其中一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)的天然來源氨基酸的人工化學合成類似物，以及天然產(chǎn)生的氨基酸聚合物。此外，該術(shù)語適用于由肽連接鍵或其他"修飾的連接鍵"連接的氨基酸(例如，肽鍵被a-酯、(3-酯、硫酰胺、磷酰胺，碳酸酯(carbomate)、羥基化物等取代(參見例如，Spatola，(1983)C/zem.所oc/zem.^wom'Jc/A尸roto'm7:267-357)，酰胺被飽和胺取代(參見例如，Skiles等，美國專利4,496,542，其內(nèi)容被納入本文作為參考和Kaltenbronn等'(1990)第969-970頁，美國第11屆肽研討會(Proc.1lthAmericanPeptideSymposium),ESCOM科學出版社(ESCOMSciencePublishers),荷蘭，等))。本文所用術(shù)語"殘基"表示天然、合成或修飾的氨基酸。各種氨基酸類似物包括但不限于2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、P-丙氨酸(P-氨基丙酸)、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌啶酸(piperidinicacid)、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2,4-二氨基丁酸、鎖鏈素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、n-乙基甘氨酸、n-乙基天冬酰胺、羥基賴氨酸、別(allo)-羥基賴氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、異鎖鏈素、別-異亮氨酸、n-甲基甘氨酸、肌氨酸,、n-甲基異亮氨酸、6-n-甲基賴氨酸、n-甲基纈氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸、鳥氨酸等。這些修飾的氨基酸是示例性而非限制性的。"(3氨基酸"構(gòu)成的"P-肽"在20個標準生物學氨基酸中其氨基與|3-碳而非a-碳鍵合。唯一共同的天然來源l3氨基酸是P-丙氨酸。類肽或7V-取代的甘氨酸是肽模擬物的特殊亞型。它們與其天然肽部分密切相關(guān)，但化學結(jié)構(gòu)存在差異，其側(cè)鏈沿分子主鏈連接于氮原子，而不是a-碳(天然氨基酸連接a-碳)。本文中術(shù)語"常規(guī)"和"天然"用于肽時表示僅由天然來源的氨基酸構(gòu)成的肽Ala，Cys，Asp，Glu，Glu，Phe，Gly，His，Ile，Lys，Leu，Met，Asn，Pro，Gln，Arg，Ser，Thr，Val，Trp和Tyr。如果本發(fā)明的化合物具有與天然來源肽的生物學活性和/或特異性相關(guān)的生物學活性(例如，抗微生物活性)，該化合物"相當于"天然的肽。所得活性可與天然肽相同，大于或小于天然肽的活性。一般來說，如果N-取代的甘氨酸衍生物在親水性、疏水性、極性等方面類似于原始氨基酸，所述類肽具有基本上對應(yīng)的單體序列，其中天然氨基酸被N-取代的甘氨酸衍生物取代。因此，例如以下肽對被認為是"對應(yīng)的"Ia.Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe(血管緊張素II)(SEQIDNO:l)禾口lb.Asp-Arg-Val*-Tyr-Ile*-His-Pro-Phe(SEQIDNO:2);IIa.Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser陽Pro-Phe-Arg(緩激肽)(SEQIDNO:3)和lib:Arg-Pro-Pro-Gly-Phe*-Ser*-Pro-Phe*-Arg(SEQIDNO:4);Ilia:Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr(|3-內(nèi)啡肽)(SEQIDNO:5);禾UIllb:Gly-Gly-Phe*-Met-Ser*-Ser-Glu-Lys*-Ser-Gln-Ser*-Pro-Leu-Val*-Thr(SEQIDNO:6)。在這些例子中，"Val*"表示N-(丙-2-基)甘氨酸，"Phe"表示N-芐基甘氨酸，"Ser"表示N-(2-羥乙基)甘氨酸，"Leu"表示N-(2-甲基丙-l-基)甘氨酸和"Ile"表示N-(l-甲基丙-l-基)甘氨酸。對應(yīng)性不需要是精確的例如，N-(2-羥乙基)甘氨酸可取代Ser、Thr、Cys和Met;N-(2-甲基丙-l-基)甘氨酸可取代20Val、Leu禾卩Ile。注意在上述IIIa和IIIb中，用Se"取代Thr和Ser，雖然存在結(jié)構(gòu)差異Se"中的側(cè)鏈是一個比Ser長并且不同于Thr羥基取代位置的亞甲基。一般來說，可以用N-羥基烷基-取代的甘氨酸來取代任何極性氨基酸，用N-芐基-或N-芳垸基-取代的甘氨酸取代任何芳族氨基酸(如，Phe、Trp等)，用N-垸基-取代的甘氨酸如N-丁基甘氨酸取代任何非極性氨基酸(如，Leu、Val、Ile等)，用N-(氨基垸基)甘氨酸衍生物取代任何堿性極性氨基酸(如，Lys和Arg)。"化合抗微生物肽"或"化合AMP"表示包含兩個或更多個連接在一起的AMP的結(jié)構(gòu)。AMP可直接連接或通過接頭連接。它們可以化學偶聯(lián)，或者直接連接在一起或通過肽連接鍵連接從而形成融合蛋白。在某些實施方式中，考慮包括任何本文所述序列的氨基酸的保守取代。在各個實施方式中，一個、兩個、三個、四個或五個不同的殘基被取代。術(shù)語"保守取代"用于表示基本上不改變分子活性(例如抗微生物活性和/或特異性)的氨基酸取代。通常，保守氨基酸取代包括一個氨基酸被具有類似化學特性(例如電荷或疏水性)的另一個氨基酸取代。以下六組各自包含相互間通常保守取代的氨基酸1)丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T);2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)，谷胺酰胺(Q);4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)，組氨酸(H);5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V);和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。在某些實施方式中，也考慮與本文所述的任意序列具有至少80%，優(yōu)選至少85%或卯％，更優(yōu)選至少95%或98%序列相同性的抗微生物肽。術(shù)語"相同"或"相同"百分比表示以最大對應(yīng)性比較和比對時，用以下序列比較算法或視覺觀察測定的相同或具有特定百分比的相同氨基酸殘基的兩個或更多個序列。相對于本發(fā)明的肽，沿肽鏈全長測定序列相同性。對于序列比較，通常一個序列用作參比序列，測試序列與之進行比對。采用比較算法時，將測試和參比序列輸入計算機，然后如果需要的話設(shè)定坐標軸，并設(shè)定序列算法程序參數(shù)。然后基于設(shè)定的程序參數(shù)，由序列比較算法計算測試序列相對于參比序列的百分序列相同性。對用于比較的序列進行最佳排列，例如通過Smith和Waterman(1981)^Wv.々少/.Mai2:482的局部同源性算法，通過Needleman和Wunsch(1970)Mo/.說W.48:443的同源性排列算法，通過Pearson和Lipman(1988)Prac.AAw/.jo^.85:2444的相似性檢索方法，通過這些算法的計算機化實現(xiàn)(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA和TFASTA，威斯康星基因軟件包(WisconsinGeneticsSoftware),基因計算機組(GeneticsComputerGroup),威斯康星州麥迪遜科學路575號(575ScienceDr.，Madison,WI))，或者通過視覺觀察。術(shù)語"特異性"與肽的抗微生物活性聯(lián)用時表示，與其他相關(guān)物質(zhì)相比，該肽優(yōu)先抑制某些微生物的生長和/或增殖和/或優(yōu)先殺傷某些微生物。在某些實施方式中，優(yōu)先抑制或殺傷是指對靶物質(zhì)的作用大至少10%(,/7,LD50低10%)，優(yōu)選大至少20%、30%、40%或50%，更優(yōu)選大至少2-倍，至少5-倍，或至少10-倍。本文所用疾病的"治療"或"處理"表示預(yù)防疾病，減緩疾病的發(fā)生或發(fā)展速率，降低疾病發(fā)生的風險，防止或延緩與疾病相關(guān)癥狀的發(fā)展，減輕或終止與疾病相關(guān)的癥狀，引發(fā)疾病的完全或部分消退，或它們的一些組合。術(shù)語"基本上由……構(gòu)成"與本文所述抗微生物肽(AMP)或AMP基序聯(lián)用時表示，文庫所包括的一種或多種肽、或其變體、類似物或衍生物具有與參比肽基本上相同或更高的抗微生物活性和/或特異性。在某些實施方式中，基本上相同或更高的抗微生物活性表示對抗特定菌種(例如變異鏈球菌)時，具有至少80%，優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%參比肽的抗微生物活性。在各種實施方式中，本文采用表l所示的氨基酸縮寫。表l:氨基酸縮寫<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>組氨酸HisH高絲氨酸Hse-異亮氨酸lieI亮氨酸Leu賴氨酸LysK甲硫氨酸MetM甲硫氨酸亞砜Met(O)-甲硫氨酸甲基锍Met(S-Me)-正亮氨酸Nle-苯丙氨酸PheF脯氨酸ProP絲氨酸SerS蘇氨酸ThrT色氨酸TrpW酪氨酸TyrY纈氨酸ValV￡-氨基己酸AhxI(NH2-(CH2)5-COOH)4-氨基丁酸gAbu(NH2-(CH2)3-COOH)四氫異喹啉-3-羧酸0Lys(N(s)-三氟乙酰基)K[TFA]a-氮基異丁酸AibB附圖簡要說明圖1示出二元和a-螺旋文庫中代表性肽的a-螺旋輪突(wheelprojection)。殘基從N端到C端連續(xù)編號，疏水殘基略去。圖2A禾卩2B示出二元-a-螺旋和二元-RW融合肽的比較性殺傷。用25嗎/ml二元-a-螺旋(圖2A)或二元-RW(圖2B)融合肽或母體AMP攻擊變異鏈球菌，在加入后的各個時間點接種存活CFU。O分鐘的樣品在肽處理之前接種。所有數(shù)據(jù)點代表至少三次獨立實驗結(jié)果的平均值±標準差。發(fā)明詳述在各個實施方式中，本發(fā)明涉及具有抗微生物活性的新型肽的發(fā)現(xiàn)。在某些實施方式中，該肽能有效殺傷和/或抑制變異鏈球菌和某些其他菌種(例如，真菌類[如，白色念珠菌(CawAV/a"/Zn'c"m)等)，革蘭氏陰性菌[如，綠膿假單胞菌CP犯w&mo"asaemg/"osa)等]和革蘭氏陽性菌[如，糞腸球菌C&2ferococcws々eca//51)，金黃色酉良胺葡萄球菌(5Vrap/^/ococciwawrews)，孚L酸桿菌(/^"0^"'/^)等)的生長和/或增殖。變異鏈球菌是一種在口腔中發(fā)現(xiàn)的病原體，是導(dǎo)致齲齒形成的主要原因，是全世界普遍存在且花費巨大的感染源之一(參見例如，國立衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesofHealth)(2000)，美國口腔健康一份普通醫(yī)師的報告(ora/v4me"'ca.'a，oWo///zeSw，owgewera/)，衛(wèi)生與公共事業(yè)部(DepartmentofHealthandHumanServices),國立牙齒與顱面研究機構(gòu)(NationalInstituteofDentalandCraniofacialResearch),馬里蘭州貝斯達的國立衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD);華盛頓少H衛(wèi)生部門(WashingtonStateDepartmentofHealth)(2002)，感染疾病-齲齒(/"/e"/owD&eosey—Dewter/Car/e力，華盛頓州奧林匹亞的華盛頓州衛(wèi)生部(WashingtonStateDepartmentofHealth，Olympia，WA);Loesche(1986)T^craZw'a/尺ev.,50:353-380;Anderson和Shi(2006)尸W,DeW.28:151-153;discussion192-198等)。在美國，治療齲齒的高昂經(jīng)濟負擔，尤其對于窮苦和少數(shù)人群，以及口腔鏈球菌(包括變異鏈球菌)可能直接導(dǎo)致更嚴重的臨床結(jié)局如心臟病的證據(jù)(Doyuk等，(2002)/"/e"45:39-41;Nakano等，(2006)J.C//".M/croWo/.'44:3313-3317)進一步強調(diào)了開發(fā)該病原體其他治療手段的重要性。本發(fā)明抗微生物肽(AMP)可用于許多領(lǐng)域。例如，肽可全身或局部給藥以抑制或消除包括變異鏈球菌和其他菌株或菌種在內(nèi)的感染。在某些實施方式中，也可將抗微生物肽摻入各種保健品中。例如，可將肽摻入牙膏或漱口劑中以降低或防止口腔集落形成或再形成，從而降低齲齒形成的發(fā)生率和/或程度。在各個實施方式中，出于類似目的可將AMP摻入牙線中，或者可摻入用于拭抹牙齒和口腔粘膜的拭子中。在某些實施方式中，可將AMP加入產(chǎn)品中作為防腐劑組分，以抑制細菌集落形成和/或產(chǎn)品的降解。這些應(yīng)用是示例性而非限制性的。采用本文公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，肽可用作抗微生物制劑中的活性成分用于各種應(yīng)用，這些應(yīng)用包括但不限于制品的表面處理以對抗所述表面上的微生物生長，以及用作人和動物食品、衛(wèi)生護理產(chǎn)品、消毒劑、清潔劑、生物殺滅劑中的添加劑。I.抗微生物肽。為避免合成大量隨機肽的組合文庫，通過合理設(shè)計幾種小結(jié)構(gòu)多樣肽文庫制備具有變異鏈球菌活性的合成肽，然后篩選這些文庫的變異鏈球菌殺傷能力。在某些實施方式中，每個文庫限于限定尺寸和結(jié)構(gòu)框架的肽，每個文庫中序列遞增變化以產(chǎn)生具有各種生物化學特征的肽。這些特征包括芳族疏水殘基含量、凈正電荷和預(yù)測的兩性a-螺旋形成特性。從一些活性兩親序列系統(tǒng)性刪除殘基來構(gòu)件一個文庫(參見例如，實施例4)。另一個文庫通過取代組氨酸(His)產(chǎn)生。設(shè)計這些酸活化的肽，使其在低于pH6.0時具有活性(參見例如，實施例2)。為了進一步提高具有抗變異鏈球菌特性的肽的有效性，將來自各個文庫的大多數(shù)抗菌肽以單個分子、各種組合以及每個抗微生物區(qū)域之間具有柔性肽接頭或沒有該接頭的形式合成在一起，產(chǎn)生融合肽。與原始非偶聯(lián)分子相比，許多這些融合肽中殺傷活性提高。因此，本文所述結(jié)果提供了新型抗微生物肽和用小型經(jīng)合理設(shè)計的文庫鑒別其他抗微生物肽的新方法。有趣的是，看來該研究中活性最高的肽是一些革蘭氏陽性口腔細菌選擇性的。由于變異鏈球菌通常在體內(nèi)生物膜狀態(tài)中生長，這就激勵我們在載玻片上體外生長的變異鏈球菌生物膜中發(fā)現(xiàn)本文所述肽的活性(數(shù)據(jù)未顯示)。示例性的肽如表6所述(二元文庫，a螺旋文庫和RW文庫)。在各種實施方式中，本發(fā)明考慮肽的多聯(lián)體(整體或片段，例如下式i所示)，以及兩個肽直接連接在一起、或者通過肽接頭或化學偶聯(lián)在一起的嵌合體。在某些實施方式中(例如，二元文庫和a-螺旋文庫)，抗微生物肽包括式i的氨基酸基序或氨基酸基序的環(huán)狀變換(h'c^cWhScWhVc5^i其中n為1-5，可以0.1為單位遞增；H1、H2、H3、114和115獨立地選自疏水或親水氨基酸；C'，C2，C3，d和CS獨立地選自正電荷或負電荷氨基酸和/或在某些實施方式中，中性氨基酸；所述肽能有效殺傷或抑制培養(yǎng)物中變異鏈球菌的生長和/或增殖。在某些實施方式中，肽形成(X螺旋。在某些實施方式中，所述肽不包括氨基酸序列FKKFWKWFRRF(SEQIDNO:31)。在式I中，n以0.1為單位遞增以識別可能部分重復(fù)的基序。該過程如表2所示。表2:n以0.1為單位遞增時基序如何部分重復(fù)n<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>在某些實施方式中，利用不帶電的S、T、Y;帶正電的K、R、H;或帶負電N、Q、D、E殘基改變C位電荷。在某些實施方式中，用L、I、V、W和F氨基酸控制疏水性變化。在某些實施方式中，表6所示二元文庫肽包括式I的肽，其中n為1.1，而a-螺旋文庫肽包括式I的肽，其中n為1.4。還提供了RW文庫的肽(參見例如，表6)。在各種實施方式中，RW文庫的肽是7個、8個、9個、IO個或ll個氨基酸的肽，除2個之外的所有其他氨基酸是以任意組合排列的Arg(R)或Trp(W)(或類似物或其衍生物)。2個非-Arg或TrpRW殘基是Lys或Phe或其衍生物或類似物。在某些實施方式中，肽是七個殘基的肽，除2個之外的所有其他氨基酸是Arg或Trp(以任意組合排列)。2個非-Arg或Trp殘基是Lys或Phe或其衍生物或類似物。在各個實施方式中，RW文庫肽的N-末端殘基是精氨酸。在某些實施方式中，本發(fā)明的肽包括但不限于酸活化的肽(例如參見實施例2)，殺傷文庫#7的肽(參見例如，實施例3)和(3-刪除文庫的肽(參見例如，實施例4)。類似于上文所述，殺傷文庫#7和(3-刪除文庫中的肽由疏水和帶電氨基酸的交替簇的序列框架構(gòu)成。對于殺傷文庫#7，氨基酸的最大數(shù)目限于9，在某些實施方式中限于酰胺化的C-末端(參見例如，表11)。對于P-刪除文庫(參見例如，表12)，改變序列大小，從14到7個殘基，但所有序列限于相當?shù)膬捎H和疏水特性(數(shù)據(jù)未顯示)。組氨酸殘基的側(cè)鏈pKa接近6.0，因而在pH等于和小于6.0時帶正電，而在中性pH時不帶電。根據(jù)這一特征，我們構(gòu)建了酸活化的文庫，使得兩性螺旋形成排列(引起抗變異鏈球菌活性)可導(dǎo)致低pH環(huán)境(例如齲病損時變異鏈球菌產(chǎn)生的環(huán)境)，但肽在pH超過6.0時仍然無活性。因此，在某些實施方式中，活性抗微生物肽包括長約7-11個氨基酸的酸活化的兩性螺旋肽，其中絕大部分帶電殘基是在酸性pH時帶正電的His或其衍生物或類似物。通常在中性pH時肽幾乎沒有或者基本上沒有抗微生物活性(例如，對變異鏈球菌)，但在酸性pH(例如，pH約為6或以下，例如從約pH1.4到約pH6，從約pH2，約pH3，約pH4，或約pH5到約pH6，或約pH6.5)時具有抗微生物活性(例如對于變異鏈球菌)。在某些實施方式中，這些肽中的所有帶電殘基是在負pH時帶正電的His或其衍生物或類似物。某些酸活化的肽包括HH和FF的交替重復(fù)。在某些實施方式中，肽在一端或兩端還包含氨基酸序列KLLK(SEQIDNO:166)，或其保守取代。在某些實施方式中，肽的一端或兩端還包含氨基酸序列KLLK(SEQIDNO:166),或其保守取代，其中KLLK(SEQIDNO:166)通過接頭(i7,GAT(SEQIDNO:167)連接于末端。各種酸活化的肽包含氨基酸序列FHFFHHFFHFFHHF(SEQIDNO:168)。許多酸活化的AMP在實施例2中闡述(例如參見表10)。在各個實施方式中，任何本文所述的肽可包含天然產(chǎn)生的氨基酸，或非天然產(chǎn)生的氨基酸，包括天然產(chǎn)生的氨基酸的衍生物和類似物。此外，各種肽可包含L-型氨基酸、D-型氨基酸和/或(3-氨基酸。還應(yīng)理解，除了本文特別指出的D-型、L-型和(3-肽序列之外，本發(fā)明也考慮反和反-逆(retro-inverso)形式的各種肽。在反形式(retroform)中，序列方向反轉(zhuǎn)。在逆形式中，組成氨基酸的手性反轉(zhuǎn)(S卩，L型氨基酸變成D型氨基酸，D型氨基酸變成L型氨基酸)。在反-逆形式中，氨基酸的順序和手性都反轉(zhuǎn)。因此，例如，肽B-36(RLLKRFKHLFK，SEQIDNO:34)的反形式具有序列KFLHKFRKLLR(SEQIDNO:28)。如果B-36肽中所有氨基酸為L型，則其逆形式將包括所有D型氨基酸，反-逆形式將具有包括所有D型氨基酸的序列SEQIDNO:28。在各種實施方式中，任何本文所述的肽可具有一個或多個保護基。因此，例如，羧基末端可被酰胺化。在各個實施方式中，某些末端和/或側(cè)鏈具有一個或多個封端基團?？捎萌绫疚乃龅囊粋€或多個封端基團對C-端、和/或N-端、和/或中間殘基進行封端。許多保護基適用于該目的。這些基團包括但不限于乙?；０泛屯榛?，乙?；屯榛绕溥m用于N-端保護，而酰胺基團優(yōu)選用于羧基端保護。在某些實施方式中，保護基包括但不限于脂肪酸中的烷基鏈，丙?；?pr叩eonyl)，甲?；?。某些優(yōu)選的羧基保護基包括但不限于形成酰胺、酯和醚的保護基。在一個實施方式中，可使用乙?；Ｗo氨基端，用酰胺基團保護羧基端。這些封端基團提高的肽的螺旋形成傾向。某些尤其優(yōu)選的封端基團包括各種長度的垸基，例如具有通式CH3-(CH2)n-CO-的基團，其中n約為1-20，優(yōu)選約1-16或18，更優(yōu)選約3-13，最優(yōu)選約3-10。其他合適的保護基包括但不限于Fmoc、叔丁氧基羰基G-BOC)、9-芴乙?；?、l-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-l-羧基、芐氧基羰基、噸基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧基三苯甲基(Mmt)、4-甲氧基-2,3,6-三甲基-苯磺酰基(Mtr)、均三甲基苯-2-磺酰基(Mts)、4,4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)、甲苯磺?；?Tos)、2,2,5,7,8-五甲基色滿-6-磺?；?Pmc)、4-甲基芐基(MeBzl)、4-甲氧基節(jié)基(MeOBzl)、節(jié)氧基(BzlO)、節(jié)基(Bzl)、苯甲酰基(Bz)、3-硝基-2-吡啶次磺?；?sulphenyl)(Npys)、l-(4,4-二甲基-2，6-二氧雜環(huán)亞己基)乙基(Dde)、2，6-二氯芐基(2，6-DiCl-Bzl)、2-氯芐氧基羰基(2-Cl-Z)、2-溴芐氧基羰基(2-Br-Z)、芐氧基甲基(Bom)、環(huán)己氧基(cHxO)、叔丁氧基甲基(Bum)、叔丁氧基(tBuO)、叔丁基(tBu)、乙?；?Ac)和三氟乙酰基(TFA)等。保護/封端基團，以及將這些基團偶聯(lián)到本發(fā)明的肽的適當殘基的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的(參見例如，Greene等，(1991)，《有機合成中的保護基》(尸rate"/veOow戸(9rgam'c5y"Ae^"第2版，新澤西州索姆賽特的約翰威利父子公司(JohnWiley&Sons,Inc.Somerset,N丄))。在一個實施方式中，例如，合成期間當肽在樹脂上時用乙酸酐實現(xiàn)乙?；?。通過選擇用于合成的適當樹脂實現(xiàn)酰胺保護。例如，使用洗脫型(rink)酰胺樹脂作為固相載體，進行本發(fā)明所述的肽的合成。合成完成后，同時去除酸性雙官能氨基酸如Asp和Glu和堿性氨基酸Lys上的半永久性保護基以及Tyr上的羥基。由該樹脂通過酸性處理洗脫得到的肽具有乙酰基保護的N端和NH2保護的羧基端，同時去除了所有其他保護基。在各個實施方式中，本發(fā)明還考慮本發(fā)明各種保護或未保護的L-型、D-型、|3-、反-、逆、和/或反-逆肽的聚乙二醇化形式。聚乙二醇可用于改善肽的生物相容性和/或提高血清半衰期。對肽進行聚乙二醇化的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的(參見例如，美國專利7,256,258，6,552,170和6,420,339，以及本文引用的參考文獻)。對于本文所述的二元殺傷肽#7，(3-刪除和ot-螺旋文庫，結(jié)果表明，相對疏水性高并且凈電荷超過+3的肽對變異鏈球菌的活性最高。具有上述任一種特性的肽的活性處于中間水平。這些結(jié)果與具有陽離子兩性特征的大多數(shù)合成和天然AMP的已知內(nèi)容一致，提示這些文庫中的B-33，a-7和其他序列的性能類似于其他AMP;g卩，肽的正電荷提供了對陰離子細菌膜的AMP吸引作用，而兩性則有利于膜相互作用、螺旋轉(zhuǎn)化和細胞殺傷作用(Hancock和Lehrer(1998)7Ve"^5/ofecA"o/.，16:82-88;Shai(1999)5/oc/nm5/op/zjAs爿cto1462:55-70)。這些結(jié)果也表明，高的<處#嚴>值本身可能不與陽離子兩性AMP的抗變異鏈球菌活性的提高有關(guān)。然而，在pH6.0，酸活化文庫中的一些肽具有強的兩性螺旋形成特征，似乎與His相對含量以及抗變異鏈球菌活性的提高有關(guān)。對于RW文庫，如二元和a-螺旋文庫所述，大多數(shù)疏水和正電荷序列活性最高(2C-3，-4)。雖然與其他文庫中的肽相比長度和周期性不同，RW肽由于初始肽結(jié)合或膜插入的改善而活性提高。不受具體理論的束縛，據(jù)信富含Arg和Trp的肽雖然<11#〉值較低，卻能在與膜相互作用時形成穩(wěn)定的螺旋樣兩性排列，TrpH電子與Arg官能團之間通過靜電鍵合穩(wěn)定(參見例如，Mecozzi等，(1996)尸rac.Ato/.Jc"c/.C/W,93:10566-10571;Jing等，(2003)丄61:219-229)。因此，RW文庫中的肽獨特的序列性質(zhì)使它們具有高度有利于抗微生物活性的二級結(jié)構(gòu)。在各種實施方式中，本發(fā)明考慮多聯(lián)體，其包含兩個或更多個直接連接或通過接頭(例如，肽接頭或其他接頭)連接在一起的本發(fā)明不同肽的組合。因此，考慮了化學偶聯(lián)物及融合蛋白。本文提供的結(jié)果表明，融合肽，以單一線性分子合成的AMP二聚體，與其他母體肽相比殺傷動力學提高。一些融合肽可能通過增加膜表面處每個分子中螺旋形成單元的數(shù)目而起作用，如束形AMP所述(參見例如，Sal-Man等，(2002)所oc/zew^^741:11921-11930)。而且，本文的結(jié)果提示，組成性排列(融合肽亞單位在C端或N端)的效果可能難以預(yù)測(比較FBa-12和FBa-20的MIC)，雖然其他工作已證明，兩性且推定形成螺旋的AMP似乎更耐受N端添加(Eckert等，(2006)^W/m/cra6.^ge"feOzemoAer50:3833-3838;Szynol等，(2006)C/zemi>wgDes67:425-431)?？傊?，本文提供的結(jié)果顯示，變異鏈球菌易受疏水性和正電荷相對較高的AMP的作用，用本文提供的方法可容易地從文庫分離這些AMP。因此，將這些文庫內(nèi)或者這些文庫之間的活性序列連接在一起而構(gòu)建的融合肽能夠改善這些肽的殺傷動力學。據(jù)信本文所述的AMP能有效對抗正常無菌和粘膜表面的微生物感染，即使所述感染是由抗生素耐藥株引起的?？赏ㄟ^任意常規(guī)方法局部遞送AMP?；蛘?，可通過例如口服給藥或注射全身遞送AMP。本文提供的經(jīng)合理設(shè)計的AMP較小(大多不到20個氨基酸)，因而容易以高產(chǎn)率化學合成，相對于顯著更長(30-40個氨基酸)的其他合成AMP這是一種改進，這些更長的AMP難以構(gòu)建和純化。也易于將本文所述的AMP調(diào)節(jié)成蛋白酶耐受，例如通過摻入D-異構(gòu)體氨基酸，聚乙二醇化，利用非天然產(chǎn)生的氨基酸，等等。II.肽的制備肽的制備本發(fā)明中使用的肽可采用標準化學肽合成技術(shù)進行化學合成，或者尤其是在所述肽不包括"D"型氨基酸殘基時，肽也可重組表達。在"D"型多肽是重組表達的情況下，可在向生物提供都是D型的一種或多種氨基酸的環(huán)境中培養(yǎng)宿主生物(例如細菌、植物、真菌細胞等)。這樣，該系統(tǒng)中重組表達的肽摻入所述D型氨基酸。在某些實施方式中，采用識別D型氨基酸的氨基?；?tRNA合成酶，使D型氨基酸摻入重組表達的肽中。在某些實施方式中，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意液相或固相肽合成技術(shù)化學合成所述肽。固相合成中，序列的C端氨基酸連接于不溶性載體，然后相繼加入序列中的剩余氨基酸，這是本發(fā)明多肽化學合成的優(yōu)選方法。固相合成技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，例如參見Barany和Merrifield(1963)，固相肽合成(So/W-P/2a^S，Ae^)，'第3-284頁，《肽分析、合成、生物學》(7Tze尸e/7"fife"爿"a/;w'"<S，^&^,說'o/ogy)，第2巻..i會成游專^方茲，J教；Merrifield等，(1963)/.CAem.Soc.,85:2149-2156和Stewart等(1984)，《固相肽合成》(So/W尸/zoye尸ej^V/e5:，Ae^)，第2版，伊利諾斯州羅克福德皮爾斯化學品公司(PierceChem.Co.，Rockford，IU)。在一個實施方式中，采用二苯甲基胺樹脂(貝克曼生物產(chǎn)品公司(BeckmanBioproducts)，0.59mmolNH2/克樹脂)作為固相，通過固相肽合成方法合成肽。COOH末端氨基酸(如，叔丁基羰基-Phe)通過4-(氧基甲基)苯乙?；B接于固相載體。這是比常規(guī)芐基酯連接鍵更穩(wěn)定的鍵，而最終的肽仍然能夠氫化裂解。用甲酸作為氫供體的轉(zhuǎn)移氫化可用于該目的。肽合成的詳細方案以及合成肽的分析在Anantharamaiah等，(1985)/C/zern.，260(16):10248-10255的小型印刷補充材料中描述。應(yīng)理解，在肽，尤其是包含D-氨基酸的肽的化學合成中，除了所需的全長產(chǎn)物外，合成通常還產(chǎn)生許多截短的肽。因此，肽通常需要通過例如HPLC進行純化?；瘜W合成中采用適當衍生化的氨基酸殘基可容易地在肽的一個或多個位置摻入D-氨基酸、(3氨基酸、非天然氨基酸等。固相肽合成的修飾殘基可從許多供應(yīng)商購得(參見例如，先進化學技術(shù)公司(AdvancedChemTech)，路易斯維爾；NB公司(NovaBiochem)，圣地亞哥；西格瑪公司(Sigma)，圣路易斯；BC有限公司(BachemCaliforniaInc.)，托蘭斯等)。需要的話，可在肽中任意位置摻入D-型和/或其他修飾的氨基酸或者完全省去。因此，例如，在某些實施方式中，肽可包含一個修飾的酸，而在其它實施方式中，肽包含至少兩個、通常至少三個、更常見至少四個、更常見至少五個、優(yōu)選至少六個、更優(yōu)選至少7個或者甚至所有都是修飾的氨基酸。在某些實施方式中，基本上每個氨基酸都是D-型氨基酸。如上所述，本發(fā)明的肽或融合蛋白也可重組表達。在某些實施方式中，采用重組表達系統(tǒng)來合成本發(fā)明的抗微生物肽。通常，該過程包括產(chǎn)生編碼所需的肽或融合蛋白的DNA序列，將該DNA放置到處于特定啟動子控制下的表達盒中，在宿主中表達肽或融合蛋白，分離表達的肽或融合蛋白，以及需要的話使所述肽或融合蛋白變性。編碼本文所述的肽或融合蛋白的DNA可通過上文所述的任何合適的方法進行制備，包括例如克隆和限制適當序列或直接化學合成。核酸可容易地連接到含有適當表達控制序列(例如，啟動子、增強子等)以及任選地含有一種或多種選擇性標記物(例如，抗生素耐受基因)的載體中。編碼本發(fā)明的肽或任何蛋白的核酸序列可以在各種宿主細胞中表達，包括但不限于大腸桿菌(凡CO//),其他細菌宿主，酵母，真菌，以及各種高等真核細胞如昆蟲細胞(例如，SF3)，COS，CHO和HeLa細胞系和骨髓瘤細胞系。重組蛋白質(zhì)基因通?？刹僮鞯剡B接于每個宿主適當?shù)谋磉_控制序列。在大腸桿菌中，該表達控制序列包括啟動子如T7、trp或X啟動子，核糖體結(jié)合位點和優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄終止信號。對于真核細胞，控制序列可包括啟動子和常見的增強子(例如，源自免疫球蛋白基因、SV40、巨細胞病毒等的增強子)以及聚腺苷酸化序列，并可包括剪接供體和受體序列?？赏ㄟ^公知方法將本發(fā)明質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到選定的宿主細胞中，所述方法包括大腸桿菌的氯化鈣轉(zhuǎn)化以及哺乳動物細胞的磷酸鈣處理或電穿孔?？赏ㄟ^質(zhì)粒上含有的基因(例如"，、g^、，/^g基因)所產(chǎn)生的抗生素耐受性來選擇被所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞。表達后，可根據(jù)本領(lǐng)域標準方法純化重組的肽或融合蛋白，這些方法包括硫酸銨沉淀法、親和柱、柱層析、凝膠電泳等(通常參見R.Sc叩es(1982)，蛋白質(zhì)純化(Prate/"尸wr折ca"o")，紐約SV出版社(Springer-Verlag，N.Y.);Deutscher(1990)，酶學方法(MeAo^五"2ymo/ogy)，第182巻蛋白質(zhì)純化指導(dǎo)(GuidetoProteinPurification)，紐約學術(shù)出版社公司(AcademicPress,Inc.N.Y.))。優(yōu)選同質(zhì)性至少約90-95%的基本上純的組合物，更優(yōu)選地同質(zhì)性98-99%。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，化學合成、生物表達或純化之后，本發(fā)明的肽或融合蛋白的構(gòu)象可顯著不同于所需的天然構(gòu)象。因此，需要變性并還原肽或融合蛋白，使其重新折疊形成優(yōu)選的構(gòu)象。使蛋白質(zhì)還原和變性并誘導(dǎo)重新折疊的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的(參見例如，Debinski等，(1993)丄說'o/.C7zem.，268:14065-14070;Kreitman禾。Pastan(1993)5/oco"乂wg.CAew.，4:581-585;禾卩Buchner，等，(1992)爿"a/.所oc/zew.，205:263-270)。例如，Debinski等描述了在胍-DTE中包涵體蛋白質(zhì)的變性和還原。然后在含有氧化的谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化還原緩沖液中蛋白質(zhì)重新折疊。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可對所述肽和/或融合蛋白進行修飾而不降低其生物學活性。可進行一些修飾以促進靶分子克隆、表達或摻入到融合蛋白中。這些修飾是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，包括例如在氨基末端添加甲硫氨酸以提供引發(fā)位點，或者在任一末端設(shè)置額外的氨基酸(例如多His)以形成方便定位的限制位點或終止密碼子或純化序列?；想牡闹苽湓谀承嵤┓绞街?，本發(fā)明涉及含有連接在一起的兩個或更多個抗微生物肽(AMP)的"化合"抗微生物肽的應(yīng)用。所述肽可直接相連或者通過接頭相連。在各種實施方式中，AMP化學偶聯(lián)或者可選地，它們可以直接相連或者通過肽接頭相連而使所述化合AMP表現(xiàn)為融合蛋白。通常，化合AMP包括附連于第二AMP的至少一個本文所述的AMP。第二AMP可以是本文所述的AMP，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他AMP。許多不同的AMP是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(參見例如，美國專利7,271,239，7,223,840，7,176,276，6,809,181，6,699,689，6,420,116，6,358,921，6,316,594，6,235,973，6,183,992，6,143,498，6,042,848，6,040,291，5,936,063，5,830,993，5,428,016，5,424,396，5,032,574，4,623,733，具體AMP的內(nèi)容被納入本文作為參考)。在某些實施方式中，化合AMP包含兩個或更多個相互附連的本發(fā)明AMP。在一個實施方式中，AMP相互間化學偶聯(lián)。分子間化學偶聯(lián)的方式是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。肽通常含有各種官能團，例如，羧酸(COOH)或游離胺(-NH2)基團，能夠與合適的官能團反應(yīng)而相互結(jié)合?；蛘?，可對肽進行衍生化以暴露或附連額外的反應(yīng)性官能團。衍生物作用可包括連接任意的接頭分子，例如美國伊利諾斯州羅克福德的皮爾斯化學品公司(PierceChemicalCompany，RockfordIllinois)的那些)。本文所用術(shù)語"接頭"表示用于連接兩個分子的分子。接頭通常能夠與兩邊的分子(例如AMP)形成共價鍵。合適的接頭是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，包括但不限于直鏈或支鏈碳接頭、雜環(huán)碳接頭、或肽接頭。在某些實施方式中，接頭可通過其側(cè)接基團連接于組成氨基酸(例如，通過二硫鍵連接半胱氨酸)。然而，在某些優(yōu)選的實施方式中，接頭連接于a碳氨基和末端氨基酸的羧基。一個官能團與一個分子(例如AMP)上的基團反應(yīng)，另一官能團與另一個分子(例如，另一AMP)上的基團反應(yīng)的雙官能接頭可用于形成所需的偶聯(lián)物?；蛘撸M行衍生化以提供官能團。因此，例如，用于在肽上產(chǎn)生游離巰基的方法也是已知的(參見美國專利4,659,839)。將各種分子連接至肽或蛋白的許多方法和接頭分子是已知的(參見例如，歐洲l專利申請188,256;美國專利4,671,958，4,659,839，4,414,148，4,699,784;4,680,338;4,569,789;禾卩4,589,071;和Borlinghaus等(1987)，Ca"cerU:4071-4075)。如果AMP直接連接或通過肽接頭連接，它們可采用標準化學合成技術(shù)進行合成。如果兩個組分相對較短，嵌合部分可作為單一鄰接多肽合成?；蛘?，可分別合成各部分，然后使一個分子的氨基末端與另一個分子的羧基末端發(fā)生縮合反應(yīng)融合形成肽鍵?；蛘?，AMP各自可與肽間隔物的一端縮合從而形成鄰接融合蛋白。在某些實施方式中，可采用重組DNA方法以融合蛋白的形式合成化合AMP。通常，該方法包括產(chǎn)生編碼融合蛋白的DNA序列，將該DNA序列置于特定啟動子控制下的表達盒中，在宿主中表達蛋白質(zhì)，分離表達的蛋白質(zhì)，以及如果需要的話使蛋白質(zhì)變性。產(chǎn)生融合蛋白的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在各種實施方式中，使用肽接頭連接各個AMP。在各種實施方式中，肽接頭相對較短，通常不到約10個氨基酸，優(yōu)選不到約8個氨基酸，更優(yōu)選約3-5個氨基酸。合適的示例性接頭包括但不限于PSGSP(SEQIDNO:106)、ASASA(SEQIDNO:107)或GGG(SEQIDNO:108)。在某些實施方式中，也可使用較長的接頭如(GGGGS)3(SEQIDNO:29)。在某些實施方式中，本發(fā)明克隆將本發(fā)明的AMP或化合AMP附連于靶部分(例如細菌特異性肽或抗體)以提高AMP的特異性。示例性的抗體和/或肽耙部分例如在USSN10/706,391中描述，以US2004/0137482公開。耙部分可化學偶聯(lián)于AMP或化合AMP，或者嵌合部分可以融合蛋白的形式表達，例如如上所述，用于化合AMP的構(gòu)建。肽的標記在各個實施方式中，用可檢測的標記物對本文所述的抗微生物肽和/或化合AMP進行標記。適用于本發(fā)明的可檢測的標記物包括可通過分光光度法、光化學方法、生物化學方法、免疫化學方法、電學方法、光學方法或化學方法檢測的任何組合物。本發(fā)明中有用的標記物包括但不限于用標記的親和素偶聯(lián)物染色的生物素、磁珠(例如DynabeadsTM)、熒光染料(例如熒光素、得克薩斯紅、羅丹明、綠色熒光蛋白、量子點(quantumdot)等，參見例如，美國俄勒岡州尤金分子探針公司(MolecularProbes,Eugene,Oregon,USA))，放射標記(例如，3H、125I、35S、14C或32P)，酶(例如，辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶及其他ELISA中常用的酶)，和比色標記如膠態(tài)金(例如，高效散射綠光的直徑40-80nm的金顆粒)或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、膠乳等)小珠。公開這些標記物的專利包括美國專利3,817,837;3,850,752;3,939,350;3,996,345;4,277,437;4,275,149;和4,366,241。在某些實施方式中，優(yōu)選熒光標記，因為它們能提供非常強的信號而背景低并且無放射性。它們也可以高分辨率和靈敏度通過快速掃描方法進行光學檢測?？刹捎玫暮线m的色原包括能夠吸收特定波長范圍的光的那些分子和化合物，因而在用特定波長或波長范圍的輻射進行照射時(例如熒光劑)能夠看到顏色，或者可選地發(fā)射光。理想地，熒光標記應(yīng)吸收大于約300nm，優(yōu)選約350nm，更優(yōu)選大于約400nm的光，通常在比吸收光波長高10nm的波長處發(fā)射光。應(yīng)理解，結(jié)合染料的吸收和發(fā)射特征不同于未結(jié)合染料的這些特征。因此，當表示染料的不同波長范圍和特征時，旨在說明采用的染料而不是在任意溶劑中的未偶聯(lián)和表征的染料?？蓹z測的信號也可通過化學發(fā)光和生物發(fā)光源提供?；瘜W發(fā)光源包括，化學反應(yīng)電激發(fā)后發(fā)射光的化合物，發(fā)射的光用作可檢測的信號或向熒光受體供給能量?；蛘撸灩馑嘏c熒光素酶或光澤精聯(lián)用而產(chǎn)生生物發(fā)光。自旋標記由具有不配對的電子自旋的報告分子提供，可通過電子自旋共振(ESR)分光光度計檢測。示例性的自旋標記包括但不限于有機自由基、過渡金屬復(fù)合物、尤其是釩、銅、鐵和錳等。示例性的自旋標記包括硝基氧自由基。標記可直接或者通過接頭部分連接于AMP。一般來說，標記或接頭標記附連的位置并不限于任何具體位置。例如，標記可附連于氨基酸側(cè)鏈，或者末端殘基的氨基或羧基端，通常在任何不會干擾肽的活性和/或特異性的位置。應(yīng)理解，熒光標記并不限于單種有機分子，而是包括無機分子、有機和/或無機分子的多分子混合物、結(jié)晶、雜聚物等。因此，例如，硅膠殼體中包裹的CdSe-CdS核-殼納米晶體(nanocrystal)便于衍生化以偶聯(lián)生物分子(Bruchez等，(1998)S"'wce，281:2013-2016)。類似地，高熒光強度量子點(硫化鋅-封端的硒化鎘)共價偶聯(lián)于生物分子，用于超靈敏生物檢測(Warren和Nie(1998)Sc/e匿，281:2016-2018)。III.制劑藥物制劑為了實施本發(fā)明的方法，給予需要的哺乳動物，例如患有微生物感染的哺乳動物或預(yù)防性地給予該哺乳動物，一種或多種活性劑(例如，本文所述的抗微生物肽(AMP)或化合抗微生物肽)，以防止微生物感染和/或防止或降低齲齒的發(fā)病率或嚴重程度?；钚詣┛梢?天然"形式，或者在需要時以鹽、酯、酰胺、前藥、衍生物等形式給予，前提是這些鹽、酯、酰胺、前藥或衍生物適合藥用，即在本發(fā)明方法中有效?；钚詣┑柠}、酯、酰胺、前藥和其他衍生物可采用合成有機化學領(lǐng)域技術(shù)人員己知的標準方法進行制備，例如參見March(1992)，《高等有機化學；反應(yīng)、機理與結(jié)構(gòu)》(J(iv朋ced(9rg朋/cC7ze而'欲y，'ie"c"o似，Mec/7am'smsSfr"c加")，第4版，紐約威利國際出版社(N.Y.Wiley-Interscience)。配制這些衍生物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，許多遞送試劑的二硫化鹽在PCT公開WO00/059863中揭示，其內(nèi)容被納入本文作為參考。類似地，治療型肽、類肽或其他模擬物的酸性鹽可采用常規(guī)方法由游離堿制備，該方法通常包括與合適的酸進行反應(yīng)。通常，將堿式藥物溶解在極性有機溶劑如甲醇或乙醇中，然后加入酸。所得鹽沉淀出來或者通過加入少量極性溶劑而析出。用于制備酸加成鹽的合適的酸包括但不限于有機酸，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、延胡索酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、苦杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、p-甲苯磺酸、水楊酸等；和無機酸，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。用合適的堿處理，酸加成鹽可重新轉(zhuǎn)化為有機堿。某些尤其優(yōu)選的本文所述活性劑的酸加成鹽包括氯化物鹽，例如可用鹽酸或氫溴酸制備。相反，本發(fā)明活性劑的堿性鹽的制備可釆用藥學上可接受的堿，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、三甲胺等，以類似的方式制備。尤其優(yōu)選堿性鹽包括堿金屬鹽，如鈉鹽和銅鹽。酯的制備通常包括使活性劑分子結(jié)構(gòu)內(nèi)存在的羥基和/或羧基官能化。在某些實施方式中，酯通常是游離醇基團的?；〈苌铮从赏ㄊ絉COOH的羧酸衍生化所得部分，其中R是烷基，尤其低級垸基。需要時，采用常規(guī)氫解或水解方法可將酯重新轉(zhuǎn)化為游離酸。酰胺也可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或相關(guān)文獻中描述的技術(shù)進行制備。例如，酰胺可采用合適的胺試劑進行制備，或者可通過酸酐或酸氯化物與氨或低級烷基胺反應(yīng)進行制備。在各種實施方式中，本文所述的活性劑適合胃腸外、外用、口服、鼻腔(或吸入)、直腸或局部給藥，如氣霧劑或透皮，用于感染(例如，微生物感染)以及本文所述的一種或多種病狀和/或適應(yīng)癥(例如動脈粥樣硬化和/或其癥狀)的預(yù)防和/或治療?？梢远喾N單位劑型給予藥物組合物，取決于給藥方法。合適的單位劑型包括但不限于粉末劑、片劑、丸劑、膠囊、錠劑、栓劑、貼劑、鼻腔噴霧劑、注射劑、可植入緩釋制劑、脂質(zhì)復(fù)合物等。本發(fā)明的活性劑可與藥學上可接受的載體(賦形劑)組合從而形成藥理學組合物。藥學上可接受的載體可包含一種或多種生理學上可接受的化合物，例如用于穩(wěn)定組合物或用于提高或降低活性劑的吸收。生理學上可接受的化合物可包括例如糖，如葡萄糖、蔗糖或右旋糖苷；抗氧化劑，如抗壞血酸或谷胱甘肽；螯合劑；低分子量蛋白質(zhì)；保護和攝取促進劑，如脂質(zhì)；降低活性劑的清除或水解的組合物，或賦形劑或其他穩(wěn)定劑和/或緩沖液。其他生理學上可接受的化合物，尤其是適合片劑、膠囊、軟膠囊的制備應(yīng)用的化合物包括但不限于粘合劑、稀釋劑/填充劑、崩解劑、潤滑劑、懸浮劑等。在某些實施方式中，為制備口服劑型(例如片劑)，將賦形劑(例如乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇等)，任選的崩解劑(例如碳酸鈣、羧甲基纖維素鈣、乙醇酸淀粉鈉、交聚維酮等)，粘合劑(例如a-淀粉、阿拉伯膠、微晶纖維素、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基纖維素、環(huán)糊精等)和任選的潤滑劑(如，滑石粉、硬脂酸鎂、聚乙二醇6000等)加入活性成分(如活性肽和水楊苯胺)中，然后壓制所得組合物。如果需要，采用已知方法對壓制的產(chǎn)物進行包衣，例如用于掩蔽味道或為了腸溶出或緩釋。合適的包衣材料包括但不限于乙基_纖維素、羥甲基纖維素、聚氧乙烯二醇、乙酸鄰苯二甲酸鹽纖維素、鄰苯二甲酸鹽羥丙基甲基纖維素和優(yōu)拉劑(Eudragit)(德國羅姆哈斯公司(Rohm&Haas，Germany);甲基丙烯酸-丙烯酸共聚物)。其他生理學上可接受的化合物包括尤其適用于防止微生物的生長或作用的濕潤劑、乳化劑、分散劑或防腐劑。各種防腐劑是眾所周知的，包括例如，苯酚和抗壞血酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，根據(jù)活性劑的給藥途徑以及活性劑的具體物理化學性質(zhì)來選擇藥學上可接受的載體，包括生理學上可接受的化合物。在某些實施方式中，賦形劑無菌且基本沒有不良物質(zhì)。這些組合物可通過常規(guī)公知的滅菌技術(shù)進行滅菌。對于各種口服劑型的賦形劑(例如片劑和膠囊)，不要求滅菌。USP/NP標準通常已足夠。在治療應(yīng)用中，局部給予或者口服或鼻腔給予患有感染或處于感染風險或者預(yù)防性給予本發(fā)明的組合物，以防止齲齒或表現(xiàn)為微生物感染的其他牙齒或口腔粘膜的病狀，給藥量足以防止和/或治愈和/或至少部分地防止或阻止疾病和/或其并發(fā)癥。足以實現(xiàn)該目的的量定義為"治療有效劑量"。用于該用途的有效量將取決于疾病的嚴重程度以及患者的一般健康狀況。組合物的單劑量或多劑量給藥取決于劑型以及患者所需且耐受的給藥頻率。在任何事件中，組合物應(yīng)提供足夠量的本發(fā)明制劑的活性劑以有效治療患者(緩解一種或多種癥狀)。根據(jù)選定的具體給藥模式及患者需要可改變活性劑的濃度，主要基于活性劑的活性、患者體重等進行選擇。然而，通常選擇的濃度能提供約0.1或1毫克/千克/天到約50毫克/千克/天，有時更高的劑量。常用劑量約為3-3.5毫克/千克/天，優(yōu)選約3.5-7.2毫克/千克/天，更優(yōu)選約7.2-11.0毫克/千克/天，最優(yōu)選約11.0-15.0毫克/千克/天。在某些優(yōu)選的實施方式中，劑量約為10-50毫克/千克/天。在某些實施方式中，劑量約為20-50毫克，口服每天兩次。應(yīng)理解，可改變該劑量以優(yōu)化爭對具體對象或?qū)ο蠼M的治療和/或預(yù)防方案。在某些實施方式中，將本發(fā)明的活性劑給予口腔。這可通過使用錠劑、氣霧劑、漱口劑、涂覆拭子等容易地實現(xiàn)。在某些實施方式中，將本發(fā)明活性劑局部給予(例如)皮膚表面，給予局部病灶或傷口、給予外科手術(shù)部位，等等。在某些實施方式中，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的標準方法全身給予(例如，口服，或者用作注射劑)本發(fā)明的活性劑。在其他優(yōu)選的實施方式中，也可采用常規(guī)經(jīng)皮藥物遞送系統(tǒng)，即透皮"貼劑"經(jīng)皮膚遞送藥劑，該遞送系統(tǒng)中活性劑通常包含在層狀結(jié)構(gòu)中，用作可固定到皮膚上的藥物遞送裝置。在該結(jié)構(gòu)中，藥物組合物通常包含在上方背襯層之下的一層或"儲器"中。應(yīng)理解，本文中的術(shù)語"儲器"表示最終能夠遞送到皮膚表面的一定量的"活性劑"。因此，例如，"儲器"可包括貼劑背襯層上粘合劑中的活性劑，或者在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何各種不同的基質(zhì)制劑中。貼劑可包括單個儲器，或者可包含多個儲器。在一個實施方式中，儲器包括在藥物遞送期間用于將系統(tǒng)固定到皮膚上的藥學上可接受的接觸型粘合材料的聚合物基質(zhì)。合適的皮膚接觸型粘合材料的例子包括但不限于聚乙烯、聚硅氧烷、聚異丁烯、聚丙烯酸酯、聚氨酯等?；蛘撸巸ζ骱推つw接觸型粘合劑分別位于不同的層中，粘合劑在儲器下方，在這種情況下，儲器即可以是上文所述的聚合物基質(zhì)，也可以是液態(tài)或水凝膠形式，或者可采取一些其他的形式。所述疊層中的背襯層用作裝置的上表面，優(yōu)選作為貼片的主要結(jié)構(gòu)元件并提供裝置大部分的柔性。選擇用于背襯層的材料優(yōu)選基本上不可滲透活性劑和存在的任何其他物質(zhì)。局部遞送的其他制劑包括但不限于軟膏、凝膠、噴霧劑、流體和乳膏。軟膏是一種半固體制劑，通?；诘V脂或其他石油衍生物。含選定活性劑的乳膏通常是粘稠液態(tài)或半固體乳劑，常常是水包油或油包水乳劑。乳膏基質(zhì)通常是可水洗的，含有油相、乳化劑和水洗。油相有時也稱為"內(nèi)相"，常常由礦脂和脂肪醇(例如鯨蠟醇或硬脂醇)構(gòu)成；雖然不是必需的，水相通常在體積上超過油相，常常含有致濕劑。乳膏制劑中的乳化劑通常是非離子、陰離子、陽離子或兩性離子表面活性劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解使用的具體的軟膏或乳膏基質(zhì)，該基質(zhì)能夠優(yōu)化藥物遞送。對于其他載體或運載體，乳膏基質(zhì)應(yīng)為惰性、穩(wěn)定、無刺激且無致敏性。如上所述，也考慮了各種口頰、舌下制劑。在某些實施方式中，本發(fā)明的一種或多種活性劑可以是"濃縮物"的形式，在儲存容器(例如，預(yù)定體積)中稀釋后使用，或者位于可溶性膠囊中加入一定體積的水、醇、過氧化氫或其他稀釋劑后使用。雖然相對于人體使用描述的本發(fā)明，本發(fā)明也適用于動物，例如獸醫(yī)使用。因此，某些優(yōu)選的生物體包括但不限于人、非人靈長動物、犬、馬、貓、豬、有蹄動物、兔形目動物等。上述制劑和給藥方法是示例性而非限制性的。應(yīng)理解，采用本文所提供的內(nèi)容，可容易地設(shè)計其他合適的制劑和給藥模式。健康護理產(chǎn)品制劑在某些實施方式中，本發(fā)明的一種或多種抗微生物肽(AMP)和/或化合AMP可摻入健康護理制劑，例如家用、旅行中、工作中、在牙科診所、醫(yī)院等場所使用的處方或非處方產(chǎn)品。這些制劑包括但不限于牙膏、漱口劑、牙齒增白條或溶液、隱形眼鏡儲存液、潤濕劑、或清潔溶液、牙線、牙簽、牙刷刷毛、口腔噴霧劑、口腔錠劑、鼻腔噴霧劑、口腔和/或鼻腔應(yīng)用的粉霧劑、傷口敷料(例如繃帶)等等。這些健康產(chǎn)品的制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可簡單地將本發(fā)明AMP和/或化合AMP以有效劑量(例如，抑制齲齒形成的預(yù)防劑量等)加入這些制劑中。例如，牙膏制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。通常，這些制劑是一些成分的混合物磨料和表面活性劑；抗齲劑，如氟化物；牙垢控制成分，如焦磷酸四鈉和甲基乙烯基醚/馬來酸酐共聚物；pH緩沖液；致濕劑，以防止干透并增加令人愉快的口感；和粘合劑，以提供稠度和形狀(參見例如，表4)。粘合劑使固相保持適當懸浮在液相中以防止液相從牙膏中分離出來。它們還可提供牙粉主體，尤其是從牙膏管中擠壓到牙刷上之后。表4:常用牙膏組分<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>氟化物來源提供1000-15000卯m的氟。表5列出了制劑中的常用成分；最終的組合將取決于以下因素各成分的相容性和成本；地方慣例、所需的效益以及產(chǎn)品遞送的品質(zhì)等。應(yīng)理解，可簡單地將本發(fā)明的一種或多種AMP和/或化合AMP加入這些制劑中或代替一種或多種其他成分使用。表5:常用成分列表<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>美國專利6,113,887中描述的一種示例性制劑包含(l)選自下組的水溶性殺菌劑吡啶鑰化合物，季銨化合物和雙胍化合物，以組合物的總重量計，含量為0.001-5.0重量％;(2)陽離子修飾的羥乙基纖維素，其羥乙基纖維素部分的平均分子量為1,000,000或更高，陽離子化程度為0.05-0.5摩爾/葡萄糖，以組合物的總重量計，其含量為0.5-5.0重量％;(3)選自聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物和醇胺化合物的表面活性劑，以組合物的總重量計，含量為0.5-13重量%;和(4)非二氧化硅型拋光劑，以組合物的總重量計，含量為5-50重量％。在某些實施方式中，可使用本發(fā)明的AMP和/或化合AMP代替殺菌劑或殺菌劑的組合。類似地，漱口制劑也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。因此，例如，含有氟化鈉的漱口劑在美國專利2,913,373，3,975,514和4,548,809和美國專利公開US2003/0124068Al，US2007/0154410Al等中描述。含有各種堿金屬化合物的漱口劑也是已知的苯甲酸鈉(WO9409752);堿金屬次石鹽(alkalimetalhypohalite)(US20020114851A1);二氧化氯(CN1222345);堿金屬磷酸鹽(US2001/0002252Al，US2003/0007937Al);硫酸氫鹽/碳酸氫鹽(JP8113519);十六垸基氯化吡啶鐵(CPC)(參見例如，US6,117,417，US5,948,390和JP2004051511)。含有高級醇(參見例如，US2002/0064505Al，US2003/0175216Al);過氧化氫(參見例如，CN1385145);0)2氣泡(參見例如，JP1275521和JP2157215)的漱口劑也是已知的。在某些實施方式中，這些和其他漱口劑還可包含一種或多種本發(fā)明的AMP或化合AMP。隱形眼鏡儲備液、潤濕劑、或清潔溶液、牙線、牙簽、牙刷刷毛、口腔噴霧劑、口腔錠劑、鼻腔噴霧劑、口腔和/或鼻腔應(yīng)用的粉霧劑等也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可容易地適配以摻入一種或多種本發(fā)明的AMP和/或化合AMP。20上述健康護理制劑和/或裝置是示例性而非限制性的。采用本文提供的內(nèi)容，本發(fā)明的AMP和/或化合AMP可容易地摻入其他產(chǎn)品中。IV.藥盒在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了在哺乳動物中抑制感染和/或治療和/或預(yù)防齲齒的藥盒。該藥盒通常包括含有一種或多種本文所述的活性劑(即抗微生物肽或化合抗微生物肽)的容器。在某些實施方式中，活性劑以單位劑量制劑(例如，栓劑、片劑、囊片、貼劑等)形式提供，和/或任選地與一種或多種藥學上可接受的賦形劑組合。在某些實施方式中，藥盒包含一種或多種本文所述的健康護理產(chǎn)品制劑(例如，牙膏、漱口劑、牙齒增白條或溶液、隱形眼鏡儲存液、潤濕劑、或清潔溶液、牙線、牙簽、牙刷刷毛、口腔噴霧劑、口腔錠劑、鼻腔噴霧劑、口腔和/或鼻腔應(yīng)用的粉霧劑等等)。此外，藥盒可任選地包括標簽和/或說明材料，為本發(fā)明"治療"或"預(yù)防"的實施方法或應(yīng)用提供指導(dǎo)(即方案)。優(yōu)選的說明材料描述了本發(fā)明一種或多種活性劑治療性或預(yù)防性抑制或防止感染和/或抑制齲齒形成的應(yīng)用。說明材料也可任選地描述優(yōu)選的劑型/治療方案，計數(shù)指示等。雖然說明材料通常包括書面或印刷材料，但并不限于這些材料。能夠儲存說明并將這些說明傳遞給最終使用者的任何介質(zhì)都包括的本發(fā)明范圍內(nèi)。這些介質(zhì)包括但不限于電子儲存介質(zhì)(例如，磁盤、磁帶、盒帶、芯片)、光學介質(zhì)(例如CDROM)等。這些介質(zhì)可包含能夠提供這些說明材料的英特網(wǎng)的地址。實施例提供下面的實施例是為了闡述而非限制本發(fā)明。實施例1:對抗變異鏈球菌的新型合成抗微生物肽變異鏈球菌是一種常見的口腔病原體，可導(dǎo)致齲齒，即使不斷努力去除或根除，它們?nèi)匀槐Ａ粼谘例X上，甚至越發(fā)繁茂。在本研究中，我們通過構(gòu)建和篩選一些結(jié)構(gòu)多樣的肽文庫得到許多對抗變異鏈球菌的合成抗微生物肽，各個文庫中疏水性和電荷遞增變化以產(chǎn)生具有不同生物化學特性的肽的集合。我們從這些文庫鑒定了具有爭對變異鏈球菌的強效殺菌活性的多種肽。為了進一步改善其效力，將來自各個文庫的殺菌性最強的肽以各種組合合成到一起成為一個分子，每個抗微生物區(qū)域之間有或沒有柔性肽接頭D與原始未連接分子相比，這些"融合"肽中的許多殺菌活性提高。該結(jié)果表明，生物化學約束肽的小型文庫可用于產(chǎn)生爭對變異鏈球菌的抗微生物肽，其中的一些可能是功能性抗齲劑。材料與方法菌株使用前將變異鏈球菌臨床分離物UA140(32)，UA159(1)，T8(33)，ATCC25175，GS5(Kuramitsu和Ingersoll(1977)/"/e"/mww".,17:330-337)和下面列出的所有革蘭氏陽性菌(見表9)在心腦浸液或Todd-Hewitt(TH)肉湯(Difco)中在厭氧條件下于37。C培養(yǎng)過夜(Eckert等，(2006)」油'/m'croZ).^gewbC/2emW/2er50:3651-3657)。非典型韋榮球菌(Ke/〃owe〃aa(y;7/cfl0PK1910在韋榮球菌屬培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)(Egland等，(2004)尸rac.Ato/.^cat/.,OSL4，101:16917-16922)。所有菌株在80%N2、10%(302和10%H2的厭氧環(huán)境中培養(yǎng)。肽的合成與純化采用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)固相方法，在Apex396肽合成儀(AAPPT公司(AAPPTec)，肯塔基州路易維爾(Louisville，KY))上合成肽。購得的所有氨基酸，適當取代的樹脂(Anaspec)和反應(yīng)試劑(Fisher)為肽合成級別。線性肽的一般合成包括以下過程將0.6毫升25y。哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)溶液加入負載有第一氨基酸的樹脂上，然后攪拌27分鐘，二氯甲烷(一次洗滌用1毫升)和從甲基吡咯垸酮(共7次，每次0.8毫升)洗滌循環(huán)。為進行偶聯(lián)反應(yīng)，加入DMF(0.1毫升)和W-甲基吡咯垸酮(0.2毫升)配制的5M過量Fmoc-保護的氨基酸、W-羥基苯并三唑、HBTU((9-苯并三唑-7V;AUVVV-四甲基脲六氟磷酸)和二異丙基乙45基胺(10M過量)的溶液，并將該反應(yīng)混合物攪拌45分鐘。最后的氨基酸偶聯(lián)于樹脂之后，用1毫升三氟乙酸-硫代茴香醚-水-l,2-乙垸二硫醇(10毫升:0.5毫升:0.5毫升:0.25毫升)在室溫下處理2小時，然后相繼用DMF、甲醇和二氯甲垸洗漆，真空干燥過夜，使受保護的肽從樹脂解離。用Source15RPC柱進行分析型和制備型反相高效液相色譜(ACTA純化器；安瑪西亞公司(Amersham))，用含0.1%三氟乙酸的H20和CH3CN以線性梯度進行洗脫，如之前所述(Eckert等，(2006)^w"7m'cra6.C/zemo^e廣50:3833-3838)。所有肽純化至>90%(數(shù)據(jù)未顯示)。將樣品溶解在H20-CH3CN1:2的混合物中，通過基質(zhì)輔助的激光解吸電離質(zhì)譜證實肽的質(zhì)量。采用a-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)(航行者系統(tǒng)(Voyagersystem);ABI)以線性模式進行測量。所有情況下所得質(zhì)量等于計算值(數(shù)據(jù)未顯示)。肽特性的評估采用〃us.expasy.org/tools/pscale/Hphob.Fauchere.html上顯不的Fauchere禾口Pliska標度(Fauchere和Pliska(1983)丄Cte附.18:369-375)，計算每個殘基的肽平均疏水性(<^>)。選擇該方法計算AMP的疏水性是因為它與描述宿主-客體系統(tǒng)中單個氨基酸的膜親和力的實驗證據(jù)相一致(Thorgdrsson等，(1996)歷0c/2e,m'W0;35:1803-1809)。采用Liu和Deber開發(fā)的限定單個氨基酸在非極性膜環(huán)境中的螺旋傾向的標度來估計每個殘基的平均a-螺旋-形成傾向(<潔處"，例如AMP在靶細胞表面上遇到的情況(Lehrer和Ganz(2002)Cwm采用無菌％-孔板，以最終體積100TH或韋榮球菌屬培養(yǎng)基進行抗菌生長抑制實驗，如過去所述(Qi等，(2005)i^EMSM'cro6/a/丄e仏251:321-326)。簡言之，將細菌細胞培養(yǎng)過夜，使其在600nm處的光密度為0.75-0.8(對應(yīng)于1x108CFU/ml)，然后在肉湯中稀釋至1x105CFU/ml，接種到板上。板的第一列中加入適當體積的肽儲備液(5-20mg/ml，用水或甲醇配制，取決于溶解度)，500pg/ml或512pg/ml，沿板以1:2的比例連續(xù)稀釋，使含肽各孔的濃度從500到1.95jig/ml或512到2pg/ml。對照孔僅加入甲醇以研究溶劑影響。然后將板在厭氧條件下，37'C靜置孵育16-20小時，測定MIC，以視覺觀察后最后Qp/"./mmwwo/.14:96-102)。MIC分析的澄清孔中存在的肽的濃度表示。一直到5%(體積比)的甲醇未發(fā)現(xiàn)抗微生物效應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。所有細菌一式三份進行MC測定?？刮⑸飫恿W的評價融合和母體肽的殺傷動力學的測定過程基本上如過去所述(Eckert等，(2006)v4油'm/cro6.C/zemoAer.50:1480-1488)。簡言之，在預(yù)定的時間間隔，用濃度25pg/ml的肽處理培養(yǎng)基稀釋的過夜UA159培養(yǎng)物(0.5x106到1x1(^CFU/ml)("0分鐘"表示未處理樣品)，取出l(HiL試樣，(l:50)稀釋到生長培養(yǎng)基中復(fù)蘇存活CFU，然后鋪展到TH瓊脂板上進行定量。初步實驗提示存在一些存活者(<3,000CFU/ml)，將全部1-毫升樣品接種到板中。記錄在肽存在下存活CFU/ml的平均數(shù)與孵育時間來確定動力學(所有試驗獨立地重復(fù)進行3-5次)。在表8中，將細菌殺傷時間(rC)值定義為肽處理培養(yǎng)物的存活水平CFU/ml比從未處理樣品回收的變異鏈球菌的水平CFU/ml低3logu)所需的時間。結(jié)果約束肽文庫的設(shè)計我們假設(shè)在約束預(yù)測構(gòu)象的構(gòu)架內(nèi)具有遞增變化的疏水和正電荷特性的一系列小型肽文庫將包含具有抗變異鏈球菌活性的AMP。本研究開發(fā)了三個文庫二元、a-螺旋和RW文庫。二元和a-螺旋文庫內(nèi)的肽由兩性a-螺旋序列排列構(gòu)架(HCCHHCHHCCn(SEQIDNO:30)設(shè)計，其中H是疏水殘基，C是帶電殘基)，它是從一些公開的AMP兩親序列模板產(chǎn)生的(Blondelle和Lohner(2000)說'ojro(yme;^55:74-87;Zelezetsky等，(2005)尸e/"V/^26:2368-2376)并采用螺旋-輪突(Schiffer和Edmundson(1967)S/o;/^■/，7:121-135)和平均螺旋傾向<螺旋>驗證(表6)。圖l顯示了來自各個文庫的兩個代表性輪突。二元和a-螺旋文庫內(nèi)肽的長度分別限制在11和14個氨基酸，接近形成跨膜通孔所需的最少殘基的估計量(Shai(2002)歷o尸o/yme"66:236-248)。在該結(jié)構(gòu)構(gòu)架內(nèi)，通過用疏水/芳族或正電荷程度較低的殘基進行取代(B-33已用比較命名法公開，S6L3-33[Eckert等，(2006)爿""m/cro6.C/zewW/zer.50:3651-3657])，以逐步方式減少基線序列FKKFWKWFRRF(B-33，SEQIDNO:31)內(nèi)疏水/芳族和正電荷組分來構(gòu)建二元文庫。32種肽的該文庫內(nèi)所得電荷梯度和疏水性(<//〉)在表6中示出。a-螺旋文庫的設(shè)計比二元文庫長(14相對于11個氨基酸)，以類似于二元文庫的方式，在整個a-螺旋文庫中遞增改變疏水性和電荷特性(表6)。表6:對抗變異鏈球菌臨床分離物的二元、a-螺旋和RW文庫的肽的序列和抗微生物活性<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>3C-1RRRRWWK(SEQIDNO:80)125+5-0.0760.193C-2RRWWRRK(SEQIDNO:81)125+5-0.0760.193C-3RRRWWWK(SEQIDNO:82)31.25-125+40.390.243C-4RWRWRWK(SEQIDNO:83)32+40.390.244C-1RRRKWWK(SEQIDNO:84)250+5-0.0730.194C-2RRWKRRK(SEQIDNO:85)500+6-0.390.134C-3RRRKWWK(SEQIDNO:86)125+5-0.510.194C-4RWRKRWK(SEQIDNO:87)125—500+5-0.510.19a星號表示酰胺化的c端。6測定所有變異鏈球菌分離物的MIC范圍或值。CpH7.0的電荷，如前所述進行計算(Zhang等，(2001)丄&o/.C/iem.,276:35714-35722)。許多天然產(chǎn)生的AMP含有許多Arg和Trp殘基(Chan等，(2007)萬/oc//w所op/^Jcto.51(4):1351-1359)，過去的報道表明在通過合成組合或類似方法產(chǎn)生的六聚(hexameric)AMP中這些氨基酸的占優(yōu)勢(Blondelle禾nHoughten(1996)7>e"A14:60-65;Chan等，(2007)B/oc/z/mB/o//z;^51(4):1351-1359)。因此，我們構(gòu)建RW文庫以包含富含Arg-和Trp-(R和W)的七聚體，其堿性(Arg或Lys)和Trp殘基的順序以及堿性和疏水殘基的比例不同，如表6所示。設(shè)計這些序列不是為了形成常規(guī)的a-螺旋構(gòu)象，如其低<產(chǎn)#》值所反映的那樣。二元文庫肽的活性通過MC試驗評價二元文庫對抗一系列臨床分離物的抗變異鏈球菌活性(表6)。二元文庫中MIC最低(范圍，8-24pg/ml)的兩種肽B-33和B-34也顯示最強的疏水和正電荷特性。類似地，具有活性但活性不如B-33或B-34的肽B-37、-38、-41、-53、-54、-57和-58的凈電荷至少為+3，<//>為>0.55。相反，疏水性低于0.55的肽不具有抗微生物活性，但有兩個例外B-61和B-62(MIC范圍，16-32pg/ml)。顯然，這兩種肽各自僅具有一個芳族殘基，但凈電荷+6，可能有助于其持久活性。MIC結(jié)果與以下想法相一致凈正電荷和一些疏水含量是設(shè)計活性肽的關(guān)鍵參數(shù)(Chan等，(2007)S/oc//wJc/".51(4):1351-1359;50Deslouches等，(2005)^""mfcra6.C7zemoAer.49:316-322)。因此，加入負電荷殘基，尤其是在肽的中間區(qū)域，似乎會消除AMP活性(例如，B-43)，可能是因為將肽吸引到細菌表面所需的正電荷的中斷。數(shù)據(jù)顯示兩種感興趣的例外B-49和B-50，雖然缺乏強的正電荷特性，卻具有弱活性。這些肽特別高的<77>值(因而可能快速分配到宿主膜中)可能解釋了這種現(xiàn)象。選擇B-33，-34和-38，該文庫中三種活性較強的肽進行進一步增強。有趣的是，在整個研究過程中，沒有變異鏈球菌的菌株對測試的AMP更敏感或耐受(數(shù)據(jù)未顯示)。a-螺旋文庫肽的活性如表6所示，MIC測定表明許多a-螺旋文庫的肽具有對抗變異鏈球菌強效活性；僅兩種凈正電荷或〈H〉值(分別是cx-4和a-8)較低的肽無活性。雖然許多a-螺旋文庫的肽具有對抗變異鏈球菌相等的強效殺傷活性，僅選擇a-ll進行進一步的修飾。RW文庫肽的活性如表6所示，我們發(fā)現(xiàn)2C-3和2C-4是RW(富含Arg-和Trp)文庫中對抗變異鏈球菌活性最高的肽(MIC范圍，4-8ng/ml)。數(shù)據(jù)表明，為實現(xiàn)強效抗微生物活性，要求疏水氨基酸與帶電氨基酸(包括酰胺化C端Phe作為帶電殘基)的比率接近1:1，類似于研究富含Trp/Arg-的AMP的Blondelle等人觀察到的4:3的比率(Blondelle等，(1996)爿""脂'cro6.CAemW/zw.40:1067-1071;Shai(2002)歷o，/ywe"66:236-248)。疏水氨基酸與帶電氨基酸比率較低的RW文庫的肽(表現(xiàn)為<//〉值較低)的活性不如2C-3或2C-4。由于其MC較低，選擇這些肽進行進一步增強。融合AMP的設(shè)計過去的研究已表明，與單個組成型AMP相比，合成各種排列的聯(lián)接線性二聚體或五聚體束形式的AMP可提高肽活性(Devi等，(1998)丄及'omo/.Sfn/c〖.D，.15:653-651;Sal-Man等，(2002)所oc/zew&^y41:11921-11930)。以類似的方式，我們假設(shè)表6所示變異鏈球菌活性序列的活性可通過將兩個AMP頭尾連接到一起形成單一融合線性肽分子而提高。注意在過去的研究中，肽之間的接頭區(qū)域?qū)刮⑸锘钚杂杏绊?Eckert等，(2006)勘rim/cra6.4gwteC7wmW/zw.50:1480-1488)。因此，為產(chǎn)生具有更高抗變異鏈球菌活性的肽，我們合成了融合蛋白文庫(表7),該文庫中組成性AMP的排列和各個AMP之間的接頭區(qū)域(或沒有接頭)的序列不同。在二元-a-螺旋集合中，將B-33和B-38在N或C端與ct-ll合成在一起。三-Gly接頭在過去已顯示能有效分隔線性序列內(nèi)功能上獨立的肽區(qū)域(Eckert等，(2006)爿油'm/cro6.C/zemoAer50:1480-1488)并且可能是模型膜中肽二級結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵(Tack等，(2002)五w.丄269:1181-1189)，采用該三-Gly接頭來分隔兩個AMP區(qū)域。融合肽的RW-RW集合含有線性同型二聚體形式2C-3和2C-4，其間有或沒有各種接頭區(qū)域。在表7所示的最后一組(二元-RW集合)中，將2C-4在N或C端與B-33、-34或-38合成到一起，同樣由Gly接頭區(qū)域分隔。這些排列允許我們研究接頭組成(及存在)以及AMP亞基排列(融合肽內(nèi)的N或C端)對抗變異鏈球菌活性的重要性。融合AMP的抗微生物活性MC揭示，融合AMP對抗變異鏈球菌的活性與其母體AMP大致相當或稍低(表7)。例外包括FBa-20，與B-33或a-ll相比其MIC范圍降低；FBRW-22，與母體肽B-33相比，其MC范圍稍微降低?？傮w上，這些數(shù)據(jù)表明，融合AMP最多僅能夠?qū)崿F(xiàn)適度的MC改善。然而，MC試驗會使比較肽之間殺菌速率的顯著差異變得模糊不清(Eckert等，(2006)^""m/cra6,jge"toC/wmW/zer50:1480-1488)，提示需要更詳細的肽殺傷動力學試驗來全面評價融合AMP。表7:融合文庫的肽的序列和活性<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>星號表示酰胺化的c端。測試的所有變異鏈球菌分離物的MIC范圍或值，三次獨立試驗的最小值。采用時間-殺菌試驗分析融合AMP對抗變異鏈球菌的殺傷動力學。如圖2A所示，與B-34或o-ll相比，融合肽FBcc-21的殺傷動力學明顯提高與母體肽處理的樣品相比，30分鐘后融合肽處理的培養(yǎng)物中CFU/ml要小超過2個log1()的值。該趨勢在所有FBcx肽中具有代表性(數(shù)據(jù)未顯示)。所有二元-RW文庫偶聯(lián)物(FBRW-14和-23除外)的殺傷動力學的提高也顯著(圖2B):與用任一母體肽處理的樣品相比，處理30分鐘后，2C-4在N或C端與二元文庫AMP的融合肽在改善變異鏈球菌殺傷動力學水平方面同樣有效，大于3個31ogH)。這些結(jié)果表明，聯(lián)接的AMP區(qū)域可產(chǎn)生對抗變異鏈球菌的提高的殺菌效果，短時肽處理后尤其顯著。如表8所示，我們還發(fā)現(xiàn)，一些RW-RW融合肽的殺傷動力學提高。在用沒有接頭區(qū)域的2C-4同型二聚體(FRW-8)處理的樣品中，變異鏈球菌的存活數(shù)CFU/ml比未處理樣品低3logK)(定義為殺菌活性時間，或Tc)需要50分鐘，而2C-4的7b為220分鐘。與用其母體肽(2C-3)處理的樣品相比，在較低的程度上，該趨勢在接觸沒有接頭的2C-3同型二聚體(FRW-2)的樣品中也存在。有趣的是，在2C-3趨勢間加入柔性氨基酸的接頭區(qū)域(PSGSP(SEQIDNO:106)，ASASA(SEQIDNO:107)或GGG(SEQIDNO:108))不能提高殺傷動力學(FRW-3或-5的rc>250分鐘)，而2C-4同型二聚體FRW-9和-11雖然存在ASASA(SEQIDNO:107)和GGG(SEQIDNO:108)接頭趨勢，與其母體2C-4AMP相比的殺菌速率提高(表8)。這些結(jié)果提示，合成沒有接頭區(qū)域的肽可提高RW-基肽對抗變異鏈球菌的活性，而當采用接頭區(qū)域時，數(shù)據(jù)表明提高的動力學是類似序列，因而二級結(jié)構(gòu)依賴性的，因為通過與柔性氨基酸的接頭區(qū)域偶聯(lián)可提高2C-4的活性(除了PSGSP，SEQIDNO:106)，但2C-3不能。表8:母體RW和融合FRW文庫的肽的殺菌動力學<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>。rc，使可回收CFU/ml下降3個log,o所需的時間。對抗其他口腔細菌的肽活性選擇具有最佳抗變異鏈球菌活性的一系列肽(MIC測定)來研究這些AMP對抗一些正常共生的口腔鏈球菌株和干酪乳酸桿菌(丄acto6ad//^c^e/)以及口腔革蘭氏陰性非典型韋榮球菌的活性(表9)。MIC結(jié)果表明，這些序列具有活性，但其對抗格氏鏈球菌(Sfreptococc^goWom》、干酪乳酸桿菌(X.ca化z;j和血鏈球菌f^r印tococcM加wgw/m;s)的程度不如對抗變異鏈球菌的活性程度。進行試驗的所有肽通常對緩癥鏈球菌OS伊印tococc^m/to.KaO^'ca)僅具有弱活性。非典型韋榮球菌似乎比測試的其他細菌更敏感，但對RW文庫的肽2C-3和2C-4較耐受。<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>討論在美國，通過補充更有效的抗變異鏈球菌療法的牙齒衛(wèi)生方案能夠緩解與齲齒治療有關(guān)的高昂經(jīng)濟負擔，尤其是在窮苦和少數(shù)人群中(Anderson和Shi(2006)尸e&Wr.，28:151-153;討論部分192-198;國立衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesofHealth)(2000)，美國口腔健康一份普通醫(yī)師的報告(ora//"爿men'ca;areporto//7化5Wgeo"ge"era〃，公共健康月艮務(wù)部(DepartmentofHealthandHumanServices),國立牙齒與顱面研究機構(gòu)(NationalInstituteofDentalandCraniofacialResearch)，馬里蘭州貝瑟達的國立健康t幾構(gòu)(NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD);華盛頓州健康部門(WashingtonStateDepartmentofHealth)(2002)，感染性疾病-腐齒(7"/e"/owsLfaewes—De"to/Ca〃'e^，華盛頓州奧林匹亞的華盛頓健康部門(WashingtonStateDepartmentofHealth，Olympia，WA))。因此，本文提供的結(jié)果提示，通過篩選小型合理設(shè)計的文庫能夠鑒別具有強效抗變異鏈球菌活性的肽。有趣的是，源自該研究的活性最強的肽似乎對其他革蘭氏陽性口腔細菌具有一些活性，雖然需要的更多數(shù)據(jù)來全面評估這些序列的疏水和兩親特性是否能夠指示抗革蘭氏陽性菌的一般活性。由于變異鏈球菌通常在體內(nèi)生物膜狀態(tài)下生長，這就激勵我們研究所有表9中的肽在體外對蔗糖存在下、載玻片上生長的變異鏈球菌生物膜是否具有活性(數(shù)據(jù)未顯示)。對于二元和a-螺旋文庫，結(jié)果表明，疏水性較高且凈正電荷超過+3的肽具有最大變異鏈球菌活性。其特性被一種性質(zhì)控制的肽具有中間活性水平。這些結(jié)果與具有陽離子兩親特性的大多數(shù)合成和天然AMP已知的結(jié)果相一致，提示這些文庫中的B-33、a-7和其他活性肽序列可能以類似于該結(jié)構(gòu)類型中其他AMP的方式起作用；即需要肽的正電荷以使AMP吸引到陰離子細菌膜上，而需要兩性來實現(xiàn)膜相互作用、螺旋轉(zhuǎn)變和細胞殺傷作用(Jing等，(2003)丄61:219-229;Shai(2002)5/opo/j;me^66:236-248)。這些結(jié)果也表明，高<《值本身可能不與陽離子兩性AMP的抗變異鏈球菌活性的提高相關(guān)。對于RW文庫，如二元和a-螺旋文庫所述，疏水性最高且正電荷的序列活性最高(2C-3和-4)。雖然與其他文庫中的肽相比長度和周期性存在差異，認為RW肽能夠從初始肽結(jié)合或膜插入的改善獲得活性的提高。該結(jié)果得到證據(jù)支持，表明富含Arg-和Trp-的肽雖然〈類7》值較低，卻能夠通過TipH電子與Arg官能團之間的靜電鍵穩(wěn)定化的膜相互作用形成穩(wěn)定的螺旋樣兩性排列(Jing等，(2003)丄/e5.61:219-229;Mecozzi等，(1996)/Voc.Ato/.93:10566-10571)。因此，RW文庫肽的獨特序列性質(zhì)使它們獲得對抗微生物活性高度有益的二級結(jié)構(gòu)。有趣的是，我們的結(jié)果表明，融合肽，以單一線性分子合成的AMP二聚體，與其他母體肽相比殺傷動力學提高。一些融合肽可能通過增加膜表面處每個分子中螺旋形成單元的數(shù)目而起作用，如束形AMP所述(Sawai等，(2002)尸roto'"15:225-232)。關(guān)于AMP區(qū)段間的接頭區(qū)域的影響尚不清楚，雖然數(shù)據(jù)的確表明接頭區(qū)域可能對單個肽具有不同的作用(參見表7和8中FRW-3和FRW-9的結(jié)果)。正在進行的工作直接研究接頭組合物對AMP活性的影響。而且，我們的結(jié)果提示，組成性排列(融合肽亞單位在C端或N端)的效果可能難以預(yù)測(比較FBa-12和FBa-20的MIC)，雖然其他工作已證明，兩性且推定形成螺旋的AMP似乎更耐受N端添加，但原因尚不清楚(Eckert等，(2006)^"">mcTo6.爿gew^yCAewoAer.50:1480-1488;Szynol等，(2006)C/zem.5Zo./DrwgDe&，67:425-431)。結(jié)論是，我們的結(jié)果表明，變異鏈球菌似乎對疏水性較高且正電荷的肽較敏感，而這些肽是從我們的約束文庫中容易分離得到的。此外，將這些文庫內(nèi)或文庫之間的活性序列聯(lián)接后構(gòu)建形成的融合肽能夠改善這些肽的殺傷動力學。實施例2:酸活化文庫肽的活性組氨酸殘基的側(cè)鏈pKa接近6.0，因而在pH等于和小于6.0使具有正電荷，但在中性pH下不帶電。根據(jù)這一特征，我們構(gòu)建了酸活化的文庫，使得兩性螺旋形成排列(引起抗變異鏈球菌活性)可導(dǎo)致低pH環(huán)境(例如齲病損時變異鏈球菌產(chǎn)生的環(huán)境)，但肽在pH超過6.0時仍然無活性。為驗證該假設(shè)，發(fā)現(xiàn)文庫中的大多數(shù)序列在pH4.9時具有對抗變異鏈球菌的強效抗微生物活性，但在pH7.4時無活性(表10)。該研究期間不選擇來自該文庫的肽進行進一步增強。表10:酸活化文庫肽抗變異鏈球菌的MIC<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>*表示酰胺化的(:端實施例3:殺傷肽文庫#7的活性設(shè)計殺傷文庫#7內(nèi)的肽(表11)，相對于本文所述的其他文庫，分子較小、疏水并具有弱的陽離子特性?？棺儺愭溓蚓腗IC研究揭示，該文庫內(nèi)的許多序列無活性或弱活性。S6L1-5顯示中等活性。不選擇該文庫內(nèi)的肽進行進一步研究。表ll:殺傷肽文庫#7<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>*表示酰胺(匕的c端實施例4:B-刪除文庫肽的活性將該文庫內(nèi)的疏水性陽離子肽從15個氨基酸系統(tǒng)性縮短至7個氨基酸，得到物理大小的梯度，同時保持疏水性和電荷參數(shù)基本穩(wěn)定。我們發(fā)現(xiàn)，通過MC評價，該文庫內(nèi)的一些序列具有強效抗變異鏈球菌活性(表12)?；钚孕蛄邪ǜ鞣N大小的肽，雖然數(shù)據(jù)表明至少9個殘基是活性必需的。我們還發(fā)現(xiàn)，該文庫內(nèi)的肽對所檢查的革蘭氏陰性菌一綠膿假單胞菌通常無活性，但對一些其他革蘭氏陽性菌有活性。本研究期間不選擇這些肽進行進一步增強。表12:(3-刪除文庫<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>應(yīng)理解，本文所述的實施例和實施方式僅僅是為了說明的目的，根據(jù)這些內(nèi)容的各種改性或改變是本領(lǐng)域技術(shù)人員所明白的，包括在本申請的精神和范圍以及所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。本文引用的所有出版物、專利和專利申請以其全部內(nèi)容納入本文作為參考。權(quán)利要求1.一種抗微生物肽，所述肽包含以下氨基酸基序或以下氨基酸基序的環(huán)狀排列(H1C1C2H2H3C3H4H5C4C5)n式中，n為1-5并以0.1為單位遞增；H1、H2、H3、H4和H5獨立地選自疏水性或親水性氨基酸；C1、C2、C3、C4和C5獨立地選自不帶電氨基酸、正電荷氨基酸或負電荷氨基酸；所述肽形成α螺旋；所述肽不含氨基酸序列FKKFWKWFRRF(SEQIDNO31)；和所述肽能有效殺傷或抑制培養(yǎng)物中變異鏈球菌的生長或增殖。2.如權(quán)利要求1所述的抗微生物肽，其特征在于，C1、C2、C3、C^和C5獨立地選自正電荷氨基酸或負電荷氨基酸3.如權(quán)利要求1所述的抗微生物肽，立地選自S、T和Y。4.如權(quán)利要求1所述的抗微生物肽，立地選自K、R和H。5.如權(quán)利要求1所述的抗微生物肽，立地選自N、Q、D禾口E。6.如權(quán)利要求1所述的抗微生物肽，氨基酸獨立地選自L、I、V、W和F。7.如權(quán)利要求1所述的抗微生物肽，其特征在于，所述不帶電氨基酸、正電荷氨基酸或負電荷氨基酸獨立地選自S、T、Y、K、R、H、N、Q、D禾口E;禾口所述疏水性或親水性氨基酸獨立地選自L、I、V、W和F。8.如權(quán)利要求1所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽在羧基末端還包含游離胺。其特征在于，所述不帶電氨基酸獨其特征在于，所述正電荷氨基酸獨其特征在于，所述負電荷氨基酸獨其特征在于，所述疏水性或親水性9.如權(quán)利要求8所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽在羧基末端包含由精氨酸或賴氨酸提供的游離胺。10.如權(quán)利要求8所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽在羧基末端包含由酰胺化的非陽離子殘基提供的游離胺。11.如權(quán)利要求1所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽經(jīng)聚乙二醇化。12.如權(quán)利要求1所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽具有一個或多個保護基。13.如權(quán)利要求1所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽具有一個或多個選自下組的保護基乙?；?、酰胺、3-20個碳的烷基、Fmoc、Tboc、9-芴乙酰基、l-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-l-羧基、芐氧基羰基、n占噸基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧基三苯甲基(Mmt)、4-甲氧基-2,3，6-三甲基-苯磺?；?Mtr)、均三甲基苯-2-磺?；?Mts)、4,4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)、甲苯磺?；?Tos)、2,2，5，7,8-五甲基色滿-6-磺?；?Pmc)、4-甲基芐基(MeBzl)、4-甲氧基芐基(MeOBzl)、芐氧基(BzlO)、芐基(Bzl)、苯甲酰基(Bz)、3-硝基-2-吡啶次磺?；?Npys)、l-(4,4-二甲基-2，6-二氧雜環(huán)亞己基)乙基(Dde)、2,6-二氯芐基(2,6-DiCl-Bzl)、2-氯芐氧基羰基(2-Cl-Z)、2-溴芐氧基羰基(2-Br-Z)、芐氧基甲基(Bom)、叔丁氧基羰基(Boc)、環(huán)己氧基(cHxO)、叔丁氧基甲基(Bum)、叔丁氧基(tBuO)、叔丁基(tBu)、乙酰基(Ac)和三氟乙?；?TFA)。14.如權(quán)利要求1所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽包含所有天然產(chǎn)生的氨基酸。15.如權(quán)利要求1所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽包含一個或多個"D"氨基酸。16.如權(quán)利要求1所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽包含一個或多個(3氨基酸。17.如權(quán)利要求1所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽在生理pH下具有至少+3凈正電荷。18.如權(quán)利要求1所述的抗微生物肽，其特征在于，n為1.1;和所述肽包含基序H1(31(^112113^114115(^^116，其中116是獨立選擇的疏水氨基酸。19.如權(quán)利要求18所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽包含選自下組的氨基酸序列LKRFLKWFKRF(SEQIDNO:32)(B-34)，KLFKRWKHLFR(SEQIDNO:33)(B-35),RLLKRFKHLFK(SEQIDNO:34)(B-36)，F(xiàn)KTFLKWLHRF(SEQIDNO:35)(B-37)，IKQLLHFFQRP(SEQIDNO:36)(B-38)，KLLQTFKQIFR(SEQIDNO:37)(B-39)，RILKELKNLFK(SEQIDNO:38)(B-40)，LKQFVHFIHRF(SEQIDNO:39)(B-41)，VKTLLHIFQRF(SEQIDNO:40)(B-42)，KLVEQLKEIFR(SEQIDNO:41)(B-43)，RVLQEIKQILK(SEQIDNO:42)(B-44)，VKNLAELVHRF(SEQIDNO:43)(B-45)，ATHLLHALQRF(SEQIDNO:44)(B-46)，KLAENVKEILR(SEQIDNO:45)(B-47)，RALHEAKEALK(SEQIDNO:46)(B-48)，F(xiàn)HYFWHWFHRF(SEQIDNO:47)(B-49)，LYHFLHWFQRF(SEQIDNO:48)(B-50)，YLFQTWQHLFR(SEQIDNO:49)(B-51)，YLLTEFQHLFK(SEQIDNO:50)(B扁52)，F(xiàn)KTFLQWLHRF(SEQIDNO:51)(B-53)，IKTLLHFFQRF(SEQIDNO:52)(B-54)，KLLQTFNQIFR(SEQIDNO:53)(B-55)，TILQSLKNIFK(SEQIDNO:54)(B-56)，LKQFVKFIHRF(SEQIDNO:55)(B-57)，VKQLLKIFNRF(SEQIDNO:56)(B-58)，KLVQQLKNIFR(SEQIDNO:57)(B-59)，RVLNQVKQILK(SEQIDNO:58)(B-60)，VKKLAKLVRRF(SEQIDNO:59)(B-61)，AKRLLKVLKRF(SEQIDNO:60)(B-62)，KLAQKVKRVLR(SEQIDNO:61)(B-63)和RALKRIKHVLK(SEQIDNO:62)(B-64)。20.如權(quán)利要求19所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽被酰胺化。21.如權(quán)利要求1所述的抗微生物肽，其特征在于，n為1.4;禾口所述肽包含基序！^^(:21121"13(33114115(:4(:5116(:6(37117，其中H6和H是獨立選擇的疏水氨基酸，d和d是獨立選擇的正電荷或負電荷氨基酸。22.如權(quán)利要求22所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽包含選自下組的氨基酸序列KLKKLLKKLKKLLK(SEQIDNO:64)(a-5)，LKLLKKLLKLLKKF(SEQIDNO:65)(a-6)，LQLLKQLLKLLKQF(SEQIDNO:66)(a-7)，RWRRWWRHFHHFFH(SEQIDNO:68)(a陽9)，KLKKLLKRWRRWWR(SEQIDNO:69)(a-10)，RWRRLLKKLHHLLH(SEQIDNO:70)(a-1l)和KLKKLLKHLHHLLH(SEQIDNO:71)(a-12)。23.如權(quán)利要求22所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽被酰胺化。24.如權(quán)利要求l、19或22所述的抗微生物肽，其特征在于，用可檢測的標記物標記所述肽。25.如權(quán)利要求24所述的抗微生物肽，其特征在于，用選自下組的可檢測的標記物標記所述肽酶標記、熒光標記、比色標記、自旋標記和反射性標記。26.如權(quán)利要求1、19、22或41所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽附連于第二抗微生物肽從而形成化合抗微生物肽。27.如權(quán)利要求26所述的抗微生物肽，其特征在于，所述化合抗微生物肽是融合蛋白。28.如權(quán)利要求26所述的抗微生物肽，其特征在于，所述第二抗微生物肽是包含以下氨基酸基序或以下氨基酸基序的環(huán)狀排列的肽(Hi(^C2H2H3c3H4H5c4c5)n式中，n為l-5并以0.1為單位遞增；H1、H2、H3、114和115獨立地選自疏水性或親水性氨基酸；禾口C1、C2、C3、d和CS獨立地選自中性氨基酸、正電荷氨基酸或負電荷氨基酸；或者所述肽包含7個毗連氨基酸，其中除2個氨基酸外的所有其他氨基酸是Arg或Trp、或其衍生物或類似物；所述2個非Arg或Trp氨基酸是Lys或Phe、或其衍生物或類似物；和N-末端殘基是Arg或其衍生物或類似物。29.如權(quán)利要求26所述的抗微生物肽，其特征在于，所述第二抗微生物肽是表6所列的肽。30.—種抗微生物肽，所述肽包含7個毗連氨基酸，其中除2個氨基酸外的所有其他氨基酸是Arg或Trp、或其衍生物或類似物；所述2個非Arg或Trp氨基酸是Lys或Phe、或其衍生物或類似物；和N-末端殘基是Arg或其衍生物或類似物。31.如權(quán)利要求30所述的抗微生物肽，其特征在于，除2個氨基酸外的所有其他氨基酸是Arg或Trp;所述2個非Arg或Trp氨基酸是Lys或Phe;和N-末端殘基是Arg。32.如權(quán)利要求30所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽包含選自下組的氨基酸序列RRRRWWW(SEQIDN0:72)(1C-1)，RRWWRRW(SEQIDNO:73)(1C-2)，RRRWWWR(SEQIDNO:74)(1C-3)，RWRWRWR(SEQIDNO:75)(1C-4)，RRRFWWR(SEQIDNO:76)(2C-1)，RRWWRRF(SEQIDNO:77)(2C-2)，RRRWWWF(SEQIDNO:78)(2C-3)，RWRWRWF(SEQIDNO:79)(2C-4)，RRRRWWK(SEQIDNO:80)(3C-1)，RRWWRRK(SEQIDNO:81)(3C-2)，RRRWWWK(SEQIDNO:82)(3C-3)，RWRWRWK(SEQIDNO:83)(3C-4)，RRRKWWK(SEQIDNO:84)(4C-1)，RRWKRRK(SEQIDNO:85)(4C-2)，RRRKWWK(SEQIDNO:86)(4C-3)和RWRKRWK(SEQIDNO:87)(4C-4)。33.如權(quán)利要求30所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽經(jīng)聚乙二醇化。34.如權(quán)利要求30所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽具有一個或多個保護基。35.如權(quán)利要求30所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽具有一個或多個選自下組的保護基乙?；?、酰胺、3-20個碳的垸基、Fmoc、Tboc、9-芴乙酰基、l-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-l-羧基、芐氧基羰基、咕噸基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧基三苯甲基(Mmt)、4-甲氧基-2,3,6-三甲基-苯磺?；?Mtr)、均三甲基苯-2-磺?；?Mts)、4,4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)、甲苯磺酰基(Tos)、2，2,5,7,8-五甲基色滿-6-磺?；?Pmc)、4-甲基節(jié)基(MeBzl)、4-甲氧基節(jié)基(MeOBzl)、節(jié)氧基(BzlO)、芐基(Bzl)、苯甲酰基(Bz)、3-硝基-2-吡啶次磺?；?Npys)、l-(4，4-二甲基-2,6-二氧雜環(huán)亞己基)乙基(Dde)、2,6-二氯芐基(2，6-DiCl-Bzl)、2-氯芐氧基羰基(2-Cl-Z)、2-溴芐氧基羰基(2-Br-Z)、芐氧基甲基(Bom)、叔丁氧基羰基(Boc)、環(huán)己氧基(cHxO)、叔丁氧基甲基(Bum)、叔丁氧基(tBuO)、叔丁基(tBu)、乙?；?Ac)和三氟乙?；?TFA)。36.如權(quán)利要求30然產(chǎn)生的氨基酸。37.如權(quán)利要求30多個"D"氨基酸。38.如權(quán)利要求30多個卩氨基酸。39.如權(quán)利要求30標記所述肽。40.如權(quán)利要求39測的標記物標記所述肽標記。41.一種酸活化的肽，其包含長度約7-11個氨基酸的兩性螺旋肽，其中絕大部分帶電殘基是在酸性pH下帶正電的His或其衍生物或類似物，所述肽在中性pH下基本沒有抗微生物活性，但在酸性pH下具有對抗變異鏈球菌的抗微生物活性。42.如權(quán)利要求41所述的抗微生物肽，其特征在于，所有帶電殘基是在酸性pH下帶正電的His或其衍生物或類似物。43.如權(quán)利要求41所述的抗微生物肽，其特征在于，所述酸性pH為pH6或更低。44.如權(quán)利要求41所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽包含HH和FF的交替重復(fù)。所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽包含所有天所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽包含一個或所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽包含一個或所述的抗微生物肽，其特征在于，用可檢測的標記物所述的抗微生物肽，其特征在于，用選自下組的可檢:酶標記、熒光標記、比色標記、自旋標記和反射性45.如權(quán)利要求41或44所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽在一端或兩端包含氨基酸序列KLLK(SEQIDNO:166)。46.如權(quán)利要求41或44所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽在一端或兩端包含氨基酸序列KLLK(SEQIDNO:166)，所述KLLK通過接頭連接于所述末端。47.如權(quán)利要求26所述的抗微生物肽，其特征在于，所述接頭是GAT(SEQIDNO:167)。48.如權(quán)利要求41所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽包含氨基酸序列FHFFHHFFHFFHHF(SEQIDNO:168)。49.如權(quán)利要求41所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽包含選自下組的氨基酸序列HHFFHHFHHFFHHF(SEQIDNO:109)(AA-1)，F(xiàn)HFFHHFFHFFHHF(SEQIDNO:110)(AA-2)，KLLKGATFHFFHHFFHFFHHF(SEQIDNO:lll)(AA-3)，KLLKFHFFHHFFHFFHHF(SEQIDNO:112)(AA-4)，F(xiàn)HFFHHFFHFFHHFKLLK(SEQIDNO:113)(AA-5)，F(xiàn)HYF麗曹HRF(SEQIDNO:114)(AA-6)禾卩LYHFLHWFQRF(SEQIDNO:115)(AA-7)。50.如權(quán)利要求41所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽具有一個或多個保護基。51.如權(quán)利要求41所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽具有一個或多個選自下組的保護基乙?；?、酰胺、3-20個碳的烷基、Fmoc、Tboc、9-芴乙酰基、l-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-l-羧基、芐氧基羰基、咕噸基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧基三苯甲基(Mmt)、4-甲氧基-2,3,6-三甲基-苯磺?；?Mtr)、均三甲基苯-2-磺?；?Mts)、4,4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)、甲苯磺?；?Tos)、2,2,5,7，8-五甲基色滿-6-磺?；?Pmc)、4-甲基芐基(MeBzl)、4-甲氧基芐基(MeOBzl)、芐氧基(BzlO)、芐基(Bzl)、苯甲酰基(Bz)、3-硝基-2-吡啶次磺?；?Npys)、l-(4,4-二甲基-2，6-二氧雜環(huán)亞己基)乙基(Dde)、2，6-二氯芐基(2,6-DiCl-Bzl)、2-氯芐氧基羰基(2-Cl-Z)、2-溴芐氧基羰基(2-Br-Z)、芐氧基甲基(Bom)、叔丁氧基羰基(Boc)、環(huán)己氧基(cHxO)、叔丁氧基甲基(Bum)、叔丁氧基(tBuO)、叔丁基(tBu)、乙?；?Ac)和三氟乙?；?TFA)。52.—種抗微生物肽，其包含選自下組的肽LKQKLKILF(SEQIDNO:116(S6L1陽2)，LKQLKAGIY(SEQIDNO:117)(S6Ll-3)，VGKCVKLLY(SEQIDNO:118)(S6L1-4)，KFVKLILAY(SEQIDNO:119)(S6L1-5)，KLVKLVFLY(SEQIDNO:120)(S6Ll-6)，IKVFAKQKY(SEQIDNO:121)(S6Ll-7)和RFRHFQERY(SEQIDNO:122)(S6L1隱8)。53.—種抗微生物肽，其包含選自下組的肽FVFRHKWVWKHRFLF(SEQIDNO:123)(S3L8-1)，VFIVWVHKHVLF(SEQIDNO:124)(S3L8-2)，WRWRARWRWRLRWRF(SEQIDNO:125)(S3L8-3)，WRIHLRARLHVKFRF(SEQIDNO:126)(S3L8-4)，LRIHARFKVHIRLKF(SEQIDNO:127)(S3L8隱5)，F(xiàn)HIKFRVHLKVRFHF(SEQIDNO:128)(S3L8-6)，F(xiàn)HVKlHFRLHVKFHF(SEQIDNO:129)(S3L8-7)，LHIHAHFHVHIHLHF(SEQIDNO:130)(S3L8陽8)，F(xiàn)KIHFRLKVHIRFKF(SEQIDNO:131)(S3L8-9)，F(xiàn)KAHIRFKLRVKFHF(SEQIDNO:132)(S3L8-10)，LKAKIKFKVKLKIKF(SEQIDNO:133)(S3L8-11)，WIWKHKFLHRHFLF(SEQIDNO:134)(S3L8-12),VFLHRHVIKHKLVF(SEQIDNO:135)(S3L8-13)，F(xiàn)LHKHVLRHRIVF(SEQIDNO:136)(S3L8-14)，VFKHKIVHRHILF(SEQIDNO:137)(S3L8-15),FLFKHLFL服FF(SEQIDNO:138)(S3L8-16),LFKHILIHRVIF(SEQIDNO:139)(S3L8陽17)，F(xiàn)LHKHLFKHKLF(SEQIDNO:140)(S3L8-18)，VFRHRFIHRHVF(SEQIDNO:141)(S3L8-19),FIHKLVHKHVLF(SEQIDNO:142)(S3L8-20)，VLRHLFRHRIVF(SEQIDNO:143)(S3L8-21)，LVHKLILRHLLF(SEQIDNO:144)(S3L8-22)，VFKRVLIHKLIF(SEQIDNO:145)(S3L8-23)，IVRKFLFRHKVF(SEQIDNO:146)(S3L8-24)，VLKHVIAHKRLF(SEQIDNO:147)(S3L8-25)，F(xiàn)IRKFLFKHLF(SEQIDNO:148)(S3L8-26)，VIRHVWVRKLF(SEQIDNO:149)(S3L8-27)，F(xiàn)LFRHRFRHRLVF(SEQIDNO:150)(S3L8-28)，LFLHKHAKHKFLF(SEQIDNO:151)(S3L8-29)，F(xiàn)KHKFKHKFIF(SEQIDNO:152)(S3L8-30)，LRHRLRHRLIF(SEQIDNO:153)(S3L8-31)，LILKFLFKFVF(SEQIDNO:154)(S3L8-32)，VLIRILVRVIF(SEQIDNO:155)(S3L8曙33)，F(xiàn)RHRFRHRF(SEQIDNO:156)(S3L8-34),LKHKLKHKF(SEQIDNO:157)(S3L8-35)，F(xiàn)KFKHKLIF(SEQIDNO:158)(S3L8-36)，LRLRHRVLF(SEQIDNO:159)(S3L8-37),FKFLFKFLF(SEQIDNO:160)(S3L8-38),LRLFLRWLF(SEQIDNO:161)(S3L8-39),FKFLFKHKF(SEQIDNO:162)(S3L8-40)，LRLFLRHRF(SEQIDNO:163)(S3L8-41)，F(xiàn)KFLFKF54.—種藥物制劑，其包含如權(quán)利要求1-53中任一項所述的抗微生物肽；和藥學上可接受的賦形劑。55.如權(quán)利要求54所述的藥物制劑，其特征在于，所述制劑是單位劑量制劑。56.如權(quán)利要求54所述的藥物制劑，其特征在于，所述賦形劑是口腔粘膜給藥可接受的。57.—種健康護理產(chǎn)品，其包含如權(quán)利要求1-54中任一項所述的抗微生物肽，其中所述抗微生物肽包含在選自下組的產(chǎn)品中牙膏、漱口劑、牙齒增白條或溶液、隱形眼鏡儲存液、潤濕劑、或清潔溶液、牙線、牙簽、牙刷刷毛、口腔噴霧劑、口腔錠劑、鼻腔噴霧劑、口腔和/或鼻腔應(yīng)用的粉霧劑和傷口敷料。58.—種抑制細菌生長和/或增殖的方法，所述方法包括使所述細菌與足以抑制所述細菌的生長和/或增殖量的如權(quán)利要求1-53中任一項所述的肽相接觸。59.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述量是足以殺死所述細菌的量。60.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述細菌是革蘭氏陽性菌。61.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述細菌是革蘭氏陽性口腔細菌。62.如權(quán)利要求60所述的方法，其特征在于，所述細菌是鏈球菌屬。63.如權(quán)利要求60所述的方法，其特征在于，所述細菌是變異鏈球菌。64.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述接觸包括接觸粘膜表面。65.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述接觸包括接觸口腔粘膜。66.—種抑制齲齒形成的方法，所述方法包括使牙齒和/或口腔粘膜與足以抑制變異鏈球菌的生長和/或增殖量的如權(quán)利要求1-53中任一項所述的肽相接觸。67.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述接觸包括使所述牙齒和/或口腔粘膜與選自下組的組合物相接觸牙膏、漱口劑、增白條或溶液、錠劑、氣溶膠和拭子。68.如權(quán)利要求1-53中任一項所述的抗微生物肽在制造用于抑制感染的藥物中的應(yīng)用。69.如權(quán)利要求1-53中任一項所述的抗微生物肽在制造用于抑制齲齒形成的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了能夠有效抑制各種革蘭氏陽性菌的生長和/或增殖的新型抗微生物肽。具體說，所述肽能有效對抗變異鏈球菌，變異鏈球菌是一種常見口腔病原體，可導(dǎo)致齲齒。文檔編號C07K2/00GK101622271SQ200880002256公開日2010年1月6日申請日期2008年1月15日優(yōu)先權(quán)日2007年1月16日發(fā)明者M·H·安德森,R·H·埃克特,堅何,施文元,齊鳳霞申請人:加利福尼亞大學董事會;C3劍股份有限公司